ISO 21570:2005
(Main)Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid based methods
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid based methods
ISO 21570:2005 provides the overall framework of quantitative methods for the detection of genetically modified organisms (GMO) in foodstuffs, using the polymerase chain reaction (PCR). It defines general requirements for the specific amplification of DNA target sequences in order to quantify the relative GMO-derived DNA content and to confirm the identity of the amplified DNA sequence. Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in ISO 21570:2005 are intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories. ISO 21570:2005 has been established for food matrices, but is also applicable to other matrices, e.g. feed and plant samples from the environment.
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
L'ISO 21570:2005 fournit un cadre général auquel doit satisfaire toute méthode quantitative de détection des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans les produits alimentaires utilisant la PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Elle définit les exigences générales relatives à l'amplification spécifique de séquences cibles d'ADN, afin de quantifier la teneur relative en ADN dérivé d'OGM et de confirmer l'identité de la séquence d'ADN amplifiée. Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans l'ISO 21570:2005 ont pour but de garantir l'obtention de résultats comparables, exacts et reproductibles, dans différents laboratoires. L'ISO 21570:2005 a été élaborée pour les matrices de produits alimentaires, mais elle est aussi applicable à d'autres matrices, par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes issus de l'environnement.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21570
First edition
2005-11-01
Foodstuffs — Methods of analysis for the
detection of genetically modified
organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
Reference number
©
ISO 2005
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2005
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2005 – All rights reserved
Contents Page
Foreword. v
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
4.1 General. 2
4.2 Amplification, detection and confirmation of PCR products . 2
4.3 Quantitation of PCR products . 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus and equipment . 2
7 Guidelines concerning the procedure. 3
7.1 General. 3
7.2 Target sequence stability. 3
7.3 Calibration of the analysis . 3
7.4 Quantitation considerations . 3
7.5 Quality assurance requirements . 3
8 Interpretation. 4
9 Expression of results . 4
10 Test report . 5
Annex A (informative) Target taxon-specific methods. 6
A.1 Target taxon-specific method for the absolute quantitation of the adh1 gene DNA of
maize using real-time PCR. 6
Annex B (informative) Screening methods. 12
B.1 Screening method for the relative quantitation of the 35S-promoter DNA of soya bean line
GTS 40-3-2 using real-time PCR. 12
Annex C (informative) Construct-specific methods . 20
C.1 Construct-specific method for the quantitation of soya bean line GTS 40-3-2 DNA using
real-time PCR (Method 1) . 20
C.2 Construct-specific method for the quantitation of soya bean line GTS 40-3-2 DNA using
real-time PCR (Method 2) . 27
C.3 Construct-specific method for the quantitation of Event176 maize DNA using real-time
PCR. 34
C.4 Construct-specific method for the quantitation of soya bean line GTS 40-3-2 DNA using
real-time PCR . 41
C.5 Construct-specific method for the quantitation of maize line MON 810 DNA using
real-time PCR . 49
C.6 Construct-specific method for the quantitation of maize line Event176 DNA using
real-time PCR . 56
C.7 Construct-specific method for the quantitation of maize line Bt11 DNA using real-time
PCR. 63
C.8 Construct-specific method for the quantitation of maize line GA21 DNA using real-time
PCR. 71
C.9 Construct-specific method for the quantitation of maize line T25 DNA using real-time PCR . 78
Annex D (informative) Event-specific methods . 87
D.1 Event-specific method for the absolute and relative quantitation of maize line Bt11 DNA
based on real-time PCR. 87
D.2 Event-specific method for the relative quantitation of maize line MON 810 DNA using
real-time PCR. 93
Bibliography . 100
iv © ISO 2005 – All rights reserved
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21570 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,
Food products, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna
Agreement).
Introduction
The search for ingredients of genetically modified origin is performed by means of the following successive (or
simultaneous) steps. After sample collection, nucleic acids are extracted from the test portion. Extracted
nucleic acids can be further purified, simultaneously or after the extraction process. Afterwards, they are
quantified (if necessary), diluted (if necessary) and subjected to analytical procedures (such as PCR). These
steps are detailed in the present and in the following International Standards:
ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Quantitative nucleic acid based methods
Further information about definitions and general items involving the steps cited above are collected in:
ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — General requirements and definitions.
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of a patent concerning the PCR technology.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.
ISO has been informed that Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. and Hoffman-La Roche hold
patent rights concerning PCR technology. The companies have assured the ISO that they are willing to
negotiate licences under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout
the world. In this respect, the statements of the holders of these patent rights are registered with ISO.
Information may be obtained from:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404,
USA
and
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501,
USA
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be subject of patent rights
other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
vi © ISO 2005 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21570:2005(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
1 Scope
This International Standard provides the overall framework of quantitative methods for the detection of
genetically modified organisms (GMOs) in foodstuffs, using the polymerase chain reaction (PCR).
It defines general requirements for the specific amplification of DNA target sequences, in order to quantify the
relative GMO-derived DNA content and to confirm the identity of the amplified DNA sequence.
Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in this International Standard are
intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories.
This International Standard has been established for food matrices, but is also applicable to other matrices,
e.g. feed and plant samples from the environment.
Specific examples of methods are provided in Annexes A to D.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 21569:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Nucleic acid extraction
1)
ISO 24276:— , Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — General requirements and definitions
ISO Guide 32, Calibration in analytical chemistry and use of certified reference materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 apply.
1) To be published.
4 Principle
4.1 General
Quantitative analysis consists of the quantitation of target DNA sequences in the test samples. Each method
specifies the target sequences(s).
[1],[2] [3],[4]
Quantitation may be performed using competitive or real-time PCR .
A quantitative analysis should clearly express the quantity of the target genetic element, relative to the
quantity of a specific reference, appropriate calibrants and controls, and be within the dynamic range of the
analytical method used and the test portion analysed.
The analysis generally consists of
⎯ amplification of one or more specific target sequences,
⎯ detection and confirmation of the specificity of the PCR product(s), and
⎯ quantitation of the amplified fragments relative to calibrants.
NOTE In the case of real-time PCR analysis, amplification, detection and confirmation occur simultaneously.
4.2 Amplification, detection and confirmation of PCR products
See ISO 21569 for the principles of amplification, detection and confirmation of the DNA sequences.
4.3 Quantitation of PCR products
The principle of quantitation is usually to determine the ratio (expressed as a percent) of two DNA target
sequences; i.e. a sequence representing the genetically modified organism of interest and an (endogenous)
target taxon-specific sequence. However, in some cases, quantitation can also be carried out relative to a
specified amount of food matrix (e.g. when detecting GM microorganisms in foods).
Calibrants (calibration materials) used for quantitation should be traceable to certified reference materials
(CRMs), if available. If not available, other suitable reference material should be used. Example guidance is
provided in Reference [5]. Information on validation studies and measurement uncertainty has been gathered
[6],[7],[8],[9]
from international studies .
5 Reagents
All reagents and materials used in the analysis should be identical, or equivalent, to those specified in the
method. Otherwise, all reagents and materials should be of molecular biology grade. These reagents shall be
stored and used as recommended by the supplier or according to the laboratory quality assurance
specifications. For a list of reagents, see the specific annex.
6 Apparatus and equipment
See Annexes A to D and ISO 24276.
2 © ISO 2005 – All rights reserved
7 Guidelines concerning the procedure
7.1 General
General considerations relevant to PCR amplification for the detection of GMOs are described in ISO 21569.
Annexes A to D specify PCR detection methods together with details of their scope of application. The
demonstrated performance characteristics for each method are detailed.
The concentration of the DNA sequence of interest should be within the dynamic range of the method.
NOTE A target taxon specific monitor run can be undertaken to determine whether the template DNA is of sufficient
quality (length and structural integrity), purity and quantity to allow the detection and quantitation of a GMO belonging to
the target taxon. This may be of particular relevance when DNA is extracted from composite or highly processed matrices.
The DNA extracted from each test portion should be analysed at least in duplicate.
Appropriate controls shall be included (see ISO 24276:—, Table 1).
7.2 Target sequence stability
The allelic and copy number stability of the target sequence should be considered for cultivars of different
geographic and phylogenic origins.
7.3 Calibration of the analysis
An appropriate number of calibration points and replicates covering the range of quantitation shall be applied
[e.g. four calibration points with two replicates (altogether 4 × 2 values) or six calibration points with one
measurement at each point (altogether 6 values)]. The quality of the calibration influences the measurement
[9]
uncertainty .
As an alternative to genomic DNA calibration reference materials, for example, a dilution series of a plasmid
or synthetic dsDNA containing the target sequence may be used, provided that it is demonstrated to perform
in an equivalent way to the genomic DNA reference material and the genomic DNA extracted from the sample.
7.4 Quantitation considerations
PCR methods should be appropriately designed to minimize the variability.
NOTE Depending on the method used and/or the material analysed, the presence of stacked genes can lead to
overestimation of the true GMO content.
For the determination of the limit of quantitation (LOQ), see ISO 24276.
Calculation of the GMO content based on copy numbers of target sequences per haploid genome is
influenced by the homo- and heterozygosity of the species under investigation. For details, see Annexes A to
D.
Use of the ∆∆C (cycle of threshold) method is only valid if the amplification efficiencies of the target
t
taxon-specific assay and the GMO-specific assay are very similar.
7.5 Quality assurance requirements
Consistency between measurements is desirable to obtain reliable estimates of target sequence quantities.
However, knowledge of the relative standard deviation of repeatability of the method is required to establish
whether the measurements are consistent (see the ISO 5725 series for details). To calculate the relative
standard deviation of repeatability, the number of separate measurements per laboratory sample may exceed
what is feasible in practice in terms of acceptable costs. Consequently, if a specified GMO-derived DNA is to
be reported (in percent), a feasible solution should require the following as a minimum:
a) within test portion consistency:
⎯ through rejection of measurements
⎯ through maximum deviation observed between dilutions and individual measurements equals the
value expected from the corresponding dilution factor ± 33 %;
b) between test portion consistency:
⎯ estimated relative GMO-derived DNA concentrations obtained under a) for each test portion should
not differ by values greater than −50 % to +100 % of the estimated quantity value (equal to a ∆C of 1
t
in real-time PCR) (i.e. for two test portions, measurements of 1,0 % and 2,0 % are acceptable,
measurements of 0,9 % and 2,1 % are not).
In order to guarantee accuracy of the measurements, a reference material (RM), preferably certified (CRM),
for the quantity of the event concerned, with an appropriate level of metrological reliability and with reasonable
similarity of matrix shall be selected and analysed. In the absence of a CRM, in-house RM may be prepared
by a procedure demonstrating stability, homogeneity and traceability, and ensuring the absence of bias. The
quantified uncertainty shall fulfil the required uncertainty for the calibration (see ISO Guide 32).
8 Interpretation
The PCR result will be either
a) fit for quantitation of the target sequence provided
⎯ the result is positive according to ISO 21569:2005, 8.1,
⎯ the observable inhibition of the reaction is negligible,
⎯ the analysis produces an unambiguous measurement value,
⎯ the target sequence content is within the dynamic range of the method, and
⎯ the analysis is calibrated in an acceptable way (see 7.3), or
b) not fit for quantitation of the target sequence if any of the conditions listed above are not fulfilled.
The measurement uncertainty shall be sufficiently small to enable the laboratory to draw the relevant
conclusions.
Annexes A to D describe the measurement of the target DNA quantities. These quantities can be used to
calculate the GMO content. These calculations usually take into consideration relevant biological factors, such
as the homo- or heterozygosity of the target sequences.
If the GM target sequence content or the taxon-specific target sequence content is below the limit of
quantitation, the result shall only be expressed qualitatively.
NOTE Stating that the GMO-derived DNA content is below the practical LOQ accompanied by a specification of that
LOQ is considered to be a qualitative expression of the result.
9 Expression of results
The results shall clearly state the quantity of the GM target sequence relative to the target taxon-specific
sequence. The results should also provide values for the measurement uncertainty, such as the standard
4 © ISO 2005 – All rights reserved
deviation or relative standard deviation. Furthermore, the LOD and LOQ of the method and the practical LOD
and LOQ should be reported.
The target sequences may or may not be detected, or the quantity of at least one of them may be below the
limit of quantitation. Table 1 describes the four alternative cases and the corresponding expression of the
result to be included into the test report.
Table 1 — Expression of results
Result Expression of the result
Target taxon-specific sequence is not See ISO 21569.
detected.
“For species x, DNA was not detected.”
Target taxon-specific sequence is According to ISO 21569.
detected but GM target sequence is not
“For species x, GMO-derived DNA was not detected.”
detected.
In addition, if applicable, add: “The practical limit of detection is X %.”
(Specify unit used.)
The target taxon-specific sequence and For each GMO, state:
the GM target sequence are both detected
“GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by detection of
but the quantity is below the LOQ of at
(specify target sequence) derived from (specify species) was detected.”
least one of the target sequences.
In addition, if applicable: “The practical limit of quantitation is X %.” (Specify
unit used.)
The target taxon-specific sequence and For each GMO, state:
the GM target sequence are both detected
“The content of GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by
and the quantity is above the LOQ for both
detection of (specify target sequence) derived from (specify species) is
target sequences.
X ± uncertainty %.” (Specify unit used.)
The GMO-derived DNA content may also be reported as being above or below a specific value, taking into
account the measurement uncertainty.
10 Test report
The test report shall be written in accordance with ISO 24276 and ISO 21569 and shall contain at least the
following additional information:
a) LOQ of the method and the matrix used to establish it;
b) the practical LOQ;
c) a reference to the method which has been used for the extraction of DNA;
d) the reference material used;
e) the results expressed according to Clause 9.
Annex A
(informative)
Target taxon-specific methods
A.1 Target taxon-specific method for the absolute quantitation of the adh1 gene DNA
of maize using real-time PCR
A.1.1 Introduction
This annex describes a method for the specific amplification and quantitation of the taxon-specific
(housekeeping) maize (Zea mays) adh1 gene (coding for alcohol dehydrogenase 1) for determination of the
content of maize DNA, or for testing for the presence/absence of detectable PCR inhibitors in DNA solutions
extracted from products containing maize-derived DNA, e.g. foods.
For limitations, see A.1.8.
A.1.2 Validation status and performance characteristics
A.1.2.1 General
The method has been optimized for DNA extracted from pure ground maize kernels, maize leaves and
[10] [11]
certified reference materials (IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 series ) .
The reproducibility of the described method has been tested in a collaborative trial using unknown samples
(U1 to U6) consisting of wild type maize DNA at different corresponding copy number of the target sequence
(see A.1.2.2), and in other collaborative trials in combination with methods specific for GM maize events, e.g.
Bt11 (see D.1).
[11]
The copy number of the target sequence per haploid genome is estimated to be 1 .
[11]
The allelic stability of the target sequence has been established .
A.1.2.2 Collaborative trial
The method has been validated in a collaborative trial organized by the European Commission's Joint
Research Centre (EC-JRC), Institute for Health and Consumer Protection (IHCP), in agreement with the
[12]
international harmonized protocol .
[13]
Six samples (S1-S6) of wild type maize DNA (extracted from leaf material containing known absolute copy
numbers (183 486, 61 162, 20 387, 6 796, 2 265, 755) of haploid maize genomes were used to establish a
calibration curve for absolute quantitation of haploid maize genomes in unknown samples. The absolute copy
numbers in the known samples were determined by dividing the sample DNA mass (determined by
fluorometric quantitation of dsDNA with PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) by the published
[14]
average 1C value for maize genomes (2,725 pg) .
[13]
Six samples (U1-U6) of wild type maize DNA (extracted from leaf material ) were used as unknown
samples. The expected copy numbers in the unknown samples were determined in the same way as those of
the known samples.
The results of the collaborative trial validation are summarized in Table A.1
6 © ISO 2005 – All rights reserved
The method has also been validated in combination with event-specific methods for several maize GMO, e.g.
for Bt11 sweet maize. See References [15] and [16] and D.1 for details on the combined (relative quantitation)
trial.
Table A.1 — Validation data
Sample
U1 U2 U3 U4 U5 U6
Number of participating laboratories 12 12 12 12 12 12
Number of laboratories having returned results 10 10 10 10 10 10
Number of invalid laboratories 1 1 1 1 1 1
Number of retained laboratories 9 9 9 9 9 9
Number of samples per laboratory 4 4 4 4 4 4
Number of Cochran outliers 1 1 1 1 — —
Number of Grubbs outliers — 1 1 1 1 1
Number of accepted samples 35 34 34 34 35 35
Expected copy number value 7 339 18 349 36 697 55 046 91 743 146 788
Mean copy number value 9 985 23 885 46 918 75 161 100 541 122 080
Bias of true value (%) 36,1 30,2 27,9 36,5 9,6 −16,8
a
1 318,59 1 463,60 5 796,58 4 539,57 11 306,89 14 843,41
Repeatability standard deviation s
r
b
13,21 6,13 12,35 6,04 11,25 12,16
Repeatability relative standard deviation (%)
a
2 013,12 2 083,57 6 145,39 6 806,85 14 592,04 17 777,70
Reproducibility standard deviation s
R
b
20,16 8,72 13,10 9,06 14,51 14,56
Reproducibility relative standard deviation (%)
a
Expressed as copy number value.
b
Expressed as percentage of the mean value.
A.1.2.3 Molecular specificity
A.1.2.3.1 General
2)
The method has been designed to target a part of the sequence described in EMBL/GenBank/DDBJ
accession number X04050. This sequence is unique to Zea mays (maize/corn) and Zea mays subsp.
[11]
diploperennis (teosinte) .
A.1.2.3.2 Theoretical specificities
The theoretical specificities of the primers and probes were assessed through a search of the
2)
GenBank/EMBL/DDBJ databases using the nucleotide sequences as query sequences with the BLASTN
2)
programme at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ [October 9, 2003]. The result of the search confirmed a
complete identity only with the expected target sequences.
2) These are examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
A.1.2.3.3 Experimental determination of specificity
The specificity of the method was tested against a wide range of non-target taxa and 20 different maize lines
[11]
representing geographically and phylogenetically diverse samples . No cross-reactivity was observed with
the non-target taxa (except with teosinte Zea mays subsp. diploperennis, the wild ancestor of cultivated
[11], [17]
maize) . The copy number and allelic stability of the target sequence across different maize lines has
[11]
been established .
A.1.2.4 Optimization
® 3) ® 3)
This was carried out for the ABI PRISM 7700 sequence detection system (SDS) and TaqMan chemistry .
® 3)
Primer and probe design were done with Primer Express software (Applied Biosystems) .
A.1.2.5 Limit of detection (LOD)
[11]
According to method developer, the absolute LOD is 10 copies of the target sequence .
The lowest number of copies of the target sequence included in the collaborative trial was 7 399 copies of the
target sequence.
A.1.2.6 Limit of quantitation (LOQ)
[11]
According to the method developer, the absolute LOQ is 100 copies of the target sequence .
The lowest number of copies of the target sequence included in the collaborative trial was 7 399.
A.1.3 Adaptation
No specific information is available.
A.1.4 Principle
A 134 bp fragment of the adh1 gene is amplified using two maize adh1-specific primers (see Table A.2).
Accumulation of PCR products is measured at the end of each PCR cycle (real-time) by means of a maize
adh1-specific oligonucleotide probe (ADH1-MDO, see Table A.2) labelled with two fluorescent dyes: FAM as
® 3)
reporter dye and TAMRA as quencher. For that purpose, TaqMan chemistry was employed.
The measured fluorescence signal crosses a user-defined threshold value after a certain number of cycles.
This number is called the C -value. For quantitation of the amount of maize adh1-DNA in an unknown sample,
t
the C -value is converted into a corresponding copy number value by comparison with a calibration curve
t
whose C -values are directly linked with known copy numbers (regression analysis).
t
A.1.5 Reagents
A.1.5.1 General
For quality of reagents to be used, see ISO 24276:—, 6.6.
A.1.5.2 Water.
A.1.5.3 PCR buffer (without MgCl ), 10-fold.
3) These are examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
8 © ISO 2005 – All rights reserved
A.1.5.4 MgCl solution, c(MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
A.1.5.5 dNTP solution, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (each).
A.1.5.6 Oligonucleotides
Details of the oligonucleotides are listed in Table A.2.
Table A.2 — Oligonucleotides
Name Oligonucleotide DNA sequence Final concentration in PCR
ADH-FF3 5'-CgT CgT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3' 300 nmol/l
ADH-RR4 5'-CCA CTC CgA gAC CCT CAg TC-3' 300 nmol/l
a
ADH1-MDO 200 nmol/l
5'-FAM-AAT CAg ggC TCA TTT TCT CgC TCC TCA-TAMRA-3'
a
FAM: 6-carboxyfluorescein; TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine.
The length of the adh1 amplicon is 134 bp.
A.1.5.7 Thermostable DNA polymerase
® 4)
AmpliTaq Gold DNA polymerase .
A.1.5.8 Uracil N-glycosylase (optional).
A.1.5.9 Amplification reaction mixture
Details of the amplification reaction mixture are listed in Table A.3.
Table A.3 — Amplification reaction mixture in the final volume/concentration per reaction vial
Total reaction volume 25 µl
Template DNA (maximum 250 ng) 5 µl
Taq-DNA-polymerase
Decontamination system (dUTP included uracil N-glycosylase) ®
TaqMan Universal Master Mix 2X 12,5 µl (1 X)
a
Reaction buffer (containing passive reference ROX)
dNTP mix
Primers see Table A.2 see A.1.5.6
Probe see Table A.2 see A.1.5.6
a
ROX = carboxy-X-rhodamine.
4) These are examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
A.1.6 Apparatus
A.1.6.1 General
Standard laboratory apparatus should be used throughout unless otherwise specified.
A.1.6.2 Thermal cycler ®
The indicated temperature-time profile was originally tested with the ABI PRISM 7700 SDS (Applied
5)
Biosystems) . Other real-time PCR detection systems may be used after adaptation of the reaction
conditions.
A.1.6.3 Reaction vials
The reaction vials shall be suitable for PCR amplification on a real-time thermal cycler, e.g.
® ®
ABI PRISM 96-Well Optical Reaction Plate, or MicroAmp Optical Caps (8 caps/strip, flat) (Applied
5)
Biosystems) .
A.1.7 Procedure: PCR set-up
A.1.7.1 General
The PCR set-up for the reference gene target sequence and for the GMO target sequence should be carried
out in separate vials unless otherwise stated in the relevant GM target-specific annex.
The method is described for a total PCR volume of 25 µl per reaction mixture with the reagents as listed in
Table A.3.
A.1.7.2 PCR controls
If the controls do not yield the expected results, the test results shall be rejected and the analysis shall be
repeated.
As a positive control/calibration reference material, high-quality, pure genomic DNA extracted from maize (e.g.
5) [13]
a CRM from the JRC, IRMM ) may be used . Any other appropriate controls should be included as
described in ISO 24276.
A.1.7.3 Temperature-time programme ®
The temperature-time programme as outlined in Table A.4 was optimized for the ABI PRISM 7700 sequence
5)
detection system (SDS) (Applied Biosystems) . In the validation study, it was used in combination with the
® 5)
AmpliTaq Gold DNA polymerase . The use of other thermal cyclers may require specific adaptation. The
temperature and time required for enzyme activation depend on the particular polymerase used. Table A.4
describes the reaction conditions.
5) These are examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
10 © ISO 2005 – All rights reserved
Table A.4 — Procedure: Reaction conditions
Time Temperature
s °C
Pre-PCR: decontamination 120 50
Pre-PCR: activation of DNA polymerase and denaturation of template DNA 600 95
PCR (50 cycles)
Step 1 Denaturation 15 95
Step 2 Annealing elongation 60 60
A.1.8 Limitations and interpretation of the results
The presence of PCR inhibitors may have a strong impact on the accuracy of the estimated copy number of
the adh1 in the analysed samples. Therefore the absence of detectable PCR inhibitors should be verified (see
also ISO 21571:2005, Annex A), for example by setting up serial dilutions of the template DNA and examining
the correspondence between dilutions and differences in C (cycle of threshold) values (i.e. one C corresponds
t t
to a doubling of template concentration).
For the use of this method in combination with a method for the quantitation of GMO-derived DNA, it is
important that the absolute amount of template DNA (ng) be the same for both the adh1 PCR and the
GMO-specific PCR. If not, the absolute copy numbers of the reactions cannot be compared directly, and an
adjustment of the corresponding copy numbers is required. Otherwise a relative GMO concentration cannot
be calculated.
A.1.9 Calibration and calculation of results
Calibration points are produced with DNA containing defined amounts in absolute copy numbers of haploid
genomic maize DNA containing the target sequence.
A calibration curve is produced by plotting C -values against the logarithm of the target copy number for the
t
calibration points. This can be carried out, for example, by use of spread-sheet software such as Microsoft
6)
Excel , or directly by options available with the sequence detection system software.
The calibration curve is used to determine the absolute haploid genomic maize DNA copy numbers of the
unknown samples. Although the sample DNA can be degraded due to food processing or may contain
ingredients other than maize, this does not influence the calculated number of haploid genome copies of
unknown samples.
6) These are examples of suitable products available commercially. This information is only given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
Annex B
(informative)
Screening methods
B.1 Screening method for the relative quantitation of the 35S-promoter DNA of soya
bean line GTS 40-3-2 using real-time PCR
B.1.1 Introduction
This annex describes a method for the specific amplification and detection of a taxon-specific soya bean gene
(lectin gene, le1) and of the 35S-promoter DNA originating from the cauliflower mosaic virus, and for
quantitative determination of the amount of 35S-promoter DNA in soya bean ingredients containing genetically ®
modified soya bean line GTS 40-3-2 (Roundup Ready ).
For limitations, see B.1.8.
B.1.2 Validation status and performance characteristics
B.1.2.1 General
7) [18]
The method has been optimized for certified reference materials (CRM IRMM-410) consisting of dried
soya bean powder containing mixtures of GTS 40-3-2 and conventional soya bean.
The reproducibility of the described methods has been tested in collaborative trials using unknown samples
(samples labelled as SA to SE, see Table B.1) consisting of mixtures of reference materials of the type
[19] [20]
mentioned above . In addition, commercially available foodstuffs were tested .
[21], [22]
The copy numbers of each of the target sequences per genome have not been assessed in detail .
The method has been published in Reference [23].
B.1.2.2 Collaborative trial
Five unknown samples containing between 0,7 % and 3 % (mass fraction) of dried soya bean powder derived
from the line GTS 40-3-2 were analysed by eleven participants.
The 35S-promoter-specific detection method resulted in a reproducibility relative standard deviation in the
range of 17 % to 34 % (see Table B.1). During the initial experiments of the collaborative trial, it was
determined that the 1 % soya bean CRM was inconsistent with its designated value. Investigations revealed
that the diverging reference materials were manufactured using different procedures at different time points,
leading to different degrees of DNA degradation. The collaborative trial participants were advised during the
course of the collaborative trial to use the 2 % CRM and to dilute the DNA to get a 1 % reference DNA
solution for use in quantitation.
For DNA extraction, the procedure described in Reference [23] was used. In brief, 200 mg of the sample
material was lysed in 1 ml of guanidium hydrochloride//proteinase K buffer (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) at 56 °C for
7) These are examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
12 © ISO 2005 – All rights reserved
® 8)
3 h. After a RNase digestion step, 500 µl of the cleared extract was mixed with 1 ml of Wizard silica resin ®
8)
and the resin with bound DNA was recovered by aspiration through a Wizard filter column . After
isopropanol washing, the DNA was eluted from the silica resin in 10 mmol/l Tris buffer pH 9,0 at 70 °C. The
DNA concentration was estimated by OD measurement at 260 nm and adjusted to 20 µg/ml. For subsequent
PCR analysis, 200 ng of DNA from each sample was analysed in two independent reactions.
Samples were analysed in duplicate.
Since the samples labelled SA to SE were mixtures of these divergent standards, the results obtained with
these samples could not be used for the evaluation of the trueness of the applied real-time PCR method.
However the results could be used for assessing the precision of the applied method, whereby the described
circumstances reflect a worst-case scenario leading to an underestimation of the precision of the applied real-
[19]
time PCR method .
The exclusion of laboratories is based on the real-time PCR apparatus used and on the statistical calculation
of outliers. The method was developed for block thermal cyclers. Therefore, two laboratories using a
® 8)
LightCycler system were excluded before the calculation of outliers. The reason for the exclusion of a
specific type of PCR apparatus was the observation that the applied method needs careful adaptation and
o
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21570
Première édition
2005-11-01
Produits alimentaires — Méthodes
d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
quantitatives basées sur l'utilisation
des acides nucléiques
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid
based methods
Numéro de référence
©
ISO 2005
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2005
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2006
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. v
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Amplification, détection et confirmation des produits PCR. 2
4.3 Quantification des produits PCR . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et équipements. 2
7 Lignes directrices relatives au mode opératoire. 3
7.1 Généralités . 3
7.2 Stabilité de la séquence cible. 3
7.3 Étalonnage de l'analyse . 3
7.4 Considérations relatives à la quantification . 3
7.5 Exigences relatives à l'assurance qualité . 4
8 Interprétation. 4
9 Expression des résultats . 5
10 Rapport d'essai . 5
Annexe A (informative) Méthodes spécifiques du taxon cible . 6
A.1 Méthode spécifique du taxon cible pour la quantification absolue de l'ADN du gène adh1
du maïs par PCR en temps réel. 6
Annexe B (informative) Méthodes de criblage . 13
B.1 Méthode de criblage pour la quantification relative de l'ADN du promoteur 35S de la
lignée de soja GTS 40-3-2 par PCR en temps réel. 13
Annexe C (informative) Méthodes construit-spécifiques du gène. 21
C.1 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de soja
GTS 40-3-2 par PCR en temps réel (Méthode 1) . 21
C.2 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de soja
GTS 40-3-2 par PCR en temps réel (Méthode 2) . 28
C.3 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de maïs
Événement176 par PCR en temps réel . 36
C.4 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de soja
GTS 40-3-2 par PCR en temps réel. 43
C.5 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs
MON 810 par PCR en temps réel . 52
C.6 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs
Événement176 par PCR en temps réel . 60
C.7 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs
Bt11 par PCR en temps réel. 68
C.8 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs
GA21 par PCR en temps réel . 76
C.9 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs
T25 par PCR en temps réel . 84
Annexe D (informative) Méthodes événement-spécifiques. 93
D.1 Méthode événement-spécifique pour la quantification absolue et relative de l'ADN de la
lignée de maïs Bt11 par PCR en temps réel. 93
D.2 Méthode événement-spécifique pour la quantification relative de l'ADN de la lignée
de maïs MON 810 par PCR en temps réel. 100
Bibliographie . 107
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21570 a été élaborée par le Comité européen de normalisation (CEN), le comité technique CEN/TC 275,
Analyse des produits alimentaires — Méthodes horizontales, en collaboration avec le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, conformément à l'Accord sur la coopération technique entre l'ISO et le CEN
(Accord de Vienne).
Introduction
La recherche d'ingrédients d'origine génétiquement modifiée est réalisée au moyen des étapes successives
(ou simultanées) suivantes. Après la collecte d'échantillons, des acides nucléiques sont extraits de la prise
d'essai. Les acides nucléiques extraits peuvent faire l'objet d'une purification plus poussée au cours du
processus d'extraction ou une fois ce dernier achevé. Ensuite, ils sont quantifiés (si besoin est), dilués (si
besoin est) et soumis à des modes opératoires analytiques (comme la PCR). Ces étapes sont décrites en
détail dans la présente Norme internationale et dans les Normes internationales suivantes:
ISO 21569, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
ISO 21570, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
D'autres informations concernant les définitions et les aspects généraux évoqués dans les étapes ci-avant
sont réunies dans:
ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
L'Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l'attention sur le fait que la conformité avec le
présent document peut impliquer l'utilisation d'un brevet relatif à la technologie PCR.
L'ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d'application du droit de
propriété industrielle concerné.
L'ISO a été informée qu'Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. et Hoffman-La Roche détiennent
des droits de propriété industrielle relatifs à la technologie PCR. Ces sociétés ont garanti à l'ISO qu'elles
souhaitent négocier des licences à des conditions raisonnables et non discriminatoires avec les demandeurs
du monde entier. À cet égard, les déclarations des détenteurs de ces droits de propriété industrielle sont
enregistrées auprès de l'ISO. Il est possible d'obtenir des informations aux adresses suivantes:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404,
États-Unis
et
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501,
États-Unis
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de droits
de propriété industrielle ou de droits analogues autres que ceux identifiés ci-avant. L'ISO ne saurait être tenue
pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
vi © ISO 2005 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 21570:2005(F)
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation
des acides nucléiques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale fournit un cadre général auquel doit satisfaire toute méthode quantitative de
détection des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans les produits alimentaires utilisant la PCR
(réaction de polymérisation en chaîne).
Elle définit les exigences générales relatives à l'amplification spécifique de séquences cibles d'ADN, afin de
quantifier la teneur relative en ADN dérivé d'OGM et de confirmer l'identité de la séquence d'ADN amplifiée.
Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans la présente
Norme internationale ont pour but de garantir l'obtention de résultats comparables, exacts et reproductibles,
dans différents laboratoires.
La présente Norme internationale a été élaborée pour les matrices de produits alimentaires, mais elle est
aussi applicable à d'autres matrices, par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes
issus de l'environnement.
Des exemples de méthodes spécifiques figurent dans les Annexes A à D.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 21569:2005, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
1)
ISO 24276:— , Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
ISO Guide 32, Étalonnage en chimie analytique et utilisation de matériaux de référence certifiés
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 24276 s'appliquent.
1) Paru depuis la publication de la version anglaise du présent document.
4 Principe
4.1 Généralités
Une analyse quantitative consiste à dénombrer les séquences d'ADN cibles dans les échantillons pour essai.
Chaque méthode spécifie la ou les séquence(s) cible(s).
[1], [2] [3], [4]
Cette quantification peut être réalisée en utilisant une PCR compétitive ou en temps réel .
Il convient qu'une analyse quantitative indique clairement la quantité de l'élément génétique cible, rapportée à
la quantité d'une référence spécifique, de matériaux pour l'étalonnage et de témoins appropriés et qu'elle soit
comprise dans les limites de la plage dynamique de la méthode analytique utilisée et de la prise d'essai
analysée.
L'analyse comprend généralement
⎯ l'amplification d'une ou de plusieurs séquences cibles spécifiques,
⎯ la détection et la confirmation de la spécificité du ou des produit(s) PCR et
⎯ la quantification des fragments amplifiés par rapport aux matériaux pour l'étalonnage.
NOTE Dans les analyses par PCR en temps réel, l'amplification, la détection et la confirmation sont simultanées.
4.2 Amplification, détection et confirmation des produits PCR
Pour les principes d'amplification, de détection et de confirmation des séquences d'ADN, se référer à
l'ISO 21569.
4.3 Quantification des produits PCR
Le principe de la quantification consiste généralement à déterminer le rapport (exprimé en pourcentage) de
deux séquences d'ADN cibles, l'une représentant l'organisme génétiquement modifié visé et l'autre étant
spécifique (endogène) du taxon ciblé. Cependant, dans certains cas, la quantification peut également être
rapportée à une quantité spécifiée de matrice de produit alimentaire (par exemple lors de la détection de
micro-organismes génétiquement modifiés dans les produits alimentaires).
Il convient de relier les matériaux pour l'étalonnage utilisés pour la quantification à des matériaux de référence
certifiés (MRC), quand ceux-ci sont disponibles. Si ce n'est pas le cas, il convient d'utiliser d'autres matériaux
de référence appropriés. Voir l'exemple fourni dans la Référence [5]. Les informations relatives aux études de
[6], [7], [8], [9]
validation et à l'incertitude de mesure ont été rassemblées dans le cadre d'études internationales .
5 Réactifs
Il convient que tous les réactifs et matériaux utilisés dans l'analyse soient identiques ou équivalents à ceux
spécifiés dans la méthode. En l'absence de spécification, il convient que tous les réactifs et matériaux soient
de qualité «biologie moléculaire». Ces réactifs doivent être conservés et utilisés selon les recommandations
du fournisseur ou conformément aux spécifications d'assurance qualité du laboratoire. Une liste des réactifs
est donnée dans une annexe spécifique.
6 Appareillage et équipements
Voir les Annexes A à D et l'ISO 24276.
2 © ISO 2005 – Tous droits réservés
7 Lignes directrices relatives au mode opératoire
7.1 Généralités
Les principes généraux concernant l'amplification par PCR pour la détection des OGM sont décrits dans
l'ISO 21569.
Les Annexes A à D spécifient les méthodes de détection PCR ainsi que les détails de leur domaine
d'application. Les caractéristiques de performance démontrées pour chaque méthode sont exposées en détail.
Il convient que la concentration de la séquence d'ADN visée soit comprise dans les limites de la plage
dynamique de la méthode.
NOTE Une séquence de surveillance spécifique du taxon cible peut être réalisée pour déterminer si la matrice d'ADN
est de qualité (longueur et intégrité structurale), de pureté et de quantité suffisantes pour permettre la détection et la
quantification d'un OGM appartenant au taxon cible. Cela peut se révéler particulièrement important lorsque l'ADN est
extrait de matrices composites ou très transformées.
Il convient de répéter au moins une fois les analyses de l'ADN extrait de chaque prise d'essai.
Des témoins appropriés doivent être inclus (voir l'ISO 24276, Tableau 1).
7.2 Stabilité de la séquence cible
Si des cultivars d'origines géographiques et phylogénétiques différentes sont utilisés, il convient de prendre
en compte l'invariance en nombre de copies et l'invariance allélique des séquences cibles.
7.3 Étalonnage de l'analyse
Pour couvrir la plage de quantification, on doit utiliser un nombre approprié de points d'étalonnage et de
répétitions [par exemple quatre points d'étalonnage avec deux répétitions (au total 4 × 2 valeurs) ou six points
d'étalonnage avec un mesurage à chaque point (au total 6 valeurs)]. La qualité de l'étalonnage a un impact
[9]
direct sur l'incertitude de mesure .
Pour remplacer les matériaux de référence pour l'étalonnage d'ADN génomique, il est possible d'utiliser, par
exemple, une série de dilutions d'un ADNdb plasmidique ou synthétique contenant la séquence cible, à
condition de démontrer que la méthode d'action de la série est équivalente à celle du matériau de référence
d'ADN génomique ou de l'ADN génomique prélevé sur l'échantillon.
7.4 Considérations relatives à la quantification
Il convient de concevoir les méthodes PCR de manière à réduire le plus possible la variabilité.
NOTE Selon la méthode utilisée et/ou le matériau analysé, la présence d'un empilage de gènes peut mener à une
surévaluation de la teneur réelle en OGM.
Pour la détermination de la limite de quantification (LQ), se référer à l'ISO 24276.
L'homozygosité et l'hétérozygosité de l'espèce étudiée a un impact direct sur le calcul de la teneur en OGM
basé sur les nombres de copies des séquences cibles par génome haploïde. Pour plus de détails, voir les
Annexes A à D.
L'utilisation de la méthode ∆∆C (du cycle seuil) est valable uniquement si les rendements d'amplification du
t
dosage cible spécifique du taxon et du dosage d'OGM spécifique sont fortement similaires.
7.5 Exigences relatives à l'assurance qualité
Pour obtenir des estimations fiables des quantités de séquences cibles, il est souhaitable que les mesurages
soient cohérents. Cependant, pour déterminer la cohérence des mesurages (pour plus de détails, voir
l'ISO 5725), l'écart-type relatif de répétabilité de la méthode doit être connu. Pour calculer l'écart-type relatif
de répétabilité, le nombre de mesurages distincts par échantillon de laboratoire peut dépasser ce qui est
réalisable dans la pratique en termes de coûts acceptables. En conséquence, si un ADN dérivé d'OGM
spécifié doit être consigné (en pour-cent), il convient de prendre en compte les exigences minimales
suivantes pour trouver une solution réaliste:
a) dans la cohérence de la prise d'essai:
⎯ les mesurages < LQ doivent être rejetés; et
⎯ l'écart maximal observé entre les dilutions et les mesurages individuels doit être égal à la valeur
attendue du facteur de dilution correspondant ± 33 %;
b) entre la cohérence de la prise d'essai:
⎯ il convient que les concentrations relatives estimées d'ADN dérivé d'OGM obtenues en a) pour
chaque prise d'essai ne présentent pas de valeurs supérieures à −50 % ou à +100 % de la quantité
estimée (égale à un ∆C de 1 dans la PCR en temps réel) (en d'autres termes, pour deux prises
t
d'essai, des mesurages de 1,0 % et de 2,0 % sont acceptables alors que des mesurages de 0,9 % et
de 2,1 % ne le sont pas).
Afin de garantir l'exactitude des mesurages, un matériau de référence (MR), de préférence certifié (MRC)
pour la quantité de l'événement concerné avec un niveau approprié de fiabilité métrologique et une similarité
raisonnable de matrice doit être sélectionné et analysé. En l'absence d'un MRC, il est possible de préparer un
MR validé en laboratoire par le biais d'un mode opératoire ayant démontré sa stabilité, son homogénéité et sa
traçabilité et garantissant l'absence de biais. L'incertitude quantifiée doit satisfaire l'incertitude requise pour
l'étalonnage (voir ISO Guide 32).
8 Interprétation
Le résultat de la PCR sera
a) adapté à la quantification de la séquence cible, à condition que
⎯ le résultat soit positif conformément au paragraphe 8.1 de l'ISO 21569:2005,
⎯ l'inhibition observable de la réaction soit négligeable,
⎯ l'analyse produise une valeur de mesurage sans ambiguïté,
⎯ la teneur de la séquence cible soit comprise dans les limites de la plage dynamique de la méthode,
et que
⎯ l'analyse soit étalonnée de façon acceptable (voir en 7.3), ou
b) ne sera pas adapté à la quantification de la séquence cible si l'une quelconque des conditions
énumérées ci-avant n'est pas satisfaite.
L'incertitude de mesure doit être suffisamment faible pour que le laboratoire puisse tirer les conclusions
appropriées.
Le mesurage des quantités d'ADN cibles est décrit dans les Annexes A à D. Ces quantités peuvent être
utilisées pour calculer la teneur en OGM. Ces calculs tiennent généralement compte des facteurs biologiques
pertinents comme l'homozygosité ou l'hétérozygosité des séquences cibles.
Si la teneur de la séquence cible génétiquement modifiée ou de la séquence cible spécifique du taxon est
inférieure à la limite de quantification, les résultats doivent être exprimés uniquement qualitativement.
4 © ISO 2005 – Tous droits réservés
NOTE Le fait d'indiquer que la teneur en ADN dérivé d'OGM est inférieure à la LQ pratique et de spécifier cette LQ
est considéré comme une expression qualitative du résultat.
9 Expression des résultats
Les résultats doivent clairement établir la quantité de la séquence cible génétiquement modifiée rapportée à la
séquence spécifique du taxon cible. Il convient également que les résultats fournissent des valeurs pour
l'incertitude de mesure telles que l'écart-type ou l'écart-type relatif. En outre, il convient que la limite de
détection (LD) et la limite de quantification (LQ) de la méthode ainsi que la LD et la LQ pratiques soient
documentées.
Les séquences cibles peuvent ou non être détectées, ou la quantité d'au moins l'une d'entre elles peut être
inférieure à la limite de quantification. Le Tableau 1 décrit les quatre cas possibles et l'expression du résultat
correspondante qui doit être incluse dans le rapport d'essai.
Tableau 1 — Expression des résultats
Résultat Expression du résultat
Séquence spécifique du taxon cible non Voir l'ISO 21569.
détectée.
«ADN non détecté pour l'espèce x.»
Séquence spécifique du taxon cible Conformément à l'ISO 21569.
détectée mais séquence cible
«ADN dérivé d'OGM non détecté pour l'espèce x».
génétiquement modifiée non détectée.
De plus, si nécessaire, ajouter: «La limite de détection pratique est X %.»
(Spécifier l'unité utilisée.)
La séquence spécifique du taxon cible et Pour chaque OGM, indiquer:
la séquence cible génétiquement modifiée
«ADN dérivé d'OGM (spécifier l'OGM) tel que déterminé par la détection de
sont toutes les deux détectées, mais leur
(spécifier la séquence cible) dérivée de (spécifier l'espèce) a été détecté.»
quantité est inférieure à la limite de
quantification d'au moins l'une des De plus, si nécessaire: «La limite de quantification pratique est X %.»
(Spécifier l'unité utilisée.)
séquences cibles.
La séquence spécifique du taxon cible et Pour chaque OGM, indiquer:
la séquence cible génétiquement modifiée
«La teneur en ADN dérivé d'OGM (spécifier l'OGM) telle que déterminée par
sont toutes les deux détectées et leur
la détection de (spécifier la séquence cible) dérivée de (spécifier l'espèce)
quantité est supérieure à la limite de
est X ± incertitude %.» (Spécifier l'unité utilisée.)
quantification des deux séquences cibles.
La teneur en ADN dérivé d'OGM peut également être déclarée comme étant supérieure ou inférieure à une
valeur spécifique, en prenant en compte l'incertitude de mesure.
10 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit être rédigé conformément à l'ISO 24276 et à l'ISO 21569 et doit contenir au moins les
informations complémentaires suivantes:
a) la LQ de la méthode et la matrice utilisée pour déterminer cette dernière;
b) la LQ pratique;
c) une référence à la méthode utilisée pour l'extraction de l'ADN;
d) le matériau de référence utilisé;
e) les résultats exprimés conformément à l'Article 9.
Annexe A
(informative)
Méthodes spécifiques du taxon cible
A.1 Méthode spécifique du taxon cible pour la quantification absolue de l'ADN du
gène adh1 du maïs par PCR en temps réel
A.1.1 Introduction
La présente annexe décrit une méthode d'amplification et de quantification spécifiques du gène adh1 (codant
pour l'alcool déshydrogénase 1) du maïs (Zea mays) spécifique du taxon (domestique) pour la détermination
de la teneur en ADN du maïs ou pour l'analyse visant à déterminer la présence/l'absence d'inhibiteurs de PCR
détectables dans les solutions d'ADN extraites des produits contenant un ADN dérivé du maïs, par exemple
les produits alimentaires.
Pour les limites, voir en A.1.8.
A.1.2 Statut de la méthode et caractéristiques de performance
A.1.2.1 Généralités
La méthode a été optimisée pour l'ADN extrait de grains de maïs broyés purs, de feuilles de maïs et de
[10] [11]
matériaux de référence certifiés (MRC) (séries IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 ) .
La reproductibilité de la méthode décrite a été éprouvée lors d'un essai comparatif interlaboratoires, utilisant
des échantillons inconnus (de U1 à U6) consistant en un ADN de maïs de type sauvage dans un nombre
différent de copies correspondant de la séquence cible (voir en A.1.2.2), et lors d'autres essais comparatifs
interlaboratoires associés à des méthodes spécifiques aux événements de maïs génétiquement modifié tels
que le Bt11 (voir en D.1).
[11]
Le nombre de copies de la séquence cible par génome haploïde est estimé à 1 .
[11]
L'invariance allélique de la séquence cible a été établie .
A.1.2.2 Essai comparatif interlaboratoires
La méthode a été validée lors d'un essai comparatif interlaboratoires mis en place par le «Joint Research
Centre (EC-JRC)» de la Commission européenne, l'«Institute for Health and Consumer Protection (IHCP)» en
[12]
accord avec le protocole harmonisé international .
[13]
Six échantillons (S1-S6) d'ADN de maïs de type sauvage, extraits d'une feuille contenant des nombres de
copies absolus connus (183 486, 61 162, 20 387, 6 796, 2 265, 755) de génomes de maïs haploïde, ont été
utilisés pour établir une courbe d'étalonnage pour la quantification absolue de ces mêmes génomes dans des
échantillons inconnus. Les nombres de copies absolus dans les échantillons connus ont été déterminés en
divisant la masse d'ADN de l'échantillon (déterminée par la quantification fluorimétrique de l'ADNdb en
utilisant PicoGreen, Molecular Probes, numéro de Cat. P-7589) par la valeur moyenne publiée 1C pour les
[14]
génomes de maïs (2,725 pg) .
[13]
Six échantillons (U1-U6) d'ADN de maïs de type sauvage (extrait de la feuille ) ont été utilisés comme
échantillons inconnus. Les nombres de copies attendus dans les échantillons inconnus ont été déterminés de
la même manière que ceux des échantillons connus.
6 © ISO 2005 – Tous droits réservés
Le Tableau A.1 récapitule les résultats de la validation de l'essai comparatif interlaboratoires.
La méthode a également été validée en combinaison avec des méthodes événement-spécifiques pour
plusieurs OGM de maïs, par exemple pour le maïs doux Bt11. Voir les Références [15] et [16] et en D.1 pour
obtenir des détails relatifs à l'essai (de quantification relative) combiné.
Tableau A.1 — Données de validation
Échantillon
U1 U2 U3 U4 U5 U6
Nombre de laboratoires participants 12 12 12 12 12 12
Nombre de laboratoires ayant transmis
des résultats 10 10 10 10 10 10
Nombre de laboratoires non valides 1 1 1 1 1 1
Nombre de laboratoires retenus 9 9 9 9 9 9
Nombre d'échantillons par laboratoire 4 4 4 4 4 4
Nombre de valeurs aberrantes lors du test
de Cochran 1 1 1 1 — —
Nombre de valeurs aberrantes lors du test
de Grubbs — 1 1 1 1 1
Nombre d'échantillons acceptés 35 34 34 34 35 35
Valeur du nombre de copies attendue 7 339 18 349 36 697 55 046 91 743 146 788
Valeur du nombre de copies moyenne 9 985 23 885 46 918 75 161 100 541 122 080
Biais de la valeur vraie (%) 36,1 30,2 27,9 36,5 9,6
−16,8
a
1 318,59 1 463,60 5 796,58 4 539,57 11 306,89 14 843,41
Écart-type de répétabilité s
r
b
13,21 6,13 12,35 6,04 11,25 12,16
Écart-type relatif de répétabilité (%)
a
2 013,12 2 083,57 6 145,39 6 806,85 14 592,04 17 777,70
Écart-type de reproductibilité s
R
b
20,16 8,72 13,10 9,06 14,51 14,56
Écart-type relatif de reproductibilité (%)
a
Exprimé en valeur de nombre de copies.
b
Exprimé en pourcentage de la valeur moyenne.
A.1.2.3 Spécificité moléculaire
A.1.2.3.1 Généralités
2)
La méthode a été conçue pour détecter un fragment de la séquence décrite dans EMBL/GenBank/DDBJ
sous la référence X04050. Cette séquence est propre au Zea mays (maïs) et au Zea mays subsp.
[11]
diploperennis (téosinte) .
A.1.2.3.2 Spécificités théoriques
Les spécificités théoriques des amorces et des sondes ont été évaluées grâce à une recherche dans les
2)
bases de données GenBank/EMBL/DDBJ , en utilisant comme séquences de recherche celles des
2)
nucléotides avec le logiciel BLASTN à l'adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ [9 octobre 2003]. Le
résultat de cette recherche a confirmé l'identité complète avec les séquences cibles attendues.
2) Il s'agit d'exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée pour la
commodité des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne constitue pas une approbation par l'ISO des produits
ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils permettent d'obtenir des résultats
similaires.
A.1.2.3.3 Détermination expérimentale de la spécificité
La spécificité de la méthode a été soumise à essai avec une large gamme de taxons non cibles et vingt
lignées de maïs différentes, représentant des échantillons divers d'un point de vue géographique et
[11]
phylogénétique . Aucune réaction croisée n'a été observée dans les taxons non cibles (à l'exception de la
[11], [17]
téosinte Zea mays subsp. diploperennis, l'ancêtre sauvage du maïs cultivé) . L'invariance en nombre
de copies et l'invariance allélique de la séquence cible dans différentes lignées de maïs ont été
[11]
déterminées .
A.1.2.4 Optimisation
® 3)
L'optimisation a été effectuée pour le système de détection de séquence (SDS) ABI PRISM 7700 et la
® 3)
chimie TaqMan . La conception de l'amorce et de la sonde a été effectuée à l'aide du logiciel Primer
® 3)
Express (Applied Biosystems) .
A.1.2.5 Limite de détection (LD)
[11]
Selon le laboratoire à l'initiative de cette méthode, la LD absolue est de 10 copies de la séquence cible .
Le plus petit nombre de copies de la séquence cible inclus dans l'essai comparatif interlaboratoires était de
7 399 copies.
A.1.2.6 Limite de quantification (LQ)
[11]
Selon le laboratoire à l'initiative de la méthode, la LQ absolue est de 100 copies de la séquence cible .
Le plus petit nombre de copies de la séquence cible inclus dans l'essai comparatif interlaboratoires était
de 7 399.
A.1.3 Adaptation
Aucune information spécifique n'est disponible.
A.1.4 Principe
Un fragment de 134 bp issu du gène adh1 est amplifié en utilisant deux amorces spécifiques de l'adh1 du
maïs (voir le Tableau A.2). L'accumulation des produits PCR est mesurée à la fin de chaque cycle de PCR
(en temps réel) au moyen d'une sonde oligonucléotidique spécifique de l'adh1 (ADH1-MDO, voir le
Tableau A.2) marquée par deux fluorochromes; le FAM est utilisé comme rapporteur et le TAMRA est utilisé
® 3)
comme «quencher». À cet effet, la chimie TaqMan a été utilisée.
Le signal de fluorescence mesuré dépasse une valeur seuil définie par l'utilisateur après un certain nombre de
cycles. Ce nombre est appelé valeur de C . Pour la quantification de la quantité d'ADN du adh1 du maïs dans
t
un échantillon inconnu, la valeur du C est convertie en une valeur du nombre de copies correspondante par
t
comparaison avec une courbe d'étalonnage dont les valeurs de C sont directement liées aux nombres de
t
copies connus (analyse de régression).
3) Il s'agit d'exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée pour la
commodité des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne constitue pas une approbation par l'ISO des produits
ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils permettent d'obtenir des résultats
similaires.
8 © ISO 2005 – Tous droits réservés
A.1.5 Réactifs
A.1.5.1 Généralités
Pour déterminer la qualité des réactifs à utiliser, voir le paragraphe 6.6 de l'ISO 24276.
A.1.5.2 Eau.
A.1.5.3 Tampon PCR (sans MgCl ), 10 fois.
A.1.5.4 Solution de MgCl , c(MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
A.1.5.5 Solution de dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (chaque).
A.1.5.6 Oligonucléotides
Le Tableau A.2 présente les informations concernant les oligonucléotides.
Tableau A.2 — Oligonucléotides
Nom Séquence d'ADN oligonucléotidique Concentration finale en PCR
ADH-FF3 5'-CgT CgT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3' 300 nmol/l
ADH-RR4 5'-CCA CTC CgA gAC CCT CAg TC-3' 300 nmol/l
a
ADH1-MDO 200 nmol/l
5'-FAM-AAT CAg ggC TCA TTT TCT CgC TCC TCA-TAMRA-3'
a
FAM: 6-carboxyfluorescéine; TAMRA: 6-carboxytétraméthylrhodamine.
La taille de l'amplicon de l'adh1 est de 134 bp.
A.1.5.7 ADN polymérase thermostable
4) ®
ADN polymérase AmpliTaq Gold
4) Il s'agit d'exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée pour la
commodité des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne constitue pas une approbation par l'ISO des produits
ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils permettent d'obtenir des résultats
similaires.
A.1.5.8 Uracile N-glycosylase (facultatif).
A.1.5.9 Mélange réactionnel d'amplification
Le Tableau A.3 présente les informations concernant le mélange réactionnel d'amplification.
Tableau A.3 — Mélange réactionnel d'amplification dans la concentration/le volume final(e)
par tube à réactions
Volume réactionnel total 25 µl
Matrice d'ADN (maximum 250 ng) 5 µl
ADN polymérase Taq
Système de décontamination (dUTP uracile N-glycosylase) ®
TaqMan Universal
12,5 µl (1×)
a
Master Mix 2×
Tampon de réaction (contenant du ROX comme référence passive)
Mélange dNTP
Amorces Voir le Tableau A.2 Voir en A.1.5.6
Sonde Voir le Tableau A.2 Voir en A.1.5.6
a
ROX = Carboxy- X-rhodamine.
A.1.6 Appareillage
A.1.6.1 Généralités
Sauf spécification contraire, il convient d'utiliser, tout au long des essais, un appareillage de laboratoire
courant.
A.1.6.2 Thermocycleur ®
À l'origine, le profil température-temps indiqué a été soumis à essai avec un SDS ABI PRISM 7700 (Applied
5)
Biosystems) . Il est possible d'utiliser d'autres systèmes de détection PCR en temps réel, après adaptation
des conditions de réaction.
A.1.6.3 Tubes à réactions
Les tubes à réactions doivent être adaptés à l'amplification par PCR avec un thermocycleur en temps réel, par
® ®
exemple un ABI PRISM pour plaques de 96 puits ou des bouchons optiques MicroAmp (8 bouchons/bande,
5)
plat) (Applied Biosystems) .
A.1.7 Mode opératoire: réaction PCR
A.1.7.1 Généralités
Pour la séquence cible du gène de référence comme pour la séquence cible de l'OGM, il convient que la
réaction PCR soit réalisée dans des tubes séparés, sauf spécification contraire indiquée dans l'annexe
spécifique de la cible génétiquement modifiée.
La méthode est décrite pour un volume de PCR total de 25 µl par mélange réactionnel, les réactifs utilisés
étant énumérés dans le Tableau A.3.
5) Il s'agit d'exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée pour la
commodité des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne constitue pas une approbation par l'ISO des produits
ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils permettent d'obtenir des résultats
similaires.
10 © ISO 2005 – Tous droits réservés
A.1.7.2 Témoins de PCR
Si les témoins ne donnent pas les résultats attendus, les résultats d'essai doivent être rejetés et l'analyse doit
être répétée.
6)
Un ADN génomique pur, de grande qualité, extrait du maïs [par exemple un MRC du JRC, IRMM ] peut être
[13]
utilisé comme témoin positif/matériau de référence pour l'étalonnage . Il convient d'inclure tout autre témoin
approprié comme indiqué dans l'ISO 24276.
A.1.7.3 Programme d'amplification
Le programme d'amplification indiqué dans le Tableau A.4 a été optimisé pour le système de détection de
® 6)
séquence (SDS) ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) . Dans l'étude de validation, il a été utilisé en
® 6)
combinaison avec l'ADN polymérase AmpliTaq Gold . L'utilisation d'autres thermocycleurs peut nécessiter
une adaptation spécifique. La température et le temps requis pour l'activation d'enzyme dépend de la
polymérase particulière utilisée. Le Tableau A.4 décrit les conditions de réaction.
Tableau A.4 — Mode opératoire: conditions de réaction
Temps Température
s
°C
Pré-PCR: décontamination 120 50
Pré-PCR: activation de l'ADN polymérase et dénaturation de la matrice d'ADN 600 95
PCR (50 cycles)
Étape 1 Dénaturation 15 95
Étape 2 60 60
Hybridation et élongation
A.1.8 Limites et interprétation des résultats
La présence d'inhibiteurs de PCR peut largement impacter l'exactitude du nombre de copies estimé de l'adh1
dans les échantillons analysés. En conséquence, il convient de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR
détectables (voir également l'Annexe A de l'ISO 21571:2005), par exemple en mettant en place des dilutions
en série de la matrice d'ADN et en examinant la correspondance entre les dilutions et les différences au
niveau des valeurs (du cycle seuil) C (c'est-à-dire qu'une C correspond à une duplication de la concentration
t t
de la matrice).
Pour utiliser cette méthode en combinaison avec une méthode de quantification de l'ADN dérivé d'OGM, il est
important que la quantité absolue de matrice d'ADN (ng) soit identique pour la PCR de l'adh1 et pour la PCR
spécifique de l'OGM. Si ce n'est pas le cas, les nombres de copies absolus des réactions ne peuvent pas être
comparés directement et un ajustement des nombres de copies correspondants est requis. Sinon, il est
impossible de calculer une concentration en OGM relative.
A.1.9 Étalonnage et calcul des résultats
Les points d'étalonnage sont obtenus avec un ADN contenant des quantités définies en nombres de copies
absolus d'ADN du maïs génomique haploïde contenant la séquence cible.
Une courbe d'étalonnage est obtenue en représentant sous forme graphique les valeurs de C par rapport au
t
logarithme du nombre de copies cible pour les points d'étalonnage. Pour ce faire, utiliser par exemple un
6)
logiciel tableur comme Microsoft Excel ou directement les options fournies par le logiciel du système de
détection de séquence.
6) Il s'agit d'exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée pour la
commodité des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne constitue pas une approbation par l'ISO des produits
ainsi
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 21570
Первое издание
2005-11-01
Продукты пищевые. Методы анализа
для обнаружения генетически
модифицированных организмов и
полученных из них продуктов. Методы,
основанные на количественном
определении нуклеиновых кислот
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid
based methods
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2005
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe — торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2005 — Все права сохраняются
Содержание Страница
Предисловие .v
Введение .vi
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Принцип.2
4.1 Общие положения .2
4.2 Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов PCR.2
4.3 Количественное определение продуктов PCR.2
5 Реактивы .2
6 Аппаратура и оборудование .2
7 Руководящие указания, касающиеся процедуры .3
7.1 Общие положения .3
7.2 Стабильность целевой последовательности.3
7.3 Калибровка анализа.3
7.4 Соображения относительно количественного определения .3
7.5 Требования к обеспечению качества.4
8 Интерпретация .4
9 Выражение результатов .5
10 Протокол испытания.5
Приложение A (информативное) Методы, специфические для целевого таксона.6
A.1 Метод, специфический для целевого таксона, для определения абсолютного
количественного содержания DNA гена adh1 из кукурузы с использованием метода
PCR в реальном времени .6
Приложение B (информативное) Методы скрининга .12
B.1 Метод скрининга для определения относительного количественного содержания
DNA 35S-промотора сои линии GTS 40-3-2 с использованием PCR в реальном
времени .12
Приложение C (информативное) Методы, специфические для конструкции.20
C.1 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания сои линии GTS 40-3-2 с использованием PCR в реальном времени
(Метод 1) .20
C.2 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания сои линии GTS 40-3-2 с использованием PCR в реальном времени
(Метод 2) .27
C.3 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания DNA кукурузы Event176 с использованием PCR в реальном времени.34
C.4 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения содержания
DNA сои линии GTS 40-3-2 с использованием PCR в реальном времени .41
C.5 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания DNA кукурузы линии MON 810 с использованием PCR в реальном времени .49
C.6 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания DNA кукурузы линии Event176 с использованием PCR в реальном
времени .57
C.7 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания DNA кукурузы линии Bt11 с использованием PCR в реальном времени. 65
C.8 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания DNA кукурузы линии GA21 с использованием PCR в реальном времени . 73
C.9 Метод, специфический для конструкции, для количественного определения
содержания DNA кукурузы линии T25 с использованием PCR в реальном времени . 81
Приложение D (информативное) Методы, специфические для трансформационного
события . 89
D.1 Метод, специфический для трансформационного события, для абсолютного и
относительного количественного определения содержания кукурузы линии Bt11 с
использованием PCR в реальном времени . 89
D.2 Метод, специфический для трансформационного события, для относительного
количественного определения содержания DNA кукурузы линии MON 810 с
использованием PCR в реальном времени . 96
Библиография . 102
iv © ISO 2005 — Все права сохраняются
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов заключается в подготовке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-
членам на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения
не менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
Международный стандарт ISO 21570 подготовлен Европейским комитетом по стандартизации (CEN)
Технического комитета CEN/TC 275, Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы, в
сотрудничестве с Техническим комитетом ISO/TC 34, Продукты пищевые, в соответствии с
Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венское соглашение).
Введение
Поиск ингредиентов полученных генетически модифицированных организмов осуществляется путём
следующих последовательных (или одновременных) стадий. После отбора образца нуклеиновые
кислоты экстрагируются из пробы для анализа. Экстрагированные нуклеиновые кислоты могут далее
очищаться в процессе экстракции или после него. Затем производится их количественное
определение (при необходимости), разбавление (при необходимости) и они подвергаются
аналитическим процедурам (таким как PCR). Эти стадии подробно изложены в настоящем и в
следующих международных стандартах:
ISO 21569, Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на
качественном определении нуклеиновых кислот
ISO 21570, Продукты пищевые. Методы анализа, предназначенные для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на
количественном определении нуклеиновых кислот
Дополнительная информация об определениях и общих требованиях, упоминающихся в стадиях,
цитированных выше, собрана в:
ISO 24276, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных
организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения.
Международная организация по стандартизации (ISO) обращает внимание на заявление о том, что
соблюдение настоящего документа может включать использование патента, касающегося технологии
PCR.
ISO не высказывает никакого мнения относительно очевидности, достоверности и области применения
этих патентных прав.
ISO было проинформировано, что Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. и Hoffman-La
Roche являются держателями патентных прав, касающихся технологии PCR. Компании гарантировали
ISO, что они намерены вести переговоры о лицензиях на приемлемых и не дискриминационных
условиях с заявителями по всему миру. В этой связи заявления держателей этих патентных прав
зарегистрированы ISO. Информация может быть получена от:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404,
USA
и
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501,
USA
Обращается внимание на возможность того, что некоторые элементы настоящего документа могут
быть предметом патентных прав иных, чем определенные выше. ISO не может нести ответственность
за идентификацию какого-либо одного или всех таких патентных прав.
vi © ISO 2005 — Все права сохраняются
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 21570:2005(R)
Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения
генетически модифицированных организмов и полученных
из них продуктов. Методы, основанные на количественном
определении нуклеиновых кислот
1 Область применения
Настоящий международный стандарт предоставляет общий набор количественных методов
обнаружения генетически модифицированных организмов [genetically modified organisms (GMOs)] в
продуктах питания с использованием полимеразной цепной реакции [polymerase chain reaction (PCR)].
Он определяет общие требования к специфической амплификации целевых последовательностей
DNA с целью количественной оценки содержания DNA (ДНК) из GMO и к подтверждению идентичности
амплифицированной последовательности DNA.
Руководящие принципы, минимальные требования и критерии исполнения, изложенные в настоящем
международном стандарте, имеют своей целью обеспечение сравнимости, точности и
воспроизводимости результатов, получаемых в разных лабораториях.
Настоящий международный стандарт установлен для продуктов питания, но может быть применен
также и для других объектов, например, для кормов и растительных образцов, отобранных из
окружающей среды.
Специфические примеры методов приведены в Приложениях A−D.
2 Нормативные ссылки
Следующие нормативные документы являются обязательными для применения настоящего документа.
Для жестких ссылок применяются только указанное по тексту издание. Для плавающих ссылок
необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа (включая
любые изменения).
ISO 21569:2005, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на
качественном определении нуклеиновых кислот
ISO 21571, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных
организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот
1)
ISO 24276:— , Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически
модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения
ISO Guide 32, Калибровка в аналитической химии и использование аттестованных стандартных
образцов
3 Термины и определения
Для целей настоящего документа применяются термины и определения, данные в ISO 24276.
1)
Будет опубликован.
4 Принцип
4.1 Общие положения
Количественный анализ состоит в количественном определении целевой последовательности DNA в
образцах для испытания. Каждый метод определяет целевую последовательность(и).
[1],[2]
Количественное определение может проводиться с использованием конкурентной PCR или PCR в
[3],[4]
реальном времени .
Количественный анализ должен явно выражать количество целевого генетического элемента
относительно количества специфического стандарта, соответствующих материалов, применяющихся
для калибровки, и контролей и быть внутри динамического диапазона применяемого аналитического
метода и анализируемой пробы для анализа.
Анализ обычно состоит из
− амплификации одной или большего числа специфических целевых последовательностей;
− обнаружения и подтверждения специфичности продукта(ов) PCR, и
− количественного определения амплифицированных фрагментов относительно материалов,
применяющихся для калибровки.
ПРИМЕЧАНИЕ В случае анализа с помощью PCR в реальном времени амплификация, обнаружение и
подтверждение происходят одновременно.
4.2 Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов PCR
См. описание принципов амплификации, обнаружения и подтверждения последовательностей DNA в
ISO 21569.
4.3 Количественное определение продуктов PCR
Принцип количественного определения обычно состоит в определении соотношения (выраженного в
процентах) двух целевых последовательностей DNA, т.е. последовательности, представляющей
интересующий генетически модифицированный организм, и (эндогенной) последовательности,
специфической для целевого таксона. Однако в некоторых случаях количественное определение может
также производиться по отношению к определенному количеству основного анализируемого вещества
пищевого продукта (например, когда производится обнаружение GM-микроорганизмов в пищевых продуктах).
Материалы, применяющиеся для калибровки, которые используются для количественного
определения, должны быть пригодными для контроля с сертифицированными стандартными
материалами [certified reference materials (СRMs)], если таковые имеются. Если такие материалы
отсутствуют, следует использовать другие подходящие стандартные материалы. Примерное
руководство приведено в ссылке [5]. Информация об исследованиях по авлидации и погрешности
[6],[7],[8],[9]
измерения собраны в международных исследованиях .
5 Реактивы
Все реактивы и материалы, использующиеся для анализа, должны быть идентичны или эквивалентны
реактивам и материалам, определенным в методе. В противном случае все реактивы и материалы
должны иметь квалификацию для молекулярно-биологических работ. Эти реактивы должны храниться и
использоваться, как рекомендовано поставщиком или в соответствии с техническими требованиями
обеспечения качества лабораторных работ. Список реактивов приведен в специальном приложении.
6 Аппаратура и оборудование
См. Приложения с A по D и ISO 24276.
2 © ISO 2005 — Все права сохраняются
7 Руководящие указания, касающиеся процедуры
7.1 Общие положения
Общие соображения, имеющие отношение к PCR-амплификации для обнаружения GMO, описаны в
ISO 21569.
Приложения с A по D описывают методы PCR-детектирования наряду с деталями их области
применения. Для каждого метода подробно описаны демонстрируемые рабочие характеристики.
Концентрация интересующей последовательности DNA должна находиться внутри динамического
диапазона метода.
ПРИМЕЧАНИЕ Для определения того, достаточного ли качества кодирующая нить DNA (по длине и
структурной целостности), а также достаточны ли ее чистота и количество для обеспечения обнаружения и
количественного определения GMO, принадлежащего к целевому таксону, может быть проведен контрольный
прогон, специфический для целевого таксона. Он может быть тем более обоснован, когда DNA экстрагирована из
композитного или подвергнувшегося глубокой обработке материала.
DNA, экстрагированная из каждой пробы для анализа, должна быть проанализирована по крайней
мере в двух повторностях.
Соответствующие контроли должны быть использованы (см. ISO 24276, Таблица 1).
7.2 Стабильность целевой последовательности
Следует принимать во внимание аллельную и по числу копий стабильность целевой
последовательности для сортов различного географического и филогенетического происхождения.
7.3 Калибровка анализа
Должны быть применены соответствующее число калибровочных точек и реплик, охватывающих
диапазон количественного определения [например, четыре калибровочных точки в двух репликах
(всего 4 × 2 значений) или шесть калибровочных точек с одним измерением в каждой точке (всего
[9]
6 значений)]. Качество калибровки влияет на погрешность измерения .
В качестве альтернативы геномной DNA в качестве стандартного материала для калибровки может
использоваться, например, серия разбавлений плазмиды или синтетической двухцепочечной DNA,
содержащих целевую последовательность, при условии, что она демонстрирует при калибровке поведение,
аналогичное стандартному материалу геномной DNA и геномной DNA, экстрагированной из образца.
7.4 Соображения относительно количественного определения
Методы PCR следует соответствующим образом разрабатывать с целью минимизации изменчивости.
ПРИМЕЧАНИЕ В зависимости от применяемого метода и/или анализируемого материала присутствие
конструкций, включающих несколько целевых генов, может привести к завышенной оценке истинного содержания GMO.
Для определения предела количественного определения (LOQ) см. ISO 24276.
На расчет содержания GMO, основанный на числе копий целевых последовательностей в гаплоидном
геноме, влияет гомо- и гетерозиготность изучаемых образцов. Подробности см. в Приложениях с A по D.
Применение метода ΔΔС (порогового цикла) обосновано только в том случае, если эффективности
t
амплификации пробы, специфической для целевого таксона, и пробы, специфической для GMO, очень
близки.
7.5 Требования к обеспечению качества
Для получения достоверных оценок количества целевой последовательности желательна
согласованность между измерениями. Однако для установления согласованности измерений
необходимо знание относительного стандартного отклонения повторяемости метода (подробности см.
в ISO серии 5725). Для расчета относительного стандартного отклонения повторяемости число
отдельных измерений на лабораторный образец может превышать то, что допустимо на практике в
приемлемых ценах. Следовательно, если наличие указанной происходящей из GMO DNA (в
процентах) запротоколировано, возможное решение требует как минимум:
a) согласованности внутри пробы для анализа:
— через отбраковку измерений, меньших предела количественного определения (LOQ), и
— через максимальное отклонение, наблюдаемое между разбавлениями и индивидуальными
измерениями, равное ожидаемому значению, исходя из соответствующего фактора
разбавления, ± 33 %;
b) согласованности между пробами для анализа:
— расчетные относительные концентрации происходящей из GMO DNA, полученные с учетом
пункта а) для каждой пробы для анализа, не должны различаться на значение, превышающее
от −50 % до +100 % оцененного значения количества (равного ΔС 1 при PCR в реальном
t
времени) (т.е. для двух проб для анализа приемлемы результаты измерений 1,0 % и 2,0 %, в
то время как 0,9 % и 2,1 % — неприемлемы).
Для того чтобы гарантировать точность измерений, для количества исследуемого события должен
выбираться и анализироваться стандартный материал [reference material (RМ)], предпочтительно
сертифицированный (СRМ), с соответствующим уровнем метрологической надежности и с
надлежащим сходством вещества продукта. В отсутствие CRM может быть приготовлен RM
собственного производства с помощью процедуры, обеспечивающей стабильность, однородность и
единство измерений и гарантирующей отсутствие систематического отклонения. Оцененная
количественно погрешность должна удовлетворять требуемой для калибровки (см. ISO Guide 32).
8 Интерпретация
Результаты PCR могут быть либо
a) пригодными для количественной оценки целевой последовательности при условии, что
— результат положительный в соответствии с 8.1 ISO 21569:2005,
— наблюдаемое ингибирование реакции незначительно,
— аналитические процедуры дают ознозначное значение измерений,
— количество целевой последовательности находится внутри динамического диапазона метода, и
— проведена калибровка аналитической процедуры соответствующим образом (см. 7.3), или
b) непригодными для количественной оценки целевой последовательности, если любое из
перечисленных выше условий не было соблюдено.
Погрешность измерения должна быть достаточно мала для того, чтобы лаборатория могла дать
обоснованное заключение.
В Приложениях с A по D описаны измерения количеств целевой DNA. Эти количества могут быть
использованы для расчета количества GMO. Эти расчеты обычно принимают во внимание такие
относящиеся к делу биологические факторы, как гомо- и гетерозиготность целевых последовательностей.
Если количество целевой GM-последовательности или последовательности, специфической для целевого
таксона, ниже предела количественного определения, результат должен выражаться только качественно.
4 © ISO 2005 — Все права сохраняются
ПРИМЕЧАНИЕ Утверждение, что количество происходящей из GMO DNA ниже фактического предела
количественного определения, сопровождающееся его спецификацией, рассматривается как качественное
выражение результата.
9 Выражение результатов
Результаты должны ясно констатировать количество целевой GM-последовательности относительно
последовательности, специфической для целевого таксона. Результаты должны также содержать значения
погрешности измерения, такие как стандартное отклонение или относительное стандартное отклонение.
Кроме того, должны приводиться значения предела детектирования и предела количественного
определения метода и фактические пределы детектирования и количественного определения.
Целевые последовательности могут быть, а могут и не быть обнаружены, или количество по крайней
мере одной из них может быть ниже предела количественного определения. В Таблице 1 описаны
четыре альтернативных случая и соответствующее им выражение результата, которые должны быть
включены в протокол испытания.
Таблица 1 — Выражение результатов
Результат Выражение результатов
Последовательность, специфическая См. ISO 21569.
для целевого таксона, не обнаружена.
“Для вида x DNA не обнаружена.”
Последовательность, специфическая В соответствии с ISO 21569.
для целевого таксона, обнаружена, но
“Для вида x DNA, происходящая из GMO, не обнаружена.”
не обнаружена целевая
В надлежащих случаях, кроме того, добавляется “Фактический предел
последовательность, происходящая из
детектирования составляет Х %” (Указываются использованные
GMO.
единицы).
Обнаружены как последовательность, Для каждого GMO констатируется:
специфическая для целевого таксона,
“DNA, происходящая из GMO (специфицируется GMO), обнаруженная с
так и целевая последовательность,
помощью (специфицируется целевая последовательность), полученной
происходящая из GMO, однако
из (специфицируется вид), была обнаружена.”
количество, по крайней мере, одной из
В надлежащих случаях, кроме того, добавляется “Фактический предел
целевых последовательностей ниже
количественного определения составляет Х %” (Указываются
предела количественного определения.
использованные единицы).
Обнаружены как последовательность, Для каждого GMO констатируется:
специфическая для целевого таксона,
“Содержание DNA, происходящей из GMO (специфицируется GMO),
так и целевая последовательность,
обнаруженное с помощью (специфицируется целевая
происходящая из GMO, и количество
последовательность), полученной из (специфицируется вид),
обеих целевых последовательностей
составляет Х ± погрешность %.” (Указываются использованные
выше предела количественного
единицы).
определения.
Может также указываться содержание DNA, происходящей из GMO, с учетом погрешности измерения
как в том случае, когда оно превышает конкретное значение, так и когда не достигает ее.
10 Протокол испытания
Протокол испытания должен быть написан в соответствии с ISO 24276 и ISO 21569 и должен
содержать по крайней мере следующую дополнительную информацию:
a) предел количественного определения (LOQ) метода и материал, с помощью которого он был
установлен;
b) фактический предел количественного определения (LOQ);
c) ссылка на метод, который был использован для экстракции DNA;
d) использованный стандартный материал;
e) результаты, выраженные в соответствии с Разделом 9.
Приложение A
(информативное)
Методы, специфические для целевого таксона
A.1 Метод, специфический для целевого таксона, для определения
абсолютного количественного содержания DNA гена adh1 из кукурузы с
использованием метода PCR в реальном времени
A.1.1 Введение
В этом приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения
таксон-специфического (вспомогательного) гена adh1 (кодирующего алкогольдегидрогеназу 1) из
кукурузы (Zea mays) для определения содержания DNA кукурузы или для тестирования
присутствия/отсутствия в растворах DNA, экстрагированной из продуктов, содержащих кукурузную
DNA, например, из пищевых продуктов, детектируемых количеств ингибиторов PCR.
Ограничения см. в А.1.8.
A.1.2 Статус валидации и характеристики рабочих параметров
A.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для DNA, экстрагированной из чистых размолотых кукурузных зерен, листьев
[10] [11]
кукурузы и сертифицированных стандартных материалов (серий IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 ) .
Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью совместных испытаний с
использованием неизвестных образцов (от U1 до U6), состоящих из DNA кукурузы дикого типа с
различным числом копий соответствующей целевой последовательности (см. А.1.2.2), а также других
совместных испытаний в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий
GM-кукурузы, например, Bt11 (см. D.1).
[11]
Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно 1 .
[11]
Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности .
A.1.2.2 Совместные испытания
Валидация метода была проведена в ходе совместных испытаний, организованных Объединенным
исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и Институтом защиты здоровья и потребителей
[Institute for Health and Consumer Protection (IHCP)] в соответствии с Международным
[12]
гармонизированным протоколом .
Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов
кукурузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (S1-S6) DNA кукурузы дикого типа
[13]
(экстрагированной из материала листьев , содержащей известное абсолютное число копий (183 486,
61 162, 20 387, 6 796, 2 265 и 755) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных
образцах было определено путем деления массы образца DNA (определенной методом
флуориметрического количественного определения двухцепочечной DNA фирмы PicoGreen, Molecular
[14]
Probes, Cat. Number P-7589) на опубликованное среднее значение 1С для геномов кукурузы (2,725 пг) .
[13]
Шесть образцов (U1-U6) DNA кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев ) были
использованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах
было определено тем же методом, что и в известных образцах.
6 © ISO 2005 — Все права сохраняются
Результаты валидации метода, полученные в ходе совместных испытаний, суммированы в Таблице А.1.
Валидация метода была также проведена в комбинации с методами, специфическими для
трансформационных событий для нескольких образцов GM-кукурузы, например, для сладкой кукурузы
Bt11. Подробности комбинированных испытаний (относительного количественного определения) см. в
ссылках [15] и [16], а также в D.1.
Таблица A.1 — Данные валидации
Образец
U1 U2 U3 U4 U5 U6
Число участвовавших лабораторий 12 12 12 12 12 12
Число лабораторий, имеющих возвратные
10 10 10 10 10 10
результаты
Число лабораторий с недостоверными
1 1 1 1 1 1
результатами
Число оставшихся лабораторий 9 9 9 9 9 9
Число образцов на лабораторию 4 4 4 4 4 4
Число выбросов Кохрена 1 1 1 1 − —
Число выбросов Граббса — 1 1 1 1 1
Число принятых образцов 35 34 34 34 35 35
Ожидаемое значение числа копий 7 339 18 349 36 697 55 046 91 743 146 788
Среднее значение числа копий 9 985 2 3885 46 918 75 161 100 541 122 080
Отклонение от истинного значения (%) 36,1 30,2 27,9 36,5 9,6 −16,8
а
Стандартное отклонение повторяемости s 1 318,59 1 463,60 5 796,58 4 539,57 11 306,89 14 843,41
r
Относительное стандартное отклонение
13,21 6,13 12,35 6,04 11,25 12,16
b
повторяемости (%)
а
Стандартное отклонение воспроизводимости s 2 013,12 2 083,57 6 145,39 6 806,85 14 592,04 17 777,70
R
Относительное стандартное отклонение
b 20,16 8,72 13,10 9,06 14,51 14,56
воспроизводимости (%)
а
Выражается как значение числа копий.
b
Выражается как процент среднего значения.
A.1.2.3 Молекулярная специфичность
A.1.2.3.1 Общие положения
Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной в
)
EMBL/GenBank/DDBJ регистрационный номер X04050. Эта последовательность является уникальной
[11]
для Zea mays (кукуруза/маис) и Zea mays subsp. diploperennis (теосинте мексиканского) .
A.1.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных
2)
EMBL/GenBank/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных
2)
последовательностей с помощью программы BLASTN на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
[9 октября 2003]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми
целевыми последовательностями.
Это примеры доступных на рынке подходящих продуктов. Приведенная информация дана для удобства
пользователей этого международного стандарта и не является подтверждением ISO названного продукта. Могут
быть использованы эквивалентные продукты, если может быть показано, что они приводят к тем же результатам.
A.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Специфичность метода была проверена в отношении широкого диапазона нецелевых таксонов и 20 различных
[11]
линий кукурузы, представляющих географическое и филогенетическое разнообразие образцов . Не было
обнаружено перекрестной реактивности с нецелевыми таксонами (за исключением теосинте мексиканского Zea
[11], [17]
mays subsp. diploperennis, дикого предка культурной кукурузы) . Были установлены число копий и аллельная
[11]
стабильность целевой последовательности у различных линий кукурузы .
A.1.2.4 Оптимизация
Оптимизация была проведена для системы детектирования последовательностей [sequence detection
) ® ® 3)
system (SDS)] ABI PRISM 7700 и TaqMan химия . Расчет праймеров и зондов был произведен с
® 3)
помощью программного обеспечения Primer Express (Applied Biosystems) .
A.1.2.5 Предел детектирования (LOD)
В соответствии с рекомендациями разработчика метода, абсолютный LOD составляет 10 копий
[11]
целевой последовательности .
Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в совместные испытания,
составляло 7 399 копий целевой последовательности.
A.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
В соответствии с рекомендациями разработчика метода, абсолютный LOQ составляет 100 копий
[11]
целевой последовательности .
Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в совместные испытания,
составляло 7 399 копий целевой последовательности.
A.1.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
A.1.4 Принцип
Фрагмент гена adh1 в 134 п.о. амплифицируют с использованием двух кукурузных adh1-специфических
праймеров (см. Таблицу А.2). Накопление продуктов PCR измеряют в конце каждого цикла PCR (в
реальном времени) с помощью кукурузного adh1-специфического олигонуклеотидного зонда
(ADH1-MDO, см. Таблицу А.2), меченого двумя флуоресцентными красителями: FAM в качестве
® 3)
репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применяют TaqMan химию .
Измеренный сигнал флуоресценции пересекает определяемое пользователем пороговое значение
после нескольких циклов. Число этих циклов называют C -значением. Для количественной оценки
t
количества кукурузной adh1-DNA в неизвестном образце C -значение преобразуют в соответствующее
t
значение числа копий путем сравнения с калибровочной кривой, чьи C -значения напрямую связаны с
t
известным числом копий (регрессионный анализ).
A.1.5 Реактивы
A.1.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ISO 24276:-, 6.6.
Это примеры доступных на рынке подходящих продуктов. Приведенная информация дана для удобства
пользователей этого международного стандарта и не является подтверждением ISO названного продукта. Могут
быть использованы эквивалентные продукты, если может быть показано, что они приводят к тем же результатам.
8 © ISO 2005 — Все права сохраняются
A.1.5.2 Вода
A.1.5.3 Буфер для PCR (без MgCl ), 10-кратный.
A.1.5.4 Раствор MgCl , c(MgCl ) = 25 ммоль/л.
2 2
A.1.5.5 Раствор дНТФ, c(дНТФ) = 2,5 ммоль/л (каждый).
A.1.5.6 Олигонуклеотиды
Подробности относительно применяемых олигонуклеотидов приведены в Таблице А.2.
Таблица A.2 — Олигонуклеотиды
Окончательная концентрация
Наименование DNA- последовательность олигонуклеотида
при PCR
ADH-FF3 5'-CgT CgT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3' 300 нмоль/л
ADH-RR4 5'-CCA CTC CgA gAC CCT CAg TC-3' 300 нмоль/л
a
ADH1-MDO 200 нмоль/л
5'-FAM-AAT CAg ggC TCA TTT TCT CgC TCC TCA-TAMRA-3'
a
FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.
Длина ампликона adh1 составляет 134 п.о.
A.1.5.7 Термостабильная DNA-полимераза
4) ®
DNA-полимераза AmpliTaq Gold .
A.1.5.8 Урацил-N-гликозилаза (необязательно).
A.1.5.9 Реакционная смесь для амплификации
Подробно о реакционной смеси для амплификации см. в Таблице А.3.
Таблица A.3 — Реакционная смесь для амплификации в окончательном объеме/концентрации
на реакционную пробирку
Суммарный реакционный объем 25 мкл
Кодирующая нить DNA (максимум 250 нг) 5 мкл
Taq-DNA-полимераза
Деконтаминационная система (дУТФ, включая урацил-N-гликозилазу) ®
TaqMan Universal Master Mix 2X 12,5 мкл (1 X)
а
Реакционный буфер (содержащий пассивный стандартный ROX)
смесь дНТФ
Праймеры см. Таблицу A.2 см. A.1.5.6
Зонд см. Таблицу A.2 см. A.1.5.6
a
ROX = карбокси-Х-родамин.
4)
Это примеры доступных на рынке подходящих продуктов. Приведенная информация дана для удобства
пользователей этого международного стандарта и не является подтверждением ISO названного продукта. Могут
быть использованы эквивалентные продукты, если может быть показано, что они приводят к тем же результатам.
A.1.6 Аппаратура
A.1.6.1 Общие положения
Следует использовать стандартную лабораторную аппаратуру, если не определено иначе.
A.1.6.2 Термоциклер ®
Отмеченный температурно-временной профиль изначально был оттестирован с прибором ABI PRISM
5)
7700 SDS (Applied Biosystems) Могут использоваться другие системы детектирования PCR в
реальном времени после адаптации реакционных условий.
A.1.6.3 Реакционные пробирки
Реакционные пробирки должны быть подходящими для PCR-амплификации в термоциклере реального
® ®
времени, например, ABI PRISM 96-Well Optical Reaction Plate, или MicroAmp Optical Caps
5)
(8 крышек/полоску, плоская) (Applied Biosystems) .
A.1.7 Процедура: порядок проведения PCR
A.1.7.1 Общие положения
PCR для целевой последовательности референсного гена и для целевой последовательности GMO
следует проводить в отдельных пробирках, если это не установлено иным образом в соответствующем
приложении для GM-специфических целевых последовательностей.
Метод описан для суммарного объема реакционной смеси PCR 25 мкл с реактивами, список которых
приведен в Таблице А.3.
A.1.7.2 Контроли PCR
Если контроли не дают ожидаемого результата, результаты анализа должны быть аннулированы, а
сам анализ должен быть повторен.
В качестве положительного контроля и/или стандартного материала для калибровки может быть
использована высококачественная чистая геномная DNA, экстрагированная из кукурузы (например, CRM от
) [13]
JRC, IRMM ) . Следует проводить любые другие соответствующие контроли, как это описано в ISO 24276.
A.1.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, описанная в Таблице А.4, была оптимизирована для (SDS) ABI
® 5)
PRISM 7700 (Applied Biosystems) В исследовании по валидации метода он использовался совместно
® 5)
с AmpliTaq Gold DNA-полимеразой Использование других термоциклеров может потребовать
специальной адаптации. Температура и время, необходимые для активации фермента, зависят от
особенностей используемой полимеразы. Условия реакции описаны в Таблице А.4.
Это примеры доступных на рынке подходящих продуктов. Приведенная информация дана для удобства
пользователей этого международного стандарта и не является подтверждением ISO названного продукта. Могут
быть использованы эквивалентные продукты, если может быть показано, что они приводят к тем же результатам.
10 © ISO 2005 — Все права сохраняются
Таблица A.4 — Процедура: условия реакции
Время Температура
с °C
Пред-PCR: деконтаминация 120 50
Пред-PCR: активация DNA-полимеразы и денатурация кодирующей нити DNA 600 95
PCR (50 циклов)
Стадия 1 Денатурация 15 95
Стадия 2 Отжиг и элонгация 60 60
A.1.8 Ограничения и интерпретация результатов
Присутствие ингибиторов PCR может оказать сильное влияние на точность оценки числа копий adh1-
последовательности в анализируемых образцах. Поэтому отсутствие детектируемого количества
ингибиторов PCR следует верифицировать (см. также ISO 21571:2005, Приложение А), например,
путем проведения серии разбавлений кодирующей нити DNA и проверки соответствия между
разбавлениями и расхождениями значений C (порогового цикла), т.е. одному C соответствует
t t
удвоение концентрации кодирующей нити DNA.
Для использования этого метода в комбинации с методом количественного определения
происходящей из GMO DNA, важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити DNA (нг) было
таким же, как при adh1-PCR, так и при GMO-специфической PCR. Если это будет не так, то абсолютное
число копий, полученное в ходе этих реакций, не может быть сравнено непосредственно и будет
необходимо приведений этих чисел в соответствие. В противном случае относительная концентрация
GMO не может быть рассчитана.
A.1.9 Калибровка и расчет результатов
Калибровочные точки получают с DNA, содержащей определенное количество (в абсолютных числах
копий) гаплоидной геномной DNA кукурузы, включающей целевую последовательность.
Калибровочную кривую получают путем построения графика значений C относительно логарифма
t
числа копий целевой последовательности для калибровочных точек. Это может быть осуществлено,
например, путем использования программного обеспечения (электронной таблицы), такого как
6)
Microsoft Excel , или напрямую с помощью опций, доступных в программном обеспечении системы
детектирования последовательностей.
Калибровочную кривую используют для определения абсолютного числа гаплоидных геномных копий
кукурузной DNA неизвестных образцов. Несмотря на то, что DNA образца может быть деградирована
вследствие процесса обработки пищевого продукта, либо может содержать ингредиенты, иные чем кукуруза,
это не будет влиять на рассчитываемое число гаплоидных геномных копий неизвестных образцов.
6)
Это примеры доступных на рынке подходящих продуктов. Приведенная информация дана для удобства
пользователей
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.