ISO 21570:2005/Amd 1:2013
(Amendment)Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid based methods — Amendment 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid based methods — Amendment 1
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques — Amendement 1
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 21570
Первое издание
2005-11-01
ИЗМЕНЕНИЕ 1
2013-04-15
Продукты пищевые. Методы анализа
для обнаружения генетически
модифицированных организмов и
полученных из них продуктов. Методы,
основанные на количественном
определении нуклеиновых кислот
ИЗМЕНЕНИЕ 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe – торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright @ iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов заключается в подготовке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-
членам на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения
не менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
Изменение 1 к ISO 21570:2005 подготовлено Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 16 Горизонтальные методы молекулярного анализа с помощью биомаркеров.
© ISO 2013 — Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения
генетически модифицированных организмов и полученных
из них продуктов. Методы, основанные на количественном
определении нуклеиновых кислот
ИЗМЕНЕНИЕ 1
В настоящем изменении не стремились привести нумерацию сносок в соответствие с системой,
принятой в ISO 21570:2005. Приведенные номера сносок используются исключительно в этом
изменении.
Страница 1, Раздел 2
Внести изменения в ссылки 1 – 3 следующим образом и исключить сноску 1).
ISO 21569:2005 + AM1:2013, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения
генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы,
основанные на качественном определении нуклеиновых кислот
ISO 21571:2005 + AM1:2013, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения
генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция
нуклеиновых кислот
ISO 24276:2006 + AM1:2013, Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения
генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие
требования и определения
Страница 3, 7.1, последний абзац; Стр. 8, A.1.5.1; Стр. 15, B.1.5.1; Стр. 23, C.1.5.1; Стр. 31, C.2.5.1; Стр.
38, C.3.5.1; Стр. 46, C.4.5.1; Стр. 53, C.5.5.1; Стр. 61, C.6.5.1; Стр. 69, C.7.5.1; Стр. 77, C.8.5.1; Стр. 85,
C.9.5.1; Стр. 92, D.1.5.1; Стр. 99, D.2.5.1
Исключить "ISO 24276:—", вставить "ISO 24276:2006".
Страница 4, Разделы 8–10
Заменить существующий текст следующим.
8 Интерпретация
Результаты ПСР могут быть либо a), либо b).
a) Пригодными для количественной оценки целевой последовательности при условии, что
— результат положительный в соответствии с 8.1 ISO 21569:2005;
— наблюдаемое ингибирование реакции незначительно;
— аналитические процедуры дают однозначное значение измерений;
— количество целевой последовательности находится внутри динамического диапазона метода;
— проведена калибровка аналитической процедуры соответствующим образом (см. 7.3).
© ISO 2013 — Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
b) Непригодными для количественной оценки целевой последовательности, если не соблюдается
любое из перечисленных условий в a).
Интерпретация неоднозначных результатов, полученных на одной и той же пробе для анализа: в
случае +/− результатов для двух реплик повторяют две ПСР для соответствующей пробы для анализа.
Если при испытании двух новых реплик получают результат +/− или −/−, то пробу для анализа считают
отрицательной.
Интерпретация неоднозначных результатов, полученных от двух проб для анализа: в случае ±
результатов для двух проб для анализа, отобранных от пробы, должны быть выполнены экстракция и
анализ двух новых проб для анализа. Если снова получают результаты +/−, то пробу для анализа
считают отрицательной в соответствии с ISO 24276:2006, 6.3.
Неопределенность измерения должна быть достаточно мала для того, чтобы лаборатория могла дать
обоснованное заключение.
В Приложениях с A по D описаны измерения количеств целевой ДНК. Эти количества могут быть
использованы для расчета количества GMO. Эти расчеты обычно принимают во внимание такие
относящиеся к делу биологические факторы, как гомо- или гетерозиготность целевых
последовательностей.
Если количество целевой GM-последовательности или последовательности, специфической для целевого
таксона, ниже предела количественного определения, результат должен выражаться только качественно.
ПРИМЕЧАНИЕ Утверждение, что количество происходящей из GMO ДНК ниже фактического значения LOQ,
сопровождающееся его спецификацией, рассматривается как качественное выражение результата.
9 Выражение результатов
Результаты должны ясно констатировать количество целевой GM-последовательности относительно
последовательности, специфической для целевого таксона. Результаты должны также содержать значения
неопределенности измерения, такие как стандартное отклонение или коэффициент вариации. Кроме того,
должны приводиться значения LOD и LOQ метода и фактические значения LOD и LOQ. Следует указать
в отчете, что результат относится только к GMO-мишеням. В случае применения количественного
анализа методом скрининга или составных матриц рекомендуется указать, что сигнал GMO может
поступить от нецелевых таксонов.
Целевые последовательности могут быть, а могут и не быть обнаружены, или количество, по крайней
мере, одной из них может быть ниже предела количественного определения. В Таблице 1 описаны
четыре альтернативных случая и соответствующее им выражение результата, которое должно быть
включено в протокол испытания.
Содержание ДНК, происходящей из GMO, также может указываться как выше или ниже конкретного
значения с учетом неопределенности измерения.
10 Протокол испытания
Протокол испытания должен быть написан в соответствии с ISO 24276 и ISO 21569 и должен
содержать по крайней мере следующую дополнительную информацию:
a) значение LOQ метода и материал, с помощью которого он был установлен;
b) фактическое значение LOQ;
c) ссылка на метод, который был использован для экстракции ДНК;
d) ссылка на методы, которые были использованы для амплификации целевых
последовательностей ДНК;
2 © ISO 2013 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
e) использованный стандартный материал;
f) результаты, выраженные в соответствии с Разделом 9;
g) мишень ПСР и рассматривается ли метод “специфический для события” или “специфический для
конструкции” или “скрининга”;
h) определение используемой неопределенности измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ Для g) и h) информация может фигурировать в других документах (например, в комментариях
к контракту, спецификации).
Таблица 1 — Выражение результатов
Результат Выражение результата
Последовательность, “Для вида X, ДНК не обнаружена.”
специфическая для целевого
таксона, не обнаружена.
Последовательность, В соответствии c ISO 21569.
специфическая для целевого
“Для пробы X, целевая GM-последовательность Y не обнаружена.
таксона, обнаружена, но не
Значение LOD метода составляет x %, определенное с применением ABC
обнаружена целевая
(идентифицируют стандартный материал).”
GM-последовательность.
Если невозможно продемонстрировать, что размер пробы для испытания и
количество целевой ДНК, включенной в ПСР, достаточны для применения
значения LOD, то должно быть добавлено следующее предложение:
“Однако количество целевой ДНК, экстрагированной из вида X, может
быть/было недостаточно для применения значения LOD к этой пробе. Значение
LOD пробы составляет x %." (Указываются использованные единицы.)
ПРИМЕЧАНИЕ Значение LOD пробы определяется количеством ДНК вида,
включенного в аналитическую реакцию (число копий), и отношением абсолютного
значения LOD GM-мишени (число копий) и, в случае зерна и семян, количествазерна или
семян в размолотой порции.
Обнаружены как Для каждого GMO констатируется:
последовательность,
“ДНК, происходящая из GMO (специфицируется GMO), обнаруженная с
специфическая для целевого
помощью (специфицируется целевая последовательность), полученной из
таксона, так и целевая GM-
(специфицируется вид), была обнаружена, но ее количество ниже фактического
последовательность, однако
предела количественного определения.”
количество, по крайней мере,
В надлежащих случаях, кроме того, добавляется “Фактический предел
одной из целевых
количественного определения составляет x %.” (Указываются использованные
последовательностей ниже
единицы.)
значения LOQ.
Обнаружены как Для каждого GMO констатируется:
последовательность,
“Содержание ДНК, происходящей из GMO (специфицируется GMO),
специфическая для целевого
обнаруженное с помощью (специфицируется целевая последовательность),
таксона, так и целевая
полученной из (специфицируется вид), составляет x ± u %" где u —
meas meas
GM-последовательность, и
неопределенность измерения. (Указываются использованные единицы.)
количество обеих целевых
последовательностей выше
значения LOQ.
Страница 11, Приложение A
Добавить A.2 и A.3.
© ISO 2013 — Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
A.2 Метод, специфичный для целевого таксона, для определения ДНК,
полученной из риса
A.2.1 Принцип
Ген SPS из риса был описан как пригодный для использования в качестве эндогенного референсного
гена для идентификации и количественного определения GM-риса (Ссылка [59]). Лаборатория по
обнаружению GMO Шанхайского университета (GMDL-SJTU) организовала совместные испытания для
валидации применимости гена сахарозофосфат-синтазы (SPS) в качестве эндогенного гена для
количественного анализа генетически модифицированного (GM) или генетически
немодифицированного (non-GM) риса. В совместном исследовании участвовали 12 лабораторий из
Испании, Кореи, Литвы, Словении, Японии, Италии и Китая.
Рабочая процедура совместных испытаний состояла из следующих этапов.
Количественный анализ методом ПСР в реальном времени для количественного определения
слепых проб ДНК риса, используемых для построения стандартных кривых.
Количественный анализ методом ПСР в реальном времени для количественного определения
слепых проб ДНК риса, используя построенные стандартные кривые.
Межлабораторное испытание было проведено в соответствии со следующими руководящими
указаниями, принятыми на международном уровне:
[51]–[56]
— ISO 5725;
— протоколом IUPAC по разработке, проведению и интерпретации исследований по определению
рабочих характеристик метода (Ссылка [12]).
Результаты совместных испытаний, а также соответствующий протокол приводятся в A.2.3.3.
A.2.2 Область применения
Данный метод был оптимизирован для зерен риса и продуктов его переработки, содержащих смеси
риса и других матриц, например, кукурузы и сои. Пригодность гена SPS была протестирована во время
совместных испытаний, используя пробы ДНК, экстрагированной из зерен риса.
A.2.3 Статус валидации и характеристики рабочих параметров
A.2.3.1 Устойчивость метода
Устойчивость количественных систем ПСР в реальном времени для гена SPS была протестирована
разработчиком метода при различных температурно-временных программах (т.е. двух- и трехэтапных)
и трех различных пробах ДНК, содержащих известные количества ДНК риса (пробы генома ДНК риса
массой 10 нг, 1 нг и 0,1 нг). Каждая проба анализировалась трижды. Количественные системы ПСР в
реальном времени имели ожидаемую надежность и хорошо работали при различных температурно-
временных программах и трех концентрациях проб ДНК риса.
Количественная система ПСР для гена SPS также была протестирована на различных приборах,
1)
1)
использующих метод ПСР в реальном времени (Rotor gene 3000A, Corbett Research и ABI7700,
Applied Biosystems), с тремя разными реакционными объемами (20 мкл, 25 мкл и 30 мкл; по три
повторности на объем). Количественная система ПСР в реальном времени продемонстрировала
соответствующую надежность, хорошую работу на различных приборах, использующих метод ПСР в
реальном времени, и с разными реакционными объемами.
1) Это примеры доступных на рынке подходящих продуктов. Приведенная информация дана для удобства
пользователей этого международного стандарта и не является подтверждением ISO названного продукта.
4 © ISO 2013 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
A.2.3.2 Межлабораторные испытания
Для приготовления пробы все пробы ДНК были подвергнуты экстракции, используя метод на основе
цетил(триметил)аммонийбромида (CTAB), одобренный в ISO 21571. Спектрометрическое определение
количества общей экстрагированной ДНК было выполнено с использованием метода, приведенного в
ISO 21571:2005, B.1. После количественного определения ДНК был выполнен количественный прогон
методом ПСР в реальном времени для получения данных относительно возможного ингибирования
ПСР.
Система ПСР для гена SPS была протестирована тремя исследователями с помощью геномной ДНК
риса и были получены удовлетворительные результаты; в частности, в количественном анализе
методом ПСР, систематическая погрешность была ниже 25 % в динамическом диапазоне (т.е. от
0,05 нг до 1,00 нг).
A.2.3.3 Совместные испытания
Стандартные кривые были построены с использованием последовательно разведенных проб ДНК,
экстрагированных в лаборатории GMDL-SJTU из четырех сортов риса при количественном анализе
методом ПСР. Эффективность системы ПСР для гена SPS, рассчитанная по углу наклона стандартной
−1/a
кривой как (10 − 1) × 100, где a — угол наклона, изменялась от 0,846 3 до 1,223 3, а линейность
2
(коэффициент регрессии, R ) была в среднем равна 0,997.
c
Результаты для восьми слепых проб ДНК представлены в Таблице A.5. Они оцениваются по критерию
приемки метода и требованиям к рабочим характеристикам метода, установленным Европейской
сетью лабораторий GMO (ENGL) и одобренным Лабораторией ЕС по определению генетически
модифицированных пищевых продуктов и кормов (EU-RL GMFF) (Ссылка [60]). В Таблице A.5
представлены оценки как повторяемости, так и воспроизводимости, для каждого уровня концентрации
риса после идентификации и удаления выбросов согласно критерию Кохрена.
Таблица A.5 — Результаты количественного анализа методом ПСР в реальном времени
Слепые пробы
Параметр
0,5 нг 0,5 нг 1нг 1 нг 2 нг 5 нг 5 нг 10 нг
Лаборатории, выдающие
12 12 12 12 12 12 12 12
результаты
Образцов на
1 1 1 1 1 1 1 1
лабораторию
Число общих данных 108 108 108 108 108 108 108 108
Исключенные данные 4 2 0 8 0 0 0 0
Критерий Критерий Критерий
Причина исключения — — — — —
Кохрена Кохрена Кохрена
Среднее значение 0,407 8 0,412 1 0,814 6 0,734 4 1,857 5 5,261 0 5,445 7 10,889 6
Стандартное отклонение
0,058 3 0,071 9 0,143 5 0,111 0,336 2 0,936 4 1,142 7 1,867 7
повторяемости
Коэффициент вариации
14,29 17,44 17,62 15,11 18,10 17,80 20,98 17,15
повторяемости, %
Стандартное отклонение
0,130 2 0,061 8 0,249 6 0,092 7 0,201 3 0,810 9 0,989 6 1,617 5
воспроизводимости
Коэффициент вариации
31,92 14,99 30,65 12,63 10,84 15,41 18,17 14,85
воспроизводимости, %
Систематическая
погрешность, 0,092 2 0,087 8 0,185 3 0,265 5 0,142 4 −0,261 0 −0,445 8 −0,889 6
абсолютное значение
Систематическая
−18,44 −17,57 −18,54 −26,53 −7,12 5,22 8,92 8,90
погрешность, %
© ISO 2013 — Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
A.2.3.4 Молекулярная специфичность
A.2.3.4.1 Общие положения
Праймеры и зонд, направленно воздействующие на фрагмент ДНК гена SPS длиной 81 п.о. (пар
нуклеотидных оснований), перечислены в Таблице A.6.
Таблица A.6 — Последовательности олигонуклеотида для праймеров и зонда
Наименование ДНК-последовательность олигонуклеотида (5′ – 3′)
Последовательность для праймеров и зонда при количественном анализе методом ПСР в реальном времени
SPS праймер F TTgCgCCTgAACggATAT
SPS праймер R CggTTgATCTTTTCgggATg
SPS зонд HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA
A.2.3.4.2 Экспериментальная специфичность
Пробы ДНК, экстрагированные из 11 различных растительных материалов (включая рис), были
проанализированы с использованием метода ПСР для гена SPS. Из 11 проб только проба ДНК риса
дала положительные результаты. Оставшиеся 10 проб (т.е. бамбук, шетинник зеленый, ячмень,
пшеница, просо итальянское, семена рапса, томат, картофель, соя и Arabidopsis) дали отрицательные
результаты.
Пробы ДНК, экстрагированные из 12 различных сортов риса, были проанализированы специфическим
методом ПСР, разработанным для обнаружения гена SPS. Все 12 проб дали положительные
результаты.
A.2.3.4.3 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зонда для гена SPS была оценена путем поиска подобия с
использованием программы BLASTN2.0MP-WashU (Ссылка [64], дата поиска: 2010-01-09).
Последовательность длиной 81 п.о., используемая как запрос в базу данных, входит в состав
инвентарного номера U33175 (нуклеотиды 1055–1135) Национального центра биотехнологий (NCBI).
Результаты поиска подтверждены полной идентичностью запросной последовательности с
последовательностью для гена SPS риса, и отсутствием подобия с другими генами и видами.
A.2.4 Принцип и резюме
Фрагмент гена SPS длиной 81 п.о. амплифицируют с использованием двух рисовых sps-
специфических праймеров. Накопление продуктов ПСР измеряют в конце каждого цикла ПСР (в
реальном времени) с помощью рисового sps-специфического олигонуклеотидного зонда, меченого
двумя флуоресцентными красителями: FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве
1)
гасителя (см. Таблицу A.6). Для этих целей применяют TaqMan® химию. Измеренный сигнал
флуоресценции пересекает определяемое пользователем пороговое значение после нескольких
циклов. Число этих циклов называют C -значением. Для количественной оценки количества рисовой
t
adh1-ДНК в неизвестной пробе C -значение преобразуют в соответствующее значение числа копий
t
путем сравнения с калибровочной кривой, чьи C -значения напрямую связаны с известным числом
t
копий (регрессионный анализ).
A.2.5 Термины и определения
[51]
Применительно к этому разделу применяют термины и определения, установленные в ISO 5725-1 и
ISO 24276.
6 © ISO 2013 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
A.2.6 Тип и количество пробы
Пробы ДНК, экстрагированные из зерен четырех сортов риса, использовались для построения
стандартных кривых в этих совместных испытаниях. Затем анализировались восемь слепых проб с
использованием четырех построенных стандартных кривых.
Участники испытаний получили следующие пробы.
— Четыре пробы ДНК различных сортов риса (3M, сорт Indica из США; Balilla, сорт Japonica из
Италии; Guangluai, сорт Indica из Южного Китая и Shennong265, сорт Chinese Japonica), 50 нг/мкл,
по 30 мкл каждая. Проба ДНК каждого сорта риса была разведена и использована для построения
соответствующей стандартной кривой.
— Восемь слепых проб ДНК риса от четырех различных сортов риса различных концентраций (от
0 нг/мкл до ~50 нг/мкл), по 50 мкл каждая.
— Отрицательный контроль целевой ДНК (обозначенный N): ДНК спермы лосося (20 нг/мкл).
— Положительный контроль целевой ДНК (обозначенный P): геномная ДНК (Guangluai4) (20 нг/мкл).
Все пробы ДНК подверглись очистке в лаборатории GMDL-SJTU с использованием метода CTAB.
Для каждой чашки ПСР использовались отрицательные и положительные контроли целевой ДНК.
— Праймеры и зонды для системы ПСР гена SPS (см. Таблицу A.6) и следующие дополнительные
реактивы:
— универсальная смесь для постановки ПСР в реальном времени (1 мл × 6);
— разбавленный раствор ДНК (0,1× TE, 1,2 мл).
A.2.7 Предел количественного определения (LOQ), диапазон применения
В соответствии с усовершенствованным методом абсолютное значение LOQ составляет 0,01 нг/мкл.
Относительное значение LOQ при количественном анализе методом ПСР не оценивалось при
проведении совместных испытаний.
A.2.8 Оценка неопределенности измерения
Общая неопределенность метода задается результатами совместных испытаний (см. Таблицу A.5).
A.2.9 Интерференция
Количество нуклеиновой кислоты, используемой в качестве кодирующей нити ДНК для анализа
методом ПСР в реальном времени, а также ее способность к амплификации имеют важнейшее
значение для чувствительности метода. Помимо этого общего положения, неизвестны специфические
интерференции для этого метода.
A.2.10 Физические условия и условия окружающей среды
Для выполнения процедур требуется опыт работы в стерильных условиях.
Рабочие зоны для экстракции ДНК, постановки ПСР и амплификации должны быть четко разделены.
Любые остатки ДНК следует удалять из оборудования перед его использованием.
Для предотвращения контаминации следует использовать наконечники с фильтром для пипеток
(A.2.11.6), защищающие от аэрозолей.
Используют только перчатки без присыпки (A.2.11.8) и часто меняют их.
© ISO 2013 — Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
Периодически очищают лабораторные столы и оборудование раствором гипохлорита натрия (10 %
активного хлорида) (отбеливание).
Следует регулярно калибровать пипетки, если необходимо.
A.2.11 Аппаратура и оборудование
Обычная лабораторная аппаратура и, в частности, следующая.
A.2.11.1 Микроцентрифуга.
A.2.11.2 Морозильная камера, поддерживающая температуру −20 °C, и холодильник,
поддерживающий температуру 4 °C.
A.2.11.3 Микропипетки.
A.2.11.4 Вихревой смеситель.
A.2.11.5 Пробирки, вместимостью 0,2 мл, 1,5 мл, 2,0 мл.
A.2.11.6 Наконечники и наконечники с фильтром для микропипеток.
A.2.11.7 Штатив для реакционных пробирок.
A.2.11.8 Перчатки из винила или латекса.
A.2.11.9 Вакуумная сушилка, пригодная для сушки гранул ДНК, необязательно.
A.2.11.10 Система ПСР в реальном времени, с пластмассовыми реакционными пробирками,
пригодными для измерения флуоресценции
1)
A.2.11.11 Программное обеспечение: Sequence Detection System версия 1.7 (Applied Biosystems
1)
Part No 4311876 ) или эквивалентные версии.
®1)
A.2.11.12 Оптические 96-луночные реакционные плашки, MicroAmp (Applied Biosystems Part
1)
No N801-0560 ).
®1)
A.2.11.13 Оптические адгезивные полные крышки для реакционных плашек, MicroAmp
1)
(Applied Biosystems Part No 4311971 ).
®1)
A.2.11.14 Оптические крышки для реакционных плашек, MicroAmp (Applied Biosystems Part
1)
No. No 801-0935 ).
A.2.12 Реактивы и материалы
A.2.12.1 Общие положения
Если не оговорено иначе, используют только реактивы, соответствующие требованиям ISO 24276, и
только стерильную дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной
чистоты.
A.2.12.2 Экстракция ДНК
A.2.12.2.1 Цетилтриметиламмонийбромид (CTAB), ультрачистый.
Tris-(гидроксиметил)аминометан, гидрохлорид (tris), для молекулярной биологии.
A.2.12.2.2
8 © ISO 2013 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
A.2.12.2.3 Этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль (EDTA), массовая доля
99,9 % при титровании.
A.2.12.2.4 Этанол, φ[CH CH OH] объемная доля, по меньшей мере, 96 %.
3 2
A.2.12.2.5 Изопропанол, φ[CH CH(OH)CH ] объемная доля, по меньшей мере, 99,7 %.
3 3
A.2.12.2.6 Хлороформ, φ(CHCl ) объемная доля, по меньшей мере, 99 %.
3
A.2.12.2.7 Хлорид натрия, w(NaCl) массовая доля, по меньшей мере, 99 %.
A.2.12.2.8 Гидроксид натрия, безводный, w(NaOH) массовая доля, по меньшей мере, 98 %.
A.2.12.2.9 Раствор RNase A, 10 мг/мл.
A.2.12.2.10 Раствор протеиназы K, 20 мг/мл.
A.2.12.2.11 Буфер для разведения: tris (A.2.12.2.2), 10 ммоль/л, pH 9,0.
A.2.12.2.12 Соляная кислота, ρ(HCl) = 370 г/л.
A.2.12.2.13 ДНК из молок сельди, ДНК из тимуса теленка, или Лямбда-ДНК.
A.2.12.3 Универсальная реакционная смесь для постановки ПСР в реальном времени
®1)
Универсальная реакционная смесь для постановки ПСР TaqMan (1×) или подходящий эквивалент.
A.2.13 Отбор, транспортировка, консервация и хранение проб
Растворы ДНК могут храниться при температуре 4 °C максимум в течение 1 недели или при
температуре −20 °C в течение длительного времени (A.2.11.2). Для количественного анализа методом
ПСР в реальном времени реактивы ПСР должны храниться оттаянными при температуре от 1 °C до
4 °C на льду.
A.2.14 Приготовление пробы для испытания
Гарантируют, что проба для испытания является представительной для лабораторной пробы,
например, путем размола или гомогенизации. Необходимые количества и операции, которые должны
приниматься во внимание, подробно описаны в ISO 21571. При совместных испытаниях общее
использованное количество составляло 1 г размолотой рисовой лапши.
A.2.15 Калибровка прибора
Приборы, например, термоциклеры и пипетки, должны быть калиброваны, например, в соответствии с
[61]
ISO/IEC 17025.
A.2.16 Этапы анализа
A.2.16.1 Общие положения
A.2.16.1.1 Приготовление ДНК для построения стандартной кривой
Каждая из проб ДНК риса концентрацией 50 нг/мкл была разведена до концентрации 10 нг/мкл,
1 нг/мкл, 0,1 нг/мкл, 0,01 нг/мкл, 0,002 нг/мкл, используя разбавленный раствор ДНК, поставляемый
разработчиком метода, затем по 5 мкл каждой из разведенных проб ДНК использовались для анализа
методом ПСР в реальном времени для построения стандартной кривой.
© ISO 2013 — Все права сохраняются 9
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(R)
Относительно специфичных требований см. ISO 21571.
A.2.16.1.2 Реактивы ПСР
A.2.16.1.3 Универсальная реакционная смесь для постановки ПСР
См. A.2.12.3.
A.2.16.1.4 Праймеры и зонд
См. Таблицу A.6.
A.2.16.2 Процедура
A.2.16.2.1 Общие положения
Количественный анализ методом ПСР для гена SPS риса разработан для суммарного объема
реакционной смеси 25 мкл.
Оттаивают, осторожно перемешивают и центрифугируют универсальную реакционную смесь для
количественного анализа методом ПСР в реальном времени и пробы ДНК, необходимые для прогона.
Хранят оттаянные реактивы при температуре от 1 °C до 4 °C на льду.
Распределяют по 20 мкл универсальной реакционной смеси в реакционные пробирки ПСР
вместимостью 200 мкл (A.2.11.5). Добавляют в пробирки по 5 мкл проб раствора ДНК, рисовый
положительный контроль, отрицательный контроль и пустой контроль (H O) соответственно.
2
Осторожно перемешивают раствор в пробирках ПСР и центрифугируют в микроцентрифуге (A.2.11.1)
при ускорении 1 000 × g в течение 10 с.
Помещают реакционную плашку (A.2.11.12) в прибор.
Выполняют прогон ПСР в условиях циклического повторения количественного анализа методом ПСР в
реальном времени.
A.2.16.2.2 Контроли ПСР
См. A.2.6.
A.2.16.2.3 Построение стандартных кри
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21570
First edition
2005-11-01
AMENDMENT 1
2013-04-15
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based
methods
AMENDMENT 1
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Reference number
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Amendment 1 to ISO 21570:2005 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 16, Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
AMENDMENT 1
No attempt has been made in this amendment to update the footnote numbering to fit in with the scheme
adopted in ISO 21570:2005. The footnote numbers given are for use solely within this amendment.
Page 1, Clause 2
Update entries 1 to 3 as follows and delete footnote 1).
ISO 21569:2005 + AM1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21571:2005 + AM1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — Nucleic acid extraction
ISO 24276:2006 + AM1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — General requirements and definitions
Page 2, 7.1, last paragraph; Page 8, A.1.5.1; Page 15, B.1.5.1; Page 23, C.1.5.1; Page 31, C.2.5.1; Page 38,
C.3.5.1; Page 45, C.4.5.1; Page 53, C.5.5.1; Page 60, C.6.5.1; Page 68, C.7.5.1; Page 75, C.8.5.1; Page 83,
C.9.5.1; Page 90, D.1.5.1; Page 96, D.2.5.1
Delete “ISO 24276:—”, insert “ISO 24276:2006”.
Page 4, Clauses 8–10
Replace the existing text with the following.
8 Interpretation
The PCR result will be either a) or b).
a) Fit for quantification of the target sequence provided:
— the result is positive according to ISO 21569:2005, 8.1;
— the observable inhibition of the reaction is negligible;
— the analysis produces an unambiguous measurement value;
— the target sequence content is within the dynamic range of the method;
— the analysis is calibrated in an acceptable way (see 7.3).
b) Unfit for quantification of the target sequence if any of the conditions listed in a) are not fulfilled.
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Interpretation of ambiguous results within the same test portion: in case of +/− results for the two
replicates, repeat the two PCR for the relevant test portion. If the two novel replicates are tested +/− or
−/−, the test portion is considered as negative.
Interpretation of ambiguous results between two test portions: in case of ± results for the two test
portions of a sample, the extractions and analysis of two new test portions shall be performed. If again
the results are +/−, the sample is considered as negative according to ISO 24276:2006, 6.3.
The measurement uncertainty shall be sufficiently small to enable the laboratory to draw the
relevant conclusions.
Annexes A to D describe the measurement of the target DNA quantities. These quantities can be used
to calculate the GMO content. These calculations usually take into consideration relevant biological
factors, e.g. the homo- or heterozygosity of the target sequences.
If the GM target sequence content or the taxon-specific target sequence content is below the limit of
quantification, the result shall only be expressed qualitatively.
NOTE Stating that the GMO-derived DNA content is below the practical LOQ accompanied by a specification
of that LOQ is considered to be a qualitative expression of the result.
9 Expression of results
The results shall clearly state the quantity of the GM target sequence relative to the target taxon-specific
sequence. The results should also provide values for the measurement uncertainty, such as the standard
deviation or coefficient of variation. Furthermore, the LOD and LOQ of the method and the practical
LOD and LOQ should be reported. The indication that the result refers only to GMO targets should be
reported. In the case of quantitative screening analysis on complex matrices, it is recommended to
specify that the GMO signal can come from non target taxons.
The target sequences can or cannot be detected, or the quantity of at least one of them can be below the
limit of quantification. Table 1 describes the four alternative cases and the corresponding expression of
the result to be included into the test report.
The GMO-derived DNA content can also be reported as being above or below a specific value, taking into
account the measurement uncertainty.
10 Test report
The test report shall be written in accordance with ISO 24276 and ISO 21569 and shall contain at least
the following additional information:
a) the LOQ of the method and the matrix used to establish it;
b) the practical LOQ;
c) a reference to the method which has been used for the extraction of DNA;
d) a reference to the methods used for the amplification of the DNA target sequences;
e) the reference material used;
f) the results expressed according to Clause 9;
g) the PCR target and whether considered “event specific” or “construct specific” or “screening”;
h) the definition of the measurement uncertainty used.
NOTE For g) and h), information can figure in different documents (e.g. contract review, technical data sheets).
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Table 1 — Expression of results
Result Expression of the result
Target taxon-specific sequence “For species X, DNA was not detected.”
is not detected.
Target taxon-specific sequence According to ISO 21569.
is detected but GM target
“For sample X, GM target sequence Y was not detected.
sequence is not detected.
The LOD of the method is x % determined with ABC (identify the reference
material).”
If it cannot be demonstrated that the test sample size and the amount of target
DNA included in the PCR is sufficient for the LOD to be applicable, then the fol-
lowing sentence shall be added:
“However, the amount of the target DNA extracted from species X can be/was
insufficient for the LOD to be applicable for this sample. The LOD of sample is
x %.” (Specify the unit used.)
NOTE The LOD of the sample is determined by the quantity of DNA of the species
included in the analytical reaction (copy number), and the ratio relative to the absolute
LOD of the GM target (copy number), and in the case of grain and seeds, the number of
grain or seeds in the portion that is ground.
The target taxon-specific For each GMO, state:
sequence and the GM target
“GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by detection of (specify
sequence are both detected,
target sequence) derived from (specify species) was detected, below the prac-
but the quantity is below the
tical limit of quantification”
LOQ of at least one of the target
sequences. In addition, if applicable: “The practical limit of quantification is x %.” (Specify
the unit used.)
The target taxon-specific For each GMO, state:
sequence and the GM target
“The content of GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by detec-
sequence are both detected
tion of (specify target sequence) derived from (specify species) is x ± u %”
meas
and the quantity is above the
where u is the measurement uncertainty. (Specify the unit used.)
meas
LOQ for both target sequences.
Page 11, Annex A
Add A.2 and A.3.
A.2 Target-taxon-specific method for the detection of DNA derived from rice
A.2.1 Principle
Rice SPS gene has been described as being suitable for use as an endogenous reference gene in GM rice
identification and quantification (Reference [59]). The GMO Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong
University (GMDL-SJTU) organized a collaborative trial for validation of the applicability of the rice
sucrose phosphate synthase (SPS) gene as an endogenous gene for quantitative analysis of genetically
modified (GM) or non-GM rice. The study involved 12 laboratories from Spain, Korea, Lithuania, Slovenia,
Japan, Italy, and China.
The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules.
Quantitative real-time PCR for quantification of blind rice DNA samples used to construct standard
curves.
Quantitative real-time PCR for the quantification of blind rice DNA samples using the constructed
standard curves.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
The interlaboratory test was carried out in accordance with the following internationally accepted guidelines:
[51]–[56]
— ISO 5725;
— the IUPAC protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies
(Reference [12]).
The results of the collaborative study as well as the related protocol are given in A.2.3.3.
A.2.2 Scope
The method has been optimized for rice grain and its processed products containing mixtures of
rice and other matrices, e.g. maize and soybean. The applicability of the SPS gene was tested through
collaborative trials using DNA samples extracted from rice grains.
A.2.3 Validation status and performance criteria
A.2.3.1 Robustness of the method
The robustness of the SPS gene quantitative real-time PCR system was tested by the method developer on
different temperature–time programmes (i.e. two-step and three step) and on three different DNA samples
containing known amounts of rice DNA (10 ng, 1 ng, 0,1 ng rice genome DNA samples). There were three
repetitions per sample. The quantitative real-time PCR systems had the expected ruggedness and worked
well at different temperature–time programmes and three concentrations of the rice DNA samples.
The quantitative PCR system for the SPS gene was also tested on different real-time PCR instruments
1)
1)
(Rotor gene 3000A, Corbett Research and ABI7700, Applied Biosystems), with three different
reaction volumes (20 µl, 25 µl, and 30 µl; three repetitions per volume). The quantitative real-time PCR
system demonstrated appropriate ruggedness, working well on the different real-time PCR instruments
and with the different reaction volumes.
A.2.3.2 Intralaboratory trial
For sample preparation, all the DNA samples were extracted using the cetyl(trimethyl)ammonium
bromide (CTAB) method adopted from ISO 21571. Spectrometric quantification of the amount of total DNA
extracted was performed using a method adopted from ISO 21571:2005, B.1. After the DNA quantification,
a quantitative real-time PCR run was carried out to provide data about possible PCR inhibition.
The SPS gene PCR system was tested by three researchers using the rice genome DNA, and gave
satisfactory results; in particular, in quantitative PCR, the bias was below 25 % over the dynamic range
(i.e. 0,05 ng to 1,00 ng).
A.2.3.3 Collaborative trial
Standard curves were constructed using serially diluted DNA samples extracted by the GMDL-SJTU
from four rice cultivars by means of quantitative PCR. The PCR efficiency, calculated from the slope of
−1/a
the standard curve as (10 − 1) × 100, where a is the slope, of the SPS gene PCR system ranging from
2
0,846 3 to 1,223 3, and the linearity (regression coefficient, R ) was on average equal to 0,997.
c
The results of the eight blind DNA samples are reported in Table A.5. These are evaluated with respect
to the method acceptance criteria and to the method performance requirements, as established by the
European Network of GMO laboratories (ENGL) and adopted by the European Reference Laboratory
for GM Food and Feed (EU-RL GMFF) (Reference [60]). In Table A.5, estimations of both repeatability
and reproducibility for each rice concentration level are reported, after identification and removal of
outliers according to Cochran’s test.
1) Product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and
does not constitute an endorsement by ISO of this product.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
Table A.5 — Results of quantitative real-time PCR
Blind samples
Parameter
0,5 ng 0,5 ng 1ng 1 ng 2 ng 5 ng 5 ng 10 ng
Laboratories returning
12 12 12 12 12 12 12 12
results
Samples per laboratory 1 1 1 1 1 1 1 1
Total data no. 108 108 108 108 108 108 108 108
Data excluded 4 2 0 8 0 0 0 0
Cochran’s Cochran’s Cochran’s
Reason for exclusion — — — — —
test test test
Mean value 0,407 8 0,412 1 0,814 6 0,734 4 1,857 5 5,261 0 5,445 7 10,889 6
Repeatability standard
0,058 3 0,071 9 0,143 5 0,111 0,336 2 0,936 4 1,142 7 1,867 7
deviation
Repeatability coefficient
14,29 17,44 17,62 15,11 18,10 17,80 20,98 17,15
of variation, %
Reproducibility standard
0,130 2 0,061 8 0,249 6 0,092 7 0,201 3 0,810 9 0,989 6 1,617 5
deviation
Reproducibility coef-
31,92 14,99 30,65 12,63 10,84 15,41 18,17 14,85
ficient of variation, %
Bias, absolute value 0,092 2 0,087 8 0,185 3 0,265 5 0,142 4 −0,261 0 −0,445 8 −0,889 6
Bias, % −18,44 −17,57 −18,54 −26,53 −7,12 5,22 8,92 8,90
A.2.3.4 Molecular selectivity
A.2.3.4.1 General
The primers and probe targeting the 81 bp SPS gene DNA fragment are listed in Table A.6.
Table A.6 — Oligonucleotide primers and probe sequences
Name Oligonucleotide DNA sequence (5′ to 3′)
Quantitative-real time PCR primer and probe sequence
SPS primer F TTgCgCCTgAACggATAT
SPS primer R CggTTgATCTTTTCgggATg
SPS probe HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA
A.2.3.4.2 Experimental
DNA samples extracted from 11 different plant materials (including rice) were analysed using the SPS
gene PCR method. Among the 11 samples, only rice DNA gave positive results. The 10 other samples
(i.e. bamboo, green bristlegrass, barley, wheat, foxtail millet, rapeseed, tomato, potato, soybean and
Arabidopsis) gave negative results.
DNA samples extracted from 12 different rice cultivars were analysed by the specific PCR method
developed for the detection of the SPS gene. All 12 samples gave positive results.
A.2.3.4.3 Theoretical
The theoretical specificity of the SPS gene primers and probe was assessed through a similarity search
using the BLASTN 2.0MP-WashU program (Reference [64], search date: 2010-01-09). The 81 bp sequence
© ISO 2013 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
used as query is part of the NCBI accession number U33175 (nucleotides 1055–1135). The results of the
blast search confirmed the complete identity of the query sequence with rice SPS gene sequence, and no
similarity with other genes and species.
A.2.4 Principle and summary
An 81 bp fragment of the SPS gene is amplified using two rice sps-specific primers. Accumulation
of PCR products is measured at the end of each PCR cycle (real-time) by means of a rice sps-specific
oligonucleotide probe labelled with two fluorescent dyes: FAM as reporter dye and TAMRA as quencher
1)
(see Table A.6). For that purpose, TaqMan® chemistry is employed. The fluorescence signal measured
crosses a user-defined threshold value after a certain number of cycles. This number is called the C
t
value. For quantification of the amount of rice sps-DNA in an unknown sample, the C value is converted
t
into a corresponding copy number value by comparison with a calibration curve whose C values are
t
directly linked with known copy numbers (regression analysis).
A.2.5 Terms and definitions
[51]
For the purposes of this clause, the terms and definitions of ISO 5725-1 and ISO 24276 apply.
A.2.6 Sample type and amounts
DNA samples extracted from the grains of four rice cultivars, were used to construct the standard
curves in this collaborative study. Then, eight blind samples were analysed using the four standard
curves constructed.
The participants received the following samples.
— Four DNA samples from different rice varieties (3M, Indica variety from US; Balilla, Japonica
variety from Italy; Guangluai, Indica variety from Southern China, and Shennong265, Chinese
Japonica variety), 50 ng/μl, 30 μl each. Each rice cultivar DNA was diluted and used to generate the
corresponding standard curve.
— Eight blind rice DNA samples from four different rice varieties with different concentrations (0 ng/µl
to ~50 ng/µl), 50 μl each.
— Negative DNA target control (labelled N): salmon sperm DNA (20 ng/µl).
— Positive DNA target control (labelled P): (Guangluai4) genomic DNA (20 ng/µl). All the DNA samples
were purified using the CTAB method by-GMDL-SJTU. The negative and positive DNA target controls
were used for each PCR plate.
— Primers and probes for the SPS gene PCR system (see Table A.6) and further reaction reagents as
follows:
— real-time PCR master mixture (1 ml × 6);
— DNA dilute solution (0,1× TE, 1,2 ml).
A.2.7 Limit of quantification (LOQ), range of use
According to the developed method, the absolute LOQ of the method is 0,01 ng/μl. The relative LOQ of
quantitative PCR has not been assessed in a collaborative trial.
A.2.8 Estimation of measurement uncertainty
The global uncertainty of the method is given by the results of the collaborative trial (see Table A.5).
6 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.9 Interferences
The amount and the ability for amplification of the nucleic acid used as template for the real-time PCR
is of major importance for the sensitivity of the method. In addition to this general point, no specific
interferences are known for this method.
A.2.10 Physical and environmental conditions
The procedures require experience of working under sterile conditions.
Maintain strictly separated working areas for DNA extraction, PCR set-up and amplification.
Any residual DNA should be removed from equipment prior to its use.
In order to avoid contamination, filter pipette tips (A.2.11.6) protected against aerosol should be used.
Use only powder-free gloves (A.2.11.8) and change them frequently.
Clean laboratory benches and equipment periodically with sodium hypochlorite (10 % active chloride)
solution (bleach).
Pipettes should be calibrated regularly, if necessary.
A.2.11 Apparatus and equipment
Usual laboratory equipment and in particular the following.
A.2.11.1 Microcentrifuge.
A.2.11.2 Freezer maintained at −20 °C and refrigerator maintained at 4 °C.
A.2.11.3 Micropipettes.
A.2.11.4 Vortex mixer.
A.2.11.5 Tubes, of capacities 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
A.2.11.6 Tips and filter tips for micropipettes.
A.2.11.7 Rack for reaction tubes.
A.2.11.8 Vinyl or latex gloves.
A.2.11.9 Vacuum dryer suitable for drying DNA pellets,optional.
A.2.11.10 Real-time PCR system with plastic reaction vials suitable for fluorescence measurement.
1) 1)
A.2.11.11 Software: Sequence Detection System version 1.7 (Applied Biosystems Part No 4311876 )
or equivalent versions.
®1) 1)
A.2.11.12 Optical 96 well reaction plates, MicroAmp (Applied Biosystems Part No N801-0560 ).
®1) 1)
A.2.11.13 Optical adhesive covers, MicroAmp (Applied Biosystems Part No 4311971 ).
®1) 1)
A.2.11.14 Optical caps, MicroAmp (Applied Biosystems Part No. No 801-0935 ).
A.2.12 Reagents and materials
A.2.12.1 General
Unless otherwise stated, use only reagents that conform to the specifications of ISO 24276 and only
sterile distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
© ISO 2013 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.12.2 DNA extraction
A.2.12.2.1 Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), ultrapure grade.
A.2.12.2.2 Tris-(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (tris), molecular biology grade.
A.2.12.2.3 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), titration 99,9 % mass fraction.
A.2.12.2.4 Ethanol, φ[CH CH OH] at least 96 % volume fraction.
3 2
A.2.12.2.5 Isopropanol, φ[CH CH(OH)CH ] at least 99,7 % volume fraction.
3 3
A.2.12.2.6 Chloroform, φ(CHCl ) at least 99 % volume fraction.
3
A.2.12.2.7 Sodium chloride, w(NaCl) at least 99 % mass fraction.
A.2.12.2.8 Sodium hydroxide, anhydrous, w(NaOH) at least 98 % mass fraction.
A.2.12.2.9 RNase A solution, 10 mg/ml.
A.2.12.2.10 Proteinase K solution, 20 mg/ml.
A.2.12.2.11 Dilution buffer: tris (A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.
A.2.12.2.12 Hydrochloric acid, ρ(HCl) = 370 g/l.
A.2.12.2.13 Herring testes DNA, calf thymus DNA, or Lambda DNA.
A.2.12.3 Quantitative real-time PCR
®1)
TaqMan universal PCR master mix (1×) or suitable equivalent.
A.2.13 Sample collection, transport, preservation and storage
DNA solutions may be stored at 4 °C for a maximum of 1 week, or at −20 °C for long-term storage
(A.2.11.2). For quantitative real-time PCR set up, PCR reagents shall be kept thawed at 1 °C to 4 °C on ice.
A.2.14 Preparation of test sample
Ensure that the test sample is representative of the laboratory sample, e.g. by grinding or homogenization.
Measures and operational steps to be taken into consideration are described in detail in ISO 21571. For
the collaborative study, a total amount of 1 g ground rice noodles was used.
A.2.15 Instrument calibration
[61]
Instruments, e.g. thermocyclers and pipettes shall be calibrated, e.g. according to ISO/IEC 17025.
A.2.16 Analysis steps
A.2.16.1 General
A.2.16.1.1 Preparation of the DNA for standard curve construction
Each of the 50 ng/μl rice DNA samples was diluted to 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl
using the DNA dilute solution provided by the method developer, and 5 μl of each of the diluted DNA
samples was used for real-time PCR for the standard curve construction.
For specific requirements, see ISO 21571.
A.2.16.1.2 PCR reagents
8 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.16.1.3 PCR master mix
See A.2.12.3.
A.2.16.1.4 Primers and probe
See Table A.6.
A.2.16.2 Procedure
A.2.16.2.1 General
The quantitative PCR for rice SPS gene is developed for a total volume of 25 µl per reaction mixture.
Thaw, mix gently and centrifuge the quantitative real-time PCR master mix and the DNA samples needed
for the run. Keep thawed reagents at 1 °C to 4 °C on ice.
Distribute 20 µl/tube of the master mixture to 200 µl PCR reaction tubes (A.2.11.5). Add 5 µl of DNA
solution samples, rice positive control, negative control, and blank control (H O) to the tubes, respectively.
2
Mix the PCR tubes gently and centrifuge in the microcentrifuge (A.2.11.1) at 1 000 × g for 10 s.
Place the plate (A.2.11.12) into the instrument.
Run the PCR with quantitative real-time PCR cycling conditions.
A.2.16.2.2 PCR controls
See A.2.6.
A.2.16.2.3 Preparation of standards
Calibration curves are produced by plotting C values against the logarithm of the quantity of target
t
1)
DNA, in nanograms. This can be done by use of spreadsheet software [e.g. Microsoft Excel ], or directly
by options available with the sequence detection system software (A.2.11.11).
The mass, in nanograms, measured for the unknown sample DNA is obtained by interpolation from the
standard curve.
A.2.16.2.4 Temperature–time programme (PCR)
®1)
The PCR assay has been optimized for use in an ABI Prism 7700 sequence detection system and
1)
a Rotor Gene 3000A real-time PCR system (A.2.11.10). Other systems may be used. In these cases,
thermal cycling conditions may have to be adjusted. The quantitative real-time PCR temperature–time
programme is outlined in Table A.7.
Table A.7 — Quantitative real-time PCR temperature–time programme
T Time
Step Stage Acquisition Cycles
°C s
1 Activation of DNA polymerase and denaturation 95 900 No 1×
2 Denaturation 95 15 No 40×
Amplification
3 Annealing and extension 60 45 Measure
© ISO 2013 – All rights reserved 9
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.2.16.2.5 Accept or reject criteria
A.2.16.2.5.1 Acceptance and performance criteria are described in Reference [60].
Method performance requirements used to evaluate the results from the collaborative study are given
in A.2.16.2.5.2 to A.2.16.2.5.4.
A.2.16.2.5.2 The dynamic range of the method should include 1/10 and at least five times the target
concentration. Target concentration should be intended as the threshold relevant for legislative
requirements.
A.2.16.2.5.3 The coefficient of variation of reproducibility should be below 35 % at the target concentration
and over the entire dynamic range. A C < 50 % is acceptable for concentrations below 0,2 %.
V, R
A.2.16.2.5.4 The trueness should be within ±25 % of the accepted reference value over the whole
dynamic range.
A.2.16.2.6 Identification
®1)
The use of a TaqMan probe allows the unambiguous identification of PCR products.
A.2.17 Sample identification
See A.2.6.
A.2.18 Interpretation and calculations of the results
After the quantitative real-time PCR is completed, locate the threshold line in the area where the
amplification profiles are parallel (exponential phase of PCR — logarithmic mode) and where there
is no cross-effect between repetitions of the same sample. Determine the cycle number at which the
threshold line crosses the first amplification curve and set the baseline three cycles before that value.
Export all the data for further calculations.
After having defined a threshold value within the logarithmic phase of amplification as described in
the previous paragraph, C values for each reaction are calculated using the instrument’s software. The
t
standard curves are constructed according to the C values at the threshold and the decimal logarithms
t
of the original template DNA quantities.
Thereafter, the standard curves are used to estimate the DNA content in the blind sample DNA by-
interpolation from the standard curves.
A.2.19 Record keeping
[61]
Record keeping shall conform to ISO/IEC 17025 requirements.
A.2.20 Reporting
[61]
Reporting shall conform to ISO 24276 and ISO/IEC 17025 requirements.
A.2.21 Safety measures
No specific requirements. See ISO 24276.
A.2.22 Pollution prevention and waste disposal
No specific requirements. See ISO 24276.
10 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(E)
A.3 Target-taxon-specific method for the detection of components derived from
tomato (Lycopersicon esculentum)
A.3.1 Principle
The LAT52 gene encodes a heat-stable, glycosylated, cysteine-rich protein that is necessary for tomato
pollen development. The LAT52 detection system has been demonstrated to be suitable for use as an
endogenous reference gene in GM tomato identification and quantification (Reference [62]). The GMO
Detection Laboratory of Shanghai Jiao Tong University (GMDL-SJTU) organized the collaborative trial
for validation of the method of detection of the tomato LAT52 gene as tomato endogenous gene for
quantitative analysis of genetically modified (GM) or non-GM tomato. The study involved 13 laboratories
from the USA, Singapore, Korea, Lithuania, Slovenia, Norway, Italy, and China. The results appear in
Reference [63], appendices 1 and 2.
The operational procedure of the collaborative study comprised the following modules:
— Quantitative real-time PCR for the quantitative standard curve construction using tomato DNA
samples from four different tomato cultivars.
— Quantitative real-time PCR for the quantification of blind tomato DNA samples using the constructed
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21570
Première édition
2005-11-01
AMENDEMENT 1
2013-04-15
Produits alimentaires — Méthodes
d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
quantitatives basées sur l’utilisation
des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid
based methods
AMENDMENT 1
Numéro de référence
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
©
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’Amendement 1 à l’ISO 21570:2005 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la
détection des organismes génétiquement modifiés et des
produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur
l’utilisation des acides nucléiques
AMENDEMENT 1
Dans le présent amendement, la numérotation des notes de bas de page n’a pas fait l’objet d’une mise à jour
permettant de l’adapter à la numérotation adoptée dans l’ISO 21750:2005. Les renvois de note de bas de
page indiqués sont donnés pour utilisation uniquement comme références au sein du présent amendement.
Page 1, Article 2
Mettre à jour les trois premières références comme suit et supprimer la note de bas de page 1).
ISO 21569:2005 + Amd.1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation
des acides nucléiques
ISO 21571:2005 + Amd.1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
ISO 24276:2006 + Amd.1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
Page 3, 7.1, dernier alinéa; Page 9, A.1.5.1; Page 16, B.1.5.1; Page 24, C.1.5.1; Page 32, C.2.5.1; Page 40, C.3.5.1;
Page 48, C.4.5.1; Page 56, C.5.5.1; Page 64, C.6.5.1; Page 72, C.7.5.1; Page 80, C.8.5.1; Page 88, C.9.5.1; Page 96,
D.1.5.1; Page 103, D.2.5.1
Remplacer «ISO 24276» par «ISO 24276:2006».
Pages 4 et 5, Articles 8 à 10
Remplacer le texte existant par le texte suivant.
ͺ Interprétation
Le résultat de la PCR sera soit a) soit b).
a) Approprié pour quantifier la séquence cible fournie si
— le résultat est positif conformément à l’ISO 21569:2005, 8.1;
— l’inhibition de la réaction observée n’est pas significative;
— l’analyse produit des mesures sans équivoque;
— la quantification de la séquence cible se situe dans la gamme dynamique de la méthode;
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
— l’analyse est étalonnée de façon acceptable (voir 7.3).
b) Inadapté pour quantifier la séquence cible si l’une des conditions indiquées en a) n’est pas remplie.
Interprétation de résultats non cohérents obtenus pour la même prise d’essai: en cas de résultats +/−
pour les deux réplicats, répéter les deux PCR pour la prise d’essai considérée. Si les deux nouveaux
réplicats donnent des résultats +/− ou −/−, le résultat est considéré comme négatif.
Interprétation de résultats non cohérents obtenus entre deux prises d’essai: en cas de résultats +/− pour
les deux prises d’essai d’un échantillon, les extractions et les analyses de deux nouvelles prises d’essai
doivent être refaites. Si ces résultats s’avèrent à nouveau +/−, alors le résultat est considéré comme
négatif conformément à l’ISO 24276:2006, 6.3.
L’incertitude de mesure doit être suffisamment faible pour permettre au laboratoire d’en tirer des
conclusions pertinentes.
Les Annexes A à D décrivent le mesurage des quantités d’ADN cible. Ces quantités peuvent être utilisées
pour déterminer le contenu en OGM. Ces opérations prennent en compte les facteurs biologiques
pertinents tels que l’homozygotie ou l’hétérozygotie des séquences cibles.
Si le contenu en séquences cibles GM ou en séquences cibles basées sur les taxons est inférieur à la limite
de quantification, alors les résultats doivent être seulement exprimés qualitativement.
NOTE L’expression d’un contenu en ADN OGM inférieur à la LQ pratique (accompagné d’une justification de
cette LQ) est considérée comme l’expression d’un résultat positif.
9 Expression des résultats
Les résultats doivent clairement indiquer la quantité de séquence cible GM en fonction de la séquence
spécifique des taxons cibles. Il convient également de fournir les résultats relatifs aux valeurs
d’incertitude de mesure, comme l’écart-type ou le coefficient de variation. En outre, il convient que
la limite de détection (LD) et la limite de quantification (LQ) de la méthode ainsi que la LD et la LQ
pratiques soient consignées. Il convient d’indiquer que le résultat concerne uniquement des cibles OGM.
Pour l’analyse de criblage quantitatif portant sur des matrices complexes, il est recommandé de préciser
si le signal OGM peut venir de taxons qui n’ont pas de lien avec la cible.
Les séquences cibles peuvent être ou non détectées, ou la quantité de l’une d’entre elles peut être
inférieure à la limite de quantification. Le Tableau 1 décrit les quatre cas alternatifs et l’expression du
résultat correspondant à inclure dans le rapport d’essai.
Le contenu en ADN OGM peut être également rapporté comme étant supérieur ou inférieur à une valeur
particulière, tout en prenant en compte l’incertitude de mesure.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Tableau 1 — Expression des résultats
Résultat Expression du résultat
La séquence spécifique des taxons cibles «Pour l’espèce X, l’ADN n’a pas été détecté.»
n’est pas détectée.
La séquence spécifique des taxons cibles Conformément à l’ISO 21569.
est détectée alors que la séquence cible
«Pour l’échantillon X, la séquence cible GM Y n’a pas été détectée.
GM ne l’est pas.
La LD de la méthode est de x %, mesurée à partir d’ABC (identifier le
matériel de référence).»
S’il est impossible de prouver que la taille de l’échantillon pour essai et la
quantité d’ADN cible dans la PCR sont suffisantes pour appliquer la LD,
alors la phrase suivante doit être ajoutée:
«Cependant, la quantité de l’ADN cible extrait de l’espèce X peut être/
était insuffisante pour que la LD soit applicable à cet échantillon. La LD
de l’échantillon est de x %.» (Spécifier l’unité de mesure utilisée.)
NOTE La LD de l’échantillon est déterminée par la quantité relative d’ADN de
l’espèce introduite dans la réaction analytique (nombre de copies), et par rapport
à la LD absolue de la cible GM (nombre de copies) et dans le cas des graines et des
semences, le nombre de graines ou de semences dans la portion qui a été broyée.
La séquence spécifique des taxons cibles Pour chaque OGM, indiquer:
et la séquence cible GM sont toutes les
«Le contenu en ADN OGM (spécifier le type d’OGM) tel que déterminé
deux détectées mais la quantité obtenue
par la détection de (spécifier la séquence cible) provenant de (spécifier
est inférieure à la LQ pour au moins une
l’espèce) a été détecté, mais sa valeur était inférieure à la limite de quan-
des séquences cibles.
tification pratique.»
En outre, le cas échéant: «La limite de quantification pratique est de x %.»
(Spécifier l’unité de mesure utilisée.)
La séquence spécifique des taxons cibles et Pour chaque OGM, indiquer:
la séquence cible GM sont toutes les deux
«Le contenu en ADN OGM (spécifier l’OGM) tel que déterminé par la détec-
détectées et leur quantité est supérieure
tion de (spécifier la séquence cible) provenant de (spécifier l’espèce) est
à la LQ des deux séquences cibles.
de x ± u %” où u est l’incertitude de mesure.» (Spécifier l’unité
meas meas
utilisée.)
10 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit être rédigé conformément à l’ISO 24276 et l’ISO 21569 et doit contenir au moins
les informations complémentaires suivantes:
a) la LQ de la méthode et la matrice utilisée pour l’établir;
b) la LQ pratique;
c) une référence à la méthode d’extraction de l’ADN utilisée;
d) une référence aux méthodes employées pour l’amplification des séquences ADN cibles;
e) le matériel de référence utilisé;
f) les résultats exprimés conformément à l’Article 9;
g) la cible PCR, en particulier si cette cible est considérée comme «spécifique de l’événement» ou
«spécifique du construit», ou comme un «criblage»;
h) la définition de l’incertitude de mesure utilisée.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
NOTE Pour les points g) et h), les informations peuvent figurer dans différents documents (par exemple
revue de contrat, fiches techniques).
Page 12, Annexe A
Ajouter A.2 et A.3.
A.2 Méthode spécifique du taxon cible pour détecter l’ADN de riz
A.2.1 Principe
Le gène SPS du riz a été décrit comme un gène endogène de référence, parfaitement adapté pour identifier
et quantifier du riz génétiquement modifié (Référence [59]). Le laboratoire de détection des OGM de
l’Université Jiao Tong de Shanghai (GMDL-SJTU) a organisé un essai interlaboratoires pour valider
l’applicabilité du gène codant pour la saccharose phosphate synthase (SPS) du riz comme gène endogène
pour l’analyse quantitative du riz génétiquement modifié (GM) ou non génétiquement modifié (non-GM).
Douze laboratoires situés en Espagne, en Corée, en Lituanie, en Slovénie, au Japon, en Italie et en Chine
ont participé à cet essai.
Le mode opératoire de l’essai interlaboratoires comprenait les modules suivants.
— PCR quantitative en temps réel pour quantifier des échantillons d’ADN de riz sélectionnés en aveugle
pour construire des courbes étalons.
— PCR quantitative en temps réel pour quantifier des échantillons d’ADN de tomate sélectionnés en
aveugle à l’aide des courbes étalons construites.
L’essai interlaboratoires a été réalisé conformément aux lignes directrices suivantes reconnues au
niveau international:
[51]-[56]
— ISO 5725 ;
— protocole pour la conception, la conduite et l’interprétation des études de performance des méthodes
de l’IUPAC (Référence [12]).
Les résultats de cet essai interlaboratoires ainsi que le protocole correspondant sont indiqués en A.2.3.3.
A.2.2 Domaine d’application
La méthode a été optimisée pour les grains de riz et ses produits dérivés contenant des mélanges de
riz et d’autres matrices comme le maïs et le soja. L’applicabilité du gène SPS a été évaluée lors d’essais
interlaboratoires en utilisant des échantillons d’ADN extraits de grains de riz.
A.2.3 Statut de validation et critères de performance
A.2.3.1 Robustesse de la méthode
La robustesse du système de PCR quantitative en temps réel appliqué au gène SPS a été évaluée par
le concepteur de la méthode sur différents programmes d’amplification (c’est-à-dire en deux ou trois
phases) et sur trois échantillons différents d’ADN contenant des quantités connues d’ADN de riz
(échantillons d’ADN génomique de riz de 10 ng, 1 ng et 0,1 ng). Pour chaque échantillon, trois répétitions
ont été effectuées. Les systèmes de PCR quantitative en temps réel ont démontré leur robustesse et
ont parfaitement fonctionné aux différents programmes d’amplification et pour les trois concentrations
utilisées pour les échantillons d’ADN de riz.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Le système de PCR quantitative appliqué au gène SPS a également été soumis à essai sur d’autres
1)
1)
instruments de PCR en temps réel (Rotor gene 3000A , Corbett Research et ABI7700 , Applied
Biosystems), en utilisant trois volumes de réaction différents (20 µl, 25 µl et 30 µl; trois répétitions
par volume). Le système de PCR quantitative en temps réel a démontré sa robustesse et a parfaitement
fonctionné sur les divers instruments de PCR en temps réel et avec les différents volumes de réaction.
A.2.3.2 Essai intralaboratoire
Pour la préparation des échantillons, tous les échantillons d’ADN ont été extraits à l’aide de la
méthode au bromure d’hexadécyltriméthylammonium (CTAB) tirée de l’ISO 21571. La quantification
spectrométrique de la quantité d’ADN total extrait a été effectuée en utilisant la méthode tirée de
l’ISO 21571:2005, B.1. Après la quantification de l’ADN, une analyse PCR quantitative en temps réel a été
réalisée pour déterminer si la réaction PCR pouvait être inhibée.
Trois chercheurs ont soumis à essai le système PCR appliqué au gène SPS en utilisant l’ADN génomique
de riz. Les résultats étaient satisfaisants; en particulier, pour la PCR quantitative, le biais était inférieur
de 25 % par rapport à la gamme dynamique (c’est-à-dire entre 0,05 ng et 1,00 ng).
A.2.3.3 Essai interlaboratoires
La PCR quantitative a été utilisée pour établir des courbes étalons à partir d’échantillons d’ADN dilués
en série extraits de quatre cultivars de riz par le laboratoire GMDL-SJTU. L’efficacité de la réaction PCR
du système de PCR appliqué au gène SPS, calculée à partir de la pente de la courbe étalon à l’aide de la
−1/a
formule (10 − 1) × 100, où a est la pente, comprise entre 0,846 3 et 1,223 3, et du coefficient de
2
régression de la linéarité, R , était en moyenne égale à 0,997.
c
Le Tableau A.5 présente les résultats des huit échantillons d’ADN sélectionnés en aveugle. Ces résultats sont
évalués sur la base des critères d’acceptation et des exigences de performance de la méthode, établis par le
Réseau européen de laboratoires sur les OGM (ENGL) et adoptés par le Laboratoire européen de référence
pour les denrées alimentaires et les aliments pour animaux génétiquement modifiés (EU-RL GMFF)
(Référence [60]). Le Tableau A.5 indique les estimations de répétabilité et de reproductivité pour chaque
concentration de riz, après identification et suppression des valeurs aberrantes par l’essai de Cochran.
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
Tableau A.5 — Résultats obtenus pour la PCR quantitative en temps réel
Échantillons sélectionnés en aveugle
Paramètre
0,5 ng 0,5 ng 1ng 1 ng 2 ng 5 ng 5 ng 10 ng
Laboratoires présen-
12 12 12 12 12 12 12 12
tant des résultats
Échantillons par labo-
1 1 1 1 1 1 1 1
ratoire
Nombre de données
108 108 108 108 108 108 108 108
total
Données exclues 4 2 0 8 0 0 0 0
Raison invoquée pour Essai de Essai de Essai de
— — — — —
l’exclusion Cochran Cochran Cochran
Valeur moyenne 0,407 8 0,412 1 0,814 6 0,734 4 1,857 5 5,261 0 5,445 7 10,889 6
Écart-type de répéta-
0,058 3 0,071 9 0,143 5 0,111 0,336 2 0,936 4 1,142 7 1,867 7
bilité
Coefficient de variation
14,29 17,44 17,62 15,11 18,10 17,80 20,98 17,15
de répétabilité, %
Écart-type de repro-
0,130 2 0,061 8 0,249 6 0,092 7 0,201 3 0,810 9 0,989 6 1,617 5
ductibilité
Coefficient de variation
31,92 14,99 30,65 12,63 10,84 15,41 18,17 14,85
de reproductibilité, %
Biais, valeur absolue 0,092 2 0,087 8 0,185 3 0,265 5 0,142 4 −0,261 0 −0,445 8 −0,889 6
Biais, % −18,44 −17,57 −18,54 −26,53 −7,12 5,22 8,92 8,90
A.2.3.4 Sélectivité moléculaire
A.2.3.4.1 Généralités
Le Tableau A.6 répertorie les amorces et la sonde ciblant le fragment d’ADN du gène SPS de 81 pb.
Tableau A.6 — Séquences des amorces et de la sonde oligonucléotidiques
Nom Séquence ADN des oligonucléotides (sens 5′-3′)
Séquence des amorces et de la sonde pour PCR quantitative en temps réel
Amorce F SPS TTgCgCCTgAACggATAT
Amorce R SPS CggTTgATCTTTTCgggATg
Sonde SPS HEX- TCCgAgCCgTCCgTgCgTC -TAMRA
A.2.3.4.2 Expérience
Les échantillons d’ADN extraits de matériels provenant de onze plantes différentes (dont le riz) ont été
analysés à l’aide de la méthode PCR appliquée au gène SPS. Sur les onze échantillons, seul l’ADN de riz a
donné des résultats positifs. Les dix autres échantillons (c’est-à-dire le bambou, la sétaire verte, l’orge, le
blé, le millet sauvage, le colza, la tomate, la patate, le soja et l’Arabidopsis) se sont révélés négatifs.
Les échantillons d’ADN extraits de douze cultivars de riz différents ont été analysés à l’aide de la méthode
PCR spécifique développée pour détecter le gène SPS. Les douze échantillons ont donné des résultats positifs.
6 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.3.4.3 Théorie
La spécificité théorique des amorces et de la sonde pour le gène SPS a été évaluée par une recherche
de similitude à l’aide du programme BLASTN 2.0MP-WashU (Référence [64], date de la recherche:
2010-01-09). La séquence de 81 pb utilisée comme séquence de recherche est référencée sous le numéro
NCBI U33175 (nucléotides 1055-1135). Les résultats de la recherche avec le programme Blast ont
confirmé l’identité totale de la séquence de recherche avec la séquence du gène SPS du riz, et l’absence de
similitude avec d’autres gènes et espèces.
A.2.4 Principe et résumé
Un fragment de 81 pb du gène SPS est amplifié en utilisant deux amorces spécifiques du gène SPS du riz.
L’accumulation de produits PCR est mesurée à la fin de chaque cycle PCR (en temps réel) à l’aide d’une
sonde oligonucléotidique spécifique du gène SPS du riz marquée avec deux colorants fluorescents: FAM,
utilisé comme rapporteur, et TAMRA, utilisé comme «quencher» (voir le Tableau A.6). À cet effet, la
1)
chimie TaqMan® est utilisée. Le signal de fluorescence mesuré dépasse une valeur seuil définie par
l’utilisateur après un certain nombre de cycles. Ce nombre est appelé valeur C . Pour la quantification de
t
la quantité d’ADN du gène SPS du riz dans un échantillon inconnu, la valeur C est convertie en une valeur
t
du nombre de copies correspondante par comparaison avec une courbe d’étalonnage dont les valeurs C
t
sont directement liées aux nombres de copies connus (analyse de régression).
A.2.5 Termes et définitions
[51]
Pour les besoins du présent article, les termes et définitions donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 24276
s’appliquent.
A.2.6 Type et quantités d’échantillon
Pour cet essai interlaboratoires, la construction des courbes étalons a été effectuée en utilisant des
échantillons d’ADN extraits de grains provenant de quatre cultivars de riz. Huit échantillons sélectionnés
en aveugle ont ensuite été analysés en utilisant les quatre courbes étalons construites.
Les participants ont reçu les échantillons suivants.
— Quatre échantillons d’ADN provenant de différentes variétés de riz (3M, variété Indica provenant
des États-Unis; Balilla, variété Japonica provenant d’Italie; Guangluai, variété Indica provenant du
sud de la Chine et Shennong265, variété Japonica d’origine chinoise). Chaque échantillon avait une
concentration de 50 ng/μl pour un volume de 30 μl chacun. Chaque ADN de cultivar de riz a été dilué
et utilisé pour générer la courbe étalon correspondante.
— Huit échantillons d’ADN de riz sélectionnés en aveugle provenant de quatre variétés différentes de
riz (concentrations variant entre 0 ng/µl et ~50 ng/µl), pour un volume de 50 µl chacun.
— Témoin négatif d’ADN cible (étiqueté N): ADN de sperme de saumon (20 ng/µl).
— Témoin positif d’ADN cible (étiqueté P): ADN génomique (Guangluai4) (20 ng/µl). Tous les échantillons
d’ADN ont été purifiés en utilisant la méthode CTAB établie par le GMDL-SJTU. Les témoins négatifs
et positifs d’ADN cible ont été utilisés pour chaque plaque PCR.
— Les amorces et les sondes pour le système PCR appliqué au gène SPS (voir le Tableau A.6) et les
réactifs pour d’autres réactions étaient les suivants:
— solution Master Mix pour PCR en temps réel (1 ml × 6);
— solution pour diluer l’ADN (0,1× TE, 1,2 ml).
A.2.7 Limite de quantification (LQ), domaine d’utilisation
Conformément à la méthode utilisée, la LQ absolue de la méthode est de 0,01 ng/μl. La LQ relative de la
PCR quantitative n’a pas été évaluée lors d’un essai interlaboratoires.
© ISO 2013 – Tous droits réservés 7
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.8 Estimation de l’incertitude de mesure
Les résultats de l’essai interlaboratoires permettent d’obtenir l’incertitude globale de la méthode (voir
le Tableau A.5).
A.2.9 Interférences
La quantité et la capacité à amplifier l’acide nucléique utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel
sont des paramètres majeurs pour évaluer la sensibilité de la méthode. En outre, on ne connaît aucune
interférence spécifique liée à cette méthode.
A.2.10 Conditions physiques et environnementales
Les modes opératoires nécessitent de travailler dans un environnement stérile.
Les zones de travail utilisées pour l’extraction de l’ADN et pour la réaction et l’amplification PCR doivent
être strictement séparées.
Il convient d’éliminer tout ADN résiduel de l’équipement avant de l’utiliser.
Pour éviter toute contamination, il convient d’équiper les embouts des pipettes (A.2.11.6) de filtres
protecteurs contre les aérosols.
Utiliser uniquement des gants non poudrés (A.2.11.8) et les remplacer régulièrement.
Nettoyer régulièrement les paillasses et les équipements de laboratoire avec une solution d’hypochlorite
de sodium (10 % de chlore actif) (eau de javel).
Si nécessaire, il convient d’étalonner régulièrement les pipettes.
A.2.11 Appareillage et matériel
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
A.2.11.1 Microcentrifugeuse.
A.2.11.2 Congélateur maintenu à −20 °C et réfrigérateur maintenu à 4 °C.
A.2.11.3 Micropipettes.
A.2.11.4 Mélangeur vortex.
A.2.11.5 Tubes, de capacités 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
A.2.11.6 Embouts et embouts de filtre pour micropipettes.
A.2.11.7 Porte-tubes pour tubes à réaction.
A.2.11.8 Gants en vinyle ou en latex.
A.2.11.9 Dessiccateur sous vide pour sécher les culots d’ADN, facultatif.
A.2.11.10 Système de PCR en temps réel avec tubes à réaction en plastique pour mesurer la
fluorescence.
1)
A.2.11.11 Logiciel: Système de détection de séquences version 1.7 (Applied Biosystems,
1)
référence 4311876 ) ou versions équivalentes.
8 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
1)
A.2.11.12 Plaques de réaction optiques 96 puits, MicroAmp® (Applied Biosystems,
1)
référence N801-0560 ).
1)
A.2.11.13 Films adhésifs de protection optique, MicroAmp® (Applied Biosystems,
1)
référence 4311971 ).
1) 1)
A.2.11.14 Bouchons optiques, MicroAmp® (Applied Biosystems, référence 801-0935 ).
A.2.12 Réactifs et matériaux
A.2.12.1 Généralités
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs conformes aux spécifications de l’ISO 24276
et uniquement de l’eau distillée ou déminéralisée stérile ou de l’eau de pureté équivalente.
A.2.12.2 Extraction d’ADN
A.2.12.2.1 Bromure d’hexadécyltriméthylammonium (CTAB), qualité ultra-pure.
A.2.12.2.2 Chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl) aminométhane (tris), qualité biologie moléculaire.
A.2.12.2.3 Acide éthylènediaminetétraacétique, sel disodique (EDTA), titrage à 99,9 % (fraction
massique).
A.2.12.2.4 Éthanol, φ[CH CH OH] minimum 96 % (fraction volumique).
3 2
A.2.12.2.5 Isopropanol, φ[CH CH(OH)CH ] minimum 99,7 % (fraction volumique).
3 3
A.2.12.2.6 Chloroforme, φ(CHCl ) minimum 99 % (fraction volumique).
3
A.2.12.2.7 Chlorure de sodium, w(NaCl) minimum 99 % (fraction massique).
A.2.12.2.8 Hydroxyde de sodium, anhydre, w(NaOH) minimum 98 % (fraction massique).
A.2.12.2.9 Solution de ribonucléase A, à 10 mg/ml.
A.2.12.2.10 Solution de protéinase K, à 20 mg/ml.
A.2.12.2.11 Tampon de dilution: tris(A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.
A.2.12.2.12 Acide chlorhydrique, ρ(HCl) = 370 g/l.
A.2.12.2.13 ADN de testicules de hareng, ADN de thymus de veau ou ADN lambda.
A.2.12.3 PCR quantitative en temps réel
1)
Solution Master Mix pour PCR TaqMan® Universal (1×) ou équivalent approprié.
A.2.13 Prélèvement, transport, conservation et stockage des échantillons
© ISO 2013 – Tous droits réservés 9
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.14 Préparation de l’échantillon pour essai
S’assurer que l’échantillon pour essai est représentatif de l’échantillon pour laboratoire, par exemple
en broyant ou en homogénéisant les échantillons. L’ISO 21571 décrit en détail les mesures et étapes
opérationnelles à prendre en compte. Pour l’essai interlaboratoires, une quantité totale de 1 g de nouilles
de riz broyées a été utilisée.
A.2.15 Étalonnage des instruments
Les instruments, par exemple les thermocycleurs et les pipettes, doivent être étalonnés, par exemple
[61]
conformément à l’ISO/CEI 17025 .
A.2.16 Étapes de l’analyse
A.2.16.1 Généralités
A.2.16.1.1 Préparation de l’ADN pour la construction de courbes étalons
Chaque échantillon d’ADN de riz de 50 ng/µl a été dilué à 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl et 0,002 ng/μl
en utilisant la solution de dilution pour ADN fournie par le concepteur de la méthode, et 5 μl de chaque
échantillon d’ADN dilué ont été utilisés pour la PCR en temps réel pour construire des courbes étalons.
Pour les exigences spécifiques, voir l’ISO 21571.
A.2.16.1.2 Réactifs PCR
A.2.16.1.3 Solution Master Mix pour PCR
Voir A.2.12.3.
A.2.16.1.4 Amorces et sonde
Voir le Tableau A.6.
A.2.16.2 Mode opératoire
A.2.16.2.1 Généralités
La PCR quantitative appliquée au gène SPS de riz est conçue pour un volume total de 25 µl par
mélange réactionnel.
Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la solution Master Mix pour PCR quantitative en temps
réel et les échantillons d’ADN nécessaires à l’analyse. Conserver les réactifs décongelés sur de la glace à
une température comprise entre 1 °C et 4 °C.
Verser 20 µl par tube de la solution Master Mix dans des tubes à réaction PCR (A.2.11.5) de 200 µl.
Ajouter dans les tubes 5 µl d’échantillons de solution d’ADN, le témoin positif, le témoin négatif et le
témoin blanc (H O), respectivement.
2
Mélanger avec précaution les tubes PCR et les centrifuger dans une microcentrifugeuse (A.2.11.1) à
1 000 × g pendant 10 s.
Placer la plaque (A.2.11.12) dans l’appareil.
Démarrer la PCR en utilisant les conditions de cyclage de la PCR quantitative en temps réel.
10 © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 21570:2005/Amd.1:2013(F)
A.2.16.2.2 Témoins PCR
Voir A.2.6.
A.2.16.2.3 Préparation des étalons
Les courbes d’étalonnage sont générées en reportant sur un graphe les valeurs C en fonction du
t
logarithme de la quantité d’ADN cible (en nanogrammes). Ces graphes peuvent être créés par tableur
1)
(par exemple Microsoft Excel ) ou directement en utilisant les options fournies avec le logiciel du
système de détection de séquences. (A.2.11.11).
L’interpolation des courbes étalons permet de mesurer la masse (en nanogrammes) d’un échantillon
d’ADN inconnu.
A.2.16.2.4 Programme d’amplification (PCR)
1)
L’essai PCR a été optimisé pour le système de détection des séquences ABI Prism® 7700 et pour le
1)
système de PCR en temps réel (A.2.11.10) Rotor Gene 3000A . D’autres systèmes peuvent être utilisés.
Dans ce cas, il peut être nécessaire d’ajuster les conditions de cyclage thermique. Le programme
d’amplification utilisé par la PCR quantitative en temps réel est décrit dans le Table
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.