ISO 17853:2011
(Main)Wear of implant materials — Polymer and metal wear particles — Isolation and characterization
Wear of implant materials — Polymer and metal wear particles — Isolation and characterization
ISO 17853:2011 specifies methods for sampling wear particles generated by joint replacement implants in humans and in joint simulators. It specifies the apparatus, reagents and test methods to isolate and characterize both polymer and metal wear particles from samples of tissues excised from around the joint replacement implant, obtained at revision surgery or post mortem, and from samples of joint simulator test fluids. Some of these procedures could certainly be adapted for isolation and characterization of particles from human biological fluids (e.g. synovial fluid).
Usure des matériaux d'implant — Particules d'usure des polymères et des métaux — Isolation et caractérisation
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 17853
Третье издание
2011-03-01
Износ материалов имплантатов.
Полимерные и металлические частицы
продуктов износа. Выделение и
определение характеристик
Wear of implant materials — Polymer and metal wear particles —
Isolation and characterization
Ответственность за подготовку русской версии несѐт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьѐй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 17583:2011(R)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2011
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по адресу ниже или представительства ISO в соответствующей стране.
Бюро авторского права ISO
Почтовый ящик 56 CH-1211 Женева 20
Тел. + 41 22 749 01 11
Факс + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
Содержание Страница
Предисловние . iv
Введение . v
1 Область применения . 1
2 Термины и определения . 1
3 Принцип, реагенты и аппаратура . 1
3.1 Принцип . 1
3.2 Реагенты . 2
3.3 Аппаратура . 2
4 Метод отбора и анализа полимерных и металлических частиц продуктов износа из
образцов ткани . 3
4.1 Хранение и подготовка образцов . 3
4.2 Процедура выделения полимерных частиц . 4
4.3 Процедура выделения металлических частиц . 5
4.4 Сбор частиц . 6
4.5 Определение характеристик формы и размера частиц . 7
4.6 Идентификация частиц . 9
5 Методы отбора и анализа полимерных и металлических частиц из смазочного
материала моделей суставов . 9
5.1 Общие положения . 9
5.2 Процедура для полимерных материалов. Например, UHMWPE и
полиэфирэфиркетон (polyetheretherketone, PEEK) . 9
5.3 Процедура для металлических частиц . 11
5.4 Процедуры для керамических частиц . 14
6 Протокол испытания . 14
Библиография . 15
© ISO 2011 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основная задача технических комитетов заключается в подготовке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-
членам на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения
не менее 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного
или всех патентных прав.
ISO 17583 был подготовлен Техническим Комитетом ISO/TC 150, Имплантаты хирургические,
Подкомитетом SC 4, Заменители костей и суставов.
Настоящее третье издание отменяет и заменяет второе издание (ISO 17853:2010), в которое внесены
незначительные изменения.
iv © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
Введение
Биологическая реакция на частицы продуктов износа способствует отказу имплантата сустава из-за
резорбции кости и последующего отсоединения имплантата. Стандартизированный метод извлечения
частиц из тканей и последующего определения характеристик частиц необходим для обеспечения того,
что исследования влияния частиц продуктов износа осуществляются с использованием единого
подхода. Описание характеристик частиц, получаемых из имплантатов в моделях суставов, также
представляют ценную информацию о свойствах и рабочих характеристиках изучаемых имплантатов.
В протоколах, включенных в настоящий международный стандарт, для выделения и определения
характеристик частиц, как из тканей, так и из жидкой испытательной среды в модели сустава, частицы
выделяются, а затем распределяются с помощью фильтрации или введения в смолу для анализа с
использованием сканирующей электронной микроскопии (scanning electron microscopy, SEM) и
трансмиссионной электронной микроскопии (transmission electron microscopy, TEM). В последнее время
были разработаны альтернативные протоколы выделения и описания характеристик металлических
частиц испытуемых имплантатов в модели сустава, в которых частицы осаждаются на пластинах для
[1]
анализа SEM, без фильтрации или введения . На момент публикации настоящего международного
стандарта, этот альтернативный метод еще не был проверен на выделение и описание характеристик
частиц из тканей, и прямое сравнение различных методов было не доступно. Таким образом, не были
включены детали последнего метода.
© ISO 2011 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 17583:2011(R)
Износ материалов имплантатов. Полимерные и
металлические частицы продуктов износа. Выделение и
определение характеристик
1 Область применения
В данном международном стандарте установлены методы отбора проб частиц продуктов износа,
образованных имплантатами для замены сустава в организме человека и в моделях суставов. В нем
определены приборы, реактивы и методы испытаний для выделения и определения характеристик как
полимерных, так и металлических частиц продуктов износа из образцов ткани, вырезанных из
областей, окружающих разные имплантаты для замены сустава, полученных при повторной операции
или после смерти, и из образцов жидкой испытательной среды при испытаниях в модели. Некоторые
из этих процедур, безусловно, могут быть адаптированы для выделения и определения характеристик
частиц из биологических жидкостей человека (например, синовиальной жидкости).
Методы, приведенные в данном международном стандарте, не определяют количественно уровень
износа имплантата или степень износа какой-либо конкретной поверхности. Настоящий стандарт не
распространяется на биологическое влияние частиц продуктов износа и не предоставляет метод
оценки биологической безопасности.
2 Термины и определения
В рамках настоящего стандарта используются следующие термины и определения.
2.1
полимерные частицы продуктов износа
polymer wear particle
частицы, образованные при износе полимерных компонентов имплантата
2.2
металлические частицы продуктов износа
metal wear particle
частицы и частицы продуктов коррозии, образованные износом металлических компонентов имплантата
2.3
керамические частицы продуктов износа
ceramic wear particle
частицы, образованные износом керамических компонентов имплантата
3 Принцип, реагенты и аппаратура
3.1 Принцип
Полимерные и металлические частицы продуктов износа выделяются из образцов ткани и смазочных
материалов модели путем гидролиза. Полученные частицы каждого вида затем очищают путем
удаления всех оставшихся органических остатков.
ПРИМЕЧАНИЕ Методы для выделения полимерных и металлических частиц разные и описаны в 4.2 и 4.3, соответственно.
© ISO 2011 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
Частицы собираются, их характеристики определяются и подсчитываются (если применимо) с
помощью сканирующей электронной микроскопии (scanning electron microscopy, SEM) и
трансмиссионной электронной микроскопии (transmission electron microscopy, TEM).
3.2 Реагенты
Во время анализа, если не указано иное, используйте только реагенты признанной аналитической
чистоты и дистиллированную воду или воду эквивалентной чистоты.
Все растворы реагентов перед использованием необходимо фильтровать через фильтр с размером
пор 0,2 мкм или меньше, чтобы избежать загрязнения образцов посторонними частицами.
3.2.1 Абсолютный спирт (этанол).
3.2.2 Ацетон, 100 % или разбавленный дистиллированной водой с объемной фракцией ацетона 80 %.
3.2.3 Дистиллированная вода.
3.2.4 Фиксатор, например, формалин, разбавленный дистиллированной водой с объемной
фракцией формалина 10 %.
3.2.5 Раствор соляной кислоты, HCl, c 0,01 моль/л.
3 3
3.2.6 Смесь изопропанол-вода, 0,96 г/см и 0,90 г/см .
3.2.7 Раствор папаина, содержащий 25 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при
4,8 ЕД/1,5 мл 250 мM натрий-фосфатного буфера, pH 7,4.
3.2.8 Натрий-фосфатный буфер, содержащий 25 мM ЭДТА при 250 мM, pH 7,4.
3.2.9 К протеиназа, 2 г/мл на 50 мM TRIS-гидрохлорида (TRIS-HCl), pH 7,6.
ПРИМЕЧАНИЕ Для частиц, выделенных из смазочных материалов моделей суставов, величина должна быть
скорректирована в зависимости от процентного содержания масла в смазочном материале и начального объема
смазочного материала, из которого выделены частицы. См. 5.3.2.
3.2.10 Смола, эпоксидная, такая как EMbed 812.
3.2.11 Додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate, SDS), 2,5 г/100 мл дистиллированной воды
или 3 г/100 мл 80 % ацетона.
3.2.12 Гидрохлорид натрия, NaOH, растворы и гранулы, c 5 M.
3 3 3 3 3
3.2.13 Растворы сахаров, 1,35 г/см , 1,17 г/см , 1,08 г/см , 1,04 г/см и 1,02 г/см .
3.2.14 Буфер TRIS -гидрохлорид, TRIS-HCl, на 50 мМ, pH 7,6.
3.3 Аппаратура
Все аппараты перед использованием должны быть очищены и трижды промыты дистиллированной
водой, ранее отфильтрованной через фильтр с размером пор 0,2 мкм (3.3.6), чтобы удалить любые
загрязняющие частицы.
3.3.1 Алюминиевая стойка.
3.3.2 Балансир, с точностью не менее 0,1 мг.
3.3.3 Карбоновый клеящий материал.
2 © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
3.3.4 Пробирки для центрифуги, различных размеров.
3.3.5 Центрифуга.
3.3.6 Фильтры, с размером пор 0,2 мкм для фильтрации реагентов и дистиллированной воды.
3.3.7 Фильтрующая установка.
3.3.8 Медные сетки, покрытые формваром, с размером ячейки 200 для TEM анализа.
3.3.9 Инфракрасный спектрометр Фурье (Fourier Transform Infrared, FTIR).
3.3.10 Нагревательная пластина.
3.3.11 Ткань без ворса.
3.3.12 Пипетки, микропипетки и наконечники.
3.3.13 Поляризационный микроскоп.
3.3.14 Фильтры с поликарбонатной мембраной, с размером пор 10 мкм, 1 мкм, 0,1 мкм, 0,05 мкм и
0,015 мкм, для сбора частиц.
3.3.15 Сканирующий электронный микроскоп (scanning electron microscope, SEM), с модулем
энергетического дисперсионного рентгеновского анализа (energy dispersive X-ray analysis, EDXA).
3.3.16 Стерильные чашки Петри, с крышками.
3.3.17 Шприц, с иглой с широким отверстием.
3.3.18 Тефлоново-стеклянный гомогенизатор ткани.
3.3.19 Трансмиссионный электронный микроскоп (transmission electron microscope, TEM), с модулем
энергетического дисперсионного рентгеновского анализа (energy dispersive X-ray analysis, EDXA).
3.3.20 Ультразвуковой клеточный деструктор, оборудованный титановой микрозондом.
3.3.21 Ультразвуковая ванна.
3.3.22 Водяная баня, с контролируемой температурой и перемешиванием.
4 Метод отбора и анализа полимерных и металлических частиц продуктов
износа из образцов ткани
4.1 Хранение и подготовка образцов
Храните ткани при температуре 70 °C (или ниже) в морозильной камере, или при комнатной
температуре в фиксаторе, таком как формалин (3.2.4), разбавленном дистиллированной водой (3.2.3),
до объемной доли формалина 10% . Разморозьте ткань, если применимо, и промойте ее в
дистиллированной воде, прежде чем продолжить экстракцию. Удалите излишки воды из промытой
ткани, промокнув ее тканью без ворса (3.3.11).
Незафиксированные ткани должны быть обработаны в обычных условиях.
Должен быть записан вид хирургических инструментов, используемых для извлечения образца, в
случае загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ Может наблюдаться изменчивость выборки, связанная с происхождением образцов.
© ISO 2011 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
4.2 Процедура выделения полимерных частиц
4.2.1 Гидролиз ткани
Есть много опубликованных методов выделения полимерных частиц из тканей, прилегающих к протезу.
[2] [3]
Методы, представленные здесь, основаны на методах К Campbell et al. , Tipper et al. и
[4]
Richards et al. .
Перед гидролизом порежьте ткань на мелкие кусочки с помощью скальпеля и лезвия для уменьшения
времени гидролиза. Удалите липиды из измельченной ткани, поместив в смесь хлороформ:метанол в
соотношении объемов 2:1 на 24 ч или до тех пор, пока ткань не опустится на дно контейнера.
Достаньте ткань и промойте с использованием PBS (3.2.8).
Добавьте к ткани 5 М NaOH (3.2.12) (10 мл 5 М NaOH на 1 г ткани) и оставьте подвергаться гидролизу
на, как минимум, 24 часа в водяной бане с перемешиванием (3.3.22) при температуре 65°C. Можно
считать гидролиз завершенным, когда в суспензии не будет видимых твердых кусочков ткани.
4.2.2 Очистка полученных полимерных частиц
4.2.2.1 Общие положения
Полимерные частицы могут быть очищены от гидролизированной ткани несколькими способами.
Используйте один из методов, описанных в 4.2.2.2 или 4.2.2.3.
4.2.2.2 Очистка полимерных частиц высокоскоростным центрифугирование
Этот метод позволяет собрать частицы всех размеров от нанометрового диапазона до нескольких
миллиметров в длину, что позволяет выделить общий объем частиц. Охладите гидролизованную ткань
до 4 °C. Добавьте равный объем ледяного абсолютного спирта (3.2.1). В этот момент соли могут
выпасть в осадок. Если это так, добавьте высокоочищенной воды до растворения солей. Инкубируйте
раствор при температуре 4 °С в течение ночи, постоянно перемешивая. Центрифугируйте раствор при
20 000 g в течение 2 ч при температуре 4 °C. Отфильтруйте надосадочную жидкость в чистую пробирку
(3.3.4) и разбавьте 400 мл высокоочищенной воды для фильтрации.
4.2.2.3 Очистка полимерных частиц ультрацентрифугированием
3 3 3 3
Поместите 2 мл каждого раствора сахарозы (3.2.13) ( =1,35 г/см , 1,17 г/см , 1,08 г/см , 1,04 г/см и
3
1,02 г/см ) в пробирки для центрифуги (3.3.4), так чтобы пробирки были заполнены примерно на три
четверти, и добавьте точно измеренное небольшое количество суспензии гидролизированной ткани на
поверхность раствора сахарозы в каждую пробирку. Ультрацентрифугируйте на 100 000 g в течение
3 ч при температуре 5°C. Осторожно соберите верхний слой в стерильную пробирку и разбавьте
дистиллированной водой при температуре 65°C, чтобы помочь разбавить остаточную сахарозу.
Подвергните воздействию ультразвука в течение 10 мин, чтобы разбить агломерированные частицы и
нагревайте в течение 1 ч при температуре 80 °С для растворения сахарозы.
Поместите измеренные объемы суспензии в двухслойную смесь изопропанол-вода (3.2.6) плотностью
3 3
0,90 г/см и 0,96 г/см , находящуюся в пробирках для ультрацентрифуги. Ультрацентрифугируйте их
при 100 000 g в течение 1 ч при температуре 20°C. После извлечения пробирок из ротора
ультрацентрифуги, на границе раздела двух слоев должен быть виден слой белых частиц. Удалите
этот слой, содержащий полимерные частицы, и поместите в стерильную пробирку, используя
стеклянную пипетку с острым концом (3.3.12), введенную через верхний, изопропаноловый, слой.
Подвергните воздействию ультразвука в течение 10 мин, чтобы разбить любые агрегаты.
Могут использоваться другие времена и скорости ультрацентрифугирования при условии, что было
продемонстрировано, что они дают такую же степень разделения и результаты проверки процедуры
были документально оформлены.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Первый шаг ультрацентрифугирования служит для отделения легких полимерных частиц
4 © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
продуктов износа от тяжелых фракций. Второй шаг ультрацентрифугирования очищает полученные полимерные
частицы, пропуская его через меньший градиент плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Этот метод может отделять полимерные частицы крупнейших размеров и, следовательно,
общий объем продуктов износа не может быть выделен.
4.3 Процедура выделения металлических частиц
Из-за растворимости металлов в сильных кислотах и щелочах нужно использовать ферментативный
[5]
метод гидролиза. Приведенный ниже метод был описан Catelas et al. и похож на методику,
разработанную ранее теми же авторами для выделения частиц из смазочных материалов моделей
суставов (см. Раздел 5); он включает лишь незначительные различия на начальных этапах, а также в
концентрации фермента в расчете на использование тканей вместо смазочных материалов.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Возможность использования той же самой процедуры для выделения и определения
характеристик частиц из тканей и смазочных материалов моделей суставов позволяет провести прямое и точное
сравнение выделенных частиц, что важно, например, для проверки модели сустава. Это является существенным
преимуществом данной процедуры.
a) Разрежьте ткань на мелкие кусочки с помощью скальпеля и лезвия для уменьшения времени
гидролиза. Проведите перерастворение нескольких маленьких кусочков (около 2 мм 2 мм 2 мм)
в пробирках 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Вес ткани зависит от общего износа, отмеченного у пациента, а также кусочка ткани,
используемого для выделения частиц (например, гранулема, капсула).
Рекомендуется живой вес от 100 мг до 150 мг, но он может быть скорректирован по мере необходимости.
b) Промойте четыре раза в течение 2 мин. в натрий-фосфатном буфере (3.2.8), рН 7,4.
c) Проведите перерастворение кусочков ткани в 1 мл SDS (3.2.11) (2,5 г/100 мл дистиллированной
воды) и прокипятите в течение 10 мин. Во время кипячения, гомогенизируйте кусочки ткани в
растворе, используя тефлоново-стеклянный гомогенизатор ткани (3.3.18) через каждые 2 мин.
d) Охладите при комнатной температуре в течение 10 мин.
e) Центрифугируйте пробирки при 16 000 g в течение 10 мин.
f) Промойте один раз в 1 мл ацетона (3.2.2), разбавленного дистиллированной водой с объемной
долей ацетона 80%. Центрифугируйте на 16 000 g в течение 10 мин.
g) Промойте три раза в 1 мл на 250 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 25 мМ ЭДТА,
рН 7,4. Центрифугируйте при 16 000 g в течение 10 мин. для каждой промывки.
h) Воздействуйте ультразвуком в 1 мл 250 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 25 мМ ЭДТА,
рН 7,4, в течение от 20 с до 25 с, с использованием ультразвукового клеточного деструктора,
оснащенного микрозондом, или воздействуйте ультразвуком в водяной бане в течение 30 мин.
Использование ультразвукового клеточного деструктора является более эффективным, но следует
использовать соответствующие аппараты с чистым и неповрежденным/некорродированным зондом,
чтобы избежать возможного загрязнения от титанового зонда.
i) Добавить 0,5 мл 250 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 25 мМ ЭДТА, рН 7,4, и папаин
(3.2.7) (4,8 единиц на 1,5 мл натрий фосфатного буфера). Инкубируйте в водяной бане с
перемешиванием (3.3.22) в течение 24 ч при температуре 65 °C.
j) Центрифугируйте пробирку на 16 000 g в течение 10 мин.
k) Осторожно снимите жидкость, используя микропипетки, не касаясь гранул на дне пробирки.
© ISO 2011 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
l) Проведите перерастворение гранул в 1 мл SDS (2,5 г/100 мл дистиллированной воды).
m) Кипятите 10 мин.
n) Охладите при комнатной температуре в течение 10 мин.
o) Центрифугируйте пробирки при 16 000 g в течение 10 мин.
p) Осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
q) Промойте гранулы в 1 мл 50 мМ TRIS-HCl (3.2.14) (рН 7,6). Центрифугируйте пробирки при 16 000 g
в течение 10 мин. Осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в
нижней части пробирки.
r) Повторите шаг q) еще раз.
s) Проведите перерастворение гранул в 1 мл 50 мМ TRIS-HCl и воздействуйте на них ультразвуком в
течение 30 с с помощью ультразвукового клеточного деструктора, оснащенного микрозондом, или
воздействуйте ультразвуком в водяной бане в течение 30 мин.
Опять же, использование ультразвукового клеточного деструктора является более эффективным, но
следует использовать соответствующие аппараты с чистым и неповрежденным/некорродированным
зондом, чтобы избежать возможного загрязнения от титанового зонда.
t) Добавьте К протеиназы (3.2.9) (буфер 2 г/мл TRIS-HCl) и инкубируйте в течение 24 ч при
температуре 55 ° С в водяной бане с перемешиванием.
u) Центрифугируйте пробирки при 16 000 g в течение 15 мин.
v) Осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
w) Добавьте 1 мл SDS (2,5 г/100 мл дистиллированной воды).
x) Кипятите 10 мин.
y) Охладите при комнатной температуре в течение 10 мин.
z) Центрифугируйте пробирки при 16 000 g в течение 15 мин.
aa) Осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
bb) Промойте 1 мл 50 мМ TRIS-HCl (рН 7,6). Центрифугируйте при 16 000 g в течение 15 мин. и
осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
cc) Промойте 0,5 мл 80% ацетона, содержащего 3% SDS (3.2.11) (3 г на 100 мл раствора с 80%
ацетона). Центрифугируйте при 16 000 g в течение 15 мин. и осторожно удалите жидкость,
используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
dd) Промойте 1 мл дистиллированной воды. Центрифугируйте при 16 000 g в течение 15 мин. и
осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
ee) Добавьте концентрированный этанол (3.2.1) и храните при температуре 4 °С до сбора частиц (см. 4.4.2).
ПРИМЕЧАНИЕ 3 В качестве альтернативного метода, шаги g)-i) можно выполнить с использованием буфера
50 мМ TRIS-HCl. Эффективность используемого фермента папаина должна быть проверена.
4.4 Сбор частиц
4.4.1 Частицы полиэтилен
Соберите частицы на фильтры с размером пор 0,1 мкм, за которым идет фильтр с размером пор
6 © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 17583:2011(R)
0,015 мкм или аналогичный. Для частиц, выделенных высокоскоростным центрифугированием или
если необходим весь объем продуктов износа, отфильтруйте весь объем образца, полученного в
4.2.2.2, используя систему вакуумной фильтрации. Для частиц, выделенных
ультрацентрифугированием (см. 4.2.2.3), следует использовать ограниченные объемы суспензии
частиц в диапазоне от 10 мкл до 300 мкл или большие объемы разведенной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ Соответствующее разведение достигается тогда, когда суспензия кажется почти чистой, как
правило, в пропорциях между 1:10 и 1:100. Целью является получение концентрации частиц на фильтре, которая
не настолько большая, чтобы сделать визуализацию дискретных частиц с помощью SEM тяжелой, но обеспечив
при этом разумное число частиц, доступных для анализа (не менее 100 частиц).
При разведении запишите точное разведение каждого образца. Для фильтрации возьмите известный
объем суспензии частиц в шприц (3.3.17) и приложите конец шприца к фильтрационному элементу
(3.3.7). Легко надавите на шприц, чтобы вода протолкнулась через фильтр и вышла на другом конце
фильтрующего элемента со скоростью около одной капли (0,045 мл) в секунду, оставив частицы на
поверхности фильтра. Замените фильтр, если он засорился. Используйте последовательную
процедуру для каждого фильтра. Промойте фильтр и шприц дистиллированной водой. Наконец,
продуйте фильтр воздухом в том же направлении, что и фильтрация, прежде чем снять фильтр с
помощью пинцета и оставить его высохнуть на стерильной чашке Петри с крышкой.
В связи с малым размером частиц, должны использоваться фильтры с размером пор меньше 0,1 мкм,
если они доступны. В этом случае может быть необходима последовательная фильтрации, чтобы
избежать засорения пор.
4.4.2 Металлические частицы
Центрифугируйте частицы в этаноле (от протокола выделения, описанного в 4.3) при 16 000 g в течение 20
мин. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 0,5 мл смеси 100% ацетон:эпоксидная смола (3.2.10) (1:1).
Поместите пробирку в держатель пробирок и оставьте вращаться на ночь при комнатной температуре (этот
шаг мог бы быть сокращен для очень маленьких гранул). Центрифугируйте частицы при 16 000 g в течение 20
мин. Осторожно удалите жидкость, используя микропипетку, не касаясь гранул в нижней части пробирки.
Оставьте пробирки под вакуумом в течение 1 часа, чтобы удалить оставшийся ацетон. Добавьте 1 мл чистой
эпоксидной смолы (3.2.10) и оставьте пробирки под вакуумом в течение 3 ч. Выдержите пробирки при
температуре 60 °С в течение 48 ч для полимеризации смолы. Удалите пластиковые пробирки для получения
твердой смолы с частицами гранул на дне. Этот протокол позволяет выполнить инфильтрацию в гранулы
смолы и выделить частицы.
Разделите гранулы с помощью алмазного ножа и расположите на секциях (толщиной от 100 нм до
[5][6]
120 нм) на медной сетке, покрытой формваром, с размером ячеек 200 для анализа TEM . Сечение
гранулы должно быть таким, чтобы можно было определить все частицы, представленные в грануле
(сечение всей гранулы, если это возможно).
ПРИМЕЧАНИЕ Металлические частицы можно также собрать путем вакуумной фильтрации на мембранном
фильтре 0,015 мкм для анализа с использованием SEM c высоким разрешением. Однако при использовании этого
метода, пользователю необходимо проверить потенциальные агломерации частиц и окисление на фильтре и
учитывать потенциальные потери частиц.
4.5 Определение характеристик формы и размера частиц
4.5.1 Частицы полиэтилена
Для получения SEM изображения частиц, прикрепите фильтр с частицами на нем на опору SEM,
используя карбоновый клеящий материал (3.3.3). Накройте фильтр золотым или другим проводящим
материалом, например платиной/палла
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17853
Third edition
2011-03-01
Wear of implant materials — Polymer and
metal wear particles — Isolation and
characterization
Usure des matériaux d'implant — Particules d'usure des polymères et
des métaux — Isolation et caractérisation
Reference number
ISO 17853:2011(E)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2011
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Terms and definitions .1
3 Principle, reagents and apparatus.1
3.1 Principle .1
3.2 Reagents .2
3.3 Apparatus.2
4 Methods of sampling and analysis of polymer and metal wear particles from tissue
samples .3
4.1 Storage and preparation of samples.3
4.2 Procedure for polymer particle isolation .4
4.3 Procedure for metal particle isolation.5
4.4 Collection of particles.6
4.5 Particle size and shape characterization .7
4.6 Particle identification .8
5 Methods of sampling and analysis of polymer and metal particles from joint simulator
lubricants .9
5.1 General .9
5.2 Procedure for polymer materials — For example UHMWPE and polyetheretherketone
(PEEK).9
5.3 Procedure for metal particles.10
5.4 Procedure for ceramic particles .13
6 Test report.13
Bibliography.15
© ISO 2011 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17853 was prepared by Technical Committee ISO/TC 150, Implants for surgery, Subcommittee SC 4,
Bone and joint replacements.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 17853:2010), of which it constitutes a minor
revision.
iv © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
Introduction
The biological responses to wear particles contribute to the failure of joint implants through bone resorption
and consequent implant loosening. A standardized method of particle retrieval from the tissues followed by
particle characterization is necessary to ensure that the investigations of wear particle effects have a uniform
approach. The characterization of the particles generated from implants in joint simulators also provides
valuable information on the wear properties and performance of the implant being studied.
In the protocols included in this International Standard, for isolation and characterization of particles from both
tissues or test fluids from joint simulators, the particles are isolated and then dispersed using filtration or
embedding in resin for scanning electron microscopy (SEM) or transmission electron microscopy (TEM)
analysis. An alternative protocol for isolation and characterization of metal particles from implants tested in
joint simulators has recently been developed in which the particles are deposited on to wafers for SEM
[1]
analysis, without filtration or embedding . At the time of publication of this International Standard, this
alternative method has not been tested for isolation and characterization of particles from tissues and no
direct comparison between the different methods is available. Therefore, the latter method has not been
included in detail.
© ISO 2011 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 17853:2011(E)
Wear of implant materials — Polymer and metal wear
particles — Isolation and characterization
1 Scope
This International Standard specifies methods for sampling wear particles generated by joint replacement
implants in humans and in joint simulators. It specifies the apparatus, reagents and test methods to isolate
and characterize both polymer and metal wear particles from samples of tissues excised from around the joint
replacement implant, obtained at revision surgery or post mortem, and from samples of joint simulator test
fluids. Some of these procedures could certainly be adapted for isolation and characterization of particles from
human biological fluids (e.g. synovial fluid).
The methods given in this International Standard do not quantify the level of wear the implant produces;
neither do they determine the amount of wear from any particular surface. This International Standard does
not cover the biological effects of wear particles or provide a method for evaluation of biological safety.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
polymer wear particle
particle generated from the wear of polymeric components of an implant
2.2
metal wear particle
particle and particulate corrosion product generated from the wear of metal components of an implant
2.3
ceramic wear particle
particle generated from the wear of ceramic components of an implant
3 Principle, reagents and apparatus
3.1 Principle
Particles of polymeric and metal wear are isolated from tissue samples and simulator lubricants by digestion.
The yield of each particle species is then purified by eliminating any remaining organic debris.
NOTE The methods involved in polymer and metal particle isolation are different and are described in 4.2 and 4.3,
respectively.
The particles are collected, and are characterized and counted (where applicable) using scanning electron
microscopy (SEM) or transmission electron microscopy (TEM).
© ISO 2011 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
3.2 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled
water or water of equivalent purity.
All reagent solutions shall be filtered through a filter of 0,2 µm or smaller pore size prior to use, to avoid
contamination of the sample by extraneous particles.
3.2.1 Absolute ethanol.
3.2.2 Acetone, 100 % or diluted with distilled water, with a volume fraction of 80 % acetone.
3.2.3 Distilled water.
3.2.4 Fixative, e.g. formalin, diluted with distilled water, with a volume fraction of 10 % formalin.
3.2.5 Hydrochloric acid solution, HCl, c = 0,01 mol/l.
3 3
3.2.6 Isopropanol-water mixtures, ρ = 0,96 g/cm and ρ = 0,90 g/cm .
3.2.7 Papain solution, at 4,8 U/1,5 ml of 250 mM sodium phosphate buffer containing 25 mM
ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 7,4.
3.2.8 Sodium phosphate buffer, at 250 mM containing 25 mM of EDTA, pH 7,4.
3.2.9 Proteinase K, 2 g/ml of 50 mM TRIS-hydrochloride (TRIS-HCl), pH 7,6.
NOTE For particles isolated from joint simulator serum lubricant, the quantity should be adjusted depending on the
serum percentage of the lubricant and initial serum volume from which particles are isolated. See 5.3.2.
3.2.10 Resin, epoxy, such as EMbed 812.
3.2.11 Sodium dodecyl sulfate (SDS), 2,5 g/100 ml of distilled water or 3 g/100 ml of 80 % acetone.
3.2.12 Sodium hydroxide, NaOH, solutions and pellets, c = 5 M.
3 3 3 3 3
3.2.13 Sucrose solutions, ρ = 1,35 g/cm , 1,17 g/cm , 1,08 g/cm , 1,04 g/cm and 1,02 g/cm .
3.2.14 TRIS-hydrochloride buffer, TRIS-HCl, at 50 mM, pH 7,6.
3.3 Apparatus
All apparatus shall be cleaned and triple rinsed with distilled water previously filtered through a filter of 0,2 µm
pore size (3.3.6) before use to remove any contaminating particles.
3.3.1 Aluminium stub.
3.3.2 Balance, with an accuracy of at least 0,1 mg.
3.3.3 Carbon stickers.
3.3.4 Centrifuge tubes, different sizes.
3.3.5 Centrifuge.
3.3.6 Filters, with a pore size of 0,2 µm for filtering reagents and distilled water.
2 © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
3.3.7 Filtration unit.
3.3.8 Formvar-coated copper grids, of 200 mesh size for TEM analysis.
3.3.9 Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscope.
3.3.10 Heating plate.
3.3.11 Lint-free cloth.
3.3.12 Pipettes, micropipettes and tips.
3.3.13 Polarizing light microscope.
3.3.14 Polycarbonate membrane filters, of pore sizes 10 µm, 1 µm, 0,1 µm, 0,05 µm and 0,015 µm, for
collecting particles.
3.3.15 Scanning electron microscope, SEM, with an energy dispersive X-ray analysis (EDXA) module.
3.3.16 Sterile Petri dishes, with lids.
3.3.17 Syringe, with wide-bore needle.
3.3.18 Teflon-glass potter tissue grinder.
3.3.19 Transmission electron microscope, TEM, with an energy dispersive X-ray analysis (EDXA) module.
3.3.20 Ultrasonic cell disrupter, equipped with a titanium microprobe.
3.3.21 Ultrasonic bath.
3.3.22 Water bath, agitating temperature controlled.
4 Methods of sampling and analysis of polymer and metal wear particles from
tissue samples
4.1 Storage and preparation of samples
Store the tissue at −70 °C (or lower) in a freezer, or at room temperature in a fixative such as formalin (3.2.4),
diluted with distilled water (3.2.3), with a volume fraction of 10 % formalin. Thaw the tissue, if applicable, and
rinse it thoroughly in distilled water before continuing with the extraction method. Remove excess water from
the rinsed tissue by blotting with a lint-free cloth (3.3.11).
Unfixed tissue should be handled under universal conditions.
The nature of surgical instruments used for sample retrieval should be recorded in case of contamination.
NOTE Sampling variability due to specimen origin can occur.
© ISO 2011 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
4.2 Procedure for polymer particle isolation
4.2.1 Tissue digestion
There are many published methods for polyethylene particle isolation from periprosthetic tissues. The
[2] [3] [4]
methods presented here are based on those of Campbell et al. , Tipper et al. and Richards et al. .
Cut the tissue into smaller pieces using a scalpel and blade before digestion to speed up the digestion times.
Extract the lipids from the minced tissue by placing into a 2:1 (volume ratio) chloroform:methanol mixture for
24 h or until the tissue sinks to the bottom of the container. Remove and rinse the tissue with PBS (3.2.8).
Add 5 M NaOH (3.2.12) to the tissue (10 ml of 5 M NaOH to 1 g of tissue) and leave to digest for a minimum
of 24 h in an agitating water bath (3.3.22) at 65 °C. Digestion can be judged to be complete when no visible
solid pieces of tissue remain in the suspension.
4.2.2 Purification of the polymer particle yield
4.2.2.1 General
The polymer particles can be purified from the digested tissue in a number of ways. Use one of the methods
described in 4.2.2.2 or 4.2.2.3.
4.2.2.2 Purification of polymer particles by high-speed centrifugation
This method enables all particle sizes to be collected from the nanometre-size range to several millimetres in
length, enabling the total wear volume of particles to be isolated. Cool the digested tissue to 4 °C. Add an
equal volume of ice-cold absolute ethanol (3.2.1). At this point, salts might precipitate. If this is the case, add
ultrapure water until the salt dissolves. Incubate the solution at 4 °C overnight with stirring. Centrifuge the
solution at 20 000 g for 2 h at 4 °C. Decant the supernatant liquid into a clean tube (3.3.4) and dilute with
400 ml of ultrapure water prior to filtration.
4.2.2.3 Purification of polymer particles by ultracentrifugation
3 3 3 3
Place 2 ml of each sucrose solution (3.2.13) (ρ = 1,35 g/cm , 1,17 g/cm , 1,08 g/cm , 1,04 g/cm and
3
1,02 g/cm ) into centrifuge tubes (3.3.4) so that the tubes are roughly three-quarters full, and apply measured
aliquots of the digested tissue suspension to the surface of the sucrose solution in each tube. Ultracentrifuge
at 100 000 g for 3 h at 5 °C. Carefully collect the top layer into a sterile tube and dilute with distilled water at
65 °C to help dilute the residual sucrose. Ultrasonicate for 10 min to break up the agglomerated particles and
then heat for 1 h at 80 °C to dissolve the sucrose.
Apply measured volumes of the suspension to two layers of isopropanol-water mixture (3.2.6) of densities
3 3
0,90 g/cm and 0,96 g/cm formed in ultracentrifuge tubes. Ultracentrifuge these at 100 000 g for 1 h at 20 °C.
After removing the tubes from the ultracentrifuge rotor, a layer of white particles should be visible at the
interface of the two layers. Remove this layer, containing the polyethylene particles, and place into a sterile
tube using a fine-tipped glass pipette (3.3.12) inserted through the top isopropanol layer. Ultrasonicate for
10 min to break up any aggregates.
Different ultracentrifugation times and speeds may be used, provided that they have been demonstrated to
give the same degree of separation and the results of the verification procedure have been documented.
NOTE 1 The first ultracentrifugation step serves to separate the lighter polyethylene wear particles from the heavier
fractions. The second ultracentrifugation step purifies the polyethylene particle yield by putting it through a finer density
gradient.
NOTE 2 This method might discriminate against the largest sizes of polyethylene generated, and consequently, the
total wear volume might not be isolated.
4 © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
4.3 Procedure for metal particle isolation
Due to the solubility of metals in strong acids and alkalis, an enzymatic digestion method needs to be used.
[5]
The method below has been described by Catelas et al. and is similar to the procedure developed earlier by
[6]
the same authors for particle isolation from joint simulator lubricant (c.f. Clause 5), with only minor
differences in the initial steps as well as in the enzyme concentrations to account for the use of tissue instead
of serum lubricant.
NOTE 1 Being able to use the same procedure to isolate and characterize particles from tissues and joint simulator
[7]
lubricant enables direct and accurate comparison of the isolated particles , which is important, for example, for joint
simulator validation. This is a significant advantage of this procedure.
a) Cut the tissue into small pieces using a scalpel and blade to speed up the digestion time. Resuspend
several small pieces (about 2 mm × 2 mm × 2 mm) in 2 ml tubes.
NOTE 2 The tissue weight depends on the overall wear noticed in the patient as well as the piece of tissue used for
particle isolation (e.g. granuloma, capsule).
The recommended wet weight is 100 mg to 150 mg, but may be adjusted as necessary.
b) Wash four times for 2 min in sodium phosphate buffer (3.2.8), pH 7,4.
c) Resuspend the tissue pieces in 1 ml of SDS (3.2.11) (2,5 g/100 ml of distilled water) and boil for 10 min.
While boiling, homogenize the tissue pieces in solution using a Teflon-glass potter tissue grinder (3.3.18)
every 2 min.
d) Cool at room temperature for 10 min.
e) Centrifuge the tubes at 16 000 g for 10 min.
f) Wash once with 1 ml of acetone (3.2.2), diluted with distilled water with a volume fraction of 80 % acetone.
Centrifuge at 16 000 g for 10 min.
g) Wash three times with 1 ml of 250 mM sodium phosphate buffer containing 25 mM EDTA, pH 7,4.
Centrifuge at 16 000 g for 10 min for each wash.
h) Sonicate in 1 ml of 250 mM sodium phosphate buffer containing 25 mM EDTA, pH 7,4, for 20 s to 25 s,
using an ultrasonic cell disrupter equipped with a microprobe, or in a sonicating water bath for 30 min.
Using the ultrasonic cell disrupter is more efficient, but an appropriate apparatus with a clean and
undamaged/non-corroded probe tip should be used to avoid potential titanium contamination from the probe tip.
i) Add 0,5 ml of 250 mM sodium phosphate buffer containing 25 mM EDTA, pH 7,4, and papain (3.2.7)
(4,8 units per 1,5 ml of sodium phosphate buffer). Incubate in an agitated water bath (3.3.22) for 24 h at
65 °C.
j) Centrifuge the tubes at 16 000 g for 10 min.
k) Carefully remove the liquid using a micropipette without touching the pellet at the bottom of the tubes.
l) Resuspend the pellet in 1 ml of SDS (2,5 g/100 ml of distilled water).
m) Boil for 10 min.
n) Cool at room temperature for 10 min.
o) Centrifuge the tubes at 16 000 g for 10 min.
p) Carefully remove the liquid using a micropipette without touching the pellet at the bottom of the tubes.
© ISO 2011 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
q) Wash the pellet with 1 ml of 50 mM TRIS-HCl (3.2.14) (pH 7,6). Centrifuge the tubes at 16 000 g for
10 min. Carefully remove the liquid using a micropipette without touching the pellet at the bottom of the
tubes.
r) Repeat step q) once more.
s) Resuspend the pellet in 1 ml of 50 mM TRIS-HCl and sonicate for up to 30 s using an ultrasonic cell
disrupter equipped with a microprobe, or in a sonicating water bath for 30 min.
Once again, using the ultrasonic cell disrupter is more efficient, but an appropriate apparatus with a clean and
undamaged/non-corroded probe tip should be used to avoid potential titanium contamination from the probe tip.
t) Add proteinase K (3.2.9) (2 g/ml of TRIS-HCl buffer) and incubate for 24 h at 55 °C in an agitated water
bath.
u) Centrifuge the tubes at 16 000 g for 15 min.
v) Carefully remove the liquid using a micropipette without touching the pellet at the bottom of the tubes.
w) Add 1 ml of SDS (2,5 g/100 ml of distilled water).
x) Boil for 10 min.
y) Cool at room temperature for 10 min.
z) Centrifuge the tubes at 16 000 g for 15 min.
aa) Carefully remove the liquid using a micropipette without touching the pellet at the bottom of the tubes.
bb) Wash with 1 ml of 50 mM TRIS-HCl (pH 7,6). Centrifuge at 16 000 g for 15 min and carefully remove the
liquid using a micropipette without touching the pellet at the bottom of the tubes.
cc) Wash with 0,5 ml of 80 % acetone containing 3 % SDS (3.2.11) (3 g/100 ml solution in 80 % acetone).
Centrifuge at 16 000 g for 15 min and carefully remove the liquid using a micropipette without touching
the pellet at the bottom of the tubes.
dd) Wash with 1 ml of distilled water. Centrifuge at 16 000 g for 15 min and carefully remove the liquid using a
micropipette without touching the pellet at the bottom of the tubes.
ee) Add absolute ethanol (3.2.1) and store at 4 °C until collecting the particles (see 4.4.2).
NOTE 3 Alternatively, steps g) to i) might be performed using 50 mM TRIS-HCl buffer. The efficacy of the papain
enzyme used should then be verified.
4.4 Collection of particles
4.4.1 Polyethylene particles
Collect particles on filters of pore size 0,1 µm followed by a 0,015 µm filter, or similar. For particles isolated by
high-speed centrifugation or where the whole wear volume is necessary, filter the entire sample volume
obtained in 4.2.2.2 using a vacuum filtration system. For particles isolated by ultracentrifugation (see 4.2.2.3),
use between 10 µl and 300 µl aliquots of the particle suspension or larger volumes of diluted suspension.
NOTE The appropriate dilution is achieved when the suspension appears almost clear, usually at dilutions between
1:10 and 1:100. The aim is to produce a concentration of particles on the filter which is not so dense as to make
visualization of discrete particles difficult by SEM, while ensuring a reasonable number of particles is available for analysis
(at least 100 particles).
6 © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
If diluting, record the exact dilution for each sample. For filtration, take up a known volume of the particle
suspension into a syringe (3.3.17) and attach the end of the syringe to the filtration unit (3.3.7). Apply gentle
pressure to the syringe in order to push the water through the filter and out at the other end of the filtration unit
at a rate of about one drop (0,045 ml) per second, depositing the particles on the surface of the filter. Change
the filter if it becomes blocked. Use the following procedure on each filter. Flush the filter and syringe through
with distilled water. Finally, flush the filter with air in the same direction as the filtration before removing the
filter from the unit, using tweezers, and leaving it to dry in a sterile, covered Petri dish.
Due to the small size of the particles, filters with a pore size smaller than 0,1 µm should be used, if available.
In this case, sequential filtering might be necessary to avoid pore clogging.
4.4.2 Metal particles
Centrifuge particles in ethanol (from the isolation protocol described in 4.3) at 16 000 g for 20 min. Remove
supernatant liquid and add 0,5 ml of 100 % acetone:epoxy resin (3.2.10) (1:1). Place the tubes in a tube
holder and rotate overnight at room temperature (this step could possibly be shortened for very small pellets).
Centrifuge the particles at 16 000 g for 20 min. Carefully remove the liquid using a micropipette and without
touching the pellet at the bottom of the tube. Leave the tubes under vacuum for 1 h to remove the remaining
acetone. Add 1 ml of pure epoxy resin (3.2.10) and leave the tubes under vacuum for 3 h. Place the tubes at
60 °C for 48 h to allow resin polymerization. Remove plastic tubes to obtain solid resin with the particle pellets
at the bottom. This protocol enables resin infiltration of the pellets and particle separation.
Section pellets using a diamond knife and spread the sections (about 100 nm to 120 nm thick) on
[5][6]
formvar-coated copper grids of 200 mesh size for TEM analysis . Section the pellets such that an even
representation of all the particles in the pellets can be ascertained (section the whole pellet if possible).
NOTE Metal particles can also be collected by vacuum filtration on a 0,015 µm filter membrane for analysis using
[8]
high-resolution SEM . However, when using this method, the user needs to check for potential particle agglomeration and
oxidation on the filter and be aware of potential particle loss.
4.5 Particle size and shape characterization
4.5.1 Polyethylene particles
For SEM imaging of particles, attach the filter with particles on it to an SEM mount using a carbon sticker
(3.3.3). Coat the filter with gold or other conductive material, e.g. platinum/palladium, to make the particles
conductive. The coating thickness shall be 3 nm to 5 nm. Image the polymer particles at an accelerating
voltage of not greater than 10 keV.
To characterize particles larger than 0,1 µm, select random, non-overlapping fields on the filter carrying the
particles at a magnification of at least ×5 000 until a total of 100 particles has been imaged. For particles
larger than 10 µm, use a lower magnification such as ×500.
Characterize the size, shape and area of the particles using a series of predefined descriptions such as length,
breadth, equivalent circle diameter (diameter of a circle with the same area as particle), area, perimeter,
[9]
aspect ratio (length:breadth) and roundness (perimeter 1/4π × area), as described in ASTM F 1877-05 . The
magnification at which size and shape analysis was performed should be stated in the test report.
To characterize particles smaller than 0,1 µm, use high-resolution SEM. Use magnifications up to ×100 000 at
an accelerating voltage of 3 keV.
NOTE 1 The differentiation of fibrillar and rounded polymer particles can also be useful.
NOTE 2 Computerized or manual image analysis software can be used to determine particle sizes and shapes.
NOTE 3 Particle analysers might also be used if their limit of resolution is 0,1 µm or less, however, there is a risk of
size overestimation due to particle agglomeration.
© ISO 2011 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 17853:2011(E)
4.5.2 Metal particles
4.5.2.1 General
As described in 4.4.2, particles are typically analysed by TEM, but they could also be analysed by SEM.
4.5.2.2 TEM analysis
Image metal particles using TEM at an accelerating voltage of around 80 kV and a magnification setting of at
least ×21 000 (the magnification should be stated in the report).
Characterize metal particles in terms of size and shape by manual image analysis of representative TEM
micrographs (minimum 150 particles, in case of low wear; 300 or more, if permitted). Characterize all particles
from each micrograph in order to have a better and unbiased representation of the different particle sizes.
Determine the maximum di
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.