ISO 8128-2:1993

Apple juice, apple juice concentrates and drinks containing apple juice - Determination of patulin content - Part 2: Method using thin-layer chromatography

The principle of the method specified is extraction of patulin in a mixture of ethyl acetate and chloroform (3:2 by volume), filtration of the extract on a silica-gel column and qualitative and quantitative determination by means of two-directional thin-layer chromatography. The spots are developed using a 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone (MBTH) hydrochloride solution. The limit of detection is 25 µg/l, based on 50 ml of ready-to-drink apple juice. The more precise method of analysis is HPLC.

Jus de pommes, concentrés de jus de pommes et boissons à base de jus de pommes — Détermination de la teneur en patuline — Partie 2: Méthode par chromatographie sur couche mince

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-Jun-1993
• ICS: 67.160.20 - Non-alcoholic beverages
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 3 - Fruits and vegetables and their derived products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 3 - Fruits and vegetables and their derived products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 20-Jan-2022
• Completion Date: 13-Dec-2025

Overview

ISO 8128-2:1993 specifies a standardized method for determining the patulin content in apple juice, apple juice concentrates, and drinks containing apple juice using thin-layer chromatography (TLC). Patulin is a mycotoxin commonly found in fruit products, particularly apple-derived beverages, which poses health risks if consumed in excessive amounts. This internationally recognized method ensures consistent, reliable detection and quantification of patulin, supporting food safety and regulatory compliance. The method involves extraction of patulin with a mixture of ethyl acetate and chloroform, purification via silica-gel column chromatography, and qualitative and quantitative analysis by two-directional TLC with MBTH reagent development.

Key Topics

• Scope and Purpose
  Designed for routine patulin analysis in apple juices and related products, the method enables detection down to 25 µg/l based on a 50 ml sample, suitable for screening purposes.

• Analytical Principle

  • Extraction of patulin using a 3:2 volume mixture of ethyl acetate and chloroform.
  • Purification through silica-gel column chromatography.
  • Separation using bidirectional thin-layer chromatography.
  • Visualization by spraying with 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone (MBTH) hydrochloride solution, yielding a detectable fluorescent spot under UV light.

• Reagents and Equipment

  • High-purity solvents including ethyl acetate, chloroform, benzene, methanol, toluene, and acetic/formic acids for mobile phases.
  • Silica gel for column chromatography and TLC plates (20 cm x 20 cm) with a 0.25 mm silica layer.
  • Specific apparatus such as chromatographic columns, UV lamps, and a thermostatically controlled drying oven.

• Performance Characteristics

  • Limit of detection: 25 µg/l patulin in ready-to-drink apple juice.
  • Repeatability and reproducibility are quantified with statistical values to ensure reliability of results.
  • The method provides good separation of patulin from interfering substances like hydroxymethylfurfural (HMF).

• Operational Procedure
  Includes detailed steps for sample preparation, extraction, column purification, TLC development, staining, and result interpretation using fluorescence intensity comparison with patulin standards.

Applications

• Food Safety Testing
  Ensures compliance with regulatory limits for patulin in apple juice products, helping manufacturers prevent contaminated batches from reaching consumers.

• Quality Control in Juice Production
  Facilitates routine monitoring of patulin levels during processing and formulation to maintain product safety and quality.

• Research and Analytical Laboratories
  Provides a validated reference method for laboratories conducting patulin analysis in line with international standards.

• Regulatory and Certification Bodies
  Supports enforcement of food safety regulations by providing a standardized, internationally accepted analytical approach.

Related Standards

• ISO 8128-1:1993
  Specifies an alternative, more precise method for patulin determination using high-performance liquid chromatography (HPLC), suitable for confirmatory analysis or legal disputes.

• ISO 5725
  Details general standards for the accuracy (repeatability and reproducibility) of measurement methods, applicable to validating patulin testing procedures.

• AOAC Official Methods of Analysis
  Includes reference procedures for patulin determination supporting standardized laboratory practices.

---

Keywords: ISO 8128-2, patulin detection, apple juice safety, thin-layer chromatography, TLC method, mycotoxin analysis, apple juice concentrates, beverage testing, food contaminant detection, chromatographic patulin analysis.

Standards Content (Sample)

NORME
ISO
INTERNATIONALE
8128-2
Première édition
1993-07-01
Jus de pommes, concentrés de jus de
pommes et boissons à base de jus de
pommes - Détermination de la teneur en
patuline -
Partie 2:
Méthode par chromatographie sur couche
mince
Apple juice, apple juice concentrates and drinks containing apple juice -
Determina tion of pa tulin content -
Part 2: Method using thin-layer chromatography
Numéro de référence
ISO 8128=2:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une federation
m.ondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comites techniques de I’ISO. Chaque comite membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comite technique cree a cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore etroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techniques
sont soumis aux comites membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mites membres votants.
La Norme internationale ISO 8128-2 a ete élaboree par le comité techni-
que ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 3, Produits
d&iv& des fruits et l&gumes.
L’&O 8128 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
neral Jus de pommes, concentr& de jus de pommes et boissons à base
de jus de pommes - Dbtermination de la teneur en patuline:
chroma tographie en phase liquide à haute
- Partie 1: Méthode
Par
performance
- Partie 2: Méthode par chromatographie sur couche mince
L’an nexe A de la prés ente partie de I’ISO 8128 est donnée uniquement à
titre d’information.
0 ISO 1993
Droits de reproduction réserves. Aucune partie de cette publication ne peut etre reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord Acrit de I’editeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
ISO 8128=2:1993(F)
NORME INTERNATIONALE
Jus de pommes, concentrés de jus de pommes et
Détermination
boissons à base de jus de pommes -
de la teneur en patuline -
Partie 2:
Méthode par chromatographie sur couche mince
ou du chloroforme en raison de leur toxicité et des
1 Domaine d’application
risques d’explosion qu’ils peuvent entraîner,
La présente partie de I’ISO 8128 prescrit une mé-
thode par chromatographie sur couche mince (CCM), 3.1 Solvants, acetate d’éthyle, chloroforme et to-
pour la détermination de la teneur en patuline dans les luene.
jus de pommes, les concentres de jus de pommes
et les boissons à base de jus de pommes.
3.2 Solvants de développement, pour la CCM
bidirectionnelle:
La méthode a une limite de detection de 25 pg/l ba-
sée sur 50 ml de jus de pommes prêt à la consom-
mélange de benzène/méthanol/acide acétique
mation.
(80 % en masse) (19:2:1 en volume);
NOTE 1 Si l’on souhaite obtenir des résultats d’analyse
mélange de toluéne/acétate d’éthyle/acide formi-
plus précis, ou en cas de litige, il convient d’utiliser la mé-
que (90 % en masse) (5:4:1 en volume).
thode par chromatographie en phase liquide à haute perfor-
mance faisant l’objet de I’ISO 8128-l.
3.3 Gel de silice, pour chromatographie sur co-
lonne, de 0,063 mm à 0,2 mm de granulométrie.
2 Principe
3.4 Solution d’élution, mélange de
Extraction de la patuline dans un mélange d’acétate
toluène/acétate d’éthyle (75:25 en volume).
d’éthyle-chloroforme (3:2 en volume). Filtration de
l’extrait sur une colonne de gel de silice et estimation
3.5 Solution étalon de patuline (C7H60,&
qualitative et semi-quantitative par chromatographie
sur couche mince bidirectionnelle (CCM). Les taches
3.5.1 Préparation
sont développées par emploi d’une solution de chlor-
hydrate d’hydrazone de 3-méthyl-2-benzothiazoline
Peser, a 0,l mg près, 10,O mg de patuline, dans une
(MBTH).
fiole jaugée de 100 ml et les dissoudre dans 100 ml
d’acétate d’éthyle (3.1). Ajuster au trait repère avec
de l’acétate d’éthyle.
3 Réactifs
Transférer, à l’aide d’une pipette, 10,O ml de la solu-
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
tion ainsi obtenue dans une autre fiole jaugée de
reconnue, et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de
100 ml et ajuster au trait repère avec de l’acétate
l’eau de pureté au moins équivalente.
d’éthyle.
AVERTISSEMENT - Des pr&autions particuli&es La teneur en patuline de cette solution étalon est de
doivent être prises lors de l’utilisation du benzene 10 pg/ml approximativement.
BO 8128=2:1993(F)
CCM, de
Mesurer I’absorbance à 276 nm de cette solution 4.4 Plaques supports pour
étalon à l’aide d’un spectrométre approprie, avec des 20 cm x 20 cm, recouvertes de ge I de silice (3.3)
sans indicateur
cellules en quartz présentant un parcours optique de (épaisseur de la couche 0,25 mm),
10 mm. fluorescent.
NOTE 2 Le mode de préparation de la solution étalon
être réglée à
4.5 Étuve, ventilée, pouvant 1
ainsi que la vérification de sa pureté sont basés sur la réfé-
13O”C+l “C.
-
rence [3].
5 Échantillonnage
3.5.2 Calcul de la concentration
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
Calculer la concentration, pp,, exprimée en micro-
tillon réellement représentatif, non endommage ou
grammes par millilitre, de la solution de patuline
modifie lors du transport et de l’entreposage.
(3.5.1) à l’aide de l’équation
A x Mr x 1 000 x C
6 Mode opératoire
. Pps =
A276
Préparation de la solution d’essai
6.1
où
A est I’absorbance de la solution etalon de Diluer les concentres de jus de pommes dans l’eau,
patuline; en utilisant un mélange 1:5 de concentre et d’eau, en
volume. Proceder ensuite comme pour les autres
est I’absorbance de la solution de patuline,
A276 produits de la façon suivante.
au maximum d’absorption de 276 nm (voir
Extraire 50 ml de l’échantillon pour laboratoire (dilue
note 3).
si necessaire avec de l’eau) avec 50 ml d’un mélange
est la masse moleculaire relative de la
d’acétate d’éthyle/chloroforme [(3:2 en volume)]
patuline;
pendant au moins 1 min.
C est la constante de l’appareil (1 en géné-
Répéter l’extraction deux autres fois avec des por-
ral).
mélange d’acetate
tions de 50 ml de
d’éthyle/chloroforme et filtrer chaque portion sur un
NOTE 3 Le coefficient d’absorption moléculaire de la
entonnoir en verre fritté, contenant une couche de
patuline mesuré à 276 nm, est égal à 14 600.
1 cm de sulfate de sodium anhydre, en recueillant le
filtrat directement dans un ballon d’évaporation de
250 ml.
3.6 Solution de chlorhydrate de MBTH.
Évaporer sous vide jusqu’à siccité dans un évapo-
Di
...

NORME
ISO
INTERNATIONALE
8128-2
Première édition
1993-07-01
Jus de pommes, concentrés de jus de
pommes et boissons à base de jus de
pommes - Détermination de la teneur en
patuline -
Partie 2:
Méthode par chromatographie sur couche
mince
Apple juice, apple juice concentrates and drinks containing apple juice -
Determina tion of pa tulin content -
Part 2: Method using thin-layer chromatography
Numéro de référence
ISO 8128=2:1993(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une federation
m.ondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comites techniques de I’ISO. Chaque comite membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comite technique cree a cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore etroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techniques
sont soumis aux comites membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mites membres votants.
La Norme internationale ISO 8128-2 a ete élaboree par le comité techni-
que ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 3, Produits
d&iv& des fruits et l&gumes.
L’&O 8128 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre gé-
neral Jus de pommes, concentr& de jus de pommes et boissons à base
de jus de pommes - Dbtermination de la teneur en patuline:
chroma tographie en phase liquide à haute
- Partie 1: Méthode
Par
performance
- Partie 2: Méthode par chromatographie sur couche mince
L’an nexe A de la prés ente partie de I’ISO 8128 est donnée uniquement à
titre d’information.
0 ISO 1993
Droits de reproduction réserves. Aucune partie de cette publication ne peut etre reproduite
ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord Acrit de I’editeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Geneve 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
ISO 8128=2:1993(F)
NORME INTERNATIONALE
Jus de pommes, concentrés de jus de pommes et
Détermination
boissons à base de jus de pommes -
de la teneur en patuline -
Partie 2:
Méthode par chromatographie sur couche mince
ou du chloroforme en raison de leur toxicité et des
1 Domaine d’application
risques d’explosion qu’ils peuvent entraîner,
La présente partie de I’ISO 8128 prescrit une mé-
thode par chromatographie sur couche mince (CCM), 3.1 Solvants, acetate d’éthyle, chloroforme et to-
pour la détermination de la teneur en patuline dans les luene.
jus de pommes, les concentres de jus de pommes
et les boissons à base de jus de pommes.
3.2 Solvants de développement, pour la CCM
bidirectionnelle:
La méthode a une limite de detection de 25 pg/l ba-
sée sur 50 ml de jus de pommes prêt à la consom-
mélange de benzène/méthanol/acide acétique
mation.
(80 % en masse) (19:2:1 en volume);
NOTE 1 Si l’on souhaite obtenir des résultats d’analyse
mélange de toluéne/acétate d’éthyle/acide formi-
plus précis, ou en cas de litige, il convient d’utiliser la mé-
que (90 % en masse) (5:4:1 en volume).
thode par chromatographie en phase liquide à haute perfor-
mance faisant l’objet de I’ISO 8128-l.
3.3 Gel de silice, pour chromatographie sur co-
lonne, de 0,063 mm à 0,2 mm de granulométrie.
2 Principe
3.4 Solution d’élution, mélange de
Extraction de la patuline dans un mélange d’acétate
toluène/acétate d’éthyle (75:25 en volume).
d’éthyle-chloroforme (3:2 en volume). Filtration de
l’extrait sur une colonne de gel de silice et estimation
3.5 Solution étalon de patuline (C7H60,&
qualitative et semi-quantitative par chromatographie
sur couche mince bidirectionnelle (CCM). Les taches
3.5.1 Préparation
sont développées par emploi d’une solution de chlor-
hydrate d’hydrazone de 3-méthyl-2-benzothiazoline
Peser, a 0,l mg près, 10,O mg de patuline, dans une
(MBTH).
fiole jaugée de 100 ml et les dissoudre dans 100 ml
d’acétate d’éthyle (3.1). Ajuster au trait repère avec
de l’acétate d’éthyle.
3 Réactifs
Transférer, à l’aide d’une pipette, 10,O ml de la solu-
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
tion ainsi obtenue dans une autre fiole jaugée de
reconnue, et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de
100 ml et ajuster au trait repère avec de l’acétate
l’eau de pureté au moins équivalente.
d’éthyle.
AVERTISSEMENT - Des pr&autions particuli&es La teneur en patuline de cette solution étalon est de
doivent être prises lors de l’utilisation du benzene 10 pg/ml approximativement.
BO 8128=2:1993(F)
CCM, de
Mesurer I’absorbance à 276 nm de cette solution 4.4 Plaques supports pour
étalon à l’aide d’un spectrométre approprie, avec des 20 cm x 20 cm, recouvertes de ge I de silice (3.3)
sans indicateur
cellules en quartz présentant un parcours optique de (épaisseur de la couche 0,25 mm),
10 mm. fluorescent.
NOTE 2 Le mode de préparation de la solution étalon
être réglée à
4.5 Étuve, ventilée, pouvant 1
ainsi que la vérification de sa pureté sont basés sur la réfé-
13O”C+l “C.
-
rence [3].
5 Échantillonnage
3.5.2 Calcul de la concentration
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
Calculer la concentration, pp,, exprimée en micro-
tillon réellement représentatif, non endommage ou
grammes par millilitre, de la solution de patuline
modifie lors du transport et de l’entreposage.
(3.5.1) à l’aide de l’équation
A x Mr x 1 000 x C
6 Mode opératoire
. Pps =
A276
Préparation de la solution d’essai
6.1
où
A est I’absorbance de la solution etalon de Diluer les concentres de jus de pommes dans l’eau,
patuline; en utilisant un mélange 1:5 de concentre et d’eau, en
volume. Proceder ensuite comme pour les autres
est I’absorbance de la solution de patuline,
A276 produits de la façon suivante.
au maximum d’absorption de 276 nm (voir
Extraire 50 ml de l’échantillon pour laboratoire (dilue
note 3).
si necessaire avec de l’eau) avec 50 ml d’un mélange
est la masse moleculaire relative de la
d’acétate d’éthyle/chloroforme [(3:2 en volume)]
patuline;
pendant au moins 1 min.
C est la constante de l’appareil (1 en géné-
Répéter l’extraction deux autres fois avec des por-
ral).
mélange d’acetate
tions de 50 ml de
d’éthyle/chloroforme et filtrer chaque portion sur un
NOTE 3 Le coefficient d’absorption moléculaire de la
entonnoir en verre fritté, contenant une couche de
patuline mesuré à 276 nm, est égal à 14 600.
1 cm de sulfate de sodium anhydre, en recueillant le
filtrat directement dans un ballon d’évaporation de
250 ml.
3.6 Solution de chlorhydrate de MBTH.
Évaporer sous vide jusqu’à siccité dans un évapo-
Di
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