ISO 9888:1991
(Main)Water quality — Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium — Static test (Zahn-Wellens method)
Water quality — Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium — Static test (Zahn-Wellens method)
Qualité de l'eau — Évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie des composés organiques — Essai statique (Méthode Zahn-Wellens)
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IS0
I N TE R NAT I O NA L
STANDARD 9888
First edition
1991 -10-1 5
Water quality - Evaluation of the aerobic
biodegradability of organic compounds in an
aqueous medium - Static test (Zahn-Wellens
method)
Qualité de l'eau - Évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité
aérobie des composés organiques - Essai statique (Méthode
Za hn-Wellens)
Reference number
IS0 9888: 199 1 (E)
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IS0 9888:1991(E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (IS0 member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that com m i tt ee . In ter nation a I organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
a
work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75% of the member
bodies casting a vote.
International Standard IS0 9888 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water qualify, Sub-committee SC 5, Biological rnefhoûs.
Annex A of this International Standard is for information only.
8 IS0 1991
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, electronic or mechanical, Including photocopying and microfilm, without
permission in writing from the publisher.
international Organlzatlon for Standardlzatlon
Case Postale 56 CH-1211 Geneve 20 Switzerland
Printed in Switzerland
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INTERNATIONAL STANDARD IS0 9888:î 991 (E)
Water quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of
organic compounds in an aqueous medium - Static test
(Zahn-Wellens method)
WARNING - SAFETY PRECAUTIONS - Activated sludge and sewage may contain potentially
athogenic organisms. Therefore appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic
Qest compounds and those with unknown properties should be handled with care.
2 Normative references
1 Scope
The following standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions
of this International Standard. At the time of publi-
This International Standard specifies a method for
cation, the editions indicated were valid. All stan-
the evaluation of the elimination and the “ultimate”
dards are subject to revision, and parties to
biodegradability of organic compounds at a given
agreements based on this International Standard
concentration by aerobic mi cro-org a n is ms .
are encouraged to investigate the possibility of ap-
plying the most recent editions of the standards in-
The conditions described in this International Sian-
dicated below. Members of IEC and IS0 maintain
dard normally correspond to optimal conditions for
registers of currently valid International Standards.
allowing the maximum value of biodegradation to
occur with the chosen inoculum in the test time.
IS0 6060:1989, Water quality - Determination of fhe
chemical oxygen demand.
The method applies to organic compounds which
ea re
IS0 7827:1984, Water quality - Evaluation in an
aqueous medium of the “ultimate” aerobic
a) soluble at the concentration used under the test
biodegradability of organic compounds - Method by
conditions;
analysis of dissolved organic carbon (DOC).
b) non-volatile, or which have a negligible vapour
IS0 8192:1986. Water quality - Test for inhibition of
pressure under the test conditions;
oxygen consumption by activated sludge.
c) not lost by foaming from the test solution;
IS0 8245:1987, Water quality - Guidelines for the
determination of total organic carbon (TOC).
d) not inhibitory to the test micro-organisms at the
concentration chosen for the test. Inhibitory ef-
IS0 9408:1991, Water qualify - Evaluation in an
fects can be determined by using a suitable test
aqueous medium of the “ulfimafe” aerobic
method (e.g. see IS0 8192). If the test compound
biodegradability of organic compounds - Method by
is toxic, the test concentration has to be lower
determining the oxygen demand in a closed
or a pre-exposed inoculum can be used.
respirometer.
The method can also be used to measure the elim-
IS0 9439:1990, Water quality - Evaluation in an
ination and biodegradation of organic compounds in
aqueous medium of the “ultimate” aerobic
waste water (also called “test compound” in the
biodegradability of organic compounds - Method by
method),
analysis of released carbon dioxide.
1
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IS0 9888:1991 (E)
3 Definitions 6 Reagents
For the purposes of this International Standard, the Use only reagents of recognized analytical grade.
following definitions apply.
6.1 Distilled or de-ionized water, containing less
3.1 ultimate biodegradation: The level of degra-
than 2 mg/l DOC.
dation achieved when the test compound is totally
utilized by micro-organisms resulting in the pro-
duction of carbon dioxide, water, mineral salts and
6.2 Test medium.
new microbial cellular constituents (biomass).
6.2.1 Components
3.2 suspended solids (of an activated sludge): The
amount of solids obtained by filtration or
centrifuging of a known volume of sludge under 6.2.1.1 Solution (a).
specified conditions and drying at 105 "C at constant
weight.
Anhydrous potassium
3.3 primary biodegradation: The level of degra- dihydrogenphoçphate (KH2P0,) 83 g
dation achieved when the test compound undergoes
Anhydrous dipotassium
hydrogenphosphate ( K2H PO,)
any structural change, other than complete 21,75 g a
mineralization, as a result of microbial action.
Disodium hydrogenphosphate dihydrate
(Na2HP0,.2H,O) 33,4 g
Ammonium chloride (",CI) 0,s g
Water (6.1). quantity necessary to make
4 Principle
up to 1 O00 ml
Determination of the biodegradation and elimination
from the aqueous phase of water soluble organic
The pH of this solution should be about 7,4.
compounds by aerobic m icro-org a n is m s .
6.2.1.2 Solution (b).
The organic compounds are the sole source of car-
bon and energy in the medium other than the
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate
sludge. The concentration of the compounds used is
(MgS0,.7H,O) in 1 O00 ml of the water (6.1).
such that the initial concentration of dissolved or-
ganic carbon (DOC) is normally between 50 mg/l
and 400 mg/l, or of chemical oxygen demand (COD) 6.2.1.3 Solution (c)
is between 100 mg/l et 1 O00 mg/l.
Dissolve 27,s g of anhydrous calcium chloride
NOTE 1 The chosen initial concentration of the test (CaCI,) in 1 O00 ml of the water (6.1).
compound depends on its solubility and on its toxicity to
the bacteria of the inoculum.
6.2.1.4 Solution (d).
Mesurement of the DOC or COD at the beginning
Dissolve 0,25 g of iron(ll1) chloride hexyhydrate
and end of the test (normally 28 days) and at three
(FeCI3.6H,O) in 1 O00 ml of the water (6.1). Prepare
regular intermediate time intervals at least. Deter-
this solution just before use.
mination of the percentage removal of DOC or COD
at each of these intervals. Evaluation of the
NOTE 2 It is not necessary to prepare this solution just
biodegradability of the compound used on the basis
before use if a drop of concentrated hydrochloric acid
of these data. (HCI) or 0,4 g/l of ethylenediaminetetraacetic acid,
disodium salt (EDTA) is added.
Specific analysis may give additional information on
primary biodegradation.
6.2.2 Preparation
For 1 litre of test medium, add to about 500 ml of the
water (6.1)
5 Test environment
- 10 ml of solution (a);
Incubation shall take place in the dark or in diffused
light, in an enclosure which is maintained at be-
- 1 ml of each of the solutions (b) to (d).
tween 20 "C and 25 "C and which is free from va-
pours which are toxic to micro-organisms.
Make up to 1 000 ml with the water (6.1)
2
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IS0 9888:1991 (E)
6.3 Mercury chloride solution. 8.2 Preparation of the inoculum
Dissolve 10 g of mercury chloride (HgCI,) in
Take a sample of activated sludge from the aeration
1 O00 ml of the water (6.1).
tank of a biological waste water treament plant. (See
notes 3 and 4).
7 Apparatus Mix the sample well and wash the activated sludge
by repeatedly adding tap water or test medium
(6.2), centrifuging or settling, and decanting of the
Ordinary laboratory equipment and the following
supernatant. Before use, determine the concen-
should be used.
tration of suspended solids (3.2). If necessary, con-
centrate the sludge by settling so that the volume
7.1 Glass vessels, with a volume of 1 litre to 5 litres
of sludge added to obtain the desired concentration
equipped with
(see 8 3) of suspended solids is minimal.
- an agitator with a glass or metal stirrer; rotate to
Keep the inoculum aerated at room temperature
ensure adequate mixing.
until it is to be used.
NOTES
- glass tubes of 2 mm to 4 mm inner diameter or
glass frits to introduce air which shall be free
3 Depending on the purpose of the test, the waste water
from organic carbon and toxic vapours and shall
treatment plant should receive waste water which is pre-
0
be presaturated with water vapour to reduce
dominantly municipal. To get as many different species
losses by evaporation.
or strains of bacteria as possible, it may be preferable in
cases to make a mixture from various sources.
special
The glassware shall be carefully cleaned and, in
a laboratory
Activated sludge may also be taken from
particular, free from traces of organic or toxic mat-
treatment plant.
ter.
4 Pre-exposed inocula may be used in certain circum-
stances. When such inocula are used, this will be clearly
7.2 Measuring equipment, of sufficient sensitivity
stated in the test results (e.g. percentage biodegradation
for the measurement of dissolved organic carbon =y ”/, using pre-exposed inocula) and the method of pre-
exposure detailed in the test report. Pre-exposed inocula
(see IS0 8245) or suitable for the measurement of
can be obtained from laboratory biodegradation tests
chemical oxygen demand (see IS0 6060).
conducted under a variety of conditions as appropriate
(e.g. Zahn-Wellens and SCAS tests) or from samples col-
lected from locations where relevant environmental con-
7.3 Device for filtration, with membrane filters of
ditions exist (e.g. treatment plants dealing with similar
suitable porosity (nominal aperture diameter of
compounds, contaminated areas, etc.).
0,2 pm to 0,45 pm) which neither adsorb organic
compounds nor release organic carbon significantly.
8.3 Test
7.4 Centrifuge.
Se! up at least two test vessels (7.1) (symbolized
a
FT) containing at least 500 ml of the test medium
7.5 pi-i-meter.
(6.2). Add a sufficient amount of solution of the test
compound (8.1.1) or of the waste water to be tested
to obtain a DOC concentration of 50 mg/l to
8 Procedure
400 mg/l or a CO
...
NORME IS0
I NTf R NATIONALE
Première édition
199 1-1 0-1 5
Qualité de l’eau - Évaluation, en milieu aqueux,
composés
de la biodégradabilité aérobie des
organiques - Essai statique (Méthode
Za h n - W el I ens)
Water quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic
compounds in an aqueous medium - Stalk test (Zahn-Wellens method)
Numéro de référence
IS0 9888:1991(F)
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IS0 9888:1991 (F)
I
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationaies est en général
confiée aux comités techniques de l‘lS0. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation étecirotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptes par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 Oh au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale IS0 9888 a éti! élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologi-
ques.
L‘annexe A de la présente Norme internationale est donnée uniquemeni
à titre d’information.
6 IS0 1991
Droits de reproduction rhservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 CH-I211 Genève 20 Suisse
Imprimé en Suisse
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NORME INTERNATIONALE IS0 9888:1991 (F)
Qualité de l’eau - Évaluation, en milieu aqueux, de fa
biodégradabilité aérobie des composés organiques - Essai
statique (Méthode Zahn-Wellens)
AVERTISSEMENT - SÉCURITÉ - Les boues activées et les eaux usées peuvent contenir des
ganismes potentiellement pathogènes. II convient donc de les manipuler avec les précautions
* ppropriées, de même que les composés à expérimenter toxiques ou dont les propriétés ne sont pas
connues.
sés organiques présents dans des eaux residuaires
1 Domaine d’application
(qui, dans le cadre de la présente Norme interna-
tionale, seront également appelés <
La présente Norme internationale prescrit une mé-
périmenter,,).
thode d‘évaluation de l’élimination et de la biodé-
gradabilité <[ultime,, de composés organiques,
présents à une concentration donnée, SOUS l’action
de m icroorg a n is mes aérobies.
2 Références normatives
Les conditions d’essai décrites dans la présente
Norme internationale correspondent normalement
Les normes suivantes contiennent des dispositions
aux conditions optimales d’obtention du taux de
qui, par suite de la référence qui en est faite,
biodégradation maximal avec I’inoculiim choisi et
constituent des dispositions valables pour la pré-
pendant la durée d’essai prescrite.
sente Norme internationale. Au moment de la pu-
La méthode est applicable à des composés organi- blication, les éditions indiquées étaient en vigueur.
Toute norme est sujette a révision et les parties
eues
prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la
a) solubles à la concentration utilisée et dans les
possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes
conditions de l’essai;
des normes indiquées ci-après. Les membres de la
CE1 et de I’ISO possèdent le registre des Normes
b) non volatils ou ayant une pression de vapeur
internationales en vigueur à un moment donné.
négligeable dans les conditions de l’essai;
IS0 6060,1989, Qualilé de l’eau - Détermination de
c) non susceptibles d’être perdus par formation de
mousse à partir de la solution d’essai; /a demande chimique en oxygéne.
IS0 7827:1984, Qualité de l’eau - Evaluation en mi-
d) n‘ayant pas d’action inhibitrice, à la concen-
lieu aqueux de la biodégradabilité aérobie dtirne.
tration choisie pour l‘essai, sur les micro-
des composés organiques - Méthode par analyse
organismes utilisés. L‘existence d’une action
du carbone organique dissous (COD).
inhibitrice peut être mise en évidence par une
méthode appropriée (par exemple, celle de
IS0 8192:1986, Qualité de /’eau - Essai d‘inhibition
I’ISO 8192). Si le composé a expérimenter est
de la consommation d‘oxygène par des boues acti-
toxique, il faut l‘utiliser à une concentration plus
vées.
faible ou employer un inoculum préexposé.
IS0 8245:1987, Qualité de /‘eau - Guide pour te do-
La méthode spécifiée peut également servir à me-
sage du carbone organique total (COT).
surer l’élimination et la biodégradation des compo-
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IS0 9888:1991 (F)
150 9408:1991, Qualité de l’eau - Évaluation, en mi- Mesurage du COD ou de la DCO en début et fin
lieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie «ultime,) d’essai (de durée normalement égale à 28 jours) et,
des composés organiques - Méthode par détermi- entretemps, au moins trois fois a intervalles régu-
liers. Détermination des valeurs correspondantes
nation de la demande en oxygène dans un
de la diminution (en pourcentage) du COD ou de la
respiromètre fermé.
DCO. Evaluation à partir de ces données de la bio-
dégradabilité du composé utilisé.
IS0 9439:1990, Qualité de l’eau - Évaluation, en mi-
lieu aqueux, de la biodegradabilité aérobie «ultime),
La réalisation d‘analyses spécifiques peut apporter
des composés organiques - Méthode par dosage du
des informations supplémentaires sur la biodégra-
dioxyde de carbone dégagé.
dation primaire.
3 Définitions
5 Environnement d’essai
Pour les besoins de la présente Norme internatio-
nale, les définitions suivantes s’appliquent.
L’incubation doit être menée à l’obscurité ou SOUS
lumière diffuse dans une enceinte maintenue à
3.1 biodégradation ultime: Niveau de dégradation
température constante comprise entre 20 “C et
atteint lorsque le composé à expérimenter a été to-
25 “C et ne contenant pas de vapeurs toxiques pour
talement transformé par les microorganismes en
I es mi croorg a nism es.
dioxyde de carbone, eau, sels minéraux et nouveaux
constituants cellulaires microbiens (biomasse).
6 Réactifs
3.2 matières en suspension (dans une boue actl-
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analyti-
vée): Quantité de matiéres obtenues par filtration ou
que reconnue.
centrifugation d’un volume connu de boue, dans des
conditions définies, et dessiccation à 105 ”C jusqu’à
masse constante.
6.1 Eau distillée ou délonisée, contenant moins de
2 mg/l de COD.
3.3 biodégradation prjmaire: Niveau de dégra-
dation atteint lorsque le composé à expérimenter a
6.2 Milieu d’essai
subi, sous l’action de microorganismes, une trans-
formation structurelle quelconque autre que la rni-
6.2.1 Composants
néralisation complète.
6.2.1.1 Solution (a).
4 Principe
Détermination du taux de biodégradation et d’élimi-
nation dans un milieu aqueux de composés organi- Dihydrogénophosphate de potassium
ques solubles dans l‘eau par des microorganismes anhydre (KH,PO,) 8,5
aérobies. Ces composés organiques constituent la
Monohydrogénophosphate de potassium
seule source de carbone et d‘énergie dans le milieu, anhydre (K,HP04) 21.75 g
en dehors de la boue utilisée. Ils sont introduits
Monohydrogenophosphate de sodium
dans le milieu à une concentration telle que, à
dihydraté (Na,HP0,,2H,O) 33,4 g
l’instant initial, la concentration en carbone organi-
Chlorure d‘ammonium (“,CI) 0,s g
que dissous (COD) soit normalement comprise entre
Eau (6.1): quantité nécessaire pour com-
50 mg/l et 400 mg/l, ou la demande chimique en
pléfer à 1 O00 ml
oxygéne (DCO) entre 100 mg/l et 1 O00 mgil.
NOTE 1 La concentration initiale du composé 5 expéri-
Le pH de cette solution doit normalement être d’en-
menter est choisie en fonction de sa solubilité et de son
action toxique sur les bactéries de I’inoculum. viron 7.4.
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IS0 9888:1991(F)
6.2.1.2 Solution (b). 7.2 Appareil de mesure, de sensibilité suffisante,
destiné au dosage du carbone organique dissous
Dissoudre dans 1 O00 ml d’eau (6.1) 22,5 g de sulfate
(voir IS0 8245) ou au mesurage de la demande chi-
de magnésium heptahydraté (MgS0,,7H20).
mique en oxygène (voir IS0 6060).
6.2.1.3 Solution (c).
7.3 Dispositif de filtration, comportant des mem-
branes de porosité adéquate (diamètre nominal des
Dissoudre dans 1 O00 ml d‘eau (6.1) 27,5 g de chlo-
pores de 0,2 pm à 0,45 pm), dans lequel l’adsorption
rure de calcium anhydre (CaCI,).
des composés organiques et le relargage du car-
bone organique ne sont pas significatifs.
6.2.1.4 Solution (d).
7.4 Centrifugeuse
Dissoudre dans 1 O00 ml d’eau (6.1) 0,25 g de chlo-
rure de fer(ll1) hexahydraté (FeCI3,6H,O). Préparer
7.5 pH-mètre,
cette solution juste avant emploi.
8 Mode opératoire
NOTE 2 Cette précaution n’est pas nécessaire si l’on
ajoute à la solution une goutte d’acide chlorhydrique
concentré IHCI) ou 0.4 a/l d’acide éthvlènediamine-
8.1 Préparation des salutions d’essai
gr acétique^ (EDTA). -
Préparer les solutions suivantes
6.2.2 Préparation
8.1.1 Solution du composé a expérimenter dans de
l‘eau (KI), de concentration adéquate (par exemple,
Pour 1 I de milieu d’essai, ajouter à environ 500 ml
3 O00 rng/l).
d’eau (6.1)
Les eaux résiduaires peuvent être utilisées telles
- 10 ml de solution (a);
quelles ou diluées.
- 1 ml de chacune des solutions (b), (c) et (d).
8.1.2 Solution d’un composé de référence
Compléter a 1 O00 ml avec de l’eau (6.1).
Dissoudre dans de l’eau (6.1) 3 O00 mg d‘un com-
posé organique soluble dans l’eau connu (par
6.3 Solution de chlorure mercurique
exemple, diéthylèneglycol, éthylèneglycol ou ani-
I i fi e) .
Dissoudre dans 1 O00 ml d’eau (6.1) 10 g de chlorure
mercurique (HgCI,).
8.2 Préparation de I’inaculum
Prélever un échantillon de boue activée dans le
Appareillage
bassin d’aération d’une usine de traitement biologi-
que des eaux résiduaires (voir notes 3 et 4.)
-
Matériel courant de laboratoire et appareillage sui-
Bien mélanger l‘échantillon, et laver plusieurs fois
vant.
la boue activée en procédant comme suit: ajouter
de l’eau du robinet ou du milieu d’essai (6.2), puis
centrifuger ou décanter et éliminer le surnageant.
7.1 Fioles en verre, de volume compris entre 1 I et
Déterminer, juste avant emploi, la concentration des
5 I et équipées
matiéres en suspension (3.2). Si nécessaire,
- d’un système d’agitation avec agitateur en verre concentrer la boue par décantation afin que le vo-
lume de boue à utiliser pour obtenir la concentration
ou en métal (mettre en rotation pour assurer une
souhaitée de matières en suspension (voir 8.3) soit
homog é n é isa tion convenable);
minimal.
- de tubes en verre de diamètre intérieur compris
Conserver I’inoculum jusqu‘au moment de l’emploi
entre 2 mm et 4 mm ou avec plaque en verre
dans des conditions d’aérobiose, à température
fritté, destinés B l’introduction de l’air, L’air uti-
ambiante.
lise ne doit contenir ni carbone organique ni va-
peurs toxiques et doit avoir été saturé en vapeur
NOTES
d’eau afin de limiter les pertes par évaporation.
3 Suivanl les objectifs de l‘essai, il peut être nécessaire
La verrerie de laboratoire doit être soigneusement
que l’usine de traitement reçoive des eaux d’origine es-
nettoyée et ne doit notamment pas contenir de trace sentiellement domestique. Pour obtenir autant d‘espèces
de substances organiques ou toxiques. ou de souches bactériennes différentes que possible, il
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IS0 9888:1991(F)
peut être préférable dans certains cas particuliers de Si le composé étudié est susceptible d’être éliminé
mélanger des boues de plusieurs origines. La boue acti-
par un processus abiotique, notamment I’entraî-
vée peut également provenir d’une installation de
nement par l’air, préparer une fiole témoin d’élimi-
traitement en laboratoire.
nation abiotique (symbole Fs). Mélanger le milieu
d’essai (6.2) et le composé à expérimenter (8.1.1)
4 Dans certaines circonstances, il est admis d’utiliser
comme pour la préparation des fioles FT, mais rem-
des inocula préexposés, à condition que cela soit clai-
placer I’inoculum par une substance toxique de
rement mentionné dans les résultats d’essai (par exem-
concentration suffisante pour inhiber toute activité
...
Questions, Comments and Discussion
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