ISO 19040-2:2018
(Main)Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 2: Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 2: Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
This document specifies a method for the determination of the estrogenic potential of water and waste water by means of a reporter gene assay with a genetically modified yeast strain Arxula adeninivorans. This reporter gene assay is based on the activation of the human estrogen receptor alpha. Arxula adeninivorans is a highly robust and salt- and temperature-tolerant test organism and is especially suitable for the analysis of samples with high salinity (conductivity up to 70 mS/cm). The test organism can be cultivated in medium with sodium chloride content up to 20 %. This method is applicable to: — fresh water; — waste water; — sea water; — brackish water; — aqueous extracts and leachates; — eluates of sediments (fresh water); — pore water; — aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures; — drinking water. The limit of quantification (LOQ) of this method for the direct analysis of water samples is between 1,5 ng/l and 3 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). The upper threshold of the dynamic range for this test is between 25 ng/l and 40 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). Samples showing estrogenic potencies above this threshold have to be diluted for a valid quantification. Extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary, if their estrogenic potential is below the given LOQ. An international interlaboratory trial for the validation of this document has been carried out. The results are summarized in Annex F. NOTE Extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary.
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel œstrogène de l'eau et des eaux résiduaires — Partie 2: Test d'œstrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec un gène rapporteur à l’aide d’une souche de levure génétiquement modifiée Arxula adeninivorans. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou de l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il ne répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels. L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être utilisé pour mesurer l'activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERα) en présence d'un échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques en interagissant avec le récepteur. Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme une mesure intégrale incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange sur le récepteur des œstrogènes humains. Arxula adeninivorans est un organisme d’essai très robuste, résistant au sel et à la température qui est particulièrement adapté à l’analyse d’échantillons ayant une salinité élevée (conductivité jusqu’à 70 mS/cm). L’organisme d’essai peut être cultivé dans un milieu contenant jusqu’à 20 % de chlorure de sodium. Cette méthode est applicable: — aux eaux douces; — aux eaux résiduaires; — à l’eau de mer; — à l’eau saumâtre; — aux extraits aqueux et lixiviats; — aux éluats de sédiments (eau douce); — aux eaux interstitielles; — aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques; — à l’eau potable. La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est comprise entre 1,5 ng/l et 3 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ). Le seuil supérieur de la gamme dynamique pour cet essai est compris entre 25 ng/l et 40 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ). Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée. Un essai interlaboratoires international a été réalisé pour la validation du présent document. L’Annexe F fournit un récapitulatif des résultats. NOTE L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19040-2
First edition
2018-08
Water quality — Determination of
the estrogenic potential of water and
waste water —
Part 2:
Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula
adeninivorans)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel oestrogène de l'eau et
des eaux résiduaires —
Partie 2: Test d'oestrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
Reference number
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 4
5 Interferences . 4
6 Apparatus and materials. 4
7 Reagents, media and test strains . 5
8 Sampling and samples . 9
8.1 General . 9
8.2 Bottles and material for sampling . 9
8.3 Bottles and material pre-cleaning .10
8.4 Sampling procedure .10
8.5 Transport of samples .10
8.6 Pretreatment of samples .10
8.7 Storage of samples .11
9 Procedure.11
9.1 Test set up .11
9.1.1 Preparation of the reference dilution series .11
9.1.2 Reactivation of the yeast .11
9.1.3 Negative control .12
9.1.4 Blank replicate .12
9.1.5 Sample dilution .12
9.1.6 Field blank .13
9.1.7 Plate set up .13
9.1.8 Inoculation of the test plate .13
9.2 Measurement .14
9.2.1 Measurement of the reporter gene activity .14
9.2.2 Measurement of the cell density .15
9.3 Calculations .15
9.3.1 Background correction .15
9.3.2 Calculation of the relative growth .16
9.3.3 Calculations for assessment of sample blanks .17
9.3.4 Calculation of the reporter gene induction .19
10 Validity criteria .22
11 Assessment criteria .23
12 Test report .23
13 Verification .23
Annex A (informative) Plate set up .25
Annex B (informative) Lyophilization of Arxula adeninivorans cells .26
Annex C (informative) Scheme of test principle .28
Annex D (informative) Test set up for chemicals and extracts .29
Annex E (informative) Preparation of dilution series .30
Annex F (informative) Performance data .31
Annex G (informative) Statistical assessment .41
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ISO 19040-2:2018(E)
Annex H (informative) Calculation of estradiol equivalents.42
Annex I (informative) Alternative test design for EEQ determination .45
Annex J (informative) Measurement of the lowest ineffective dilution (LID) of a waste water
— A simplified evaluation for testing of waste water .46
Annex K (informative) Example for statistical evaluation .48
Bibliography .55
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ISO 19040-2:2018(E)
Foreword
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through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
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ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
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different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
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Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
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constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
A list of all parts in the ISO 19040 series can be found on the ISO website.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 19040-2:2018(E)
Water quality — Determination of the estrogenic potential
of water and waste water —
Part 2:
Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the estrogenic potential of water and waste
water by means of a reporter gene assay with a genetically modified yeast strain Arxula adeninivorans.
This reporter gene assay is based on the activation of the human estrogen receptor alpha.
Arxula adeninivorans is a highly robust and salt- and temperature-tolerant test organism and is
especially suitable for the analysis of samples with high salinity (conductivity up to 70 mS/cm). The test
organism can be cultivated in medium with sodium chloride content up to 20 %.
This method is applicable to:
— fresh water;
— waste water;
— sea water;
— brackish water;
— aqueous extracts and leachates;
— eluates of sediments (fresh water);
— pore water;
— aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures;
— drinking water.
The limit of quantification (LOQ) of this method for the direct analysis of water samples is between
1,5 ng/l and 3 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). The upper threshold of the dynamic range for
this test is between 25 ng/l and 40 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ). Samples showing estrogenic
potencies above this threshold have to be diluted for a valid quantification. Extraction and pre-
concentration of water samples can prove necessary, if their estrogenic potential is below the given LOQ.
An international interlaboratory trial for the validation of this document has been carried out. The
results are summarized in Annex F.
NOTE Extraction and pre-concentration of water samples can prove necessary.
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2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org ./obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
blank replicate
additional replicate that contains no test organism, but is treated in the same way as the other replicates
of a sample
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
3.2
culture medium
nutrients presented in a form and phase (liquid or solidified) which support microbiological growth
3.3
dilution level
D
denominator of the dilution coefficient (using the numerator 1) of a mixture of water or waste water
with dilution water as integral number
Note 1 to entry: For undiluted water or waste water, this coefficient per definition is 1→1. The corresponding and
smallest possible value of D is 1. In this document, the arrow indicates the transition from initial total volume to
final total volume.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.4
dilution water
water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.5
50 % effect concentration
EC
50
concentration of a compound which causes 50 % of an effect
Note 1 to entry: In the sense of this document the EC is the concentration of a compound which induces 50 % of
50
the maximal reporter gene activity which can be achieved by this compound.
3.6
field blank
container prepared in the laboratory, using reagent water or other blank matrix, and sent with the
sampling personnel for exposure to the sampling environment to verify possible contamination during
sampling
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
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ISO 19040-2:2018(E)
3.7
growth rate
proportional rate of increase in cell density
[SOURCE: ISO 10253:2006, 3.2]
3.8
induction rate
quotient of the mean value of wells with enhanced reporter gene activity measured on the plates
treated with a dose of the test sample, and the mean value of the corresponding wells treated with the
negative control using the same strain under identical conditions
Note 1 to entry: Instead of the negative control, the estimated parameter A of the four-parameter model, which
describes the dose response relationship between reference compound and the induction rate, can be used.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modified — "wells with enhanced reporter gene activity measured"
replaces "mutant colonies"; "corresponding wells" replaces "corresponding plates"; “quotient” replaces
“difference”.]
3.9
inoculum
fraction of a culture of microorganisms used to start a new culture, or an exponentially growing
preculture, in fresh medium
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44]
3.10
lowest ineffective dilution value
LID
lowest dilution within a test batch which does not show any effect, i.e. no statistically significant
increase in the reporter gene activity compared with the negative control
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modified — “increase in the reporter gene activity” replaces “increase
in the number of revertant wells”.]
3.11
negative control
dilution water without test sample
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.12
reference compound
compound with one or more property values that are sufficiently reproducible and well established to
enable the calibration of the measurement method
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modified — “compound” replaces “material”; “the calibration of the
measurement method” replaces “use of the material or substance for the calibration of an apparatus,
the assessment of a measurement method or for the assignment of values to materials”.]
3.13
reporter gene activity
quantitative activity of a gene attached to the promoter sequence of another gene
3.14
test sample
undiluted, diluted or otherwise prepared portion of a sample to be tested, after completion of all
preparation steps such as centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and determination
of ionic strength
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
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4 Principle
The A-YES (Arxula Yeast Estrogen Screen) is a reporter gene assay which can be used for the
measurement of the activation of the human estrogen receptor alpha (ERα) in the presence of a sample
containing compounds which cause estrogenic effects. By this means the assay detects the estrogenic
activity of the whole sample in its actual state as an integral measure including possible additive,
synergistic and antagonistic mixture-effects.
The human estrogen receptor α is constitutively expressed in the yeast cell under control of a TEF1
promoter. The estrogen receptor belongs to the family of nuclear hormone receptors. If agonists of the
estrogen receptor enter the yeast cell, they bind to the estrogen receptor protein and thus induce its
conformational change. As a consequence two receptor proteins form a receptor dimer. This activation
of the estrogen receptor is measured by the induction of the reporter gene phyK which encodes the
enzyme phytase. The phyK is fused to an estrogen dependent promoter which contains estrogen
responsive elements (ERE). The ER-dimer binds to the promoter and by this activates the expression
and secretion of the phytase. Finally, the activity of the phytase as a measure for the estrogenic
potential of the sample is determined using an appropriate substrate which is cleaved to a coloured
reaction product. The reaction product can be measured photometrically. See Annex C for a scheme of
the test principle.
5 Interferences
Coloured or turbid samples might interfere with the photometric detection of the cell density and/
or the detection of the cleaved substrate of the reporter enzyme phytase (see Clause 10 for further
information).
Effects of the sample matrix may lead to a reduction or increase of viable cells and to a reduction or
increase of the measurable signal. Estrogenic effects of a sample may be masked by matrix effects
leading to false negative or false positive test results.
High salinity can cause toxic effects due to the resulting osmotic pressure. The conductivity of a sample
is a measure for its salinity. The Arxula adeninivorans yeast tolerates a conductivity of the sample up to
20 % sodium chloride which meets a conductivity of 180 mS/cm.
Bacterial growth in the test wells is assessed by the blank replicate (3.1). See Clause 10 for further
information.
If filtered samples are tested in order to remove bacteria from the sample solid particles are separated
from the sample also. Thus, substances with estrogenic activity which are adsorbed on particles might
not be detected.
For detailed information about appropriate sampling material that does not influence the test result
see Clause 8.
6 Apparatus and materials
For suitable sampling devices see Clause 8. Use usual laboratory apparatus and glassware if required.
In particular, the following material is needed:
6.1 Temperature- and time-controlled incubator shaker, shaker orbit at least 3 mm, 30 °C to
37 °C with an accuracy of ±1 °C.
If the shaker has no incubation function use a lab shaker with a shaker orbit of at least 3 mm in
combination with an incubator (6.17).
6.2 Lab mini shaker.
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6.3 Multi-parameter measurement device for pH and conductivity or separate devices for each
parameter.
6.4 Steam sterilizer.
6.5 Centrifuge, with a rotor for 96-well plates up to 1 000 g and a rotor for 2 ml reaction tubes.
6.6 Sterile filters, cellulose acetat, 0,2 µm pore size.
6.7 Single-channel pipettes, nominal volume 10 µl up to 10 000 µl.
6.8 Multi-channel pipettes, nominal volume 100 µl and 300 µl.
6.9 Transparent polystyrene 96-well plates with flat bottom (F-profile, 300 µl) and lid.
6.10 96-deep well plates with at least 1 ml volume with round bottom and square wells.
6.11 Microplate photometer for 96-well plates, for absorbance measurement for wavelength
405 nm ± 20 nm and 630 nm ± 5 nm or alternatively 600 nm ± 20 nm.
6.12 Air-permeable adhesive foil for deep well plates.
6.13 Reaction tubes, 2 ml.
6.14 Test tubes, 15 ml and 50 ml.
6.15 Multi-channel pipette trough.
6.16 Balance, minimum load 1 mg, d = 0,1 mg.
6.17 Incubator, 30 °C to 37 °C with an accuracy of ±1 °C. For the purpose of using the incubator in
combination with a shaker a cooled incubator is required.
7 Reagents, media and test strains
7.1 Reagents
As far as possible, use “reagent grade“-chemicals.
7.1.1 Hydrochloric acid solution, c(HCl) = 1 mol/l, molecular weight 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.1.2 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l, molecular weight 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.3 Ethanol, ≥99,8 %, C H OH, molecular weight 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
2 5
7.1.4 17β-estradiol, ≥98 %, C H O , molecular weight 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.5 Maltose monohydrate, >95 %, C H O ·H O, molecular weight 360,32 g/mol, CAS: 6363-53-7.
12 22 11 2
7.1.6 Sodium nitrate, >99 %, NaNO , molecular weight 84,98 g/mol, CAS: 7631-99-4.
3
© ISO 2018 – All rights reserved 5
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ISO 19040-2:2018(E)
7.1.7 Potassium dihydrogen phosphate, ≥99 %, KH PO , molecular weight 136,09 g/mol,
2 4
CAS: 7778-77-0.
7.1.8 Magnesium sulfate pure, MgSO , molecular weight 120,37 g/mol (water free), CAS: 7487-88-9.
4
7.1.9 Iron(III) chloride hexahydrate, >97 %, FeCl ·6H O, molecular weight 270,29 g/mol,
3 2
CAS: 10025-77-1.
7.1.10 Calcium nitrate, >99 %, Ca(NO ) , molecular weight 164,09 g/mol, CAS: 10124-37-5.
3 2
7.1.11 Calcium D-pantothenate, >98 %, C H CaN O molecular weight 238,27 g/mol, CAS: 137-08-6.
18 32 2 10
7.1.12 Thiamine hydrochloride, >98,5 %, C H Cl N OS, molecular weight 337,27 g/mol,
12 18 2 4
CAS: 67-03-8.
7.1.13 Niacin, >99,5 %, C H NO , molecular weight 123,11 g/mol, CAS: 59-67-6.
6 5 2
7.1.14 Pyridoxine hydrochloride, >99 %, C H NO ·HCl, molecular weight 205,64 g/mol, CAS: 58-56-0.
8 11 3
7.1.15 D-(+)-Biotin, ≥98,5 %, C H N O S, molecular weight 244,31 g/mol, CAS: 58-85-5.
10 16 2 3
7.1.16 Inositol, ≥99 %, C H O , molecular weight 180,16 g/mol, CAS: 87-89-8.
6 12 6
7.1.17 Boric acid, >99,8 %, H BO , molecular weight 61,83 g/mol, CAS: 10043-35-3.
3 3
7.1.18 Copper(II) sulfate pentahydrate, >99,5 %, CuSO ·5H O, molecular weight 249,68 g/mol,
4 2
CAS: 7758-99-8.
7.1.19 Potassium iodide, >99 %, KI molecular weight 166,00 g/mol, CAS: 7681-11-0.
7.1.20 Manganese sulfate monohydrate, >99 %, MnSO ·H O, molecular weight 169,02 g/mol,
4 2
CAS: 10034-96-5.
7.1.21 Zinc sulfate heptahydrate, >99,5 %, ZnSO ·7H O, molecular weight 287,56 g/mol, CAS:
4 2
7446-20-0.
7.1.22 Sodium molybdate dihydrate, >99,5 %, Na MoO ·2H O, molecular weight 241,95 g/mol,
2 4 2
CAS: 10102-40-6.
7.1.23 Cobalt(II) chloride for synthesis, CoCl , molecular weight 129,84 g/mol, CAS: 7646-79-9.
2
7.1.24 Trisodium citrate dihydrate, >99 %, C H Na O ·2H O, molecular weight 294,10 g/mol,
6 5 3 7 2
CAS: 6132-04-3.
7.1.25 Citric acid, >99,5 %, C H O , molecular weight 192,12 g/mol, CAS: 77-92-9.
6 8 7
7.1.26 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP), C H NNa O P·6H O, molecular
6 4 2 6 2
weight 371,14 g/mol, CAS: 333338-18-4.
7.1.27 Sodium hydroxide, ≥99 %, NaOH, molecular weight 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
6 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 19040-2:2018(E)
7.1.28 Sea salt with the specifications: chloride (Cl) 19 290 mg/l, sodium 10 780 mg/l, sulfate
2 660 mg/l, potassium 420 mg/l, calcium 400 mg/l, carbonate (bicarbonate) 200 mg/l, strontium
8,8 mg/l, boron 5,6 mg/l, bromide 56 mg/l, iodide 0,24 mg/l, lithium 0,3 mg/l, fluoride 1,0 mg/l,
magnesium (Mg) 1 320 mg/l.
7.1.29 Sodium chloride, ≥99 %, NaCl, molecular weight 58,44 g/mol, CAS: 7647-14-5.
7.1.30 Aceton (purity p.a.), C H O, molecular weight 58,08 g/mol, CAS: 67-64-1.
3 6
7.2 Water, grade 3, as defined in ISO 3696; water with conductivity up to 5 µS/cm is acceptable, or
ultrapure water.
If sterile water is needed, autoclave or sterilize by filtration (cellulose acetate, 0,2 µm).
Water as specified here is also used for the preparation of dilution water which is used for the stepwise
dilution of the test sample.
7.3 Test strain
This test strain is derived from Blastobotrys adeninivorans G1214 Syn.: Arxula adeninivorans G1214
(aleu2 aura3::ALEU2), Reference [1]. This strain displays an uracil auxotrophy. To prevent any formations
of antibiotic resistances in environment and to increase acceptance regarding legal requirements the
test organism contains no antibiotic resistance markers.
Genetic modifications: Integration of the selection marker AURA3mm in the plasmid Xplor2-102-hERα-
GAA2(ERE107)-phyK after exchange of the marker ALEU2 promoter-ATRP1m. The selection marker
AURA3mm was isolated from the plasmid pCR4-AURA3mm-13. The sequences of E. coli and Kanamycin
resistant marker were eliminated through restriction digestion. Stable integration of Xplor2-102-hERα-
GAA2(ERE107)-phyK in Arxula adeninivorans genome was achieved by transformation the cassette in
uracil auxotroph mutant of A. adeninivorans G1214 (aleu2 aura3::ALEU2) through recombination with
25S-rDNA.
The yeast cell suspension for determination of the estrogenic potential of aqueous samples is prepared
from lyophilized yeast cells. As the Arxula adeninivorans cells are lyophilized the test can be conducted
under highly standardized conditions and no specific lab equipment for long-term cell cultivation is
required.
The yeast cells are available commercially. Store the lyophilized yeast cells between 4 °C and 8 °C and
follow the manufacturer’s recommendations. After reactivation, the yeast cells can directly be used for
the test, precultivation is not needed for testing.
A
...
Style Definition: Heading 1: Indent: Left: 0 pt, First line:
ISO/TC 147/SC 5
0 pt
Style Definition: Heading 2: Font: Bold, Tab stops: Not at
Date: 2022-10-03
18 pt
Style Definition: Heading 3: Font: Bold
ISO 19040-2:2018(F)
Style Definition: Heading 4: Font: Bold
ISO/TC 147/SC 5
Style Definition: Heading 5: Font: Bold
Style Definition: Heading 6: Font: Bold
Secrétariat: DIN
Style Definition: ANNEX
Style Definition: RefNorm
Style Definition: Body Text_Center
Style Definition: Dimension_100
Style Definition: Figure Graphic
Style Definition: Figure subtitle
Style Definition: List Continue 1
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel œstrogéniqueoestrogène de
Style Definition: List Number 1
l’eaul'eau et des eaux résiduaires en fonction des agonistes et des antagonistes du
Style Definition: AMEND Terms Heading: Font: Bold
récepteur des œstrogènes — Partie 2: Essai d’œstrogénicité sur levuresTest
Style Definition: AMEND Heading 1 Unnumbered: Font:
d'oestrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
Bold
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water
related to agonists and antagonists of the estrogen receptor — Part 2: Yeast estrogen
screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
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ISO 19040-2:2018(F)
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Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne
peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans
autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
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Fax + 41 22 749 09 47
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ISO 19040-2:2018(F)
Sommaire
Page
Avant-propos . Error! Bookmark not defined.
1 Domaine d’application . Error! Bookmark not defined.
2 Références normatives . Error! Bookmark not defined.
3 Termes et définitions . Error! Bookmark not defined.
4 Principe . Error! Bookmark not defined.
5 Interférences . Error! Bookmark not defined.
6 Appareillage et matériel. Error! Bookmark not defined.
7 Réactifs, milieux et souches d’essai . Error! Bookmark not defined.
8 Échantillonnage et échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . Error! Bookmark not defined.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.5 Transport des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.6 Prétraitement des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.7 Conservation des échantillons . Error! Bookmark not defined.
9 Mode opératoire . Error! Bookmark not defined.
9.1 Configuration d’essai . Error! Bookmark not defined.
9.1.1 Préparation de la gamme de dilution de référence . Error! Bookmark not defined.
9.1.2 Réactivation de la levure . Error! Bookmark not defined.
9.1.3 Témoin négatif . Error! Bookmark not defined.
9.1.4 Réplicat à blanc . Error! Bookmark not defined.
9.1.5 Dilution de l’échantillon . Error! Bookmark not defined.
9.1.6 Blanc de terrain. Error! Bookmark not defined.
9.1.7 Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
9.1.8 Inoculation de la plaque d’essai . Error! Bookmark not defined.
9.2 Mesurage . Error! Bookmark not defined.
9.2.1 Mesurage de l’activité du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
9.2.2 Mesurage de la densité cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.3 Calculs . Error! Bookmark not defined.
9.3.1 Correction du bruit de fond . Error! Bookmark not defined.
9.3.2 Calcul de la croissance relative . Error! Bookmark not defined.
9.3.3 Calculs pour l’évaluation des blancs d’échantillon . Error! Bookmark not defined.
9.3.4 Calcul de l’induction du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
10 Critères de validité . Error! Bookmark not defined.
11 Critères d’évaluation . Error! Bookmark not defined.
12 Rapport d’essai . Error! Bookmark not defined.
13 Vérification . Error! Bookmark not defined.
Annexe A (informative) Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
Annexe B (informative) Lyophilisation des cellules d’Arxula adeninivorans . Error! Bookmark not
defined.
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iii
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ISO 19040-2:2018(F)
Annexe C (informative) Schéma de principe de l’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits . Error!
Bookmark not defined.
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution . Error! Bookmark not defined.
Annexe F (informative) Données de performances . Error! Bookmark not defined.
Annexe G (informative) Évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Annexe H (informative) Calcul des équivalents œstradiol . Error! Bookmark not defined.
Annexe I (informative) Autre conception d’essai pour la détermination de EEQ Error! Bookmark not
defined.
Annexe J (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires . Error! Bookmark
not defined.
Annexe K (informative) Exemple d’évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Bibliographie . Error! Bookmark not defined.
© ISO 2018 – Tous droits réservés
iv
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ISO 19040-2:2018(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 19040-2:2018(F)
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel
œstrogéniqueoestrogène de l’eaul'eau et des eaux résiduaires
en fonction des agonistes et des antagonistes du récepteur des
œstrogènes — Partie 2: Essai d’œstrogénicité sur levuresTest
d'oestrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité
qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des
pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent document
soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec un gène rapporteur à l’aide d’une souche de levure
génétiquement modifiée Arxula adeninivorans. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du
récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou de
l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il ne
répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur
comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels.
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
utilisé pour mesurer l'activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERα) en présence d'un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques en interagissant avec le
récepteur. Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état
réel comme une mesure intégrale incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du
mélange sur le récepteur des œstrogènes humains.
Arxula adeninivorans est un organisme d’essai très robuste, résistant au sel et à la température qui est
particulièrement adapté à l’analyse d’échantillons ayant une salinité élevée (conductivité
jusqu’à 70 mS/cm). L’organisme d’essai peut être cultivé dans un milieu contenant jusqu’à 20 % de
chlorure de sodium.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— à l’eau de mer;
— à l’eau saumâtre;
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ISO 19040-2:2018(F)
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable.
La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 1,5 ng/l et 3 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ). Le seuil supérieur de la gamme
dynamique pour cet essai est compris entre 25 ng/l et 40 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ).
Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une
quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer
nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
Un essai interlaboratoires international a été réalisé pour la validation du présent document. L’Annexe F Formatted: Pattern: Clear
fournit un récapitulatif des résultats.
NOTE L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences
du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non
datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
Commented [eXtyles2]: The match came back with a
different title. The original title was: Eau pour laboratoire à
usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
Commented [eXtyles3]: The text ";" is marked with
"Hyperlink" character style but does not appear to be a
hyperlink. Please check the text.
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse
https://www.iso.org/obp;https://www.iso.org/obp; Commented [eXtyles4]: The text "." is marked with
"Hyperlink" character style but does not appear to be a
hyperlink. Please check the text.
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse
https://www.electropedia.org/https://www.electropedia.org/. Commented [eXtyles5]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.1
ISO 10872:2020, Qualité de l'eau et du sol — Détermination
réplicat à blanc
de l'effet toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les autres croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis
elegans (Nematodes)
réplicats d’un échantillon
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.2
Formatted: Pattern: Clear
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ISO 19040-2:2018(F)
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance microbiologique
3.3
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux résiduaires
et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l’article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28] Commented [eXtyles6]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.4
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
eau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.5
Formatted: Pattern: Clear
concentration efficace 50 %
CE Formatted: Pattern: Clear
50
concentration d’un composé produisant 50 % d’un effet
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Au sens du présent document, la CE est la concentration d’un composé qui induit 50 % de
50
l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc, et
destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement dans
lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.7
Formatted: Pattern: Clear
taux de croissance
Formatted: Pattern: Clear
taux proportionnel d’augmentation de la densité cellulaire
[SOURCE: ISO 10253:2006, 3.2] Commented [eXtyles7]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.8
ISO 10253:2016, Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la
taux d’induction
croissance des algues marines avec Skeletonema sp. et
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
Phaeodactylum tricornutum
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai, à la valeur moyenne des puits correspondants
Formatted: Pattern: Clear
traités avec le témoin négatif à l’aide de la même souche, dans des conditions identiques
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Au lieu du témoin négatif, il est possible d’utiliser le paramètre estimé A du modèle à quatre Formatted: Pattern: Clear
paramètres, qui décrit la relation dose-effet entre un composé de référence et le taux d’induction.
Formatted: Pattern: Clear
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3
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ISO 19040-2:2018(F)
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur Formatted: Pattern: Clear
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
Formatted: Pattern: Clear
correspondantes»; «rapport» remplace «différence».]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.9
inoculum
Commented [eXtyles8]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une
préculture à croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44] Commented [eXtyles9]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.10
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
plus faible dilution sans effet
Formatted: Pattern: Clear
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation Formatted: Pattern: Clear
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
Formatted: Pattern: Clear
«augmentation du nombre de puits de révertants».]
Formatted: Pattern: Clear
3.11
Formatted: Pattern: Clear
témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51] Commented [eXtyles10]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.12
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
composé de référence
Formatted: Pattern: Clear
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
Formatted: Pattern: Clear
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
Formatted: Pattern: Clear
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
Formatted: Pattern: Clear
3.13
Formatted: Pattern: Clear
activité du gène rapporteur
Formatted: Pattern: Clear
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
Commented [eXtyles11]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.14
échantillon pour essai
ISO 7405:2018, Médecine bucco-dentaire — Évaluation de
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution de la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en
médecine bucco-dentaire
toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, l’ajustement
du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
Commented [eXtyles12]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
4 Principe
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
Formatted: Pattern: Clear
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
Formatted: Pattern: Clear
utilisé pour mesurer l’activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERa) en présence d’un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques. Ainsi, le dosage détecte
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
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4
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ISO 19040-2:2018(F)
l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme une mesure intégrale
incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange.
Le récepteur α des œstrogènes humains est exprimé de façon constitutive dans la cellule de levure sous
le contrôle du promoteur TEF1. Le récepteur des œstrogènes appartient à la famille des récepteurs
nucléaires d’hormones. Lorsque des agonistes du récepteur des œstrogènes pénètrent dans la cellule de
levure, ils se lient à la protéine réceptrice des œstrogènes et induisent ainsi son changement
conformationnel. En conséquence, deux protéines réceptrices forment un dimère récepteur. Cette
activation du récepteur des œstrogènes est mesurée par l’induction du gène rapporteur phyK qui code
l’enzyme phytase. Le gène phyK fusionne avec un promoteur œstrogéno-dépendant qui contient des
éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). L’ER dimère se lie au promoteur et active ainsi l’expression
et la sécrétion de la phytase. Enfin, l’activité de la phytase en tant que mesure du potentiel œstrogénique
de l’échantillon est déterminée en utilisant un substrat approprié dont le clivage génère un produit de
réaction coloré. Le produit de réaction peut être mesuré par photométrie. Voir l’Annexe C pour un schéma Formatted: Pattern: Clear
du principe de l’essai.
5 Interférences
Les échantillons colorés ou troubles peuvent interférer avec la détection photométrique de la densité
cellulaire et/ou la détection du substrat clivé de l’enzyme rapportrice phytase (voir l’Article 10 pour de Formatted: Pattern: Clear
plus amples informations).
Les effets de la matrice de l’échantillon peuvent entraîner une réduction ou une augmentation des cellules
viables et une réduction ou une augmentation du signal mesurable. Les effets œstrogéniques d’un
échantillon peuvent être masqués par les effets de matrice, conduisant ainsi à des résultats d’essai faux
négatifs ou faux positifs.
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. La
conductivité d’un échantillon est une mesure de sa salinité. La levure Arxula adeninivorans tolère une
conductivité de l’échantillon jusqu’à 20 % de chlorure de sodium, ce qui correspond à une conductivité
de 180 mS/cm.
La croissance bactérienne dans les puits d’essai est évaluée par le réplicat à blanc (3.1). Voir l’Article 10 Formatted: Pattern: Clear
pour de plus amples informations.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Pour des informations détaillées sur un matériel d’échantillonnage approprié qui n’influence pas le
résultat d’essai, voir l’Article 8.
Formatted: Pattern: Clear
6 Appareillage et matériel
Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8. Utiliser le matériel et la verrerie de Formatted: Pattern: Clear
laboratoire courants si nécessaire. En particulier, le matériel suivant est nécessaire:
6.1 Incubateur agitateur avec minuteur et régulation de température, agitateur décrivant une
orbite d’au moins 3 mm, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C.
Si l’agitateur n’a pas de fonction d’incubation, utiliser un agitateur de laboratoire décrivant une orbite
d’au moins 3 mm en combinaison avec un incubateur (6.17). Formatted: Pattern: Clear
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ISO 19040-2:2018(F)
6.2 Mini-agitateur de laboratoire.
6.3 Dispositif de mesurage multiparamètres pour pH et conductivité ou dispositifs séparés pour
chaque paramètre.
6.4 Stérilisateur à vapeur.
6.5 Centrifugeuse, avec un rotor pour plaques à 96 puits jusqu’à 1 000 g et un rotor pour tubes de
réaction de 2 ml.
6.6 Filtres stériles, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,2 µm.
6.7 Pipettes à canal unique, volume nominal de 10 µl à 10 000 µl.
6.8 Pipettes à canaux multiples, volume nominal de 100 µl et 300 µl.
6.9 Plaques à 96 puits en polystyrène transparent à fond plat (profil F, 300 µl) et couvercle.
6.10 Plaques à 96 puits profonds d’un volume d’au moins 1 ml, avec puits carrés à fond rond.
6.11 Photomètre pour microplaques à 96 puits, pour mesurage de l’absorbance à une longueur
d’onde de 405 nm ± 20 nm et de 630 nm ± 5 nm, ou de 600 nm ± 20 nm.
6.12 Film adhésif perméable à l’air pour plaques à puits profonds.
6.13 Tubes de réaction, 2 ml.
6.14 Tubes à essai, 15 ml et 50 ml.
6.15 Réservoir pour pipettes à canaux multiples.
6.16 Balance, charge minimale 1 mg, d = 0,1 mg.
6.17 Incubateur, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C. Pour utiliser l’incubateur en combinaison
avec un agitateur, un incubateur réfrigéré est nécessaire.
7 Réactifs, milieux et souches d’essai
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
7.1.1 Solution d’acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l, masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-
01-0.
7.1.2 Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l, masse moléculaire 40,00 g/mol,
CAS: 1310-73-2.
7.1.3 Éthanol, ≥ 99,8 %, C H OH, masse moléculaire 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
2 5
7.1.4 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.5 Maltose monohydraté, > 95 %, C H O , H O, masse moléculaire 360,32 g/mol, C
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 19040-2
Première édition
2018-08
Qualité de l'eau — Détermination du
potentiel œstrogène de l'eau et des
eaux résiduaires —
Partie 2:
Test d'œstrogénicité (A-YES, Arxula
adeninivorans)
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water
and waste water —
Part 2: Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
Numéro de référence
ISO 19040-2:2018(F)
© ISO 2018
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Publié en Suisse
ii
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ISO 19040-2:2018(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 4
5 Interférences . 4
6 Appareillage et matériel .5
7 Réactifs, milieux et souches d’essai .6
8 Échantillonnage et échantillons .10
8.1 Généralités . 10
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . 10
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . 10
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . 11
8.5 Transport des échantillons . 11
8.6 Prétraitement des échantillons . 11
8.7 Conservation des échantillons .12
9 Mode opératoire .12
9.1 Configuration d’essai .12
9.1.1 Préparation de la gamme de dilution de référence .12
9.1.2 Réactivation de la levure.12
9.1.3 Témoin négatif .13
9.1.4 Réplicat à blanc .13
9.1.5 Dilution de l’échantillon . 14
9.1.6 Blanc de terrain . 14
9.1.7 Préparation de la plaque . 14
9.1.8 Inoculation de la plaque d’essai. 15
9.2 Mesurage . . 16
9.2.1 Mesurage de l’activité du gène rapporteur . 16
9.2.2 Mesurage de la densité cellulaire . 16
9.3 Calculs . 17
9.3.1 Correction du bruit de fond . 17
9.3.2 Calcul de la croissance relative . 18
9.3.3 Calculs pour l’évaluation des blancs d’échantillon . 18
9.3.4 Calcul de l’induction du gène rapporteur . 20
10 Critères de validité .23
11 Critères d’évaluation .24
12 Rapport d’essai .24
13 Vérification .25
Annexe A (informative) Préparation de la plaque .26
Annexe B (informative) Lyophilisation des cellules d’Arxula adeninivorans .27
Annexe C (informative) Schéma de principe de l’essai .29
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits .30
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution .31
Annexe F (informative) Données de performances .32
Annexe G (informative) Évaluation statistique .43
iii
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ISO 19040-2:2018(F)
Annexe H (informative) Calcul des équivalents œstradiol . 44
Annexe I (informative) Autre conception d’essai pour la détermination de EEQ .47
Annexe J (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires .48
Annexe K (informative) Exemple d’évaluation statistique .50
Bibliographie .57
iv
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ISO 19040-2:2018(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
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NORME INTERNATIONALE ISO 19040-2:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel œstrogène
de l'eau et des eaux résiduaires —
Partie 2:
Test d'œstrogénicité (A-YES, Arxula adeninivorans)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité
de l’utilisateur d’établir des pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec un gène rapporteur à l’aide d’une souche de levure
génétiquement modifiée Arxula adeninivorans. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation
du récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou
de l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il
ne répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur
comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels.
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
utilisé pour mesurer l'activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERα) en présence d'un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques en interagissant avec le
récepteur. Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état
réel comme une mesure intégrale incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du
mélange sur le récepteur des œstrogènes humains.
Arxula adeninivorans est un organisme d’essai très robuste, résistant au sel et à la température qui est
particulièrement adapté à l’analyse d’échantillons ayant une salinité élevée (conductivité jusqu’à 70 mS/
cm). L’organisme d’essai peut être cultivé dans un milieu contenant jusqu’à 20 % de chlorure de sodium.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— à l’eau de mer;
— à l’eau saumâtre;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable.
1
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ISO 19040-2:2018(F)
La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 1,5 ng/l et 3 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ). Le seuil supérieur de la gamme
dynamique pour cet essai est compris entre 25 ng/l et 40 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ).
Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour
une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer
nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
Un essai interlaboratoires international a été réalisé pour la validation du présent document. L’Annexe F
fournit un récapitulatif des résultats.
NOTE L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
réplicat à blanc
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les
autres réplicats d’un échantillon
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
3.2
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance microbiologique
3.3
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux
résiduaires et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l'article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
2
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ISO 19040-2:2018(F)
3.4
eau de dilution
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.5
concentration efficace 50 %
CE
50
concentration d’un composé produisant 50 % d’un effet
Note 1 à l'article: Au sens du présent document, la CE est la concentration d’un composé qui induit 50 % de
50
l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc,
et destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement
dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.7
taux de croissance
taux proportionnel d’augmentation de la densité cellulaire
[SOURCE: ISO 10253:2006, 3.2]
3.8
taux d’induction
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai, à la valeur moyenne des puits correspondants
traités avec le témoin négatif à l’aide de la même souche, dans des conditions identiques
Note 1 à l'article: Au lieu du témoin négatif, il est possible d’utiliser le paramètre estimé A du modèle à quatre
paramètres, qui décrit la relation dose-effet entre un composé de référence et le taux d’induction.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
correspondantes»; «rapport» remplace «différence».]
3.9
inoculum
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une
préculture à croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44]
3.10
plus faible dilution sans effet
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
«augmentation du nombre de puits de révertants».]
3
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3.11
témoin négatif
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.12
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
3.13
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
3.14
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution
de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,
l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
4 Principe
L’essai A-YES (essai d’œstrogénicité sur levure Arxula) est un essai avec gène rapporteur qui peut être
utilisé pour mesurer l’activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (ERa) en présence d’un
échantillon contenant des composés qui provoquent des effets œstrogéniques. Ainsi, le dosage détecte
l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme une mesure intégrale
incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange.
Le récepteur α des œstrogènes humains est exprimé de façon constitutive dans la cellule de levure sous
le contrôle du promoteur TEF1. Le récepteur des œstrogènes appartient à la famille des récepteurs
nucléaires d’hormones. Lorsque des agonistes du récepteur des œstrogènes pénètrent dans la cellule
de levure, ils se lient à la protéine réceptrice des œstrogènes et induisent ainsi son changement
conformationnel. En conséquence, deux protéines réceptrices forment un dimère récepteur. Cette
activation du récepteur des œstrogènes est mesurée par l’induction du gène rapporteur phyK qui code
l’enzyme phytase. Le gène phyK fusionne avec un promoteur œstrogéno-dépendant qui contient des
éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). L’ER dimère se lie au promoteur et active ainsi l’expression
et la sécrétion de la phytase. Enfin, l’activité de la phytase en tant que mesure du potentiel œstrogénique
de l’échantillon est déterminée en utilisant un substrat approprié dont le clivage génère un produit
de réaction coloré. Le produit de réaction peut être mesuré par photométrie. Voir l’Annexe C pour un
schéma du principe de l’essai.
5 Interférences
Les échantillons colorés ou troubles peuvent interférer avec la détection photométrique de la densité
cellulaire et/ou la détection du substrat clivé de l’enzyme rapportrice phytase (voir l’Article 10 pour de
plus amples informations).
Les effets de la matrice de l’échantillon peuvent entraîner une réduction ou une augmentation des
cellules viables et une réduction ou une augmentation du signal mesurable. Les effets œstrogéniques
d’un échantillon peuvent être masqués par les effets de matrice, conduisant ainsi à des résultats d’essai
faux négatifs ou faux positifs.
4
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ISO 19040-2:2018(F)
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. La
conductivité d’un échantillon est une mesure de sa salinité. La levure Arxula adeninivorans tolère une
conductivité de l’échantillon jusqu’à 20 % de chlorure de sodium, ce qui correspond à une conductivité
de 180 mS/cm.
La croissance bactérienne dans les puits d’essai est évaluée par le réplicat à blanc (3.1). Voir l’Article 10
pour de plus amples informations.
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Pour des informations détaillées sur un matériel d’échantillonnage approprié qui n’influence pas le
résultat d’essai, voir l’Article 8.
6 Appareillage et matériel
Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8. Utiliser le matériel et la verrerie de
laboratoire courants si nécessaire. En particulier, le matériel suivant est nécessaire:
6.1 Incubateur agitateur avec minuteur et régulation de température, agitateur décrivant une
orbite d’au moins 3 mm, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C.
Si l’agitateur n’a pas de fonction d’incubation, utiliser un agitateur de laboratoire décrivant une orbite
d’au moins 3 mm en combinaison avec un incubateur (6.17).
6.2 Mini-agitateur de laboratoire.
6.3 Dispositif de mesurage multiparamètres pour pH et conductivité ou dispositifs séparés
pour chaque paramètre.
6.4 Stérilisateur à vapeur.
6.5 Centrifugeuse, avec un rotor pour plaques à 96 puits jusqu’à 1 000 g et un rotor pour tubes de
réaction de 2 ml.
6.6 Filtres stériles, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,2 µm.
6.7 Pipettes à canal unique, volume nominal de 10 µl à 10 000 µl.
6.8 Pipettes à canaux multiples, volume nominal de 100 µl et 300 µl.
6.9 Plaques à 96 puits en polystyrène transparent à fond plat (profil F, 300 µl) et couvercle.
6.10 Plaques à 96 puits profonds d’un volume d’au moins 1 ml, avec puits carrés à fond rond.
6.11 Photomètre pour microplaques à 96 puits, pour mesurage de l’absorbance à une longueur
d’onde de 405 nm ± 20 nm et de 630 nm ± 5 nm, ou de 600 nm ± 20 nm.
6.12 Film adhésif perméable à l’air pour plaques à puits profonds.
6.13 Tubes de réaction, 2 ml.
6.14 Tubes à essai, 15 ml et 50 ml.
5
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ISO 19040-2:2018(F)
6.15 Réservoir pour pipettes à canaux multiples.
6.16 Balance, charge minimale 1 mg, d = 0,1 mg.
6.17 Incubateur, 30 °C à 37 °C avec une précision de ±1 °C. Pour utiliser l’incubateur en combinaison
avec un agitateur, un incubateur réfrigéré est nécessaire.
7 Réactifs, milieux et souches d’essai
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
7.1.1 Solution d’acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l, masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-
01-0.
7.1.2 Solution d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l, masse moléculaire 40,00 g/mol,
CAS: 1310-73-2.
7.1.3 Éthanol, ≥ 99,8 %, C H OH, masse moléculaire 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
2 5
7.1.4 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.5 Maltose monohydraté, > 95 %, C H O , H O, masse moléculaire 360,32 g/mol, CAS: 6363-
12 22 11 2
53-7.
7.1.6 Nitrate de sodium, > 99 %, NaNO , masse moléculaire 84,98 g/mol, CAS: 7631-99-4.
3
7.1.7 Dihydrogénophosphate de potassium, ≥ 99 %, KH PO , masse moléculaire 136,09 g/mol,
2 4
CAS: 7778-77-0.
7.1.8 Sulfate de magnésium pur, MgSO , masse moléculaire 120,37 g/mol (anhydre), CAS: 7487-88-
4
9.
7.1.9 Chlorure de fer(III) hexahydraté, > 97 %, FeCl ·6H O, masse moléculaire 270,29 g/mol,
3 2
CAS: 10025-77-1.
7.1.10 Nitrate de calcium, > 99 %, Ca(NO ) , masse moléculaire 164,09 g/mol, CAS: 10124-37-5.
3 2
7.1.11 D-pantothénate de calcium, > 98 %, C H CaN O masse moléculaire 238,27 g/mol,
18 32 2 10
CAS: 137-08-6.
7.1.12 Chlorhydrate de thiamine, > 98,5 %, C H Cl N OS, masse moléculaire 337,27 g/mol, CAS: 67-
12 18 2 4
03-8.
7.1.13 Niacine, > 99,5 %, C H NO , masse moléculaire 123,11 g/mol, CAS: 59-67-6.
6 5 2
7.1.14 Chlorhydrate de pyridoxine, > 99 %, C H NO ·HCl, masse moléculaire 205,64 g/mol, CAS: 58-
8 11 3
56-0.
7.1.15 D-(+)-biotine, ≥ 98,5 %, C H N O S, masse moléculaire 244,31 g/mol, CAS: 58-85-5.
10 16 2 3
6
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7.1.16 Inositol, ≥ 99 %, C H O , masse moléculaire 180,16 g/mol, CAS: 87-89-8.
6 12 6
7.1.17 Acide borique, > 99,8 %, H BO , masse moléculaire 61,83 g/mol, CAS: 10043-35-3.
3 3
7.1.18 Sulfate de cuivre(II) pentahydraté, > 99,5 %, CuSO ·5H O, masse moléculaire 249,68 g/mol,
4 2
CAS: 7758-99-8.
7.1.19 Iodure de potassium, > 99 %, masse moléculaire KI 166,00 g/mol, CAS: 7681-11-0.
7.1.20 Sulfate de manganèse monohydraté, > 99 %, MnSO , H O, masse moléculaire 169,02 g/mol,
4 2
CAS: 10034-96-5.
7.1.21 Sulfate de zinc heptahydraté, > 99,5 %, ZnSO ·7H O, masse moléculaire 287,56 g/mol,
4 2
CAS: 7446-20-0.
7.1.22 Molybdate de sodium dihydraté, > 99,5 %, Na MoO ·2H O, masse moléculaire 241,95 g/mol,
2 4 2
CAS: 10102-40-6.
7.1.23 Chlorure de cobalt(II) pour synthèse, CoCl , masse moléculaire 129,84 g/mol, CAS: 7
...
Questions, Comments and Discussion
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