ISO/TR 15462:2006
(Main)Water quality — Selection of tests for biodegradability
Water quality — Selection of tests for biodegradability
ISO/TR 15462:2006 gives an overview of biodegradation tests for the aquatic environment standardized by ISO and provides recommendations on their use. The biodegradation tests listed are designed to determine the biodegradability of chemical substances or wastewaters under standardized conditions. Inhibitory tests with bacteria and mixed bacterial inocula are included because a possible toxicity on the inoculum is important information for the choice and performance of biodegradation tests.
Qualité de l'eau — Sélection d'essais de biodégradabilité
L'ISO/TR 15462 :2006 donne une vue d'ensemble des essais de biodégradation pour le milieu aquatique, normalisés par l'ISO, et fournit des recommandations pour leur utilisation. Les essais de biodégradabilité indiqués sont conçus pour déterminer la biodégradabilité de substances chimiques ou d'eaux résiduaires dans des conditions normalisées. Des essais d'inhibition employant des bactéries et des mélanges d'inoculums de bactéries sont inclus, car une toxicité potentielle sur l'inoculum constitue une information importante pour le choix et la réalisation des essais de biodégradabilité.
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TECHNICAL ISO/TR
REPORT 15462
Second edition
2006-05-15
Water quality — Selection of tests
for biodegradability
Qualité de l'eau — Sélection d'essais de biodégradabilité
Reference number
ISO/TR 15462:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO/TR 15462:2006(E)
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ISO/TR 15462:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Evaluations and recommendations . 4
Annex A (informative) Comparison of ISO International Standards with OECD Guidelines. 19
Bibliography . 20
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ISO/TR 15462:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In exceptional circumstances, when a technical committee has collected data of a different kind from that
which is normally published as an International Standard (“state of the art”, for example), it may decide by a
simple majority vote of its participating members to publish a Technical Report. A Technical Report is entirely
informative in nature and does not have to be reviewed until the data it provides are considered to be no
longer valid or useful.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TR 15462 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TR 15462:1997), which has been technically
revised.
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ISO/TR 15462:2006(E)
Introduction
The biodegradation of substances and wastewater ingredients depends not only on the molecular structures
of the test material, but also on important additional factors, such as the
⎯ aquatic or terrestrial test environments;
⎯ aerobic or anaerobic test conditions;
⎯ source and concentration of the microorganisms of the inoculum;
⎯ acclimatization and adaptation of the inoculum;
⎯ concentration of the test material;
⎯ presence of other organic substrate;
⎯ possible toxic effects of the test material under the test conditions;
⎯ physical and chemical properties and bioavailability of the test material (e.g. volatility, water solubility,
adsorption on surfaces);
⎯ physical and chemical properties of the test system (e.g. volume of test mixture and test vessels, CO
2
removal and oxygen concentration, temperature);
⎯ test conditions (e.g. mixing, shaking, mode of aeration, batch or dynamic, closed or open test vessels);
⎯ test duration;
⎯ analytical parameters used (sum parameters, such as DOC, BOD, CO or substance specific analysis).
2
As so many factors can influence the test results, it is not possible to define a “true” or “reference” method.
The reproducibility of the test results using different methods or conditions or even using identical test
methods can be low and differing test results can be obtained. Usually, a test material, which is either easily or
poorly biodegradable, will produce similar test results in replicates and on repetition. Substances, which are
partly or moderately biodegradable and need special consortia of bacteria or long adaptation periods, will
often produce disparate results.
The biodegradation tests listed in this Technical Report are designed to determine the biodegradability of
chemical substances or wastewaters under standardized conditions. The test results are required to predict
the biodegradation behaviour of the test materials in natural or technical aquatic environments, for example, in
rivers, lakes, ponds, sea, wastewater treatment plants, digesters. To improve their predictive value, the test
methods should simulate, to a certain degree, such environments. As the conditions in these environments
are often very different, sometimes even diametrically opposed, the standard methods reflect these
differences. Therefore, it is necessary to provide a sufficient number of different standardized test methods to
allow the choice of the best one for a specific purpose.
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TECHNICAL REPORT ISO/TR 15462:2006(E)
Water quality — Selection of tests for biodegradability
1 Scope
This Technical Report gives an overview of biodegradation tests for the aquatic environment standardized by
ISO and provides recommendations on their use. In Annex A, the biodegradation guidelines for the aquatic
medium of the OECD are included, because these methods are sometimes identical to ISO standards or are
useful supplements. In addition, inhibitory tests with bacteria and mixed bacterial inocula are included in this
Technical Report because a possible toxicity on the inoculum is important information for the choice and
performance of biodegradation tests. It is very helpful to determine bacteria toxicity in advance using the same
inoculum as the planned biodegradation test before starting biodegradation testing.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
activated sludge
biomass and inert matter produced in the aerobic treatment of wastewater by the growth of bacteria and other
microorganisms in the presence of dissolved oxygen
2.2
biochemical oxygen demand
BOD
mass concentration of dissolved oxygen consumed under specified conditions by the aerobic biological
oxidation of a chemical compound or organic matter in water
NOTE For the purpose of this Technical Report, it is expressed as milligrams of oxygen uptake per milligram or gram
of test compound.
2.3
biodegradation phase
time from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of biodegradation has been
reached
NOTE It is expressed in days.
2.4
biogas
carbon dioxide and methane produced by anaerobic bacteria
2.5
chemical oxygen demand
COD
mass concentration of oxygen equivalent to the amount of a specified oxidant consumed by a chemical
compound or organic matter when a water sample is treated with that oxidant under defined conditions
NOTE It is expressed as milligrams oxygen uptake per milligram or gram test compound.
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ISO/TR 15462:2006(E)
2.6
concentration of suspended solids of an activated sludge
amount of solids obtained by filtration or centrifugation at known conditions of a known volume of activated
sludge and drying at about 105 °C to constant mass
NOTE Mixed liquor suspended solids is also often used.
2.7
degree of adsorption on activated sludge
percentage of a test compound eliminated by any processes but biodegradation under the conditions of a
specific aqueous batch test with activated sludge, determined by comparing the concentration at the
beginning with that at the end of the test
2.8
digested sludge
mixture of the settled phases of sewage and activated sludge, which have been incubated in an anaerobic
digester at about 35 °C to reduce biomass and odour problems and to improve the dewaterability of the
sludge, and which consists of a consortium of anaerobic fermentative and methanogenic bacteria producing
carbon dioxide and methane
2.9
dissolved inorganic carbon
DIC
part of the inorganic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation
2
NOTE Phase separation may be obtained, for example, by centrifugation of the water sample at 40 000 m/s for
15 min or by membrane-filtration using membranes with pores of 0,45 µm diameter.
2.10
dissolved organic carbon
DOC
part of the organic carbon in a sample of water which cannot be removed by specified phase separation
2
NOTE Phase separation may obtained, for example, by centrifugation of the water sample at 40 000 m/s for 15 min
or by membrane-filtration using membranes with pores of 0,45 µm diameter.
2.11
lag phase
time from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading microorganisms are achieved
and the biodegradation degree of a chemical compound or organic matter has increased to about 10 % of the
maximum level of biodegradation
NOTE It is expressed in days.
2.12
maximum level of biodegradation
maximum biodegradation degree of a chemical compound or organic matter in a test above which no further
biodegradation takes place during the test
NOTE It is expressed in percent.
2.13
mixed liquor suspended solids
MLSS
concentration of solids, expressed in a specified dried form, in the mixed liquor
[ISO 6107-3:1993, 48]
2 © ISO 2006 – All rights reserved
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ISO/TR 15462:2006(E)
2.14
plateau phase
time from the end of the biodegradation phase to the end of the test
NOTE It is expressed in days.
2.15
pre-conditioning
pre-incubation of an inoculum under the conditions of the test in the absence of the chemical compound
and/or organic matter, with the aim of improving the performance of the test by acclimatisation of the
microorganisms to the test conditions
2.16
pre-exposure
pre-incubation of an inoculum in the presence of a chemical compound and/or organic matter, with the aim of
enhancing the ability of this inoculum to biodegrade the test material by adaptation and selection of the
microorganisms
2.17
primary anaerobic biodegradation
level of degradation achieved when a test compound undergoes any structural change, other than complete
mineralization, as a result of anaerobic microbial action
2.18
primary biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms resulting in the loss of a
specific property
2.19
theoretical oxygen demand
ThOD
theoretical maximum amount of oxygen required to oxidize a chemical compound completely, calculated from
the molecular formula
NOTE In this case, it is expressed as milligrams oxygen uptake per milligram or gram test compound.
2.20
total organic carbon
TOC
all carbon present in organic matter which is dissolved and suspended in the water
2.21
ultimate aerobic biodegradation
breakdown of a chemical compound or of organic matter by microorganisms in the presence of oxygen to
carbon dioxide, water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and the production of
new biomass
2.22
total inorganic carbon
TIC
all that inorganic carbon in the water deriving from carbon dioxide and carbonate
2.23
theoretical amount of formed carbon dioxide
ThCO
2
maximum amount of carbon dioxide formed after oxidizing a chemical compound completely, calculated from
the molecular formula
NOTE It is expressed in milligrams of carbon dioxide per milligram or gram of test compound.
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2.24
theoretical amount of inorganic carbon
ThIC
maximum amount of inorganic carbon formed after oxidizing a chemical compound completely, calculated
stoichiometrically from the molecular formula
NOTE It is expressed in milligrams of carbon per milligram or gram of test compound.
2.25
ultimate anaerobic biodegradation
level of degradation achieved when a test compound is utilized by anaerobic microorganisms resulting in the
production of carbon dioxide, methane, mineral salts, and new microbial cellular constituents (biomass)
3 Evaluations and recommendations
3.1 Biodegradation test methods
The test methods for aerobic biodegradability are not of equal potential, largely because of the different
microbial densities, the concentrations of the test substances and the test durations used. ISO 7827 (DOC
removal test), ISO 9439 (CO evolution test), ISO 9408 (oxygen consumption test), ISO 10708 (BOD demand
2
in a two-phased closed bottle test) and ISO 14593 (CO headspace test) are of roughly equal potential. These
2
methods are widely used standards for biodegradation studies in the aquatic environment and correspond in
principle to the OECD tests for ready biodegradability. The test duration is 28 d. As inoculum, activated sludge
with a concentration of not more than 30 mg/l of dry substance is often used. The test flasks of ISO 10707
(closed bottle test) have a low inoculation, are not stirred or aerated and have therefore a lower degradation
potential, but they are especially useful and applicable to volatile and inhibitory test compounds. This test
corresponds in principle to the known BOD tests (ISO 5815-1 and ISO 5815-2), which are, however, not
recommended for substances because the conditions are very stringent, and the test time (5 d) is very short.
Many substances would be classified as not biodegradable and, therefore, discriminated. The BOD is the
5
oldest aquatic biodegradation test and has shown its suitability for wastewaters since many years.
ISO 9887 (SCAS test) and ISO 9888 (Zahn-Wellens test) are tests with a high inoculum concentration.
ISO 9887 uses an additional substrate (sewage) and may be extended further than the usual 28 d test
duration. Hence, these tests have a high degradation potential and may be used to determine the intrinsic
biodegradability of chemicals, which is, in the OECD philosophy, called “inherent biodegradability”. As these
tests are open systems based on DOC determination, they cannot be applied directly to volatile or water-
insoluble substances. ISO 11733 (activated sludge simulation test) is a continuous dynamic test simulating
wastewater treatment plants including nitrification and denitrification techniques. ISO 14592 (shake flask
test/river simulation test) is a special test for biodegradation of substances at low environmentally realistic
concentrations and is suitable to determine biodegradation kinetics in the aquatic environment. ISO 14592-1 is
a batch test simulating standing water bodies like lakes or ponds, ISO 14592-2 is a dynamic system and
simulates flowing waters like rivers. ISO 11734 (biogas production measurement) is the only standardized
aquatic test for anaerobic biodegradability and is applied independently on tests for aerobic biodegradability.
Priority for application should be given to those chemicals which are not sufficiently degraded aerobically and
preferentially adsorb onto activated sludge, and which enter in this way anaerobic digesters in wastewater
treatment plants. ISO 16221 is a standard for marine biodegradation testing and includes five different tests
with different analytical parameters which are based on established fresh water tests adapted for marine
conditions.
The kinetics and the degree of degradation can be variable in different environmental compartments; therefore,
results from different test methods can vary for the same test material. It is clear that differences are expected
between aerobic and anaerobic biodegradation tests as well as between marine and fresh water test systems.
It is also obvious that the potential for degradation increases if the test conditions are favourable. Tests with
high inoculum concentrations and which allow even pre-exposure of the inoculum and permit the extension of
the test duration until the plateau phase is reached, will more often show biodegradation than tests with less
favourable conditions. An important parameter is an optimal test concentration which is neither too high thus
avoiding the risk of inhibition nor too low thus making it difficult or impossible to determine the DOC removal,
oxygen uptake or carbon dioxide production accurately and precisely. In the extreme, at very low
concentrations (e.g. much less than 1 mg/l), biodegradation may not occur at all because the threshold value
for a successful degradation is too low.
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ISO/TR 15462:2006(E)
Chemicals which do not degrade in the rather stringent tests on ready biodegradability may, however,
degrade in the powerful inherent tests. Nevertheless, they may fail to degrade in the continuously performed
activated sludge simulation test. Tests on ready biodegradability may deliver contradictory results, which
cannot be explained just by the different degradation power, as in the case of the rather weak, closed bottle
test (ISO 10707). Experience also shows that tests, which are supposed to have the same degradation
potential (such as ISO 7827, ISO 9408 and ISO 9439), and which are prepared, stirred and aerated identically
and use the same inoculum concentration, may give different results. The reason is the different analytical
techniques used. Consumption and hence the measurement of oxygen differs from the production and
measurement of carbon dioxide which is the last step of aerobic biodegradation processes. Furthermore, a
part of the carbon dioxide will be left dissolved in the test water and its determination lags behind its biological
production. The full amount of carbon dioxide is measured only after acidification at the end of the test. This
fault of the CO production test is almost completely eliminated when the CO headspace method
2 2
(ISO 14593) is used. Another improvement is a new analytical development which determines the produced
CO by continuous conductivity measurement instead of DIC. The equivalent degrees of biodegradation will
2
take longer than with DOC removal or oxygen uptake and could influence the fulfilling of the 10-days-window
(3.5).
Even within one test method, different results may be obtained in parallel vessels if, e.g. the lag-phases vary
and the test is finished before the plateau phase is reached. Experience has shown that easily degradable
chemicals usually give comparable results as well as poorly degradable substances, which show their relative
persistence in nearly all test systems. Chemicals of intermediate ability to biodegrade give more consistent
results in tests with higher degradation potential or when pre-exposed inocula are used. Poorly biodegradable
substances may, nevertheless, be well eliminated in wastewater treatment plants if they have, for example, a
high adsorption potential onto activated sludge. Such adsorption processes do not always take place in
parallel to the biodegradation processes. For the determination of this special elimination, ISO 18749 (batch
test) is suitable.
3.2 Analytical parameters and expression of test results
In most of the standardized tests, information on ultimate biodegradability is requested, i.e. the complete
breakdown of an organic substance to the inorganic catabolites CO and water. To determine the complete
2
aerobic degradation (mineralization), the sum parameters DOC, BOD or CO -evolution are used. BOD and
2
CO always clearly indicate biodegradability, whereas DOC removal may be due to biodegradation as well as
2
to abiotic elimination, such as adsorption onto activated sludge or evaporation. In the case of substances with
low water solubility, the DOC cannot be determined because the test substance would be removed from
solution by filtration or centrifugation, and therefore cannot be used. In anaerobic tests, the production of
biogas (methane and carbon dioxide), measured by changes in pressure, is the usual analytical parameter.
For analytical reasons, sum parameters require rather high concentrations of test substance. If the test
concentration should be as close as possible to natural concentrations, e.g. for kinetic reasons, they should be
very low in the test. In this case, substance-specific analytical techniques are used to investigate biological
transformations of a chemical, the so-called primary biodegradability. If even lower concentrations are
required, radio-labelled substances are necessary. There may be also other analytical techniques which are
suitable to follow biodegradation, but only the methods mentioned here are used in standardized tests.
In the DOC measurement, the initial concentration is compared with the final concentration. When using BOD
and CO , the measurements during the test are accumulated and compared at the end with the respective
2
theoretical values ThOD or ThCO which are calculated from the molecular formula of the test substance.
2
From the measured values, the percentages of biodegradation are calculated and plotted against the period of
incubation to show a degradation curve. Biodegradation curves frequently have
⎯ a marked lag phase, in which the microorganisms of the inoculum adapt to the test substance, followed
by
⎯ the actual degradation phase, in which the conversion of the test substance takes place, DOC is removed,
oxygen used and CO produced, and
2
⎯ a plateau phase, in which biodegradation is completed and no further significant biodegradation is
measured.
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The test result is usually the degree of degradation in percent, determined as a mean value in the plateau
phase. If this is not possible, because there are only a few data points available or no clear plateau phase is
obtained, the highest value in the plateau phase or the value measured on the last day of the test is used
instead.
3.3 Pass levels for biodegradation
The percentage biodegradation as expressed by DOC removal for ultimate biodegradability or test substance
removed for primary biodegradability can reach 100 %. It should be verified in a test that abiotic elimination
processes, such as physical adsorption are negligibly small or they should be considered in the calculation.
Under the limiting batch conditions in ready biodegradation tests (3.5) it is assumed that 100 % cannot be
expected in a 10 days window, or even in a total test time of 28 d, and therefore values of > 70 % DOC and
> 80 % test substance removal determined with a substance-specific analytical method have been adopted as
pass levels ultimate or primary biodegradation. Experience has shown that substances which fulfil these
criteria usually reach higher values in activated sludge simulation tests and in the real environment. In fact, in
many cases well over 70 % and 80 % respectively are often found in the “ready” batch tests.
The production of CO and oxygen uptake in batch tests expressed as a percentage of the respective
2
theoretical values ThCO and ThOD is always less than the percentage determined by DOC removal (see
2
References [2] and [3]). This can especially be seen in cases where simultaneous measurements are made,
for example, using the CO /DOC combination method described in Annex D of ISO 9439:1999. The reason
2
for this is that in bacterial metabolism some of the organic carbon of the test substance is biochemically
oxidized and thus converted to CO , whilst other fractions are synthesized into new cellular material or into
2
organic metabolic products. These fractions are not oxidized and do not contribute to the CO production, but
2
are, nevertheless, part of the ultimate biodegradation. The proportion of organic carbon converted to cell
material depends on factors, such as the nature of the test substance and the collection of bacterial species
present. There is, however, not a single value, which can be adopted as a “general pass” level in these cases.
Data from interlaboratory tests performed during the standardization and establishment of these methods and
the experience of many laboratories led to the presently used and accepted pass level of > 60 % ThOD or
ThCO in ready biodegradation tests. Examples and a discussion of the OECD-based pass levels are given in
2
Reference [3].
3.4 Toxicity to bacteria
It has been observed that chemicals, which are inhibitory towards bacteria and do not degrade at the usual
test concentrations, may degrade at lower concentrations of the test compound or by using an inoculum from
another source or after pre-adaptation. So, additional information is required to prevent the classification of a
chemical as poorly biodegradable. However, in reality, it is not degraded because it is toxic under the test
conditions. One way to avoid this is to add an inhibition control during the test. Most of the standard tests
include additional vessels containing the test substance and the reference substance together. The
biodegradation degree of this mixture is a good assessment of any inhibition. But, it may be better to have this
information before an expensive and time-consuming biodegradation test is started and to know the effective
concentration EC of the test substance in advance to choose the right test concentration. Therefore, it is
20
recommended to perform bacteria-toxicity tests using the same mixed inoculum as in the degradation tests,
which is often municipal activated sludge. Suitable methods for aerobic conditions are the test for inhibition of
oxygen consumption by activated sludge (ISO 8192) and the test on the growth of sludge microorganisms
(ISO 15522). For anaerobic biodegradation testing, such an inhibition control is not possible due to the high
concentration of organic material in the test. However, two toxicity tests with different conditions, ISO 13641-1
and ISO 13641-2, are available for different concentrations of the digested sludge and test durations. The
results of these toxicity investigations may not only be used to choose the best degradation tests and the
correct test concentrations, but also to predict the toxic behaviour of a test substance in wastewater treatment
plants or digesters. In this context, the nitrification inhibition test (ISO 9509) should also be mentioned; this
allows the prediction of toxic effects on the very sensible microbial nitrification process.
Also, standardized bacteria toxicity tests exist using pure bacteria cultures. For example, ISO 10712 uses
Pseudomonas putida and ISO 11348 (all parts) uses the luminescent bacterium Vibrio fischeri. It is not
recommended to use these methods because the effective concentrations obtained may be far beyond what
happens in biodegradation tests or in the real environment. The reason may be that the test substance could
be toxic to the used test species, but not to the more tolerant microbial community of activated sludge bacteria.
6 © ISO 2006 – All rights reserved
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IS
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RAPPORT ISO/TR
TECHNIQUE 15462
Deuxième édition
2006-05-15
Qualité de l'eau — Sélection d'essais
de biodégradabilité
Water quality — Selection of tests for biodegradability
Numéro de référence
ISO/TR 15462:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO/TR 15462:2006(F)
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ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO/TR 15462:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Évaluations et recommandations . 4
Annexe A (informative) Comparaison des Normes internationales ISO avec les Lignes directrices
de l'OCDE. 22
Bibliographie . 23
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
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ISO/TR 15462:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Exceptionnellement, lorsqu'un comité technique a réuni des données de nature différente de celles qui sont
normalement publiées comme Normes internationales (ceci pouvant comprendre des informations sur l'état
de la technique par exemple), il peut décider, à la majorité simple de ses membres, de publier un Rapport
technique. Les Rapports techniques sont de nature purement informative et ne doivent pas nécessairement
être révisés avant que les données fournies ne soient plus jugées valables ou utiles.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TR 15462 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO/TR 15462:1997), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
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ISO/TR 15462:2006(F)
Introduction
La biodégradation de substances et d'éléments présents dans les eaux résiduaires ne dépend pas
uniquement des structures moléculaires du matériau d'essai, mais également de facteurs supplémentaires
importants, tels que
⎯ les milieux d’essai, aquatiques ou terrestres;
⎯ les conditions d'essai, aérobies ou anaérobies;
⎯ l'origine et la concentration des micro-organismes de l'inoculum;
⎯ l'acclimatation et l'adaptation de l'inoculum;
⎯ la concentration du matériau d'essai;
⎯ la présence d'autres substrats organiques;
⎯ l'existence possible d'effets toxiques du matériau d'essai dans les conditions d'essai;
⎯ les propriétés physiques et chimiques et la biodisponibilité du matériau d'essai (par exemple volatilité,
solubilité dans l'eau, adsorption sur les surfaces);
⎯ les propriétés physiques et chimiques du système d'essai (par exemple volume du mélange d'essai et
des récipients d'essai, d'élimination du CO et concentration en oxygène, température);
2
⎯ les conditions d'essai (par exemple mélange, agitation, mode d'aération, statique ou dynamique,
récipients d'essai ouverts ou fermés);
⎯ la durée de l'essai;
⎯ paramètres d'analyse utilisés (paramètres globaux tels que COD, DBO, CO ou analyse spécifique de la
2
substance).
Étant donné le nombre de facteurs susceptibles d'affecter les résultats d'essai, il n'est pas possible de définir
une méthode «exacte» ou «de référence». La reproductibilité des résultats d'essai, que les méthodes ou les
conditions d'essai utilisées soient identiques ou non, peut être faible et les résultats d'essai obtenus peuvent
être différents. En général, un matériau d'essai, qu'il soit facilement ou peu biodégradable, donnera des
résultats d'essai similaires en cas de reproduction ou de répétition de l'essai. Les substances partiellement ou
modérément biodégradables, et qui nécessitent des consortiums de bactéries particulières ou des périodes
d'adaptation prolongées, vont souvent produire des résultats très variables.
Les essais de biodégradabilité indiqués dans le présent Rapport technique sont conçus pour déterminer la
biodégradabilité de substances chimiques ou d'eaux résiduaires dans des conditions normalisées. Les
résultats d'essai sont nécessaires pour prévoir le comportement de biodégradation des matériaux d'essai
dans des environnements aquatiques naturels ou industriels, par exemple dans des rivières, des lacs, des
étangs, dans la mer, des usines de traitement des eaux résiduaires ou dans des digesteurs. Pour améliorer
leur valeur prédictive, il convient que les méthodes d'essai simulent, jusqu'à un certain degré, ce type de
milieux. Étant donné que les conditions sont souvent très différentes dans ces milieux, parfois diamétralement
opposées, les méthodes normalisées indiquées reflètent ces différences. Il est par conséquent nécessaire de
proposer un nombre suffisant de méthodes d'essai normalisées différentes, afin de pouvoir choisir la mieux
adaptée, en fonction de l'objectif spécifique visé.
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RAPPORT TECHNIQUE ISO/TR 15462:2006(F)
Qualité de l'eau — Sélection d'essais de biodégradabilité
1 Domaine d'application
Le présent Rapport technique donne une vue d'ensemble des essais de biodégradation pour le milieu
aquatique normalisés par l'ISO et fournit des recommandations pour leur utilisation. L'Annexe A inclut
également les lignes directrices pour le milieu aquatique de l'OCDE, car ces méthodes sont parfois identiques
à celles des Normes internationales ISO ou constituent des suppléments utiles. En outre, des essais
d'inhibition employant des bactéries et des mélanges d'inoculums de bactéries sont inclus dans le présent
Rapport technique, car une toxicité potentielle sur l'inoculum constitue une information importante pour le
choix et la réalisation des essais de biodégradabilité. Il est notamment très utile de déterminer par avance la
toxicité bactérienne, en utilisant le même inoculum que celui prévu pour l'essai de biodégradation, avant de
commencer les essais de biodégradation.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
boue activée
biomasse et matière inerte produites dans le traitement aérobie des eaux résiduaires par la croissance de
bactéries et d'autres micro-organismes en présence d'oxygène dissous
2.2
demande biochimique en oxygène
DBO
concentration massique en oxygène dissous consommé dans des conditions spécifiques par l'oxydation
biologique aérobie d'un composé chimique ou d'une matière organique dans l'eau
NOTE Aux fins du présent Rapport technique, elle est exprimée en milligrammes de consommation d'oxygène par
milligramme ou gramme de composé d'essai.
2.3
phase de biodégradation
moment à partir de la fin du temps de latence d'un essai jusqu'à ce qu'environ 90 % du taux maximal de
biodégradation ait été atteint
NOTE Elle est exprimée en jours.
2.4
biogaz
dioxyde de carbone et méthane produits par des bactéries anaérobies
2.5
demande chimique en oxygène
DCO
concentration massique en oxygène équivalente à la quantité d'un oxydant spécifique consommé par un
composé chimique ou une matière organique lorsqu'un échantillon d'eau est traité à l'aide de cet oxydant
dans des conditions définies
NOTE Elle est exprimée en consommation d'oxygène par milligramme ou gramme de composé d'essai.
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ISO/TR 15462:2006(F)
2.6
concentration de matières solides en suspension d'une boue activée
quantité de matières solides obtenues par filtration ou centrifugation dans des conditions connues d'un
volume connu de boue activée puis par séchage à environ 105 °C jusqu’à masse constante
NOTE Des matières solides en suspension dans la liqueur mixte sont également souvent utilisées.
2.7
degré d'adsorption sur une boue activée
pourcentage d'un composé d'essai éliminé par tout procédé, hormis la biodégradation, dans les conditions
d'un essai aqueux statique spécifique avec une boue activée, déterminé en comparant la concentration au
début de l'essai à celle à la fin de l'essai
2.8
boue digérée
mélange de phases décantées d'eaux usées et de boue activée, qui ont été placées en incubation dans un
digesteur anaérobie à environ 35 °C afin de réduire la biomasse et les nuisances olfactives et d'améliorer
l'essorabilité de la boue, et qui se compose d'un consortium de bactéries fermentatives et méthanogènes
anaérobies produisant du dioxyde de carbone et du méthane
2.9
carbone inorganique dissous
CID
partie du carbone inorganique dans l'eau qui ne peut pas être éliminée par une séparation de phases
spécifique
NOTE La séparation de phases peut être obtenue, par exemple, par centrifugation de l'échantillon d'eau à
2
40 000 m/s pendant 15 min ou par filtration sur membrane en utilisant des membranes avec des pores de 0,45 µm de
diamètre.
2.10
carbone organique dissous (COD)
partie du carbone organique dans un échantillon d'eau qui ne peut pas être éliminée par une séparation de
phases spécifique
NOTE La séparation de phases peut être obtenue, par exemple par centrifugation de l'échantillon d'eau à
2
40 000 m/s pendant 15 min ou par filtration sur membrane en utilisant des membranes avec des pores de 0,45 µm de
diamètre.
2.11
temps de latence
période à partir du début d'un essai jusqu'à ce que l'adaptation et/ou la sélection des micro-organismes de
dégradation soient atteintes et que le degré de biodégradation d'un composé chimique ou de la matière
organique ait augmenté pour atteindre environ 10 % du taux maximal de biodégradation
NOTE Il est exprimé en jours.
2.12
taux maximal de biodégradation
degré maximal de biodégradation d'un composé chimique ou de la matière organique dans un essai
au-dessus duquel aucune biodégradation supplémentaire n'a lieu dans l'essai
NOTE Il est exprimé en pourcentage.
2.13
matières solides en suspension dans la liqueur mixte
MSSL
concentration des matières solides dans la liqueur mixte, exprimée en matière sèche déterminée dans des
conditions définies
[ISO 6107-3:1993, 48]
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO/TR 15462:2006(F)
2.14
phase de plateau
période à partir de la fin de la phase de biodégradation jusqu'à la fin de l'essai
NOTE Elle est exprimée en jours.
2.15
pré-conditionnement
pré-incubation d'un inoculum dans les conditions de l'essai en l'absence du composé chimique et/ou de
matière organique, dans le but d'améliorer les performances de l'essai par acclimatation des
micro-organismes aux conditions d'essai
2.16
pré-exposition
pré-incubation d'un inoculum en présence d'un composé chimique et/ou de matière organique, dans le but
d'améliorer la capacité de cet inoculum à biodégrader le matériau d'essai par l'adaptation et la sélection des
micro-organismes
2.17
biodégradation anaérobie primaire
taux de dégradation atteint lorsqu'un composé d'essai subit tout changement structurel, autre qu'une
minéralisation complète, suite à l'action de microbes anaérobies
2.18
biodégradation primaire
changement structurel (transformation) d'un composé chimique sous l’action de micro-organismes provoquant
la perte d'une propriété spécifique
2.19
demande théorique en oxygène
DThO
quantité théorique maximale d'oxygène nécessaire pour oxyder complètement un composé chimique,
calculée à partir de la formule moléculaire
NOTE Dans ce cas, elle est exprimée en milligrammes de consommation d'oxygène par milligramme ou gramme de
composé d'essai.
2.20
carbone organique total
COT
ensemble de carbone présent dans la matière organique dissoute et en suspension dans l'eau
2.21
biodégradation aérobie ultime
décomposition d'un composé chimique ou de la matière organique en dioxyde de carbone, eau et sels
minéraux de tout autre élément présent (minéralisation) et production d'une nouvelle biomasse, sous l’action
de micro-organismes en présence d'oxygène
2.22
carbone inorganique total
CIT
ensemble du carbone inorganique dans l'eau provenant du dioxyde de carbone et du carbonate
2.23
quantité théorique de dioxyde de carbone formé
ThCO
2
quantité maximale de dioxyde de carbone formé après oxydation complète d'un composé chimique, calculée
à partir de la formule moléculaire
NOTE Elle est exprimée en milligrammes de dioxyde de carbone par milligramme ou gramme de composé d'essai.
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ISO/TR 15462:2006(F)
2.24
quantité théorique de carbone inorganique formé
ThCI
quantité maximale de carbone inorganique formé après oxydation complète d'un composé chimique, calculée
stœchiométriquement à partir de la formule moléculaire
NOTE Elle est exprimée en milligrammes de carbone par milligramme ou gramme de composé d'essai.
2.25
biodégradation anaérobie ultime
taux de dégradation atteint lorsqu'un composé d'essai est utilisé par des micro-organismes anaérobies ayant
pour résultat de la production de dioxyde de carbone, de méthane, de sels minéraux et de nouveaux
constituants cellulaires microbiens (biomasse)
3 Évaluations et recommandations
3.1 Méthodes d'essai de biodégradation
Les méthodes d'essai de la biodégradabilité aérobie n'ont pas toutes le même potentiel, et ce, principalement
en raison des différences entre les densités microbiennes, les concentrations des substances d’essai et la
durée des essais utilisées. L'ISO 7827 (méthode par analyse du COD), l'ISO 9439 (essai de dégagement du
CO ), l'ISO 9408 (essai de la consommation en oxygène), ISO 10708 (demande biochimique en oxygène en
2
fiole fermée à deux phases) et l'ISO 14593 (essai de mesurage du CO dans l'espace de tête) ont a peu près
2
le même potentiel. Ces méthodes sont des normes largement utilisées pour les études relatives à la
biodégradation en milieu aquatique et correspondent dans leur principe aux essais de l'OCDE portant sur la
biodégradabilité facile. La durée des essais est de 28 jours. Des boues activées ayant une concentration ne
dépassant pas 30 mg/l de substance sèche sont souvent employées comme inoculum. Les fioles d'essai de
l'ISO 10707 (essai en fiole fermée) ont une inoculation faible, ne sont pas agitées ou aérées et ont par
conséquent un potentiel de dégradation moins important, mais elles sont particulièrement utiles et applicables
aux composés d'essai volatils et inhibiteurs. Cet essai correspond dans son principe aux essais de DBO
connus (ISO 5815-1 et ISO 5815-2), qui ne sont toutefois par recommandés pour les substances car les
conditions d'essai sont très rigoureuses et la durée de l'essai (5 jours) est très courte. De nombreuses
substances seraient alors classées comme non biodégradables et s'en trouveraient discriminées. La DBO
5
est l'essai de biodégradation aquatique le plus ancien et son adaptabilité aux eaux résiduaires a été
démontrée depuis de nombreuses années.
L'ISO 9887 (Méthode SCAS) et l'ISO 9888 (Méthode Zahn-Wellens) proposent des essais avec une
concentration élevée d'inoculum. L'ISO 9887 utilise un substrat supplémentaire (eaux usées) et l'essai peut
être étendu au-delà de la durée d'essai habituelle de 28 jours. Ces essais ont donc un fort potentiel de
dégradation et peuvent être utilisés pour déterminer la biodégradabilité intrinsèque des substances chimiques
appelée «biodégradabilité intrinsèque», selon la philosophie de l'OCDE. Étant donné que ces essais utilisent
des systèmes ouverts basés sur la détermination du COD, ils ne peuvent pas être appliqués directement à
des substances volatiles ou solubles dans l'eau. L'ISO 11733 (essai de simulation des boues activées)
propose un essai dynamique en continu simulant une usine de traitement des eaux résiduaires comprenant
des techniques de nitrification et de dénitrification. L'ISO 14592 (méthode par agitation de flacon/essai de
simulation de rivière) propose un essai spécial pour la biodégradation des substances à de faibles
concentrations réalistes d'un point de vue environnemental. Cet essai est par ailleurs adapté à la
détermination de la cinétique de biodégradation dans l’environnement aquatique. L'ISO 14592-1 propose un
essai statique simulant des plans d'eaux stagnantes tels que les lacs ou les étangs, l'ISO 14592-2 propose un
système dynamique et simule les eaux vives telles que les rivières. L'ISO 11734 (méthode par mesurage de
la production de biogaz) propose le seul essai aquatique normalisé pour la biodégradabilité anaérobie et
s'applique indépendamment à des essais de biodégradabilité aérobie. Il convient que cet essai s'applique en
priorité aux substances chimiques qui ne sont pas suffisamment dégradées par des procédés aérobies et qui,
de préférence, s'adsorbent sur des boues activées et entrent de cette manière dans des digesteurs
anaérobies d'usines de traitement des eaux résiduaires. L'ISO 16221 est une norme d'essai relative aux
essais de biodégradation en milieu marin et comporte cinq essais avec des paramètres d'analyse différents
basés sur des essais en eau douce reconnus, adaptés aux conditions marines.
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La cinétique et le degré de dégradation pouvant varier dans différents compartiments environnementaux, les
résultats obtenus à partir de différentes méthodes d'essai peuvent donc varier pour le même matériau d'essai.
On s'attend clairement à obtenir des différences entre les essais de biodégradation aérobie et anaérobie ainsi
qu'entre les systèmes d'essai d'eau douce et d'eau de mer. Il est également évident que le potentiel de
dégradation augmente lorsque les conditions d'essai sont favorables. Les essais réalisés avec des
concentrations élevées d'inoculum et qui autorisent même une pré-exposition de l'inoculum et l'extension de
la durée d'essai jusqu'à ce que la phase de plateau soit atteinte, montreront plus souvent une biodégradation
que les essais ayant des conditions moins favorables. Une concentration d'essai optimale est un paramètre
important: celle-ci n'est ni trop élevée pour éviter le risque d'inhibition, ni trop faible pour éviter qu’il ne soit
difficile ou impossible de déterminer exactement et précisément l'élimination du COD, la consommation
d'oxygène ou la production de dioxyde de carbone. À l'extrême, il se peut qu’aucune biodégradation ne se
produise à de très faibles concentrations (par exemple très inférieures à 1 mg/l), car la valeur limite pour
permettre une dégradation est trop faible.
Les substances chimiques qui ne se dégradent pas dans les essais assez rigoureux de biodégradabilité facile
peuvent toutefois se dégrader dans les essais plus puissants de biodégradabilité intrinsèque. Néanmoins, il
est possible qu’elles ne réussissent pas à se dégrader dans l'essai de simulation en continu des boues
activées. Les essais de biodégradabilité facile peuvent donner des résultats contradictoires qui ne peuvent
pas uniquement s’expliquer par la différence de puissance de dégradation, comme dans le cas de l'essai
réalisé en fiole fermée (ISO 10707) et considéré comme ayant un faible potentiel. L'expérience montre que
des résultats différents peuvent même être obtenus avec des essais supposés avoir le même potentiel de
dégradation (tels que ceux des Normes internationales ISO 7827, ISO 9408 et ISO 9439), dans lesquels les
substances sont préparées, agitées et aérées de manière identique et qui utilisent la même concentration
d'inoculum. Cela est lié aux différentes techniques d'analyse utilisées. La consommation et par là même le
mesurage de l'oxygène, diffèrent de la production et du mesurage du dioxyde de carbone qui constitue la
dernière étape des processus de biodégradation aérobie. De plus, une partie du dioxyde de carbone restera
dissoute dans l'eau d'essai et il existe un décalage entre sa détermination et sa production biologique. La
quantité totale de dioxyde de carbone est uniquement mesurée après l'acidification qui survient à la fin de
l'essai. Ce défaut de production de CO est pratiquement complètement éliminé en employant la méthode
2
d'essai de mesurage du CO dans l'espace de tête (ISO 14593). Une autre amélioration est également offerte
2
par un nouveau développement analytique qui détermine le CO produit par le mesurage en continu de la
2
conductivité au lieu du CID. Des degrés de biodégradation équivalents prendront plus de temps qu'avec
l'élimination du COD ou la consommation d'oxygène et cela pourrait influencer l'accomplissement de la
fenêtre de 10 jours (voir 3.5).
Des résultats différents peuvent même être obtenus dans des récipients parallèles avec la même méthode
d'essai, par exemple lorsque les temps de latence varient et que l'essai est terminé avant que la phase de
plateau soit atteinte. L'expérience a montré que les substances chimiques facilement dégradables donnent
généralement des résultats comparables, il en est de même pour les substances peu dégradables, dont la
persistance relative est détectée avec pratiquement tous les systèmes d'essai. Les substances chimiques
ayant une capacité de biodégradation intermédiaire donnent des résultats plus cohérents dans les essais
avec un potentiel de dégradation plus élevé ou lorsque des inoculums pré-exposés sont utilisés. Les
substances peu biodégradables peuvent néanmoins être éliminées dans les usines de traitement des eaux
résiduaires si elles présentent par exemple un potentiel d'adsorption élevé sur les boues activées. Ces
processus d'adsorption n'ont pas toujours lieu parallèlement aux processus de biodégradation. L'ISO 18749
(essai statique) est adaptée à la détermination de cette élimination spéciale.
3.2 Paramètres d'analyse et expression des résultats d'essai
Dans la plupart des essais normalisés, des informations sont demandées sur la biodégradabilité ultime, c'est-
à-dire la décomposition complète d'une substance organique en des catabolites inorganiques que sont le CO
2
et l’eau. Des paramètres globaux tels le COD, la DBO ou le dégagement de CO sont utilisés afin de
2
déterminer la dégradation aérobie complète (minéralisation). La DBO et le CO indiquent toujours clairement
2
la biodégradabilité, tandis que l'élimination du COD peut tout aussi bien être liée à la biodégradation qu'à une
élimination abiotique telle qu'une adsorption sur des boues activées ou une évaporation. Dans le cas des
substances ayant une faible solubilité dans l'eau, il n’est pas possible de déterminer le COD car la substance
d'essai serait éliminée de la solution par filtration ou centrifugation; par conséquent, ce paramètre ne peut pas
être utilisé. La production de biogaz (méthane et dioxyde de carbone) mesurée par des changements de
pression est le paramètre d'analyse habituel dans les essais anaérobie.
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ISO/TR 15462:2006(F)
Pour des raisons analytiques, les paramètres globaux exigent plutôt des concentrations élevées de substance
d'essai. S'il convient que la concentration d'essai soit aussi proche que possible des concentrations naturelles,
par exemple pour des raisons de cinétiques, il est recommandé d'utiliser une faible concentration d'essai.
Dans ce cas, des techniques d'analyses spécifiques de la substance sont utilisées pour étudier les
transformations biologiques d'une substance chimique, également appelées biodégradabilité primaire. Si des
concentrations encore plus faibles sont exigées, des substances radiomarquées sont nécessaires. D'autres
techniques d'analyse peuvent également être adaptées au suivi de la biodégradation, mais seules les
méthodes mentionnées dans le présent Rapport technique sont utilisées dans des essais normalisés.
Dans le mesurage du COD, la concentration initiale est comparée à la concentration finale. Lorsque l'on utilise
la DBO et le CO , les mesurages durant l'essai sont accumulés puis comparés à la fin de l'essai avec les
2
valeurs théoriques respectives DThO et ThCO qui sont calculées à partir de la formule moléculaire de la
2
substance d'essai. À partir des valeurs mesurées, les pourcentages de biodégradation sont calculés et
représentés graphiquement par rapport à la période d'incubation afin de présenter une courbe de dégradation.
Les courbes de biodégradation présentent fréquemment
⎯ un temps de latence marqué, pendant lequel les micro-organismes de l'inoculum s'adaptent à la
substance d'essai, suivi par
⎯ la phase de dégradation réelle pendant laquelle la conversion de la substance d'essai a lieu: le COD est
alors éliminé, l'oxygène est utilisé et le CO est produit, et
2
⎯ une phase de plateau pendant laquelle la biodégradation est achevée et aucune autre biodégradation
significative n'est mesurée.
Le résultat d'essai est généralement le degré de dégradation en %, déterminé sous forme d'une valeur
moyenne dans la phase de plateau. Si cela n'est pas possible, parce qu'il y a seulement un petit nombre de
points de données disponibles ou si la phase de plateau n'a pas été clairement obtenue, on utilise alors la
valeur la plus élevée dans la phase de plateau ou la valeur mesurée le dernier jour de l'essai.
3.3 Seuils de réussite de la biodégradation
Le pourcentage de biodégradation, tel qu'exprimé par l'élimination du COD pour la biodégradabilité ultime ou
par l’élimination de la substance d'essai pour la biodégradabilité primaire, peut atteindre 100 %. Il est
recommandé de vérifier que les processus d'élimination abiotiques, tels que l'adsorption physique, sont
négligeables dans un essai, sinon il convient de les prendre en compte dans le calcul. Dans les conditions
statiques limitantes des essais de biodégradation facile (voir 3.5), on suppose que des valeurs égales à
100 % ne peuvent pas être attendues dans la fenêtre de 10 jours, ou même pendant une durée d'essai totale
de 28 jours. En conséquence, des valeurs d'élimination de COD > 70 % et de la substance
...
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