ISO 14371:2012
(Main)Water quality — Determination of fresh water sediment toxicity to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Water quality — Determination of fresh water sediment toxicity to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
This International Standard specifies a method for the determination of lethal as well as sublethal effects of contaminated sediments on the ostracod crustacean Heterocypris incongruens after 6 d exposure. The method is applicable not only to fresh water sediments, but also by extension to solid wastes and soils after addition of (uncontaminated) water. The method can also be applied to chemicals or preparations which are spiked into a reference sediment. This International Standard is not applicable to the testing of sediments from the estuarine or marine environment.
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité des sédiments d'eau douce envers Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination des effets létaux et sublétaux de sédiments contaminés sur le crustacé ostracode Heterocypris incongruens après 6 jours d'exposition. La méthode est applicable non seulement aux sédiments d'eau douce mais également, par extension, aux déchets solides et aux sols après ajout d'eau (non contaminée). La méthode peut également être appliquée aux produits chimiques ou aux préparations qui sont introduits dans un sédiment de référence. La présente Norme internationale n'est pas applicable aux essais sur les sédiments estuariens ou marins.
Kakovost vode - Določevanje strupenosti sedimenta celinskih vod s Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Ta mednarodni standard določa metodo za določanje letalnih in subletalnih vplivov onesnaženih sedimentov na rake dvoklopnike Heterocypris incongruens po 6 dneh izpostavljenosti. Ta metoda se uporablja za sladkovodne sedimente ter tudi trdne odpadke in prsti, ki jim je bila dodana (neonesnažena) voda. Metodo je mogoče uporabiti tudi za kemikalije ali preparate, primešane referenčnemu sedimentu. Ta mednarodni standard ne velja za preskušanje sedimentov v rečnih ustjih ali morju.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14371
First edition
2012-03-01
Water quality — Determination of fresh
water sediment toxicity to Heterocypris
incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des sédiments d’eau
douce envers Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Reference number
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©
ISO 2012
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test environment . 2
6 Reagents, test organisms and media . 2
7 Apparatus and material . 3
8 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of the
sediment samples . 4
9 Procedure . 4
9.1 Hatching of the cysts . 4
9.2 Pre-feeding of the ostracod neonates . 4
9.3 Length measurement of the neonates . 4
9.4 Addition of sediment and algal food to the test container . 5
9.5 Transfer of the ostracod neonates into the test container . 5
9.6 Incubation of the test system . 6
9.7 Measurements . 6
10 Reference test . 8
11 Tests on pure chemicals or preparations .10
12 Validity criteria .10
13 Test report .10
Annex A (informative) Culturing of Heterocypris incongruens for cyst production . 11
Annex B (informative) Precision data.13
Bibliography .15
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ISO 14371:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14371 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
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ISO 14371:2012(E)
Introduction
The evaluation of harmful effects on water quality has for several years involved the performance of biological
tests. Historically, toxicity tests have mainly focused on the impact of pollutants present in the water column of
aquatic ecosystems, without considering the hazard of toxicants present and accumulating in the sediments.
“Direct contact” tests in which the test organisms are exposed to the whole sediment have been gradually
developed with endobenthic species, such as chironomid larvae [Chironomus riparius or Chironomus dilutus
(formerly C. tentans)] or epibenthic amphipod crustaceans (Hyalella azteca).
The test specified in this International Standard is a direct contact test for determination of the percentage
mortality and/or growth inhibition on the fresh water ostracod Heterocypris incongruens (Ramdohr, 1808) after
6 d exposure to a whole sediment (see References [1], [2]).
H. incongruens is a cosmopolitan ostracod species, which has to date already been used extensively for toxicity
testing not only of whole sediments, but also by extension on sludges and soils (see References [3]–[21]).
The direct contact test with H. incongruens has a sensitivity which is quite similar to that of the amphipod
crustacean Hyalella azteca and the midge larva Chironomus riparius (see References [22]–[25]).
The assays are performed with neonates hatched from dormant eggs (cysts), which bypasses the need for
culturing or maintaining live stock cultures of test organisms.
H. incongruens neonates (150 µm to 200 µm) are substantially smaller than Hyalella azteca and Chironomus
riparius, and the assays can be performed in much smaller test containers, hence require much less bench
space and incubator space.
The effects are evaluated after a shorter exposure time (6 d) than in the assays with the amphipod crustacean
(10 d to 28 d) and midge larvae species (10 d to 28 d).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14371:2012(E)
Water quality — Determination of fresh water sediment toxicity
to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of lethal as well as sublethal effects of
contaminated sediments on the ostracod crustacean Heterocypris incongruens after 6 d exposure.
The method is applicable not only to fresh water sediments, but also by extension to solid wastes and soils after
addition of (uncontaminated) water.
The method can also be applied to chemicals or preparations which are spiked into a reference sediment.
This International Standard is not applicable to the testing of sediments from the estuarine or marine environment.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable
for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition
of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15:2009, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge
and sediment samples
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
neonate
newly hatched individual
3.2
pre-feeding
feeding of the neonates (3.1) with a small amount of dried algae (Spirulina) prior to the test
4 Principle
Freshly hatched Heterocypris incongruens larvae are exposed to the sediment sample under analysis and the
percentage mortality of the test organisms is determined after 6 d exposure.
If the percentage mortality is low (e.g. <30 %), the growth inhibition of the organisms in the sediment sample is
determined in comparison to the control sediment, as a sublethal effect criterion.
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ISO 14371:2012(E)
5 Test environment
The test shall be carried out in the dark, in a temperature-controlled room or incubator at (25 ± 1) °C in the
test containers.
Maintain the atmosphere free from toxic dusts or vapours. The use of control solutions is a double check that
the test is performed in an atmosphere free from toxic dusts and vapours.
6 Reagents, test organisms and media
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organisms. The test organisms are neonates of the fresh water ostracod Heterocypris incongruens
which are hatched from dormant eggs (cysts) of this crustacean.
Cysts of H. incongruens are obtained from laboratory cultures, as described in Annex A, or can be purchased
1)
from a specialized company .
6.2 Pure water, having a conductivity below 10 µS/cm.
6.3 Test medium, prepared by dissolving the following mineral substances in 1 l of pure water (6.2):
NaHCO 96 mg
3
CaSO•2H O 60 mg
4 2
MgSO 60 mg
4
KCl 4 mg
This test medium corresponds to a synthetic water of moderate hardness, i.e. containing CaCO at concentrations
3
of 80 mg/l to 100 mg/l (see Reference [26]). Thus prepared, the medium has a pH of 7,6 ± 0,3.
The test medium can be used for two weeks when stored in a refrigerator (4 °C to 7 °C) in the dark.
Aerate the test medium until the dissolved oxygen concentration has reached the air saturation value and until
the pH has stabilized. If necessary, adjust the pH to 7,6 ± 0,3 using a sodium hydroxide or hydrochloric acid
solution. The concentration of the acid or base required shall be selected so that the volume to be admixed is
as small as possible. Bring the temperature of the test medium up to (25 ± 1) °C prior to use.
6.4 Algal food.
6.4.1 Spirulina suspension. A suspension of powder of the blue-green alga Spirulina platensis prepared by mixing
150 mg dry mass Spirulina in 10 ml pure water (6.2). Spirulina powder is available commercially in health stores.
6.4.2 Green algae. A 25 ml suspension of green algae (e.g. Scenedesmus spp.) at a concentration of around
7
1,5 × 10 cells/ml, prepared with test medium (6.3).
The algae can also be encapsulated in algal beads, which can be stored for long periods of time in a refrigerator,
[31]
and “de-immobilized” at the time of use (see ISO 8692:2012 , Annexes B and C).
1) MicroBioTests Inc., Mariakerke (Gent), Belgium, is an example of a supplier able to provide suitable Heterocypris
incongruens cysts. This information is given for the convenience of the users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this supplier.
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ISO 14371:2012(E)
6.5 Lugol solution, to immobilize and fix the test organisms at the end of the test.
Lugol solution is prepared by mixing 5 g iodine (I ) and 10 g potassium iodide (KI) with 85 ml pure water (6.2).
2
6.6 Control sediment. Commercial (not toxic and not calcareous) river sand or marine sand, which is water
2)
washed and sieved to eliminate dirt and debris, and air-dried is a suitable control sediment provided it is of the
category “medium size” sand, with a granulometry 0/2 (i.e. a particle size range between 0 mm and 2 mm).
At the time of testing, the control sediment shall first be “water saturated” as follows.
Fill a small glass beaker with control sediment and pour test medium (6.3) on it until the sediment is completely
wet. During this operation, the sediment shall be stirred with a spatula to ensure complete water saturation.
Supernatant test medium shall be decanted.
6.7 Reference substance. Copper sulfate pentahydrate (CuSO•5H O) is the recommended reference chemical.
4 2
7 Apparatus and material
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
7.1 Temperature-controlled room or chamber.
7.2 Petri dishes, diameter 5 cm, glass or inert plastic material for hatching of the cysts and transfers of the
test organisms.
7.3 Test containers. Disposable microplates made from chemically inert material, with wells of a capacity of
at least 10 ml. Six (2 × 3) well microplates with a well diameter of approximately 35 mm are suitable.
7.4 Micropipette, in glass for sampling the test organisms, with an internal diameter of ∼1 mm at the tip, for
capturing the animals while allowing sampling of only a small volume of medium.
Micropipettes provided with a bulb at the end are very suitable for the operations.
7.5 “Large mouth” micropipettes, in an inert plastic material and with a wide opening, for transfer of
sediment suspensions.
7.6 Spatula scoop, stainless steel or inert plastic material, with a capacity of 500 µl or 1 000 µl.
7.7 Flat spatula, stainless steel or inert plastic material.
7.8 Microsieve, with a 100 µm mesh.
7.9 Stereomicroscope with incident (bottom) illumination, with a magnification of at least 8 times and, if
possible, a continuous magnification.
7.10 Calibrated eyepiece for the stereomicroscope, for length measurements of the test organisms.
7.11 Light source, providing a range of light intensity in the hatching Petri dish (7.2) of 3 000 lx to 4 000 lx.
7.12 Sample-collecting containers, in accordance with ISO 5667-15:2009, Clause 7.
2) River sand or marine sand can be obtained in every country from aquarium shops.
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ISO 14371:2012(E)
8 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of the
sediment samples
Perform sampling, transportation, and storage of the samples in accordance with the general procedures
specified in ISO 5667-16.
The containers with the sediment samples shall be stored at (4 ± 2) °C in darkness with no head space above
the sediment, and the assays shall be carried out as soon as possible after collection. The toxicity tests should
be performed within two weeks of sampling, and preferably within one week. In any case, the assays shall start
no later than six weeks after sample collection.
NOTE Scientific studies report that the toxicity of sediments stored at 4 °C did not change after several months of
storage, but in other cases toxicity changes were noted within days to weeks.
Prior to the test performance, the samples shall be homogenized by stirring with a spoon or spatula in a
container of stainless steel or inert plastic material. Large debris or large indigenous macro-organisms should
be removed manually.
9 Procedure
9.1 Hatching of the cysts
Heterocypris incongruens cysts shall be hatched as follows.
Put 8 ml test medium (6.3) into a small Petri dish (7.2) and add a sufficient amount of ostracod cysts (6.1) to
3)
perform a complete test .
Cover the Petri dish with its lid and incubate for 48 h at (25 ± 1) °C under continuous illumination (7.11).
9.2 Pre-feeding of the ostracod neonates
The neonates shall be provided with food for a few hours immediately after they have hatched (i.e. after 48 h
incubation of the cysts).
Take the container with the Spirulina suspension (6.4.1) and homogenize the contents by hand shaking. Add
1 ml Spirulina suspension to the hatching Petri dish and gently shake the Petri dish to distribute the food
suspension evenly.
Put the hatching Petri dish back in the incubator for 4 h.
9.3 Length measurement of the neonates
Pick up 10 ostracods from the hatching Petri dish with a glass micropipette, taking care to aspirate as little test
medium (6.3) as possible, and drop the organisms in the centre of a glass slide.
Place the slide on the stage of the stereomicroscope and focus on the field with the ostracods. Put one drop of
Lugol solution (6.5) on the organisms and wait for a few minutes until the neonates are completely immobile.
Measure the length of the ostracods with the aid of the calibrated eyepiece and score the results on the data
report template 1 (see Table 1). Calculate and score the mean length, L , of the neonates on the template.
start
NOTE The size of ostracod neonates ranges from 150 µm to 250 µm.
3) The amount depends on the hatchability of the cysts and should be sufficient to provide enough nauplii to perform a
complete toxicity test (i.e. > 120 nauplii). 10 mg dry ostracod cysts is normally sufficient.
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ISO 14371:2012(E)
Table 1 — Data report template 1: Length of ostracod neonates
Length
Ostracod neonate
µm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mean length, L
start
9.4 Addition of sediment and algal food to the test container
Perform the direct contact test on the whole sediment in six replicates, in parallel to a control sediment (6.6)
also in six replicates. When using six-well microplates (7.3), the assay requires two such plates.
Inoculate three wells in each microplate with whole sediment and the three other wells with control sediment.
Alternatively, the six wells of the first microplate can be filled with whole sediment, and those of the second
plate with control sediment.
Put 2 ml test medium (6.3) into all the cups of the two microplates.
Fill the cup of the spatula scoop (7.6) with test sediment and strike off the excess of sediment with the flat
spatula (7.7) to keep a volume of sediment of either 500 µl or 1 000 µl sediment in the scoop (depending of the
type of spatula).
Transfer the sediment into the six wells of the two microplates using the tip of the flat spatula to empty the cup of
the spatula scoop completely. Each well shall receive 1 000 µl sediment (i.e. two scoops of 500 µl when using
a spatula scoop of 500 µl capacity).
Proceed similarly with the control sediment (6.6), filling the remaining six wells of the microplates with 1 000 µl
control sediment.
Keeping the microplates horizontal, gently shake them to distribute the sediment evenly over the bottom surface
of the wells.
Take the container with the algal food suspension (6.4.2), shake it gently to homogenize the algal suspension,
and add 2 ml algal suspension to each well of the two microplates.
NOTE Algal food is provided to the organisms at the start of the test to avoid starvation which may lead to mortality
or decreased growth of the test organisms.
9.5 Transfer of the ostracod neonates into the test container
Put the hatching Petri dish with the neonates on the stage of the stereomicroscope.
Fill a small Petri dish (7.2) with 10 ml test medium (6.3) and transfer with the glass micropipette about 65 to 70
ostracods into the Petri dish.
Put the Petri dish with the ostracods under the stereomicroscope and transfer 10 neonates into each well of
the first microplate.
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Repeat this transfer operation for the second microplate.
On completion of the transfers, cover the two microplates with a sheet, e.g. of polyethylene, and the microplate cover.
9.6 Incubation of the test system
Incubate the two microplates at (25 ± 1) °C in darkness for 6 d.
9.7 Measurements
9.7.1 General
At the end of the exposure period, the ostracods have to be recovered from the test containers to determine the
percentage mortality and to make the length measurements of the surviving ostracods.
The ostracods can be recovered “directly” from the wells containing control sediment since they are easily
visible under a stereomicroscope. This is, however, mostly not the case for the test wells containing test
sediment, for which a “sieving procedure” has to be applied to recover the ostracods.
9.7.2 Recovery of the living ostracods from the wells with control sediment
Place one multiwell on the stage of the stereomicroscope and switch on (preferably) both the top and the
bottom illumination.
Centre one well containing control sediment and, with the aid of the glass micropipette, pick up the living
ostracods one by one and transfer them into a small Petri dish (7.2) containing test medium (6.3)
Perform the same operation for all the wells containing control sediment.
9.7.3 Recovery of the ostracods from the wells with test sediment
Take one multiwell, and with a “large mouth” pipette (7.5) gently mix the sediment in the first well which contains
test sediment, with the layer of test medium (6.3) on top of the sediment.
Aspirate part of the sediment suspension, transfer it into the microsieve (7.8) and gently rinse the contents of
the microsieve with tap water from a wash bottle until all the fine sediment particles are washed out.
Proceed further with the stepwise transfer of the sediment suspension from the well to the microsieve, followed
by rinsing with tap water, until most of the sediment has been transferred from the well to the microsieve.
Add a few millilitres of test medium (6.3) to the well, mix it with the remaining part of the sediment, and transfer
it to the microsieve for rinsing. Repeat this operation several times, if necessary, to make sure that all the
sediment and all the ostracods have been transferred.
Turn the microsieve upside down on top of a small Petri dish (7.2) and rinse the contents of the microsieve back
into the Petri dish with test medium (6.3). Make sure that the full contents of the microsieve are transferred into
the Petri dish.
These transfer and rinsing operations have, subsequently, to be performed for all the wells with test sediment
of the two microplates.
NOTE The Petri dishes will contain the remaining (large) sediment particles and the living and dead ostracods which
can now easily be seen under a stereomicroscope.
The user can, if desired, also apply other techniques to recover the ostracods.
9.7.4 Scoring of the mortality
Put, one by one, all the Petri dishes containing the ostracods on the stage of the stereomicroscope and count
the number of living ostracods in each Petri dish.
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ISO 14371:2012(E)
Score the number, n , of living ostracods counted in each Petri dish on data report template 2 (Table 2) in the
A
appropriate cells of the “Number of living ostracods” row.
Subtract each of the scored numbers, n , from 10 ( i.e. the number of test organisms inoculated in the well at
A
the start) to obtain the number of dead ostracods, 10 - n , and score these numbers on data report template 2
A
in the cells of the “Number of dead ostracods” row.
NOTE The Petri dishes originating from the wells with test sediment can also contain “dead” ostracods. The total
number of ostracods (i.e. dead plus living) can still be less than 10. The explanation for this is that, except for manipulation
errors during the transfers and the sievings, dead ostracods decompose very rapidly, leaving no visible remains.
Proceed the same way with all the Petri dishes containing the test organisms from the other 11 wells and score
the results on data report template 2.
9.7.5 Determination of the percentage mortality
With the data on mortality inserted into data report template 2 for each replicate, calculate the mean number
of dead ostracods for the six replicates of the control sediment and the test sediment. Subsequently, calculate
the mean percentage mortality in the control sediment and the test sediment. Record all these data in data
report template 2.
Table 2 — Data report template 2: Mortality
Control sediment Test sediment
Replicate 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Number of living ostracods, n
A
Number of dead ostracods, 10 - n
A
Mean number of dead ostracods for all
replicates
Mean percentage mortality
9.7.6 Length measurement
Length measurements of the ostracods at the end of the 6 d exposure allow to evaluate the growth inhibition of
the test organisms in the test sediment in comparison to the control sediment, as a “sublethal” effect criterion.
The evaluation of this sublethal effect is clearly without purpose in case a substantial percentage of the
organisms in the test sediment have died during the exposure.
Length measurements shall therefore only be performed in case the percentage mortality in the test sediment
is below 30 %.
Pick up, one by one, the living ostracods from one Petri dish with the glass micropipette, and place them in
the centre of a glass slide. Put the glass slide on the stage of the stereomicroscope and add one drop of Lugol
solution (6.5) to immobilize the organisms.
Measure the length of the ostracods with the calibrated eyepiece of the stereomicroscope and score the length
results on data report template 3 (Table 3) in the appropriate cells.
Calculate the mean length of the ostracods in the control sediment and the test sediment at the end of
the assay, L .
end
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ISO 14371:2012(E)
Calculate the mean length increment, L , of the ostracods in the control sediment and in the test
increment
sediment with Formula (1):
L = L – L (1)
increment end start
Calculate the percentage growth inhibition of the ostracods in the test sediment with Formula (2):
L
increment in test sediment
100−×100 (2)
L
increment in control
Table 3 — Data report template 3: Growth inhibition
Control sediment Test sediment
Replicate 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Test organism Length of test organisms, µm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mean length of ostracods per replicate
Mean length of ostracods for all the
replicates, L
end
Mean length increment for all the
L = L =
increment in control increment in test sediment
replicates, L – L
end start
Mean percentage growth inhibition in
— L
increment in test sediment
the test sediment
100−×100 =
L
increment in control
10 Reference test
Periodically perform a reference test with the reference chemical copper sulfate pentahydrate (6.7) in order to
verify the sensitivity of the test organisms and the conformity to the test procedure.
The toxicant range to be used for the reference test is 1 mg/l to 10 mg/l of CuSO•5H O.
4 2
Prepare solutions of the reference substance in test medium (6.3) at “double strength” (i.e. two times the
concentrations to which the test organisms will be exposed during the incubation period).
After addition to each test cup of the 2 ml test medium containing the different toxicant solutions, also add 2 ml
algal food suspension to each cup (9.4). This de facto decreases the toxicant concentration in the cups by half,
which is why the solutions of the reference substance are originally prepared at double strength.
The following (log scale) dilution series of CuSO•5H O shall be prepared with test medium:
4 2
8
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 14371:2013
01-september-2013
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHVWUXSHQRVWLVHGLPHQWDFHOLQVNLKYRGV+HWHURF\SULV
LQFRQJUXHQV &UXVWDFHD2VWUDFRGD
Water quality - Determination of fresh water sediment toxicity to Heterocypris
incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité des sédiments d'eau douce envers
Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 14371:2012
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 14371:2013 en,fr
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 14371:2013
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SIST ISO 14371:2013
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14371
First edition
2012-03-01
Water quality — Determination of fresh
water sediment toxicity to Heterocypris
incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des sédiments d’eau
douce envers Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Reference number
ISO 14371:2012(E)
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test environment . 2
6 Reagents, test organisms and media . 2
7 Apparatus and material . 3
8 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of the
sediment samples . 4
9 Procedure . 4
9.1 Hatching of the cysts . 4
9.2 Pre-feeding of the ostracod neonates . 4
9.3 Length measurement of the neonates . 4
9.4 Addition of sediment and algal food to the test container . 5
9.5 Transfer of the ostracod neonates into the test container . 5
9.6 Incubation of the test system . 6
9.7 Measurements . 6
10 Reference test . 8
11 Tests on pure chemicals or preparations .10
12 Validity criteria .10
13 Test report .10
Annex A (informative) Culturing of Heterocypris incongruens for cyst production . 11
Annex B (informative) Precision data.13
Bibliography .15
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14371 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
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Introduction
The evaluation of harmful effects on water quality has for several years involved the performance of biological
tests. Historically, toxicity tests have mainly focused on the impact of pollutants present in the water column of
aquatic ecosystems, without considering the hazard of toxicants present and accumulating in the sediments.
“Direct contact” tests in which the test organisms are exposed to the whole sediment have been gradually
developed with endobenthic species, such as chironomid larvae [Chironomus riparius or Chironomus dilutus
(formerly C. tentans)] or epibenthic amphipod crustaceans (Hyalella azteca).
The test specified in this International Standard is a direct contact test for determination of the percentage
mortality and/or growth inhibition on the fresh water ostracod Heterocypris incongruens (Ramdohr, 1808) after
6 d exposure to a whole sediment (see References [1], [2]).
H. incongruens is a cosmopolitan ostracod species, which has to date already been used extensively for toxicity
testing not only of whole sediments, but also by extension on sludges and soils (see References [3]–[21]).
The direct contact test with H. incongruens has a sensitivity which is quite similar to that of the amphipod
crustacean Hyalella azteca and the midge larva Chironomus riparius (see References [22]–[25]).
The assays are performed with neonates hatched from dormant eggs (cysts), which bypasses the need for
culturing or maintaining live stock cultures of test organisms.
H. incongruens neonates (150 µm to 200 µm) are substantially smaller than Hyalella azteca and Chironomus
riparius, and the assays can be performed in much smaller test containers, hence require much less bench
space and incubator space.
The effects are evaluated after a shorter exposure time (6 d) than in the assays with the amphipod crustacean
(10 d to 28 d) and midge larvae species (10 d to 28 d).
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14371:2012(E)
Water quality — Determination of fresh water sediment toxicity
to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of lethal as well as sublethal effects of
contaminated sediments on the ostracod crustacean Heterocypris incongruens after 6 d exposure.
The method is applicable not only to fresh water sediments, but also by extension to solid wastes and soils after
addition of (uncontaminated) water.
The method can also be applied to chemicals or preparations which are spiked into a reference sediment.
This International Standard is not applicable to the testing of sediments from the estuarine or marine environment.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable
for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition
of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15:2009, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge
and sediment samples
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
neonate
newly hatched individual
3.2
pre-feeding
feeding of the neonates (3.1) with a small amount of dried algae (Spirulina) prior to the test
4 Principle
Freshly hatched Heterocypris incongruens larvae are exposed to the sediment sample under analysis and the
percentage mortality of the test organisms is determined after 6 d exposure.
If the percentage mortality is low (e.g. <30 %), the growth inhibition of the organisms in the sediment sample is
determined in comparison to the control sediment, as a sublethal effect criterion.
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5 Test environment
The test shall be carried out in the dark, in a temperature-controlled room or incubator at (25 ± 1) °C in the
test containers.
Maintain the atmosphere free from toxic dusts or vapours. The use of control solutions is a double check that
the test is performed in an atmosphere free from toxic dusts and vapours.
6 Reagents, test organisms and media
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organisms. The test organisms are neonates of the fresh water ostracod Heterocypris incongruens
which are hatched from dormant eggs (cysts) of this crustacean.
Cysts of H. incongruens are obtained from laboratory cultures, as described in Annex A, or can be purchased
1)
from a specialized company .
6.2 Pure water, having a conductivity below 10 µS/cm.
6.3 Test medium, prepared by dissolving the following mineral substances in 1 l of pure water (6.2):
NaHCO 96 mg
3
CaSO•2H O 60 mg
4 2
MgSO 60 mg
4
KCl 4 mg
This test medium corresponds to a synthetic water of moderate hardness, i.e. containing CaCO at concentrations
3
of 80 mg/l to 100 mg/l (see Reference [26]). Thus prepared, the medium has a pH of 7,6 ± 0,3.
The test medium can be used for two weeks when stored in a refrigerator (4 °C to 7 °C) in the dark.
Aerate the test medium until the dissolved oxygen concentration has reached the air saturation value and until
the pH has stabilized. If necessary, adjust the pH to 7,6 ± 0,3 using a sodium hydroxide or hydrochloric acid
solution. The concentration of the acid or base required shall be selected so that the volume to be admixed is
as small as possible. Bring the temperature of the test medium up to (25 ± 1) °C prior to use.
6.4 Algal food.
6.4.1 Spirulina suspension. A suspension of powder of the blue-green alga Spirulina platensis prepared by mixing
150 mg dry mass Spirulina in 10 ml pure water (6.2). Spirulina powder is available commercially in health stores.
6.4.2 Green algae. A 25 ml suspension of green algae (e.g. Scenedesmus spp.) at a concentration of around
7
1,5 × 10 cells/ml, prepared with test medium (6.3).
The algae can also be encapsulated in algal beads, which can be stored for long periods of time in a refrigerator,
[31]
and “de-immobilized” at the time of use (see ISO 8692:2012 , Annexes B and C).
1) MicroBioTests Inc., Mariakerke (Gent), Belgium, is an example of a supplier able to provide suitable Heterocypris
incongruens cysts. This information is given for the convenience of the users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this supplier.
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6.5 Lugol solution, to immobilize and fix the test organisms at the end of the test.
Lugol solution is prepared by mixing 5 g iodine (I ) and 10 g potassium iodide (KI) with 85 ml pure water (6.2).
2
6.6 Control sediment. Commercial (not toxic and not calcareous) river sand or marine sand, which is water
2)
washed and sieved to eliminate dirt and debris, and air-dried is a suitable control sediment provided it is of the
category “medium size” sand, with a granulometry 0/2 (i.e. a particle size range between 0 mm and 2 mm).
At the time of testing, the control sediment shall first be “water saturated” as follows.
Fill a small glass beaker with control sediment and pour test medium (6.3) on it until the sediment is completely
wet. During this operation, the sediment shall be stirred with a spatula to ensure complete water saturation.
Supernatant test medium shall be decanted.
6.7 Reference substance. Copper sulfate pentahydrate (CuSO•5H O) is the recommended reference chemical.
4 2
7 Apparatus and material
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
7.1 Temperature-controlled room or chamber.
7.2 Petri dishes, diameter 5 cm, glass or inert plastic material for hatching of the cysts and transfers of the
test organisms.
7.3 Test containers. Disposable microplates made from chemically inert material, with wells of a capacity of
at least 10 ml. Six (2 × 3) well microplates with a well diameter of approximately 35 mm are suitable.
7.4 Micropipette, in glass for sampling the test organisms, with an internal diameter of ∼1 mm at the tip, for
capturing the animals while allowing sampling of only a small volume of medium.
Micropipettes provided with a bulb at the end are very suitable for the operations.
7.5 “Large mouth” micropipettes, in an inert plastic material and with a wide opening, for transfer of
sediment suspensions.
7.6 Spatula scoop, stainless steel or inert plastic material, with a capacity of 500 µl or 1 000 µl.
7.7 Flat spatula, stainless steel or inert plastic material.
7.8 Microsieve, with a 100 µm mesh.
7.9 Stereomicroscope with incident (bottom) illumination, with a magnification of at least 8 times and, if
possible, a continuous magnification.
7.10 Calibrated eyepiece for the stereomicroscope, for length measurements of the test organisms.
7.11 Light source, providing a range of light intensity in the hatching Petri dish (7.2) of 3 000 lx to 4 000 lx.
7.12 Sample-collecting containers, in accordance with ISO 5667-15:2009, Clause 7.
2) River sand or marine sand can be obtained in every country from aquarium shops.
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8 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of the
sediment samples
Perform sampling, transportation, and storage of the samples in accordance with the general procedures
specified in ISO 5667-16.
The containers with the sediment samples shall be stored at (4 ± 2) °C in darkness with no head space above
the sediment, and the assays shall be carried out as soon as possible after collection. The toxicity tests should
be performed within two weeks of sampling, and preferably within one week. In any case, the assays shall start
no later than six weeks after sample collection.
NOTE Scientific studies report that the toxicity of sediments stored at 4 °C did not change after several months of
storage, but in other cases toxicity changes were noted within days to weeks.
Prior to the test performance, the samples shall be homogenized by stirring with a spoon or spatula in a
container of stainless steel or inert plastic material. Large debris or large indigenous macro-organisms should
be removed manually.
9 Procedure
9.1 Hatching of the cysts
Heterocypris incongruens cysts shall be hatched as follows.
Put 8 ml test medium (6.3) into a small Petri dish (7.2) and add a sufficient amount of ostracod cysts (6.1) to
3)
perform a complete test .
Cover the Petri dish with its lid and incubate for 48 h at (25 ± 1) °C under continuous illumination (7.11).
9.2 Pre-feeding of the ostracod neonates
The neonates shall be provided with food for a few hours immediately after they have hatched (i.e. after 48 h
incubation of the cysts).
Take the container with the Spirulina suspension (6.4.1) and homogenize the contents by hand shaking. Add
1 ml Spirulina suspension to the hatching Petri dish and gently shake the Petri dish to distribute the food
suspension evenly.
Put the hatching Petri dish back in the incubator for 4 h.
9.3 Length measurement of the neonates
Pick up 10 ostracods from the hatching Petri dish with a glass micropipette, taking care to aspirate as little test
medium (6.3) as possible, and drop the organisms in the centre of a glass slide.
Place the slide on the stage of the stereomicroscope and focus on the field with the ostracods. Put one drop of
Lugol solution (6.5) on the organisms and wait for a few minutes until the neonates are completely immobile.
Measure the length of the ostracods with the aid of the calibrated eyepiece and score the results on the data
report template 1 (see Table 1). Calculate and score the mean length, L , of the neonates on the template.
start
NOTE The size of ostracod neonates ranges from 150 µm to 250 µm.
3) The amount depends on the hatchability of the cysts and should be sufficient to provide enough nauplii to perform a
complete toxicity test (i.e. > 120 nauplii). 10 mg dry ostracod cysts is normally sufficient.
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Table 1 — Data report template 1: Length of ostracod neonates
Length
Ostracod neonate
µm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mean length, L
start
9.4 Addition of sediment and algal food to the test container
Perform the direct contact test on the whole sediment in six replicates, in parallel to a control sediment (6.6)
also in six replicates. When using six-well microplates (7.3), the assay requires two such plates.
Inoculate three wells in each microplate with whole sediment and the three other wells with control sediment.
Alternatively, the six wells of the first microplate can be filled with whole sediment, and those of the second
plate with control sediment.
Put 2 ml test medium (6.3) into all the cups of the two microplates.
Fill the cup of the spatula scoop (7.6) with test sediment and strike off the excess of sediment with the flat
spatula (7.7) to keep a volume of sediment of either 500 µl or 1 000 µl sediment in the scoop (depending of the
type of spatula).
Transfer the sediment into the six wells of the two microplates using the tip of the flat spatula to empty the cup of
the spatula scoop completely. Each well shall receive 1 000 µl sediment (i.e. two scoops of 500 µl when using
a spatula scoop of 500 µl capacity).
Proceed similarly with the control sediment (6.6), filling the remaining six wells of the microplates with 1 000 µl
control sediment.
Keeping the microplates horizontal, gently shake them to distribute the sediment evenly over the bottom surface
of the wells.
Take the container with the algal food suspension (6.4.2), shake it gently to homogenize the algal suspension,
and add 2 ml algal suspension to each well of the two microplates.
NOTE Algal food is provided to the organisms at the start of the test to avoid starvation which may lead to mortality
or decreased growth of the test organisms.
9.5 Transfer of the ostracod neonates into the test container
Put the hatching Petri dish with the neonates on the stage of the stereomicroscope.
Fill a small Petri dish (7.2) with 10 ml test medium (6.3) and transfer with the glass micropipette about 65 to 70
ostracods into the Petri dish.
Put the Petri dish with the ostracods under the stereomicroscope and transfer 10 neonates into each well of
the first microplate.
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Repeat this transfer operation for the second microplate.
On completion of the transfers, cover the two microplates with a sheet, e.g. of polyethylene, and the microplate cover.
9.6 Incubation of the test system
Incubate the two microplates at (25 ± 1) °C in darkness for 6 d.
9.7 Measurements
9.7.1 General
At the end of the exposure period, the ostracods have to be recovered from the test containers to determine the
percentage mortality and to make the length measurements of the surviving ostracods.
The ostracods can be recovered “directly” from the wells containing control sediment since they are easily
visible under a stereomicroscope. This is, however, mostly not the case for the test wells containing test
sediment, for which a “sieving procedure” has to be applied to recover the ostracods.
9.7.2 Recovery of the living ostracods from the wells with control sediment
Place one multiwell on the stage of the stereomicroscope and switch on (preferably) both the top and the
bottom illumination.
Centre one well containing control sediment and, with the aid of the glass micropipette, pick up the living
ostracods one by one and transfer them into a small Petri dish (7.2) containing test medium (6.3)
Perform the same operation for all the wells containing control sediment.
9.7.3 Recovery of the ostracods from the wells with test sediment
Take one multiwell, and with a “large mouth” pipette (7.5) gently mix the sediment in the first well which contains
test sediment, with the layer of test medium (6.3) on top of the sediment.
Aspirate part of the sediment suspension, transfer it into the microsieve (7.8) and gently rinse the contents of
the microsieve with tap water from a wash bottle until all the fine sediment particles are washed out.
Proceed further with the stepwise transfer of the sediment suspension from the well to the microsieve, followed
by rinsing with tap water, until most of the sediment has been transferred from the well to the microsieve.
Add a few millilitres of test medium (6.3) to the well, mix it with the remaining part of the sediment, and transfer
it to the microsieve for rinsing. Repeat this operation several times, if necessary, to make sure that all the
sediment and all the ostracods have been transferred.
Turn the microsieve upside down on top of a small Petri dish (7.2) and rinse the contents of the microsieve back
into the Petri dish with test medium (6.3). Make sure that the full contents of the microsieve are transferred into
the Petri dish.
These transfer and rinsing operations have, subsequently, to be performed for all the wells with test sediment
of the two microplates.
NOTE The Petri dishes will contain the remaining (large) sediment particles and the living and dead ostracods which
can now easily be seen under a stereomicroscope.
The user can, if desired, also apply other techniques to recover the ostracods.
9.7.4 Scoring of the mortality
Put, one by one, all the Petri dishes containing the ostracods on the stage of the stereomicroscope and count
the number of living ostracods in each Petri dish.
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Score the number, n , of living ostracods counted in each Petri dish on data report template 2 (Table 2) in the
A
appropriate cells of the “Number of living ostracods” row.
Subtract each of the scored numbers, n , from 10 ( i.e. the number of test organisms inoculated in the well at
A
the start) to obtain the number of dead ostracods, 10 - n , and score these numbers on data report template 2
A
in the cells of the “Number of dead ostracods” row.
NOTE The Petri dishes originating from the wells with test sediment can also contain “dead” ostracods. The total
number of ostracods (i.e. dead plus living) can still be less than 10. The explanation for this is that, except for manipulation
errors during the transfers and the sievings, dead ostracods decompose very rapidly, leaving no visible remains.
Proceed the same way with all the Petri dishes containing the test organisms from the other 11 wells and score
the results on data report template 2.
9.7.5 Determination of the percentage mortality
With the data on mortality inserted into data report template 2 for each replicate, calculate the mean number
of dead ostracods for the six replicates of the control sediment and the test sediment. Subsequently, calculate
the mean percentage mortality in the control sediment and the test sediment. Record all these data in data
report template 2.
Table 2 — Data report template 2: Mortality
Control sediment Test sediment
Replicate 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Number of living ostracods, n
A
Number of dead ostracods, 10 - n
A
Mean number of dead ostracods for all
replicates
Mean percentage mortality
9.7.6 Length measurement
Length measurements of the ostracods at the end of the 6 d exposure allow to evaluate the growth inhibition of
the test organisms in the test sediment in comparison to the control sediment, as a “sublethal” effect criterion.
The evaluation of this sublethal effect is clearly without purpose in case a substantial percentage of the
organisms in the test sediment have died during the exposure.
Length measurements shall therefore only be performed in case the percentage mortality in the test sediment
is below 30 %.
Pick up, one by one, the living ostracods from one Petri dish with the glass micropipette, and place them in
the centre of a glass slide. Put the glass slide on the stage of the stereomicroscope and add one drop of Lugol
solution (6.5) to immobilize the organisms.
Measure the length of the ostracods with the calibrated eyepiece of the stereomicroscope and score the length
results on data report template 3 (Table 3) in the appropriate cells.
Calculate the mean length of the ostracods in the control sediment and the test sediment at the end of
the assay, L .
end
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Calculate the mean length increment, L , of the ostracods in the control sediment and in the test
increment
sediment with Formula (1):
L = L – L (1)
increment end start
Calculate the percentage growth inhibition of the ostracods in the test sediment with Formula (2):
L
increment in test sediment
100−×100 (2)
L
increment in control
Table 3 — Data report template 3: Growth inhibition
Control sediment Test sediment
Replicate 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Test organism Length of test organisms, µm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mean length of ostracods per replicate
Mean length of ostracod
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14371
Première édition
2012-03-01
Qualité de l’eau — Détermination de
la toxicité des sédiments d’eau douce
envers Heterocypris incongruens
(Crustacea, Ostracoda)
Water quality — Determination of fresh water sediment toxicity to
Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
Numéro de référence
ISO 14371:2012(F)
©
ISO 2012
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ISO 14371:2012(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Environnement d’essai . 2
6 Réactifs, organismes d’essai et milieux d’essai . 2
7 Appareillage et matériel . 3
8 Précautions spéciales relatives à l’échantillonnage, au transport, au stockage et au traitement
des échantillons de sédiment . 4
9 Mode opératoire . 4
9.1 Éclosion des cystes . 4
9.2 Première alimentation des ostracodes nouveau-nés . 4
9.3 Mesurage de la longueur des nouveau-nés . 5
9.4 Ajout de sédiment et de nourriture algale dans le récipient d’essai . 5
9.5 Transfert des ostracodes nouveau-nés dans les récipients d’essai . 6
9.6 Incubation du système d’essai . 6
9.7 Mesurages . 6
10 Essai de référence . 9
11 Essais sur des produits chimiques purs ou des préparations .10
12 Critères de validité .10
13 Rapport d’essai . 11
Annexe A (informative) Culture d’Heterocypris incongruens pour la production de cystes .12
Annexe B (informative) Données de fidélité .14
Bibliographie .16
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 14371 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
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ISO 14371:2012(F)
Introduction
Pendant plusieurs années, l’évaluation des effets néfastes sur la qualité de l’eau dépendait de la performance
des essais biologiques. D’un point de vue historique, les essais de toxicité visaient principalement à évaluer
l’impact des polluants présents dans la colonne d’eau des écosystèmes aquatiques, sans tenir compte du
danger que représentent les substances toxiques présentes et qui s’accumulent dans les sédiments.
Des «essais par contact direct», dans lesquels les organismes d’essai sont exposés aux sédiments bruts,
ont été progressivement développés avec des espèces endobenthiques, notamment les larves de chironome
[Chironomus riparius ou Chironomus dilutus (anciennement C. tentans)] ou les crustacés amphipodes
épibenthiques (Hyalella azteca).
L’essai spécifié dans la présente Norme internationale est un essai par contact direct permettant de déterminer
le pourcentage de mortalité et/ou d’inhibition de la croissance sur l’ostracode d’eau douce Heterocypris
incongruens (Ramdohr, 1808) après 6 jours d’exposition à des sédiments bruts (voir Références [1], [2]).
H. incongruens est une espèce d’ostracode ubiquiste qui est, à ce jour, couramment utilisée non seulement
pour les essais de toxicité des sédiments bruts, mais également, par extension, des boues et des sols (voir
Références [3]-[21]).
La sensibilité de l’essai par contact direct avec H. incongruens est assez similaire à celle des crustacés
amphipodes Hyalella azteca et à celle des larves de chironome Chironomus riparius (voir Références [22]-[25]).
Les essais sont effectués avec des nouveau-nés obtenus par éclosion d’œufs quiescents (cystes), ce qui
permet de ne pas avoir besoin de cultiver ou de conserver des souches d’organismes d’essai.
Les nouveau-nés d’H. incongruens (150 µm à 200 µm) étant significativement de plus petite taille que ceux
d’Hyalella azteca et de Chironomus riparius, les essais peuvent être effectués dans des récipients d’essai
beaucoup plus petits et nécessitent moins de place sur la paillasse et dans l’incubateur.
Les effets sont évalués après une période d’exposition (6 jours) plus courte que celle des essais utilisant les
crustacés amphipodes (10 jours à 28 jours) et les larves de chironome (10 jours à 28 jours).
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NORME INTERNATIONALE ISO 14371:2012(F)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des
sédiments d’eau douce envers Heterocypris incongruens
(Crustacea, Ostracoda)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de la conformité
à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination des effets létaux et sublétaux de
sédiments contaminés sur le crustacé ostracode Heterocypris incongruens après 6 jours d’exposition.
La méthode est applicable non seulement aux sédiments d’eau douce mais également, par extension, aux
déchets solides et aux sols après ajout d’eau (non contaminée).
La méthode peut également être appliquée aux produits chimiques ou aux préparations qui sont introduits
dans un sédiment de référence.
La présente Norme internationale n’est pas applicable aux essais sur les sédiments estuariens ou marins.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-15:2009, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 15: Lignes directrices pour la conservation et
le traitement des échantillons de boues et de sédiments
ISO 5667-16, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
nouveau-né
individu nouvellement éclos
3.2
première alimentation
alimentation des nouveau-nés (3.1) avec une petite quantité d’algues séchées (Spiruline) avant l’essai
4 Principe
Les larves d’Heterocypris incongruens fraîchement écloses sont exposées à l’échantillon de sédiment à
analyser et le pourcentage de mortalité des organismes d’essai est déterminé après 6 jours d’exposition.
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Si le pourcentage de mortalité est faible (par exemple <30 %), l’inhibition de la croissance des organismes dans
l’échantillon de sédiment est déterminée par rapport à celle obtenue avec le sédiment de contrôle, comme
critère d’effet sublétal.
5 Environnement d’essai
L’essai doit être effectué à l’abri de la lumière, dans une pièce ou un incubateur thermostaté à (25 ± 1) °C dans
les récipients d’essai.
L’atmosphère doit être exempte de poussières ou de vapeurs toxiques. L’utilisation de solutions de contrôle permet
aussi de vérifier que l’essai se déroule dans une atmosphère dépourvue de poussières et de vapeurs toxiques.
6 Réactifs, organismes d’essai et milieux d’essai
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Organismes d’essai
Les organismes d’essai sont des nouveau-nés d’ostracodes d’eau douce Heterocypris incongruens obtenus
par éclosion d’œufs quiescents (cystes) de ce crustacé.
Les cystes d’H. incongruens proviennent des cultures de laboratoire décrites dans l’Annexe A. Ils peuvent
1)
également être achetés auprès d’un organisme spécialisé .
6.2 Eau pure, ayant une conductivité inférieure à 10 µS/cm.
6.3 Milieu d’essai, préparé en dissolvant les substances minérales suivantes dans 1 l d’eau pure (6.2):
NaHCO 96 mg
3
CaSO , 2H O 60 mg
4 2
MgSO 60 mg
4
KCl 4 mg
Ce milieu d’essai correspond à une eau synthétique de dureté modérée, c’est-à-dire contenant du CaCO à
3
des concentrations de 80 mg/l à 100 mg/l (voir Référence [26]). Ainsi préparé, le milieu a un pH de 7,6 ± 0,3.
Le milieu d’essai peut être utilisé pendant deux semaines lorsqu’il est conservé au réfrigérateur (entre 4 °C et
7 °C) et à l’abri de la lumière.
Aérer le milieu d’essai jusqu’à ce que la concentration en oxygène dissous atteigne la valeur de saturation
de l’air et jusqu’à ce que le pH soit stable. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,6 ± 0,3 en utilisant une solution
d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique. La concentration de l’acide ou de la base requis doit être
choisie de façon que le volume à mélanger soit le plus faible possible. Avant utilisation, porter la température
du milieu d’essai à (25 ± 1) °C.
6.4 Nourriture algale
6.4.1 Suspension de Spiruline. Suspension de poudre de l’algue bleue-verte Spirulina platensis préparée
en mélangeant 150 mg en masse sèche de Spiruline dans 10 ml d’eau pure (6.2). La poudre de Spiruline est
disponible dans les magasins diététiques.
1) MicroBioTests Inc., Mariakerke (Gent), Belgique, est un exemple de fournisseur de cystes d’Heterocypris incongruens
appropriés. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif du fournisseur ainsi désigné.
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6.4.2 Algues vertes. Suspension de 25 ml d’algues vertes (par exemple Scenedesmus spp.) à une
7
concentration d’environ 1,5 × 10 cellules/ml, préparée avec le milieu d’essai (6.3).
Les algues peuvent également être incorporées dans des billes d’alginate, qui peuvent être conservées durant de
[31]
longues périodes au réfrigérateur, et «libérées» au moment de l’utilisation (voir l’ISO 8692:— , Annexes B et C).
6.5 Solution de Lugol, pour immobiliser et fixer les organismes d’essai à la fin de l’essai.
La solution de Lugol est préparée en mélangeant 5 g d’iode (I ) et 10 g d’iodure de potassium (Kl) avec 85 ml
2
d’eau pure (6.2).
6.6 Sédiment de contrôle. Un sable de rivière ou un sable marin commercial (non toxique et non calcaire),
lavé à l’eau, tamisé pour éliminer les saletés et les débris et séché à l’air, est un sédiment de contrôle
2)
approprié à condition qu’il fasse partie de la catégorie des sables dits «de taille moyenne», c’est-à-dire ayant
une granulométrie 0/2 (soit une taille des particules comprise entre 0 mm et 2 mm).
Au moment des essais, le sédiment de contrôle doit d’abord être «saturé en eau» en procédant de la
manière suivante.
Remplir un petit bécher en verre avec le sédiment de contrôle et verser le milieu d’essai (6.3) par-dessus
jusqu’à ce que le sédiment soit complètement mouillé. Pendant cette opération, le sédiment doit être agité avec
une spatule pour garantir une saturation en eau complète. Le surnageant du milieu d’essai doit être éliminé.
6.7 Substance de référence. Le sulfate de cuivre (CuSO , 5H O) est la substance chimique de
4 2
référence recommandée.
7 Appareillage et matériel
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Pièce ou chambre thermostatée.
7.2 Boîtes de Petri, de 5 cm de diamètre, en verre ou en plastique inerte pour faire éclore les cystes et
transférer les organismes d’essai.
7.3 Récipients d’essai. Microplaques à usage unique en matériau chimiquement inerte, équipées de puits
d’une contenance d’au moins 10 ml. Des microplaques à six (2 × 3) puits d’un diamètre de puits d’environ
35 mm sont appropriées.
7.4 Micropipette, en verre pour prélever les organismes d’essai, d’un diamètre intérieur d’environ 1 mm à
l’extrémité, pour capturer les animaux tout en prélevant seulement un faible volume de milieu.
Les micropipettes équipées d’une poire à l’extrémité sont parfaitement appropriées pour réaliser les opérations.
7.5 Micropipettes «à large ouverture», en plastique inerte et à large ouverture, pour transférer les
suspensions de sédiments.
7.6 Cuillère spatule, en acier inoxydable ou en plastique inerte, d’une contenance de 500 µl ou 1 000 µl.
7.7 Spatule plate, en acier inoxydable ou en plastique inerte.
7.8 Microtamis, d’une taille de mailles de 100 µm.
2) Le sable de rivière ou le sable marin peut être obtenu, dans chaque pays, auprès des magasins d’aquariophilie.
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7.9 Stéréo-microscope à éclairage incident (épiscopique), avec un grossissement d’au moins 8 fois et, si
possible, un grossissement continu.
7.10 Oculaire étalonné pour stéréo-microscope, pour mesurer la longueur des organismes d’essai.
7.11 Source de lumière, produisant une intensité de lumière dans la boîte de Petri (7.2) de 3 000 lx à 4 000 lx.
7.12 Récipients de collecte des échantillons, conformes à l’ISO 5667-15:2009, Article 7.
8 Précautions spéciales relatives à l’échantillonnage, au transport, au stockage et
au traitement des échantillons de sédiment
Effectuer l’échantillonnage, le transport et le stockage des échantillons conformément aux modes opératoires
généraux spécifiés dans l’ISO 5667-16.
Les récipients contenant les échantillons de sédiment doivent être conservés à (4 ± 2) °C et à l’abri de la
lumière, sans espace de tête au-dessus du sédiment, et les essais doivent être réalisés dès que possible après
le prélèvement. Il convient d’effectuer les essais de toxicité dans les deux semaines suivant l’échantillonnage,
et de préférence dans la semaine. Dans tous les cas, les essais doivent commencer au plus tard dans les six
semaines suivant le prélèvement des échantillons.
NOTE Des études scientifiques indiquent que la toxicité des sédiments conservés à 4 °C ne changeait pas après
plusieurs mois de stockage mais que, dans d’autres cas, des changements de toxicité étaient observés dans les jours ou
les semaines qui suivaient.
Avant la réalisation de l’essai, les échantillons doivent être homogénéisés en les brassant avec une cuillère
ou une spatule dans un récipient en acier inoxydable ou en plastique inerte. Il convient de retirer à la main les
débris ou les macro-organismes indigènes de grande taille.
9 Mode opératoire
9.1 Éclosion des cystes
L’éclosion des cystes d’Heterocypris incongruens doit se faire comme suit.
Verser 8 ml de milieu d’essai (6.3) dans une petite boîte de Petri (7.2) et ajouter une quantité suffisante de
3)
cystes d’ostracodes (6.1) pour effectuer un essai complet .
Couvrir la boîte de Petri avec un couvercle et la mettre à incuber pendant 48 h à (25 ± 1) °C sous éclairage
continu (7.11).
9.2 Première alimentation des ostracodes nouveau-nés
Les nouveau-nés doivent être nourris dans les quelques heures qui suivent immédiatement leur éclosion
(c’est-à-dire après 48 h d’incubation des cystes).
Prendre le récipient contenant la suspension de Spiruline (6.4.1) et homogénéiser son contenu en l’agitant à la
main. Ajouter 1 ml de suspension de Spiruline dans la boîte de Petri destinée à l’éclosion et agiter doucement
la boîte pour répartir la suspension de nourriture de façon homogène.
Remettre la boîte de Petri dans l’incubateur pendant 4 h.
3) La quantité dépend du taux d’éclosion des cystes. Il convient qu’elle soit suffisante pour fournir suffisamment de nauplii
pour effectuer un essai de toxicité complet (c’est-à-dire >120 nauplii). Une quantité de 10 mg en masse sèche de cystes
d’ostracodes est normalement suffisante.
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9.3 Mesurage de la longueur des nouveau-nés
À l’aide d’une micropipette en verre, prélever 10 ostracodes de la boîte de Petri destinée à l’éclosion, en veillant
à aspirer le moins possible de milieu d’essai (6.3) et disposer les organismes au centre d’une lame de verre.
Placer la lame sur la platine du stéréo-microscope et cibler la zone contenant les ostracodes. Verser une
goutte de solution de Lugol (6.5) sur les organismes et attendre quelques minutes jusqu’à ce que les nouveau-
nés soient complètement immobiles. Mesurer la longueur des ostracodes à l’aide de l’oculaire étalonné et noter
les résultats sur le modèle de tableau de données 1 (voir Tableau 1). Calculer et noter la longueur moyenne,
L , des nouveau-nés sur le modèle.
début
NOTE La taille des ostracodes nouveau-nés varie de 150 µm à 250 µm.
Tableau 1 — Modèle de tableau de données 1: Longueur des ostracodes nouveau-nés
Longueur
Ostracodes nouveau-nés
µm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Longueur moyenne, L
début
9.4 Ajout de sédiment et de nourriture algale dans le récipient d’essai
Effectuer l’essai par contact direct sur le sédiment brut sur six réplicats, parallèlement à un sédiment de
contrôle (6.6) sur six réplicats également. En cas d’utilisation de microplaques à six puits (7.3), l’essai nécessite
deux plaques de ce type.
Dans chaque microplaque, ensemencer trois puits avec le sédiment brut et les trois autres puits avec le
sédiment de contrôle. En variante, les six puits de la première microplaque peuvent être remplis avec le
sédiment brut, et ceux de la deuxième plaque avec le sédiment de contrôle.
Verser 2 ml de milieu d’essai (6.3) dans tous les puits des deux microplaques.
Remplir le godet de la cuillère spatule (7.6) avec le sédiment d’essai et éliminer l’excédent de sédiment avec
la spatule plate (7.7) de façon à obtenir un volume de sédiment de 500 µl ou 1 000 µl dans la cuillère (selon le
type de spatule).
Transférer le sédiment dans les six puits des deux microplaques, en utilisant l’extrémité de la spatule plate,
pour vider entièrement le godet de la cuillère spatule. Chaque puits doit recevoir 1 000 µl de sédiment (c’est-à-
dire deux cuillères de 500 µl si on utilise une cuillère spatule de 500 µl de contenance).
Procéder de façon similaire avec le sédiment de contrôle (6.6), en remplissant les six puits restants des
microplaques avec 1 000 µl de sédiment de contrôle.
En maintenant les microplaques à l’horizontale, les agiter doucement pour répartir de façon homogène le
sédiment au fond des puits.
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Prendre le récipient contenant la suspension de nourriture algale (6.4.2), l’agiter doucement pour homogénéiser
la suspension algale et ajouter 2 ml de suspension algale dans chaque puits des deux microplaques.
NOTE La nourriture algale est distribuée aux organismes au début de l’essai pour éviter toute inanition susceptible
de provoquer la mort ou une limitation de la croissance des organismes d’essai.
9.5 Transfert des ostracodes nouveau-nés dans les récipients d’essai
Placer la boîte de Petri contenant les nouveau-nés sur la platine du stéréo-microscope.
Remplir une petite boîte de Petri (7.2) avec 10 ml de milieu d’essai (6.3) et transférer environ 65 à 70 ostracodes
dans la boîte de Petri à l’aide d’une micropipette en verre.
Placer la boîte de Petri contenant les ostracodes sous le stéréo-microscope et transférer 10 nouveau-nés dans
chaque puits de la première microplaque.
Répéter cette opération de transfert pour la deuxième microplaque.
Une fois que les transferts sont terminés, couvrir les deux microplaques avec une feuille de polyéthylène, par
exemple, et avec le couvercle des microplaques.
9.6 Incubation du système d’essai
Incuber les deux microplaques à (25 ± 1) °C dans l’obscurité pendant 6 jours.
9.7 Mesurages
9.7.1 Généralités
À la fin de la période d’exposition, les ostracodes doivent être récupérés dans les récipients d’essai pour déterminer
le pourcentage de mortalité et pour procéder aux mesurages de la longueur des ostracodes survivants.
Les ostracodes peuvent être récupérés «directement» dans les puits contenant le sédiment de contrôle car
ils sont facilement visibles au stéréo-microscope. Cependant, ce n’est généralement pas le cas pour les puits
d’essai contenant le sédiment d’essai, pour lesquels un «mode opératoire de tamisage» doit être mis en œuvre
afin de récupérer les ostracodes.
9.7.2 Récupération des ostracodes vivants dans les puits contenant le sédiment de contrôle
Placer une plaque multipuits sur la platine du stéréo-microscope et allumer (de préférence) à la fois l’éclairage
du haut et l’éclairage du bas.
Centrer un puits contenant le sédiment de contrôle, et à l’aide de la micropipette en verre, prélever un par un
les ostracodes vivants et les transférer dans une petite boîte de Petri (7.2) contenant le milieu d’essai (6.3).
Effectuer la même opération pour tous les puits contenant le sédiment de contrôle.
9.7.3 Récupération des ostracodes dans les puits contenant le sédiment d’essai
Prendre une plaque multipuits, et à l’aide d’une micropipette «à large ouverture» (7.5), mélanger doucement
le sédiment dans le premier puits contenant le sédiment d’essai, avec la couche de milieu d’essai (6.3)
au-dessus du sédiment.
Aspirer une partie de la suspension de sédiment, la transférer dans le microtamis (7.8) et rincer doucement le
contenu du microtamis avec de l’eau du robinet (avec une pissette) jusqu’à ce que la totalité des particules de
sédiment soit éliminée.
Effectuer ensuite le transfert progressif de la suspension de sédiment du puits dans le microtamis, puis rincer
avec de l’eau du robinet jusqu’à ce que la majeure partie du sédiment soit transférée du puits au microtamis.
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Ajouter quelques millilitres de milieu d’essai (6.3) dans le puits, les mélanger avec le sédiment restant et les
transférer dans le microtamis pour rinçage. Si nécessaire, répéter cette opération plusieurs fois pour s’assurer
que la totalité du sédiment et des ostracodes est transférée.
Retourner le microtamis au-dessus d’une petite boîte de Petri (7.2) et rincer à nouveau le contenu du microtamis
dans la boîte de Petri contenant le milieu d’essai (6.3). Veiller à ce que la totalité du contenu du microtamis soit
transférée dans la boîte de Petri.
Ces opérations de transfert et de rinçage doivent ensuite être effectuées pour tous les puits contenant le
sédiment d’essai des deux microplaques.
NOTE Les boîtes de Petri contiennent les particules de sédiment restantes (de grande taille) et les ostracodes vivants
et morts qui peuvent désormais être facilement observés au stéréo-microscope.
S’il le désire, l’utilisateur peut aussi appliquer d’autres techniques pour récupérer les ostracodes.
9.7.4 Évaluation de la mortalité
Placer une par une toutes les boîtes de Petri contenant les ostracodes sur la platine du stéréo-microscope et
compter le nombre d’ostracodes vivants dans chaque boîte de Petri.
Sur le modèle de tableau de données 2 (Tableau 2), noter le nombre, n , d’ostracodes vivants comptés dans
A
chaque boîte de Petri, dans les cases appropriées de la ligne «Nombre d’ostracodes vivants».
Soustraire chaque nombre noté, n , de 10 (c’est-à-dire le nombre d’organismes d’essai introduits dans le puits
A
au départ) pour obtenir le nombre d’ostracodes morts, 10 – n , et noter ces nombres sur le modèle de tableau
A
de données 2, dans les cases de la ligne «Nombre d’ostracodes morts».
NOTE Les boîtes de Petri provenant des puits contenant le sédiment d’essai peuvent également contenir des
ostracodes «morts». Le nombre total d’ostracodes (c’est-à-dire morts plus vivants) peut être inférieur à 10. Cela peut
s’expliquer par le fait que, hormis des erreurs de manipulation pendant les transferts et les tamisages, les ostracodes
morts se décomposent très rapidement, ne laissant aucun résidu visible.
Procéder de la même manière avec toutes les boîtes de Petri contenant les organismes d’essai provenant des
11 autres puits et noter les résultats sur le modèle de tableau de données 2.
9.7.5 Détermination du pourcentage de mortalité
À l’aide des données de mortalité renseignées dans le modèle de tableau de données 2 pour chaque réplicat,
calculer le nombre moyen d’ostracodes morts pour les six réplicats du sédiment de contrôle et du sédiment
d’essai. Ensuite, calculer le pourcentage moyen de mortalité dans le sédiment de contrôle et dans le sédiment
d’essai. Consigner toutes ces informations dans le modèle de tableau de données 2.
Tableau 2 — Modèle de tableau de données 2: Mortalité
Sédiment de contrôle Sédiment d’essai
Réplicat
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Nombre d’ostracodes vivants, n
A
Nombre d’ostracodes morts, 10 – n
A
Nombre moyen d’ostracodes morts
pour tous les réplicats
Pourcentage moyen de mortalité
9.7.6 Mesurage de longueur
Les mesurage
...
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