ISO 20776-1:2019
(Main)Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases
Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases
This document describes one reference method, broth micro-dilution, for determination of MICs. The MIC can be a guide for the clinician, and reflects the activity of the drug under the described test conditions, by taking into account other factors, such as drug pharmacology, pharmacokinetics, or bacterial resistance mechanisms. This allows categorisation of bacteria as "susceptible" (S), "intermediate" (I), or "resistant" (R). In addition, MIC distributions can be used to define wild type or non-wild type bacterial populations. Although clinical interpretation of the MIC value is beyond the scope of this document, modifications of the basic method are required for certain antimicrobial agent - bacteria combinations to facilitate clinical interpretation. These modifications are included in a separate annex of this document. It is necessary to compare other susceptibility testing methods (e.g. disc diffusion or diagnostic test devices) with this reference method for validation, in order to ensure comparable and reliable results.
Sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des performances des dispositifs pour antibiogrammes — Partie 1: Méthode de référence de microdilution en bouillon pour la détermination de la sensibilité in vitro aux agents antimicrobiens des bactéries aérobies à croissance rapide impliquées dans les maladies infectieuses
Le présent document décrit une méthode de référence, la microdilution en bouillon, pour déterminer les CMI. La CMI peut constituer un guide pour le clinicien et reflète l'activité du médicament dans les conditions d'essai décrites, en tenant compte d'autres facteurs tels que la pharmacologie du médicament, la pharmacocinétique ou les mécanismes de résistance bactérienne. Cela permet de classer les bactéries comme étant «sensibles» (S), «intermédiaires» (I) ou «résistantes» (R). En outre, les distributions de CMI peuvent être utilisées pour définir les populations bactériennes de type sauvage ou non sauvage. Bien que l'interprétation clinique de la valeur de la CMI se trouve au-delà du domaine d'application du présent document, des modifications de la méthode de base sont nécessaires pour certaines combinaisons agent antimicrobien-bactérie afin de faciliter l'interprétation clinique. Ces modifications sont incluses dans une annexe séparée du présent document. Il est nécessaire de comparer les autres méthodes d'essai de sensibilité (par exemple, les méthodes de diffusion en gélose ou les dispositifs d'essai de diagnostic) à cette méthode de référence à des fins de validation et pour garantir des résultats comparables et fiables.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20776-1
Second edition
2019-06
Corrected version
2019-12
Susceptibility testing of infectious
agents and evaluation of performance
of antimicrobial susceptibility test
devices —
Part 1:
Broth micro-dilution reference
method for testing the in vitro activity
of antimicrobial agents against rapidly
growing aerobic bacteria involved in
infectious diseases
Sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des
performances des dispositifs pour antibiogrammes —
Partie 1: Méthode de référence de microdilution en bouillon pour la
détermination de la sensibilité in vitro aux agents antimicrobiens des
bactéries aérobies à croissance rapide impliquées dans les maladies
infectieuses
Reference number
ISO 20776-1:2019(E)
©
ISO 2019
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Test procedures . 3
4.1 General . 3
4.2 Medium . 3
4.3 Antimicrobial agents . 3
4.3.1 General. 3
4.3.2 Preparation of stock solutions . 3
4.3.3 Preparation of working solutions . 4
4.3.4 Preparation of micro-dilution trays . 4
4.3.5 Storage of micro-dilution trays . 4
4.4 Preparation of inoculum . 5
4.4.1 General. 5
4.4.2 Broth culture method . 5
4.4.3 Direct colony suspension method . 5
4.5 Inoculation of micro-dilution trays . 5
4.6 Incubation of micro-dilution trays . 6
4.7 Reading results . 6
4.8 Special test situations where the MIC result might give unreliable results. 6
5 Quality control . 6
Annex A (informative) Requirements for Mueller-Hinton broth . 8
Annex B (informative) Solvents and diluents for making stock solutions of selected
antimicrobial agents . .11
Annex C (informative) Preparation of working dilutions of antimicrobial agents for use in
broth dilution susceptibility tests .16
Annex D (informative) Special test situations .17
Bibliography .18
© ISO 2019 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 20776-1:2006), which has been
technically revised.
The main changes compared to the previous edition are as follows:
— revised to a broth micro-dilution only performance document;
— removal of S, I, R breakpoint definitions and information;
— moved embedded tables to annexes;
— removed quality control range table;
— updated table (now Annex B) on solvents and diluents for antimicrobial agents used globally;
— updated information on special culture media and method performance for specific currently used
antimicrobial agents.
A list of all parts in the ISO 20776 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
This corrected version of ISO 20776-1:2019 incorporates the following correction:
— Correction of the diluent pH value for ampicillin from 8,0 to 6,0 in Annex B.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
Introduction
In vitro antimicrobial susceptibility tests are performed on micro-organisms suspected of causing
disease, particularly if the organism is thought to belong to a species that may exhibit resistance
to frequently used antimicrobial agents. The tests are also important in resistance surveillance,
epidemiological studies of susceptibility and in comparisons of new and existing agents.
Dilution procedures are used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) of
antimicrobial agents for antimicrobial susceptibility testing. MIC methods are used in resistance
surveillance, defining identifying wild type phenotypes, comparative testing of new agents, to establish
the susceptibility of organisms that give equivocal results in routine tests, for tests on organisms where
routine tests may be unreliable and when a quantitative result is required for clinical management. In
dilution tests, micro-organisms are tested for their ability to produce visible growth in broth (broth
dilution) containing serial dilutions of the antimicrobial agent or on a series of agar plates (agar
dilution).
The lowest concentration of an antimicrobial agent (in mg/l) that, under defined in vitro conditions,
prevents the appearance of visible growth of a micro-organism within a defined period of time is known
as the MIC. The MIC is a guide for the clinician to the susceptibility of the organism to the antimicrobial
agent and aids treatment decisions. Careful control and standardization is required for intra- and inter-
laboratory reproducibility of broth MIC tests. The MICs generally span two to three doubling dilutions
with a dominant central value.
Broth dilution is a technique in which containers holding identical volumes of broth with antimicrobial
agent solutions in incrementally (usually geometrically) increasing concentrations are inoculated with
a known number of micro-organisms.
Broth micro-dilution denotes the performance of the broth dilution test in micro-dilution trays.
The method described in this document is intended for the testing of pure cultures of aerobic bacteria
that are easily grown by overnight incubation on agar and grow well in standardized micro-dilution
trays containing standardized Mueller-Hinton broth (volume of ≤200 µl), which may need to be
modified depending on the antimicrobial agent being tested.
The broth micro-dilution method described in this document is essentially the same as those used in
many countries, and as the methods published by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
[1] [2]
and the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) . These methods
[3]
are based on those described by Ericsson and Sherris .
© ISO 2019 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20776-1:2019(E)
Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of
performance of antimicrobial susceptibility test devices —
Part 1:
Broth micro-dilution reference method for testing the
in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly
growing aerobic bacteria involved in infectious diseases
WARNING — The use of this document may involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all of the safety problems associated
with its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety
and health practices and to determine the applicability of any other restrictions prior to use.
1 Scope
This document describes one reference method, broth micro-dilution, for determination of MICs.
The MIC can be a guide for the clinician, and reflects the activity of the drug under the described
test conditions, by taking into account other factors, such as drug pharmacology, pharmacokinetics,
or bacterial resistance mechanisms. This allows categorisation of bacteria as “susceptible” (S),
“intermediate” (I), or “resistant” (R). In addition, MIC distributions can be used to define wild type
or non-wild type bacterial populations. Although clinical interpretation of the MIC value is beyond
the scope of this document, modifications of the basic method are required for certain antimicrobial
agent - bacteria combinations to facilitate clinical interpretation. These modifications are included in a
separate annex of this document. It is necessary to compare other susceptibility testing methods (e.g.
disc diffusion or diagnostic test devices) with this reference method for validation, in order to ensure
comparable and reliable results.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
antimicrobial agent
substance of biological, semi-synthetic or synthetic origin that inhibits the growth of or kills bacteria,
and is thus of potential use in the treatment of infections
Note 1 to entry: Disinfectants, antiseptics and preservatives are not included in this definition.
© ISO 2019 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
3.2
potency
measure of drug activity expressed in terms of the amount required to produce an effect of given
intensity
Note 1 to entry: The potency is expressed as mass fraction in milligrams per gram (mg/g), or as activity content
in International Units (IU) per gram, or as a volume fraction or mass fraction in percent, or as an amount-of-
substance concentration (molar fraction) in mole per litre of ingredients in the test substance.
3.3
concentration
amount of an antimicrobial agent in a defined volume of liquid
Note 1 to entry: The concentration is expressed as mg/l.
Note 2 to entry: mg/l is the designated ISO unit.
3.4
stock solution
initial solution used for further dilutions
3.5
minimum inhibitory concentration
MIC
lowest concentration that, under defined in vitro conditions, prevents visible growth of bacteria within
a defined period of time
Note 1 to entry: The MIC is expressed in mg/l.
3.6
breakpoint
BP
specific values of parameters, such as MICs, on the basis of which bacteria can be assigned to the clinical
categories “susceptible”, “intermediate” and “resistant”
Note 1 to entry: For current interpretive breakpoints, reference can be made to the latest publications of
organisations employing this reference method (e.g. CLSI and EUCAST).
3.7
wild type
absence of known resistance mechanisms to the antimicrobial agent for a given strain
3.8
reference strain
catalogued, characterized bacteria with stable, defined antimicrobial susceptibility phenotypes and/or
genotypes
Note 1 to entry: Reference strains are kept as stock cultures, from which working cultures are derived. They are
obtainable from culture collections and used for quality control.
3.9
broth dilution
technique in which containers are filled with appropriate volumes of an antimicrobial solution,
employing incrementally (usually two-fold) increasing concentrations of the antimicrobial agent and
appropriate volumes of broth with a defined inoculum
Note 1 to entry: The aim of this method is the determination of the MIC.
3.10
micro-dilution
performance of broth dilution in micro-dilution trays with a final test volume of ≤200 µl per well
2 © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
3.11
broth
fluid medium used for the in vitro growth of bacteria
Note 1 to entry: For the broth reference method the medium is standardised Mueller-Hinton broth (see Annex A).
3.12
inoculum
number of bacteria in a suspension, calculated with respect to the final volume
Note 1 to entry: The inoculum is expressed as colony-forming units per millilitre (CFU/ml).
3.13
inoculum effect
change in MIC related to change in inoculum in CFU/ml
4 Test procedures
4.1 General
The tests are performed in polystyrene micro-dilution trays. The method is based on the preparation
of antimicrobial agent working solutions, either in 50 µl volumes per well (with the addition of an
inoculum also in a volume of 50 µl), or in a volume of 100 µl per well (with the addition of a maximum of
10 µl inoculum volume).
4.2 Medium
Mueller-Hinton broth shall be used (see Annex A for details and Annex D for special test situations).
4.3 Antimicrobial agents
4.3.1 General
Antimicrobial agents shall be obtained directly from the manufacturer or from reliable commercial
sources; pharmaceutical preparations for clinical use are not acceptable. The antimicrobial agents shall
be supplied as powders with a lot number, potency, an expiry date and details of recommended storage
conditions. Substances shall be stored in tightly closed containers in the dark, with a desiccant at the
recommended temperature of the supplier. Hygroscopic agents should be dispensed into aliquots, one
of which is used on each test occasion.
To avoid condensation, allow containers to warm to room temperature before opening.
4.3.2 Preparation of stock solutions
The use of a calibrated analytical balance is required to weigh antimicrobial agents. Allowance for
the potency of the powder shall be made by use of the following formula to obtain the amount of
antimicrobial agent substance or the volume of diluent needed for a standard solution:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
where
© ISO 2019 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
ρ is the concentration of the stock solution, in mg/l;
m is mass of the antimicrobial agent (powder), in g;
P is the potency of the antimicrobial agent (powder), in mg/g;
V is the volume of diluent, in l.
Concentrations of stock solutions should be 1 000 mg/l or greater, although the solubility of some agents
is a limiting factor. The actual concentrations of stock solutions depend on the method of preparing
working solutions (serial dilutions). Agents should be dissolved and diluted in sterile distilled water
unless the manufacturer states otherwise. Some agents require alternative solvents (see Annex B).
NOTE For newer antimicrobial agents not identified in Annex B of this current document, consult
manufacturer information on the most appropriate solvent and diluent for the specific agent. Sterilisation of
solutions is not usually necessary. If required, sterilisation should be done by membrane filtration, and samples
before and after sterilisation should be compared by assay to ensure that adsorption has not occurred.
Unless information is available on stability of stock solutions under specified storage conditions, they
should be prepared fresh for each test batch.
4.3.3 Preparation of working solutions
The range of concentrations selected for testing depends on the micro-organisms and antimicrobial
agent. The chosen range shall allow full endpoint MIC determination for appropriate reference strains.
A two-fold dilution series based on 1 mg/l is prepared in Mueller-Hinton broth. Dilutions should not be
prepared by serial dilution steps, but according to the procedure outlined in Annex C. Working solutions
shall be used the same day unless information is available on stability of the solutions under specified
storage conditions.
4.3.4 Preparation of micro-dilution trays
Working solutions are dispensed into micro-dilution trays at 50 µl per well with double the desired
final concentrations of antimicrobial agent, or at 100 µl per well in the desired final concentrations.
At least one well, containing 50 µl or 100 µl of antimicrobial agent-free medium, should be included
as a growth control for each strain tested. Likewise, a well containing 100 µl of antimicrobial agent-
free medium should be included as an un-inoculated negative control well for each micro-organism
type tested.
4.3.5 Storage of micro-dilution trays
Filled trays may be used immediately or may be stored for up to three months or until documented
quality control or other evidence indicates degradation of the antimicrobial agent. For storage the
filled trays should be sealed in plastic bags and immediately placed in a freezer at ≤−60 °C unless the
antimicrobial agents are known to be stable at higher temperatures.
Trays shall not be stored in a self-defrosting freezer, and thawed antimicrobial solutions shall not be
re-frozen, as repeated freeze-thaw cycles accelerate the degradation of some antimicrobial agents,
particularly β-lactams.
Allow frozen plates to thaw for up to 2 h and inoculate by 4 h of removal from the freezer.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
4.4 Preparation of inoculum
4.4.1 General
Standardization of the inoculum is essential for accurate and reproducible broth micro-dilution
susceptibility tests. Therefore, purity checks and viable colony counts shall be performed on every
isolate tested with this reference procedure
4.4.2 Broth culture method
The inoculum may be prepared by diluting a broth culture or by suspending several morphologically
similar colonies (when possible) from an overnight culture on non-selective agar medium in broth with
a sterile loop or swab. When suspending colonies, morphologically similar colonies should be picked to
avoid contamination of other species or atypical variants of the same species.
The broth used shall not be antagonistic to the antimicrobial agent tested. The broth is incubated
at (35 ± 1) °C until the growth reaches a turbidity equal to or greater than that of a 0,5 McFarland
[4]
standard . If needed, the culture is adjusted with saline or broth to give a turbidity equivalent to the
0,5 McFarland standard. This can be done by means of a photometric device (using 625 nm wavelength
and a 1 cm path cuvette, the absorbance will be in the range of 0,08 to 0,13), or by employing a suitably
calibrated nephelometer. Alternatively, this can be achieved visually by comparing the appearance of
black lines through the inoculum and 0,5 McFarland standard suspensions (the inoculum and McFarland
standard shall be in tubes of the same size) or any other method that gives reproducible CFU/ml. The
5 5 5
final inoculum shall be 5 × 10 CFU/ml (target range, 2 × 10 CFU/ml to 8 × 10 CFU/ml).
NOTE A 0,5 McFarland standard can be produced by adding a 0,5 ml aliquot of 0,048 mol/l barium chloride
(BaCl ) (11,72 g/l BaCl ⋅2H O) to 99,5 ml of 0,18 mol/l sulphuric acid (H SO ), with constant stirring to maintain
2 2 2 2 4
a suspension.
4.4.3 Direct colony suspension method
Several morphologically similar colonies from a non-selective nutritive agar medium, incubated at
35 ± 1 °C for 18 h to 24 h, unless longer incubation is required, are touched with a sterile loop and the
growth transferred to sterile broth or saline. The suspension is adjusted to give a turbidity equivalent
to that of a 0,5 McFarland standard, as described in 4.4.2 for the broth culture method.
For all micro-organisms, the number of viable cells (in CFU/ml) in the final inoculum depends on
the growth phase of the culture. This effect is most pronounced for fastidious organisms such as
Streptococcus pneumoniae, where use of older cultures can significantly reduce the number of viable
cells in the suspension.
8
A correctly adjusted suspension prepared by either method contains approximately 1 × 10 CFU/ml to
8
2 × 10 CFU/ml for the common relevant bacteria.
5
The adjusted inoculum prepared as above is diluted in broth to give a final cell number of 5 × 10 CFU/
5 5
ml (target range 2 × 10 CFU/ml to 8 × 10 CFU/ml). The dilution required depends upon the bacterial
species being tested and the method used for inoculum delivery. Transfer of 0,1 ml of standardized
micro-organism suspension to a tube containing 9,9 ml (1:100 dilution) of broth results in a suspension
6
of 1 × 10 CFU/ml which, when 50 µl is added to an equal volume (50 µl) of antimicrobial agent solution,
5
results in a final inoculum of 5 × 10 CFU/ml with many Gram-negative bacteria (e.g. Escherichia coli).
If the wells already contain 100 µl of antimicrobial agents in broth, an appropriate dilution to give the
required final inoculum should be prepared prior to addition of up to 10 µl of the diluted suspension
to each well. Different dilutions of the 0,5 McFarland suspension may be necessary, as determined by
[5]
colony counts in preliminary tests .
4.5 Inoculation of micro-dilution trays
The trays shall be inoculated within 30 min of standardizing the inoculum suspension, in order to
maintain viable cell number in CFU/ml. To each well containing 50 µl of diluted antimicrobial agent in
© ISO 2019 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20776-1:2019(E)
broth (see 4.3), a volume of 50 µl of bacterial suspension (see 4.4) is added. For tray wells that contain
100 µl of diluted antimicrobial agent in broth, up to 10 µl of diluted inoculum suspension should be added.
5
Viable counts shall be performed on the test suspension to ensure that test wells contain ~ 5 × 10 CFU/
ml. This shall be done by removing 10 µl from the growth control well immediately after inoculation
and diluting it in 10 ml of broth or saline. 100 µl of this dilution is spread over the surface of a suitable
agar plate, which is then incubated overnight (12 h to18 h). Twenty to eighty colonies would be expected
from an acceptable test suspension. If this is not achieved, corrective action should be taken to ensure
proper inoculum preparation.
4.6 Incubation of micro-dilution trays
Micro-dilution trays should be sealed in polyethylene bags or fitted with a tight lid or adhesive seal
before incubation, in order to prevent desiccation. To avoid uneven heating, micro-dilution trays should
not be stacked more than four high, and a single tight lid should be placed on top of the stack of test trays.
Unless otherwise specified, micro-dilution trays are incubated at (35 ± 1) °C in ambient air for (18 ± 2) h
for most antimicrobial agent-bacteria combinations. A CO -enriched atmosphere should not be used.
2
4.7 Reading results
Results shall only be read when there is sufficient growth of the test organism (i.e. obvious button
or definite turbidity in the positive growth control), when there is no growth in the un-inoculated
or negative growth control (where present) and when purity and the appropriate cell number
concentration of the inoculum has been established. The amount of growth in each well is compared
with that in the positive growth control, and the MIC recorded is the lowest concentration of the
agent that completely inhibits visible growth. There are exceptions to this (e.g., trailing endpoints for
linezolid, partial inhibition by sulphonamides, incomplete inhibition with some bacteriostatic agents)
that will require special attention by the user.
4.8 Special test situations where the MIC result might give unreliable results
In some cases, the MIC value may not reflect relevant activity. Therefore, the interpretations of
test results with some antimicrobial agents may need to be modified for clinical application. In
those si
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20776-1
Deuxième édition
2019-06
Version corrigée
2019-12
Sensibilité in vitro des agents
infectieux et évaluation des
performances des dispositifs pour
antibiogrammes —
Partie 1:
Méthode de référence de
microdilution en bouillon pour la
détermination de la sensibilité in
vitro aux agents antimicrobiens
des bactéries aérobies à croissance
rapide impliquées dans les maladies
infectieuses
Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of
performance of antimicrobial susceptibility test devices —
Part 1: Broth micro-dilution reference method for testing the in vitro
activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic
bacteria involved in infectious diseases
Numéro de référence
ISO 20776-1:2019(F)
©
ISO 2019
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Modes opératoires d’essai . 3
4.1 Généralités . 3
4.2 Milieu . 3
4.3 Agents antimicrobiens. 3
4.3.1 Généralités . 3
4.3.2 Préparation des solutions mères . 4
4.3.3 Préparation des solutions de travail . 4
4.3.4 Préparation de plaques de microdilution. 4
4.3.5 Stockage des plaques de microdilution . 5
4.4 Préparation de l’inoculum . 5
4.4.1 Généralités . 5
4.4.2 Méthode de culture en bouillon . 5
4.4.3 Méthode de mise en suspension directe des colonies . 5
4.5 Ensemencement des plaques de microdilution . 6
4.6 Incubation des plaques de microdilution . 6
4.7 Résultats des lectures. 6
4.8 Situations particulières pour lesquelles le résultat de la CMI peut donner des
résultats peu fiables . 7
5 Contrôle de qualité . 7
Annexe A (informative) Exigences relatives au bouillon Mueller-Hinton. 8
Annexe B (informative) Solvants et diluants pour la réalisation des solutions mères des
agents antimicrobiens sélectionnés.11
Annexe C (informative) Préparation de dilutions de travail des agents antimicrobiens à
utiliser lors des essais de sensibilité de dilution en bouillon .17
Annexe D (informative) Cas d’essai particuliers .18
Bibliographie .19
© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d'analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 20776-1:2006), qui a fait l’objet
d’une révision technique.
Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— révision en un document concernant uniquement les performances de microdilution en bouillon;
— suppression des informations et définitions relatives à la concentration critique S, I, R;
— déplacement des tableaux intégrés vers les annexes;
— suppression du tableau des plages de contrôle de qualité;
— mise à jour du tableau (désormais Annexe B) relatif aux solvants et diluants généralement utilisés
pour les agents antimicrobiens;
— mise à jour des informations sur les milieux de culture spécifiques et les performances de la méthode
pour les agents antimicrobiens spécifiques actuellement utilisés.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20776 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
La présente version corrigée de l'ISO 20776:2019 inclut la correction suivante:
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
— Correction de la valeur du pH du diluant pour l'ampicilline de 8,0 à 6,0 dans l'Annexe B.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
Introduction
Les essais de sensibilité in vitro aux antimicrobiens sont réalisés sur des micro-organismes suspectés
de provoquer une maladie, en particulier si le micro-organisme est connu pour appartenir à une espèce
qui peut montrer une résistance aux agents antimicrobiens fréquemment employés. Les essais sont
également importants pour la surveillance de la résistance, pour les études épidémiologiques de la
sensibilité et pour comparer les nouveaux agents antimicrobiens à ceux déjà existants.
Les méthodes de dilution sont employées pour déterminer les concentrations minimales
inhibitrices (CMI) des agents antimicrobiens pour les essais de sensibilité antimicrobienne. Les
méthodes de détermination des CMI sont employées dans la surveillance de la résistance, pour la
définition et l’identification des phénotypes de type sauvage, pour comparer l’activité des nouveaux
agents antimicrobiens, ainsi que pour établir la sensibilité des micro-organismes aux résultats
équivoques avec les essais de routine, pour les micro-organismes dont les essais de routine peuvent
ne pas être fiables et lorsqu’un résultat quantitatif est nécessaire à la décision clinique. Dans les essais
de dilution, les micro-organismes sont soumis à essai afin de déterminer leur capacité à produire une
croissance visible dans un bouillon (dilution en bouillon) ou sur des boîtes gélosées (dilution en gélose)
contenant des dilutions en série de l’agent antimicrobien.
La concentration la plus faible d’un agent antimicrobien (en mg/l) qui, dans des conditions in vitro
définies, empêche l’apparition d’une croissance visible d’un micro-organisme au cours d’une période
définie, est connue sous le nom de CMI. Pour le clinicien, la CMI constitue une indication sur la sensibilité
de l’organisme à l’agent antimicrobien et facilite les décisions de traitement. Un contrôle strict de la
méthode et une normalisation sont nécessaires à la reproductibilité intralaboratoire et interlaboratoires
des essais de CMI en bouillon. Les CMI s’étendent généralement sur deux ou trois dilutions avec une
valeur centrale dominante.
La dilution en bouillon est une technique dans laquelle des contenants comportant des volumes
identiques de bouillon avec des solutions d’agent antimicrobien à des concentrations augmentant de
manière incrémentielle (généralement de manière géométrique) sont ensemencés avec un nombre
connu de micro-organismes.
La microdilution en bouillon indique un essai par dilution en bouillon sur des plaques de microdilution.
La méthode décrite dans le présent document est conçue pour soumettre à essai des cultures pures
de bactéries aérobies qui sont facilement cultivables en les incubant pendant une nuit sur une gélose
et qui se cultivent bien dans des plaques normalisées de microdilution contenant du bouillon Mueller-
Hinton normalisé (volume ≤ 200 µl), ce qui peut nécessiter des modifications en fonction de l’agent
antimicrobien soumis à essai.
La méthode de microdilution en bouillon décrite dans le présent document est essentiellement la
même que celles utilisées dans de nombreux pays, ainsi que les méthodes publiées par le Clinical and
[1]
Laboratory Standards Institute (CLSI) et par l’European Committee on Antimicrobial Susceptibility
[2] [3]
Testing (EUCAST). Ces méthodes s’appuient sur la méthode décrite par Ericsson et Sherris .
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 20776-1:2019(F)
Sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des
performances des dispositifs pour antibiogrammes —
Partie 1:
Méthode de référence de microdilution en bouillon pour
la détermination de la sensibilité in vitro aux agents
antimicrobiens des bactéries aérobies à croissance rapide
impliquées dans les maladies infectieuses
AVERTISSEMENT — L’utilisation du présent document peut impliquer des matériaux, des
opérations et des équipements dangereux. Le présent document n’est pas destiné à traiter tous
les problèmes de sécurité associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur du
présent document d’établir les pratiques de santé et de sécurité appropriées et de déterminer
l’applicabilité de toute autre restriction avant utilisation.
1 Domaine d’application
Le présent document décrit une méthode de référence, la microdilution en bouillon, pour déterminer
les CMI. La CMI peut constituer un guide pour le clinicien et reflète l’activité du médicament dans
les conditions d’essai décrites, en tenant compte d’autres facteurs tels que la pharmacologie du
médicament, la pharmacocinétique ou les mécanismes de résistance bactérienne. Cela permet de
classer les bactéries comme étant «sensibles» (S), «intermédiaires» (I) ou «résistantes» (R). En outre,
les distributions de CMI peuvent être utilisées pour définir les populations bactériennes de type
sauvage ou non sauvage. Bien que l’interprétation clinique de la valeur de la CMI se trouve au-delà du
domaine d’application du présent document, des modifications de la méthode de base sont nécessaires
pour certaines combinaisons agent antimicrobien-bactérie afin de faciliter l’interprétation clinique.
Ces modifications sont incluses dans une annexe séparée du présent document. Il est nécessaire de
comparer les autres méthodes d’essai de sensibilité (par exemple, les méthodes de diffusion en gélose
ou les dispositifs d’essai de diagnostic) à cette méthode de référence à des fins de validation et pour
garantir des résultats comparables et fiables.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
© ISO 2019 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
3.1
agent antimicrobien
substance d’origine biologique, semi-synthétique ou synthétique qui inhibe la croissance d’une bactérie
ou l’élimine et qui est, par conséquent, potentiellement utilisée dans le traitement des infections
Note 1 à l'article: Les désinfectants, les antiseptiques et les conservateurs ne sont pas inclus dans cette définition.
3.2
titre
mesure de l’activité d’un médicament, exprimée en termes de quantité requise pour produire un effet
d’une intensité donnée
Note 1 à l'article: Le titre est exprimé sous forme de fraction massique en milligrammes par gramme (mg/g),
sous forme d’activité en unités internationales (UI) par gramme ou sous forme de fraction volumique ou de
fraction massique en pourcentage ou en concentration de quantité de substance (fraction molaire) en mole par
litre d’ingrédients dans la substance d’essai.
3.3
concentration
quantité d’un agent antimicrobien dans un volume défini de liquide
Note 1 à l'article: La concentration est exprimée en mg/l.
Note 2 à l'article: Le mg/l est l’unité utilisée par le système ISO.
3.4
solution mère
solution initiale utilisée pour des dilutions ultérieures
3.5
concentration minimale inhibitrice
CMI
concentration la plus faible qui, dans des conditions in vitro définies, empêche la croissance visible de
bactéries en une période de temps définie
Note 1 à l'article: La CMI est exprimée en mg/l.
3.6
concentration critique
CC
valeurs spécifiques de paramètres, tels que les CMI, sur la base desquelles une bactérie peut être
affectée aux catégories cliniques «sensible», «intermédiaire» et «résistante»
Note 1 à l'article: Pour les concentrations critiques interprétatives actuelles, se référer aux dernières publications
des organisations employant cette méthode de référence (par exemple, le CLSI et l’EUCAST).
3.7
souche sauvage
absence de mécanisme de résistance connu vis-à-vis de l’agent antimicrobien pour une souche donnée
3.8
souche de référence
bactérie répertoriée, caractérisée avec des phénotypes et/ou des génotypes de sensibilité
antimicrobienne stables et définis
Note 1 à l'article: Les souches de référence sont conservées comme des cultures mères dont les cultures de travail
sont issues. Elles peuvent être obtenues à partir de collections de culture et utilisées pour le contrôle de la qualité.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
3.9
dilution en bouillon
technique dans laquelle les contenants sont remplis avec des volumes appropriés d’une solution d’agent
antimicrobien, dont la concentration augmente de façon incrémentielle (en général de raison 2), et des
volumes appropriés de bouillon avec un inoculum bien défini
Note 1 à l'article: L’objectif de cette méthode est de déterminer la CMI.
3.10
microdilution
réalisation de la dilution en bouillon dans des plaques de microdilution ayant un volume d’essai
final ≤ 200 µl par cupule
3.11
bouillon
milieu liquide utilisé pour la croissance in vitro de bactéries
Note 1 à l'article: Pour la méthode de référence en bouillon, le milieu est un bouillon Mueller-Hinton normalisé
(voir l’Annexe A).
3.12
inoculum
nombre de bactéries dans une suspension, calculé par rapport au volume final
Note 1 à l'article: L’inoculum est exprimé en unités formant colonie par millilitre (UFC/ml).
3.13
effet de l’inoculum
modification de la CMI liée à une modification de l’inoculum en UFC/ml
4 Modes opératoires d’essai
4.1 Généralités
Les essais sont réalisés dans des plaques de microdilution en polystyrène. La méthode est basée sur la
préparation de solutions de travail d’agent antimicrobien dans des volumes de 50 µl (avec l’ajout d’un
inoculum également dans un volume de 50 µl) ou dans un volume de 100 µl (avec l’ajout d’un maximum
de 10 µl de volume d’inoculum) par cupule.
4.2 Milieu
Le bouillon Mueller-Hinton doit être utilisé (voir l’Annexe A pour plus de détails et l’Annexe D pour les
cas d’essai particuliers).
4.3 Agents antimicrobiens
4.3.1 Généralités
Les agents antimicrobiens doivent être obtenus directement du fabricant ou de sources commerciales
fiables; les préparations pharmaceutiques à usage clinique ne sont pas acceptables. Les agents
antimicrobiens doivent être fournis sous forme de poudres avec un numéro de lot, un titre, une date
de péremption et des détails concernant les conditions de stockage recommandées. Les substances
doivent être conservées dans des contenants hermétiquement fermés, dans l’obscurité, à la température
recommandée par le fournisseur avec un dessiccant. Il convient de répartir les agents hygroscopiques
en aliquots, dont un est utilisé pour chaque essai.
Pour éviter toute condensation, il convient de réchauffer les contenants à température ambiante avant
de les ouvrir.
© ISO 2019 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
4.3.2 Préparation des solutions mères
L’utilisation d’une balance analytique étalonnée est nécessaire pour peser les agents antimicrobiens.
Il doit être tenu compte du titre de la poudre en utilisant la formule suivante pour obtenir la quantité de
substance d’agent antimicrobien ou le volume de diluant nécessaire pour une solution normalisée:
V×ρ
m= (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
où
ρ est la concentration de la solution mère, en mg/l;
m est la masse de l’agent antimicrobien (poudre), en g;
P est le titre de l’agent antimicrobien (poudre), en mg/g;
V est le volume de diluant, en l.
Il convient que les concentrations de solutions mères soient de 1 000 mg/l ou plus, même si la solubilité
de certains agents est limitée. Les concentrations réelles de solutions mères dépendront de la méthode
de préparation des solutions de travail (dilution en série). Il convient de dissoudre et de diluer les
agents dans de l’eau distillée stérile, sauf indication contraire du fabricant. Certains agents nécessitent
d’autres solvants (voir l’Annexe B).
NOTE Pour les nouveaux agents antimicrobiens non identifiés dans l’Annexe B du présent document,
consulter les informations du fabricant concernant le solvant et le diluant les plus appropriés pour cet agent
spécifique. La stérilisation des solutions n’est généralement pas nécessaire. Si nécessaire, il convient d’effectuer
la stérilisation par filtration membranaire et de comparer les échantillons avant et après la stérilisation par une
analyse afin de s’assurer qu’aucune adsorption ne s’est produite.
À moins que des informations sur la stabilité des solutions mères dans des conditions de stockage
spécifiées ne soient disponibles, il convient de les préparer au dernier moment pour chaque lot d’essai.
4.3.3 Préparation des solutions de travail
La plage de concentrations sélectionnée pour les essais dépend des micro-organismes et de l’agent
antimicrobien. La plage choisie doit permettre de déterminer l’ensemble des CMI possibles des
souches de référence appropriées. Une série de dilutions de raison 2 basée sur 1 mg/l est préparée en
bouillon Mueller-Hinton. Il convient de ne pas préparer les dilutions par étapes de dilutions en série,
mais de les préparer conformément au mode opératoire indiqué dans l’Annexe C. Les solutions de
travail doivent être utilisées le même jour, à moins que des informations sur la stabilité des solutions
dans des conditions de stockage spécifiées soient disponibles.
4.3.4 Préparation de plaques de microdilution
Les solutions de travail sont distribuées dans des plaques de microdilution à 50 µl/cupule avec le double
des concentrations finales souhaitées de l’agent antimicrobien ou à 100 µl par cupule aux concentrations
finales souhaitées.
Il convient d’inclure au moins une cupule, contenant 50 µl ou 100 µl de milieu dépourvu d’agent
antimicrobien pour servir de témoin de croissance pour chaque souche soumise à essai. De la même
manière, il convient d’inclure une cupule contenant 100 µl de milieu dépourvu d’agent antimicrobien
comme cupule témoin négative non ensemencée pour chaque type de micro-organisme soumis à essai.
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
4.3.5 Stockage des plaques de microdilution
Les plaques remplies peuvent être utilisées immédiatement ou être stockées jusqu’à une durée
maximale de trois mois, ou jusqu’à ce que le contrôle de qualité documenté ou toute autre preuve
indique la dégradation de l’agent antimicrobien. Pour le stockage, il convient que les plaques remplies
soient enfermées dans des sacs en plastique et immédiatement placées dans un congélateur à ≤ −60 °C,
sauf si les agents antimicrobiens sont reconnus comme stables à des températures plus élevées.
Les plaques ne doivent pas être stockées dans un congélateur autodégivrant et les solutions
antimicrobiennes décongelées ne doivent pas être recongelées, car des cycles de congelation-
décongélation répétés accélèrent la dégradation de certains agents antimicrobiens, en particulier
les β-lactamines.
Laisser les plaques congelées décongeler pendant 2 h au maximum et les inoculer au plus tard 4 h après
leur retrait du congélateur.
4.4 Préparation de l’inoculum
4.4.1 Généralités
La normalisation de l’inoculum est essentielle pour garantir la reproductibilité et l’exactitude des essais
de sensibilité par la méthode de microdilution en bouillon. En conséquence, des vérifications de pureté
et des dénombrements de colonies viables doivent être effectués sur chaque isolat soumis à essai avec
ce mode opératoire de référence.
4.4.2 Méthode de culture en bouillon
L’inoculum peut être préparé en diluant une culture en bouillon ou en mettant en suspension en bouillon
plusieurs colonies à la morphologie similaire (si possible) issues d’une culture après une nuit sur un
milieu gélosé non sélectif à l’aide d’une anse stérile ou d’un écouvillon. Lors de la mise en suspension de
colonies, il convient de choisir des colonies à la morphologie similaire pour éviter toute contamination
d’autres espèces ou l’apparition de variants atypiques de la même espèce.
Le bouillon utilisé ne doit pas être antagoniste vis-à-vis de l’agent antimicrobien soumis à essai. Le
bouillon est incubé à (35 ±1) °C jusqu’à ce que la croissance atteigne une turbidité supérieure ou égale
[4]
à celle de l’étalon McFarland 0,5. Si nécessaire, la culture est ajustée avec une solution saline ou un
bouillon afin d’obtenir une turbidité équivalente à l’étalon McFarland 0,5. Cela peut être effectué en
utilisant un dispositif photométrique (en utilisant une longueur d’onde de 625 nm et une trajectoire
de cuvette de 1 cm, l’absorbance sera comprise entre 0,08 et 0,13) ou en employant un néphélomètre
étalonné de manière adéquate. En variante, cela peut être atteint visuellement en comparant l’aspect
de lignes noires à travers l’inoculum et à travers une suspension à l’étalon McFarland 0,5 (l’inoculum
et l’étalon McFarland doivent se trouver dans des tubes de la même taille) ou avec toute autre méthode
5
qui donne des UFC/ml reproductibles. L’inoculum final doit être de 5 x 10 UFC/ml (plage cible
5 5
de 2 x 10 UFC/ml à 8 x 10 UFC/ml).
NOTE Un étalon McFarland 0,5 peut être produit en ajoutant une partie aliquote de 0,5 ml de chlorure de
baryum (BaCl ) à 0 048 mol/l (11,72 g/l de BaCl 2H O) à 99,5 ml d’acide sulfurique (H SO ) à 0,18 mol/l avec
2 2 2 2 4
une agitation constante pour maintenir une suspension.
4.4.3 Méthode de mise en suspension directe des colonies
Plusieurs colonies à la morphologie similaire sont prélevées à l’aide d’une anse stérile d’un milieu
nutritif gélosé non sélectif incubé à (35 ± 1) °C pendant 18 h à 24 h, sauf si une incubation plus longue
est nécessaire, et transférées dans le bouillon stérile ou dans une solution saline. La suspension est
ajustée pour donner une turbidité équivalente à celle d’un étalon McFarland 0,5, tel que décrit en 4.4.2
pour la méthode de culture en bouillon.
Pour tous les micro-organismes, le nombre de cellules viables (en UFC/ml) dans l’inoculum final dépend
de la phase de croissance de la culture. Cet effet est plus prononcé pour les micro-organismes exigeants,
© ISO 2019 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 20776-1:2019(F)
tels que Streptococcus pneumoniae, pour lesquels l’utilisation de cultures plus anciennes peut réduire de
manière significative le nombre de cellules viables dans la suspension.
Quelle que soit la méthode de préparation utilisée, une suspension corr
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.