Foodstuffs -- Molecular biomarker analysis -- Immunochemical methods for the detection and quantification of proteins

This document specifies performance criteria for immunochemical methods for the detection and/or quantification of a specific protein or protein(s) of interest [POI(s)] in a specified matrix. The methods discussed are applicable to the analysis of proteins from a variety of sample types. Some uses for these methods include, but are not limited to, analysing proteins involved in crop and food production, food processing, food marketing, food safety, biotechnology or disease indexing.

Produits alimentaires— Analyse des biomarqueurs moléculaires -- Méthodes immunochimiques pour la détection et la quantification des protéines

Le présent document énonce des critčres de performances pour les méthodes immunochimiques de détection et/ou de quantification d'une protéine spécifique ou de protéine(s) d'intéręt (POI) dans une matrice donnée. Les méthodes décrites sont applicables ŕ l'analyse de protéines provenant de divers types d'échantillons. Certaines utilisations de ces méthodes comprennent, entre autres, l'analyse des protéines impliquées dans la production végétale et agroalimentaire, la transformation des aliments, la commercialisation des produits alimentaires, la sécurité des aliments, les biotechnologies ou l'indexation des maladies.

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Status
Published
Publication Date
09-Oct-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
30-Aug-2019
Completion Date
10-Oct-2019
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ISO 21572:2019 - Foodstuffs -- Molecular biomarker analysis -- Immunochemical methods for the detection and quantification of proteins
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ISO 21572:2019 - Produits alimentaires— Analyse des biomarqueurs moléculaires -- Méthodes immunochimiques pour la détection et la quantification des protéines
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21572
Third edition
2019-10
Foodstuffs — Molecular biomarker
analysis — Immunochemical methods
for the detection and quantification of
proteins
Produits alimentaire — Analyse des biomarqueurs moléculaires —
Méthodes immunochimiques pour la détection et la quantification des
protéines
Reference number
ISO 21572:2019(E)
ISO 2019
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ISO 21572:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019

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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

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Fax: +41 22 749 09 47
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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ISO 21572:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Laboratory equipment ................................................................................................................................................................................... 2

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 2

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 2

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

8.2 Preparation of sample solution ................................................................................................................................................ 2

8.3 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 3

8.4 Preparation of calibration curves, positive controls, and reference materials ................................ 3

8.5 Assay procedure .................................................................................................................................................................................... 3

9 Interpretation and expression of results .................................................................................................................................... 3

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 3

9.2 Quantitative and semi-quantitative analysis ................................................................................................................. 4

9.3 Qualitative analysis ............................................................................................................................................................................. 4

10 Specific parameters that can influence results ..................................................................................................................... 4

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

10.2 Special considerations ...................................................................................................................................................................... 5

10.2.1 Selectivity ............................................................................................................................................................................... 5

10.2.2 Extraction efficiency ..................................................................................................................................................... 5

10.2.3 Matrix effects....................................................................................................................................................................... 5

10.2.4 Assay applicability .......................................................................................................................................................... 5

10.2.5 Hook effect ............................................................................................................................................................................ 5

10.2.6 Parallelism/linearity .................................................................................................................................................... 5

10.2.7 Limits of detection .......................................................................................................................................................... 6

10.2.8 Limits of quantification .............................................................................................................................................. 6

11 Confirming method ............................................................................................................................................................................................ 6

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 6

Annex A (informative) Detection of a protein by ELISA .................................................................................................................... 8

Annex B (informative) Detection of a protein or proteins by lateral flow devices ............................................19

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................26

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 21572:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 21572:2013), which has been technically

revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:

— the title has been changed to specify that the document is focused on immunochemical protein

detection methods;
— an introduction has been added;
— terms, definitions and references have been updated;

— the text has been modified to improve the document’s applicability to general protein analysis

applications.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21572:2019(E)
Introduction

Analytical techniques based on highly specific immunochemical-binding interactions have become

key tools for analysing many different chemical and macromolecular analytes, including proteins.

Methods utilizing these techniques are widely accepted in the scientific and regulatory communities.

Immunochemical assay methods are most commonly used to detect (presence or absence) and/

or quantify specific protein analytes such as allergenic proteins, disease marker proteins or newly

expressed proteins in biotech crops.

Prior to analysis, samples generally need to be ground or processed in a manner that facilitates

extraction of the analyte from the sample matrix. An important step in analytical method development

is therefore the selection of a suitable extraction buffer that does not interfere with the analytical

method performance and that ensures an appropriate level of analyte stability during the analytical

process.
The immunochemical assay process generally incorporates at least two steps:

— binding or capturing the analyte of interest present in samples with an antibody targeted specifically

to the analyte;

— detection of the antibody-analyte complex using a technique that signals the specific interaction.

Once an analytical method has been developed and optimized, it should be validated to demonstrate

that its performance is reliable and suitable for the intended use and to characterize the method

limitations. This involves performing several experiments with real samples to evaluate parameters

such as accuracy, precision, sensitivity, selectivity and the detection or quantification limits. Validation

also allows for the establishment of method performance criteria, against which routine analytical

performance can be compared to ensure that acceptable analytical results are consistently reported.

This document provides a set of general procedures and analytical considerations for using

immunochemical techniques to analyse target proteins. It discusses aspects of sample processing,

extraction, assay set-up, interpretation and reporting of results, and relevant assay performance

parameters. Two annexes are included containing example procedures that can be followed when

analysing a protein of interest (POI) in a variety of background matrices using methods based on

enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and lateral flow devices (LFDs).
© ISO 2019 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21572:2019(E)
Foodstuffs — Molecular biomarker analysis —
Immunochemical methods for the detection and
quantification of proteins
1 Scope

This document specifies performance criteria for immunochemical methods for the detection and/or

quantification of a specific protein or protein(s) of interest [POI(s)] in a specified matrix.

The methods discussed are applicable to the analysis of proteins from a variety of sample types. Some

uses for these methods include, but are not limited to, analysing proteins involved in crop and food

production, food processing, food marketing, food safety, biotechnology or disease indexing.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
conjugate

material produced by attaching two or more substances together by covalent bond via chemical groups

Note 1 to entry: Conjugates of antibodies with fluorochromes (e.g. chemical entity, such as a molecule or group,

that emits light in response to excitation by absorbed incident light), radiolabelled substances, gold or enzymes

are often used in immunoassays.
4 Principle

The target protein is extracted according to the procedure described for that specific matrix, and

a specific antibody is used to detect or measure the concentration of the POI in the sample. For the

detection of specific proteins in ingredients, the basic principle of a protein-based method is to:

— take a representative sample of the matrix;
— extract the proteins;

— detect and/or quantify the specific protein derived from the matrix under study.

© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 21572:2019(E)
5 Reagents

During the analysis, use only reagents of recognized analytical grade and only de-ionized or distilled

water or water that has been purified, or equivalent unless indicated otherwise by the manufacturer of

the reagents or the kit.

Other reagents, such as antibodies, conjugates, substrates, stop solutions and buffer components are

method specific. Refer to the method for specifics regarding reagents such as protein standards or

reference materials, antibodies or pre-coated solid surfaces, controls, and samples.

Reagents are specified in A.4.2, A.4.3, B.4.2 and B.4.3.
6 Laboratory equipment
Laboratory equipment is specified in A.5 and B.5.
7 Sampling

Sampling is not part of the method specified in this document, though Annex A and Annex B do provide

sampling instructions as per the relevant methods. It is recommended that the parties concerned come

to an agreement on this subject.
8 Procedure
8.1 General

Storage conditions and the shelf-life of LFDs, antibodies, conjugate, substrate, etc. shall be clearly

specified by the provider.

Use appropriate laboratory equipment with low protein binding capacity (e.g. polypropylene tubes) to

prevent protein adsorption during the whole procedure.

For the use of this document, general requirements of quality assurance for laboratories shall be

observed (e.g. concerning calibration of apparatus, double determination, blanks, use of reference

materials, preparation of calibration curves) Carefully clean all equipment coming into direct contact

with the sample to prevent contamination. See ISO/IEC 17025 for more information.

8.2 Preparation of sample solution

Once a representative sample is obtained, prepare the sample solution. Sample preparation procedures

are described in Annexes A and B.

Grind samples as specified in the method before test portions are taken, if necessary. Powders/flour can

have swelling properties and could require more extraction solution if a manufacturer’s method does

not specify this information. If the sample is not immediately used, follow the laboratory’s procedure

for storage (e.g. −20 °C or below).

Weigh an appropriate amount of a representative test sample (as specified in A.6.6.1 and B.6.2.1) for

analysis to create a test portion for extraction. Add extraction solution and homogenize or mix.

Laboratory samples containing high amounts of fat can be non-homogeneous and a larger test portion

should be extracted to ensure that it is representative. If applicable, instructions can be found in the

sample preparation sections of Annexes A and B.
2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21572:2019(E)
8.3 Extraction

Use an extraction procedure suitable for the matrix. Details of appropriate conditions for the extraction/

dilution of the test portions, controls and reference materials are provided in Annex A for ELISA and

Annex B for LFDs. Care should be taken to use extraction procedures validated for the matrix. Extracted

samples should be immediately used or treated as specified in the procedure for storage.

8.4 Preparation of calibration curves, positive controls, and reference materials

For the preparation of calibration curves, positive controls and reference materials for Annex A, it

is recommended to use matrix-matched reference materials or reference materials that have been

validated for the matrix. Calibration curves are not required for qualitative application such as LFDs.

However, positive and negative controls can be prepared at the discretion of the analyst.

8.5 Assay procedure

For a quantitative test, select the required number of wells, (e.g. in ELISA) for the test portion(s) to be

analysed, including blanks, positive controls and negative controls, and add each of them, at minimum

in duplicate and properly diluted so as to be within the range of the assay.

For a qualitative test or semi-quantitative test, select the required number of tests (e.g. ELISA or LFDs)

needed for the test portions to be analysed, including blanks, positive controls and negative controls. The

stability of the final signal can vary. Read the results in a timely manner as specified in Annexes A and B.

According to the method chosen, follow the instructions of each method for sample analyses, including

blanks, reference materials and/or measurement standards (if necessary). Allow the reaction to

occur at a specified temperature range and time. If necessary, terminate the reaction according to the

method described in A.6.6.2.7 and B.6.4.2. For example, if the ELISA method requires acquiring data

on a spectrophotometer, perform this step. In the case of qualitative tests, follow the kit instructions.

Generally, these are interpreted visually.
9 Interpretation and expression of results
9.1 General

The parameters to interpret vary depending on whether the assay is qualitative, semi-quantitative or

quantitative.

For quantitative methods, the coefficient of variation (C ) of optical density values resulting from

replicate measurements of a sample test solution, in general, should not exceed 15 %. The coefficient of

variation of calculated concentrations resulting from replicate measurements of a sample test solution,

in general, should not exceed 20 %.

If the coefficient of variation limit is exceeded, the analyses should be repeated on freshly prepared

sample test solution. To establish a coefficient of variation, in this case, at least three determinations

shall be carried out (e.g. values from three micro-titre wells).

Negative results shall be reported as “negative at the limit of detection” and the limit of detection (LOD)

shall be reported.

Positive results below the limit of quantification shall be reported as “positive above the limit of

detection, but below the limit of quantification”. The limits of quantification and detection shall be

reported.
© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 21572:2019(E)
9.2 Quantitative and semi-quantitative analysis

For quantitative and semi-quantitative analysis, the following parameters shall be evaluated:

— raw data of the sample test solution;
— blanks;
— reference materials or measurement standards;
— negative controls;
— % C between replicates;
— % C of standards;
— % C of control samples.

In accordance with ISO/IEC 17025, measurement uncertainty should be reported, where applicable.

Quantitative results shall not be reported by extrapolating above the highest or below the lowest

calibration point.
9.3 Qualitative analysis

For qualitative tests, including all applications thereof, the corresponding parameters are described in

Annexes A and B. The LOD shall always be reported. Negative results shall be reported as “negative at

the limit of detection”.
Positive results shall also report the LOD.
10 Specific parameters that can influence results
10.1 General

The performance criteria listed in the method of Annex A are a set of performance specifications

established for each method during the development, validation and routine use of the method. These

parameters shall be estimated and evaluated for each method to ensure they are reliable and of

consistently high quality. Each time a method is implemented, the data generated shall be evaluated

and compared with the established method performance criteria.

When a value (e.g. coefficient of variation of replicate determinations) does not agree with the assay

specifications, it signals that the result is atypical and warrants closer evaluation of the data. The list

of specifications shall be taken as whole. In certain instances, individual parameters may not meet the

specifications but the data are still perfectly acceptable. If any of the criteria are not met, this should,

however, be acknowledged in writing and the data evaluated to determine if the analysis of results

should be adjusted, or if a particular sample or a set of samples should be repeated. These decisions

should be based on the judgement of the technical expert interpreting the entire set of criteria.

In contrast to the method described in Annex A, the performance criteria of LFD assays as described

in Annex B are evaluated during the development of the method by the manufacturer of the kit. The

method should be evaluated for repeatability in the laboratory prior to use on test samples. Non-

performing kits shall not be used.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 21572:2019(E)
10.2 Special considerations
10.2.1 Selectivity

Adequate selectivity of the assay for a particular analyte shall be demonstrated for each POI or analyte

(protein) to be measured in each matrix to be tested. Where appropriate, cross-reactivity should be

evaluated for analogues (proteins with a similar sequence or structure). To test for the absence of

the POI in non-POI sample, assay the non-POI containing sample and POI-containing sample at the

appropriate dilutions and compare.

This is generally done during the development and validation of the method and is not necessary during

routine analysis of samples for which the method has previously been validated. Selectivity of the test

kits, either ELISA or LFD-based methods, should be addressed by the manufacturer of the kit (e.g. listed

in the manufacturer’s product inserts).
10.2.2 Extraction efficiency

Special care shall be taken to assess the influence of process parameters applied for the production of a

given laboratory sample.

In order to provide for the greatest sensitivity of the immunoassay, extraction efficiency should be

as high as possible, especially for quantitative methods. The assay performance is matrix dependent.

Extraction efficiency should be determined and documented for each matrix.

The extraction procedure shall be demonstrated to be reproducible and the method of calibration (if

applicable) should account for incomplete extraction.
10.2.3 Matrix effects

The scope of application clearly and exactly defines the matrices for which the given immunoassay

is applicable. The use of matrix matched reference materials allows for direct comparison between

reference materials and samples. However, if samples are to be analysed against reference materials

that are not the same matrix, then the matrix effects will have to be evaluated.

For example, prepare a negative extract for each sample (matrix) to be analysed by the method and

an extract of a positive control of known concentration. Prepare a series of dilutions of the positive

control in the negative extract and compare the resulting dose response curve with the calibration

curve from the method. If the two curves are different, then there is a matrix effect. Use a matrix that

most closely represents the true samples that will be tested. A dilution curve with a positive control of

known concentration should also be included as a reference. The shape of the calibration curve should

not change due to a matrix effect.
10.2.4 Assay applicability

Food processing will generally lead to degradation or denaturation of the POI, which could result in a

substantial change in immunoreactivity. Immunoassays should be evaluated for applicability to the POI

in processed products.
10.2.5 Hook effect

In an antibody-based LFD and plate format assay, a hook (saturation) effect could lead to a false-

negative result. A thorough demonstration that the working concentration range comfortably covers

the practical need of POI test samples is necessary.
10.2.6 Parallelism/linearity

For quantitative analyses, the expected dynamic range of the immunoassay should be explicitly stated

in the scope of applications for all matrices covered by it. The relationship of the instrument response to

known POI concentration may not be linear and shall be established for each quantitative immunoassay

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ISO 21572:2019(E)

method by the manufacturer. This relationship is typically hyperbolic if the POI concentration is plotted

on a linear scale or sigmoidal with a logarithmic concentration scale. Either a 4-parameter logistic or

5-parameter logistic regression model provides the best fit for an ELISA calibration curve, with the

linear portion in the centre of the sigmoidal curve representing the optimal region for quantitative

analysis. Other regression models (e.g. linear, quadratic, logit-log, spline-fit, third order polynomial)

may also be suitable to fit limited portions of the calibration curve.

A minimum of four calibration points, reflecting the usable portion of the curve, shall be evaluated

for quantification purposes, although a 4-parameter logistic fit requires at least five points and a

5-parameter logistic fit requires at least six points.
10.2.7 Limits of detection

Results should not be interpreted below the LOD. In this case, reporting of results shall be stated

according to applicable method as described in 9.1 to 9.3.
10.2.8 Limits of quantification

The limits of quantification for each set of calibrants (or dilutions) shall be stated explicitly.

The estimated concentration of unknown sample test solutions shall be interpolated and not

extrapolated.

Results shall not be extrapolated below the limit of quantification or above the highest or below the

lowest calibration points.
11 Confirming method

To establish the credibility of assays, another method such as western blot, high-performance liquid

chromatography (HPLC), mass spectrometry (MS) or a functional assay can be used to measure

split analytical samples of known concentration. The results of both methods are then qualitatively/

quantitatively compared. This is especially important for immunoassays, since antibodies could cross

react with other analytes present in a
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21572
Troisième édition
2019-10
Produits alimentaire — Analyse
des biomarqueurs moléculaires —
Méthodes immunochimiques pour
la détection et la quantification des
protéines
Foodstuffs — Molecular biomarker analysis — Immunochemical
methods for the detection and quantification of proteins
Numéro de référence
ISO 21572:2019(F)
ISO 2019
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21572:2019(F)
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21572:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Matériel de laboratoire .................................................................................................................................................................................. 2

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 2

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 2

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

8.2 Préparation de la solution d’échantillon .......................................................................................................................... 2

8.3 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 3

8.4 Préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de

référence ....................................................................................................................................................................................................... 3

8.5 Mode opératoire d’analyse ........................................................................................................................................................... 3

9 Interprétation et expression des résultats ............................................................................................................................... 3

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 3

9.2 Analyse quantitative et semi-quantitative ...................................................................................................................... 4

9.3 Analyse qualitative............................................................................................................................................................................... 4

10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats ........................................................................................ 4

10.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

10.2 Considérations particulières ....................................................................................................................................................... 5

10.2.1 Sélectivité ............................................................................................................................................................................... 5

10.2.2 Efficacité de l’extraction ............................................................................................................................................ 5

10.2.3 Effets de matrice .............................................................................................................................................................. 5

10.2.4 Applicabilité de l’analyse .......................................................................................................................................... 6

10.2.5 Effet crochet ......................................................................................................................................................................... 6

10.2.6 Parallélisme/Linéarité ................................................................................................................................................ 6

10.2.7 Limites de détection ........................................................................................................................................... ........... 6

10.2.8 Limites de quantification .......................................................................................................................................... 6

11 Méthode de confirmation ............................................................................................................................................................................ 6

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 7

Annexe A (informative) Détection d’une protéine par ELISA ...................................................................................................... 8

Annexe B (informative) Détection de protéine(s) à l’aide de dispositifs

d’immunochromatographie ...................................................................................................................................................................20

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................28

© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21572:2019(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 21572:2013) qui a fait l’objet d’une

révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:

— le titre a été modifié pour spécifier que le présent document concerne les méthodes immunochimiques

de détection des protéines;
— une introduction a été ajoutée;
— les termes, définitions et références ont été mis à jour;

— le texte a été modifié pour améliorer l’applicabilité du présent document aux applications générales

d’analyse des protéines.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 21572:2019(F)
Introduction

Les techniques analytiques reposant sur les interactions des liaisons immunochimiques hautement

spécifiques sont devenues des outils indispensables pour analyser de nombreux analytes chimiques

et macromoléculaires différents, notamment les protéines. Les méthodes utilisant ces techniques sont

communément reconnues dans les communautés scientifique et réglementaire. Les méthodes d’analyse

immunochimique sont couramment utilisées pour détecter (présence ou absence) et/ou quantifier les

analytes protéiques spécifiques tels que les protéines allergènes, les protéines marqueurs de maladies

ou les protéines nouvellement exprimées dans les cultures biotechnologiques.

Avant l’analyse, les échantillons nécessitent généralement d’être broyés ou transformés de manière

à faciliter l’extraction de l’analyte hors de la matrice des échantillons. Lors du développement de la

méthode analytique, il est donc essentiel de choisir un tampon d’extraction approprié qui n’interfère

pas avec le bon déroulement de la méthode analytique et qui assure un niveau approprié de stabilité des

analytes pendant l’analyse.
L’analyse immunochimique comprend généralement au moins deux étapes:

— la liaison ou capture de l’analyte d’intérêt présent dans les échantillons avec un anticorps ciblant

spécifiquement l’analyte;

— la détection du complexe anticorps-analyte à l’aide d’une technique qui signale l’interaction

spécifique.

Une fois la méthode analytique développée et optimisée, il convient de la valider pour démontrer que

ses performances sont fiables et adaptées à l’usage prévu et pour caractériser ses limites. Cela implique

d’effectuer plusieurs expériences sur des échantillons réels pour évaluer certains paramètres tels que

l’exactitude, la fidélité, la sensibilité, la sélectivité et les limites de détection ou de quantification. La

validation permet également d’établir les critères de performance de la méthode en fonction desquels

les performances analytiques de routine peuvent être comparées pour l’obtention systématique de

résultats analytiques acceptables.

Le présent document fournit un ensemble de modes opératoires généraux et de considérations

analytiques applicables à l’utilisation de techniques immunochimiques pour analyser les protéines

cibles. Il donne des informations sur le traitement des échantillons, l’extraction, la configuration de

l’analyse, l’interprétation et le compte-rendu des résultats, ainsi que sur les paramètres de performance

d’analyse. Il comprend deux annexes qui contiennent des exemples de modes opératoires qui peuvent

être suivies lors de l’analyse d’une protéine d’intérêt (POI) dans plusieurs matrices de référence en

utilisant des méthodes reposant sur des essais immuno-enzymatiques (ELISA) et des dispositifs

d’immunochromatographie (LFD).
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NORME INTERNATIONALE ISO 21572:2019(F)
Produits alimentaire — Analyse des biomarqueurs
moléculaires — Méthodes immunochimiques pour la
détection et la quantification des protéines
1 Domaine d’application

Le présent document énonce des critères de performances pour les méthodes immunochimiques de

détection et/ou de quantification d’une protéine spécifique ou de protéine(s) d’intérêt (POI) dans une

matrice donnée.

Les méthodes décrites sont applicables à l’analyse de protéines provenant de divers types d’échantillons.

Certaines utilisations de ces méthodes comprennent, entre autres, l’analyse des protéines impliquées

dans la production végétale et agroalimentaire, la transformation des aliments, la commercialisation

des produits alimentaires, la sécurité des aliments, les biotechnologies ou l’indexation des maladies.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 16577, ainsi que les suivants,

s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
conjugué

matériel produit en liant deux substances ou plus par liaison covalente par l’intermédiaire de groupes

chimiques

Note 1 à l'article: Les conjugués d’anticorps couplés à des fluorochromes (par exemple entité chimique telle

qu’une molécule ou un groupe, qui émet de la lumière en réponse à une excitation par absorption de lumière

incidente), des substances radiomarquées, de l’or ou des enzymes sont souvent utilisés dans les immunoanalyses.

4 Principe

La protéine cible est extraite selon le mode opératoire décrit pour cette matrice spécifique et un

anticorps spécifique est utilisé pour détecter ou mesurer la concentration de la POI présente dans

l’échantillon. La détection de protéines spécifiques dans les ingrédients selon une méthode fondée sur

les protéines repose sur les principes de base suivants:
— prélèvement d’un échantillon représentatif de la matrice;
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ISO 21572:2019(F)
— extraction des protéines;

— détection et/ou quantification de la protéine spécifique dérivée de la matrice étudiée.

5 Réactifs

Au cours de l’analyse, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau

désionisée, distillée, purifiée ou ayant subi un traitement équivalent, sauf indication contraire du

fabricant des réactifs ou du kit.

D’autres réactifs, tels que les anticorps, les conjugués, les substrats, les solutions de blocage et

les tampons sont propres à la méthode. Pour des cas spécifiques de réactifs, tels que des étalons

protéiniques ou des matériaux de référence, des anticorps libres ou sensibilisés sur une surface solide,

des contrôles et des échantillons, se référer à la méthode concernée.
Les réactifs sont spécifiés en A.4.2, A.4.3, B.4.2 et B.4.3.
6 Matériel de laboratoire
Le matériel de laboratoire est spécifié en A.5 et B.5.
7 Échantillonnage

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document, bien que

l’Annexe A et l’Annexe B donnent des instructions d’échantillonnage conformément aux méthodes

appropriées. Il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.

8 Mode opératoire
8.1 Généralités

Les conditions de stockage et la durée de conservation des dispositifs d’immunochromatographie, des

anticorps, du conjugué, du substrat, etc., doivent être clairement spécifiées par le fournisseur.

Utiliser un matériel de laboratoire approprié ayant une faible capacité de liaison des protéines (par

exemple tubes en polypropylène) afin d’empêcher l’adsorption des protéines pendant toute la durée du

mode opératoire.

Dans le cadre de l’utilisation du présent document, les exigences générales relatives à l’assurance qualité

des laboratoires doivent être respectées (par exemple étalonnage de l’appareillage, dosage en double,

essais à blanc, utilisation de matériaux de référence, préparation de courbes d’étalonnage). Nettoyer

avec soin l’ensemble de l’équipement se trouvant en contact direct avec l’échantillon afin d’éviter toute

contamination. Voir l’ISO/IEC 17025 pour plus d’informations.
8.2 Préparation de la solution d’échantillon

Une fois qu’un échantillon représentatif est obtenu, préparer la solution d’échantillon. Les modes

opératoires de préparation de l’échantillon sont décrits dans les Annexes A et B.

Si nécessaire, broyer les échantillons tel que spécifié dans la méthode avant de prélever les prises

d’essai. Les poudres et la farine peuvent présenter des propriétés de gonflement et sont susceptibles de

requérir un volume de solution d’extraction plus élevé si la méthode du fabricant ne précise pas cette

information. Si l’échantillon n’est pas utilisé immédiatement, respecter le mode opératoire de stockage

de votre laboratoire (par exemple −20 °C ou inférieur).
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Peser une quantité appropriée (telle que spécifiée en A.6.6.1 et B.6.2.1) d’un échantillon pour essai

représentatif pour analyse en vue d’obtenir une prise d’essai pour extraction. Ajouter la solution

d’extraction, puis homogénéiser ou mélanger.

Les échantillons pour laboratoire renfermant d’importantes quantités de matières grasses peuvent

ne pas s’avérer suffisamment homogènes; il convient, par conséquent, d’extraire une prise d’essai plus

importante pour garantir sa représentativité. Le cas échéant, des instructions peuvent être trouvées

dans les sections relatives à la préparation des échantillons des Annexes A et B.

8.3 Extraction

Suivre un mode opératoire d’extraction adapté à la matrice. Les détails des conditions requises pour

l’extraction ou la dilution des prises d’essai, des contrôles et des matériaux de référence sont indiqués

à l’Annexe A pour la méthode ELISA et à l’Annexe B pour les dispositifs d’immunochromatographie. Il

convient de suivre soigneusement les modes opératoires d’extraction validés pour la matrice. Il convient

d’utiliser immédiatement les échantillons extraits ou de les traiter conformément au mode opératoire

de stockage.

8.4 Préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de

référence

Pour la préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de référence

pour l’Annexe A, il est recommandé d’utiliser des matériaux de référence adaptés à la matrice ou

des matériaux de référence qui ont été validés pour la matrice. Des courbes d’étalonnage ne sont pas

requises pour une application qualitative telle que les dispositifs d’immunochromatographie. Toutefois,

des contrôles positifs et négatifs peuvent être préparés à la discrétion de l’analyste.

8.5 Mode opératoire d’analyse

Pour un essai quantitatif, sélectionner le nombre de puits requis (par exemple dans la méthode ELISA)

pour la (ou les) prise(s) d’essai à analyser, y compris les blancs, les contrôles positifs et les contrôles

négatifs, et ajouter chacun d’entre eux au moins en double, en les diluant correctement pour qu’ils se

situent dans la gamme de l’analyse.

Pour un essai qualitatif ou semi-quantitatif, sélectionner le nombre requis d’essais (par exemple

dispositifs d’immunochromatographie ou méthode ELISA) nécessaires pour les prises d’essai à analyser,

y compris les blancs, les contrôles positifs et les contrôles négatifs. La stabilité du signal final peut

varier. Relever les résultats aux intervalles de temps spécifiés dans les Annexes A et B.

Selon la méthode choisie, respecter les instructions de chaque méthode pour l’analyse des échantillons,

y compris pour les blancs, les matériaux de référence et/ou les étalons de mesure (si nécessaire). Laisser

la réaction se dérouler pendant le laps de temps et dans la plage de température indiqués. Si nécessaire,

terminer la réaction selon la méthode décrite en A.6.6.2.7 et B.6.4.2. Par exemple, si la méthode ELISA

requiert l’acquisition de données sur un spectrophotomètre, effectuer cette étape. En cas d’essais

qualitatifs, respecter les instructions fournies avec le kit. Ces essais sont généralement interprétés

visuellement.
9 Interprétation et expression des résultats
9.1 Généralités

Les paramètres à interpréter varient selon que l’analyse est qualitative, semi-quantitative ou

quantitative.

Pour les méthodes quantitatives, il convient que le coefficient de variation (C ) des valeurs de densité

optique résultant de mesures en double d’une solution d’essai d’échantillon ne dépasse pas, en général,

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15 %. De manière générale, il convient que le coefficient de variation des concentrations calculées

résultant de mesures en double d’une solution d’essai d’échantillon ne dépasse pas 20 %.

Si la limite du CV est dépassée, il convient de répéter les analyses avec une solution d’essai d’échantillon

fraîchement préparée. Dans ce cas, trois dosages au moins doivent être réalisés pour établir un CV (par

exemple les valeurs de trois puits de microtitration).

Les résultats négatifs doivent être rapportés comme « négatifs à la limite de détection » et la limite de

détection doit être rapportée.

Les résultats positifs situés sous la limite de quantification doivent être rapportés comme étant

« positifs au-dessus de la limite de détection, mais en deçà de la limite de quantification ». Les limites de

quantification et de détection doivent être rapportées.
9.2 Analyse quantitative et semi-quantitative

Les paramètres suivants doivent être évalués pour les analyses quantitatives et semi-quantitatives:

— données brutes obtenues sur la solution d’essai d’échantillon;
— blancs;
— matériaux de référence ou étalons de mesure;
— contrôles négatifs;
— % C entre les réplicats;
— % C des étalons;
— % C des échantillons de contrôle.

Conformément à l’ISO/IEC 17025, il convient, le cas échéant, de consigner l’incertitude de mesure.

Les résultats quantitatifs ne doivent pas être rapportés en extrapolant les chiffres au-delà du point le

plus haut ou en deçà du point le plus bas de la courbe d’étalonnage.
9.3 Analyse qualitative

Pour les essais qualitatifs et toutes les applications s’y rapportant, les paramètres correspondants sont

décrits dans les Annexes A et B. La limite de détection doit être rapportée. Les résultats négatifs doivent

être rapportés comme étant « négatifs à la limite de détection ».
Les résultats positifs doivent également inclure la limite de détection.
10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats
10.1 Généralités

Les critères de performances répertoriés dans la méthode figurant à l’Annexe A constituent un

ensemble de spécifications de performances établies pour chaque méthode au cours du développement,

de la validation et de l’utilisation en routine de la méthode. Ces paramètres doivent être estimés et

évalués pour chaque méthode pour s’assurer qu’ils sont fiables et toujours de grande qualité. À

chaque exécution d’une méthode, évaluer les données générées, puis les comparer avec les critères de

performance définis pour la méthode.

Lorsqu’une valeur (par exemple, le coefficient de variation entre des mesures en double) ne répond

pas aux spécifications d’analyse, le résultat est indiqué comme atypique et une évaluation plus fine des

données est engagée. La liste des spécifications doit être considérée globalement, car si des paramètres,

dans certains cas, peuvent ne pas répondre aux spécifications, les données peuvent néanmoins

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ISO 21572:2019(F)

demeurer parfaitement acceptables. Lorsqu’un critère quelconque n’est pas satisfait, il convient de le

noter par écrit et d’évaluer les données afin de déterminer s’il convient d’ajuster l’analyse des résultats

ou s’il convient de soumettre à un nouvel essai un échantillon particulier ou un ensemble d’échantillons.

Il convient que de telles décisions dépendent du jugement de l’expert technique interprétant l’ensemble

des critères.

Contrairement à la méthode décrite à l’Annexe A, les critères de performance des essais

d’immunochromatographie tels que décrits à l’Annexe B sont évalués au cours du développement de la

méthode par le fabricant du kit. Il convient d’évaluer la répétabilité de la méthode dans le laboratoire

avant de l’utiliser sur des échantillons pour essai. Les kits donnant de mauvais résultats ne doivent pas

être utilisés.
10.2 Considérations particulières
10.2.1 Sélectivité

L’adéquation de la sélectivité de l’analyse pour un analyte particulier doit être prouvée pour chaque

POI ou analyte (protéine) à mesurer dans chaque matrice soumise à essai. Le cas échéant, il convient

d’évaluer la réactivité croisée lorsqu’il existe des analogues (protéines ayant une séquence ou une

structure similaire). Pour déceler l’absence de POI dans un échantillon n’en contenant pas, analyser

l’échantillon ne contenant pas de POI et un échantillon en contenant selon les dilutions appropriées,

puis comparer les résultats.

Cela est généralement fait au cours du développement et de la validation de la méthode et ne s’avère pas

nécessaire pendant l’analyse de routine d’échantillons pour lesquels la méthode a été préalablement

validée. Il convient que le fabricant du kit fasse état de la sélectivité des kits d’essai, qu’ils utilisent la

méthode ELISA ou l’immunochromatographie (par exemple dans les notices d’utilisation des produits

du fabricant).
10.2.2 Efficacité de l’extraction

Un soin particulier doit être apporté à l’évaluation de l’impact des paramètres du processus appliqué à

la production d’un échantillon pour laboratoire donné.

Pour garantir la sensibilité optimale de l’immunoanalyse, il convient que l’efficacité de l’extraction soit

optimale, en particulier pour les méthodes quantitatives. Les performances de l’analyse dépendent de

la matrice. Il convient de déterminer et de documenter l’efficacité de l’extraction pour chaque matrice.

La preuve de la reproductibilité du mode opératoire d’extraction doit être apportée et il convient que la

méthode d’étalonnage (le cas échéant) tienne compte d’une extraction incomplète.
10.2.3 Effets de matrice

Le domaine d’application définit avec clarté et exactitude les matrices auxquelles l’immunoanalyse

s’applique. L’utilisation de matériaux de référence adaptés à la m
...

Questions, Comments and Discussion

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