ISO 21572:2019

Foodstuffs - Molecular biomarker analysis - Immunochemical methods for the detection and quantification of proteins

This document specifies performance criteria for immunochemical methods for the detection and/or quantification of a specific protein or protein(s) of interest [POI(s)] in a specified matrix. The methods discussed are applicable to the analysis of proteins from a variety of sample types. Some uses for these methods include, but are not limited to, analysing proteins involved in crop and food production, food processing, food marketing, food safety, biotechnology or disease indexing.

Produits alimentaires— Analyse des biomarqueurs moléculaires — Méthodes immunochimiques pour la détection et la quantification des protéines

Le présent document énonce des critères de performances pour les méthodes immunochimiques de détection et/ou de quantification d'une protéine spécifique ou de protéine(s) d'intérêt (POI) dans une matrice donnée. Les méthodes décrites sont applicables à l'analyse de protéines provenant de divers types d'échantillons. Certaines utilisations de ces méthodes comprennent, entre autres, l'analyse des protéines impliquées dans la production végétale et agroalimentaire, la transformation des aliments, la commercialisation des produits alimentaires, la sécurité des aliments, les biotechnologies ou l'indexation des maladies.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 09-Oct-2019
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 16 - Horizontal methods for molecular biomarker analysis
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 10-Jun-2025
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Consolidates: ISO 4586-3:2015 - High-pressure decorative laminates (HPL, HPDL) - Sheets based on thermosetting resins (Usually called Laminates) - Part 3: Classification and specifications for laminates less than 2 mm thick and intended for bonding to supporting substrates
• Effective Date: 06-Jun-2022
• Revises: ISO 21572:2013 - Foodstuffs - Molecular biomarker analysis - Protein-based methods
• Effective Date: 23-Apr-2020

Overview

ISO 21572:2019 - Foodstuffs: Molecular biomarker analysis - Immunochemical methods for the detection and quantification of proteins - specifies performance criteria and analytical considerations for immunochemical methods used to detect and/or quantify specific protein(s) of interest (POIs) in food and related matrices. The standard covers general principles, sample preparation, extraction, assay procedures (including ELISA and lateral flow devices in Annexes A and B), interpretation of results and relevant performance parameters for protein detection and quantification.

Key topics and technical requirements

• Scope and principle
  • Focuses on immunochemical assays that use antibody–antigen binding to detect or quantify target proteins extracted from a representative sample.
• Sample preparation & extraction
  • Guidance on preparing representative test portions, grinding, extraction buffers and matrix-appropriate procedures. Emphasises validated extraction methods and proper storage of extracts.
• Reagents and equipment
  • Use of analytical-grade reagents and low protein-binding laboratory consumables; storage and shelf-life of kits (LFDs, antibodies, conjugates) must be specified.
• Assay setup & calibration
  • Procedures for preparing calibration curves, positive/negative controls and matrix-matched reference materials for quantitative assays (ELISA). Qualitative tests (LFDs) may use controls at analyst discretion.
• Performance parameters to evaluate
  • Selectivity, extraction efficiency, matrix effects, assay applicability, hook effect, parallelism/linearity, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ).
• Quality assurance and reporting
  • Recommendations on laboratory QA (referencing ISO/IEC 17025), double determinations, blanks, calibration, confirmatory testing and required elements of the test report.
• Annexes
  • Practical example procedures for ELISA (Annex A) and lateral flow devices (Annex B).

Practical applications

ISO 21572:2019 is directly applicable to:

• Allergen testing and labelling verification
• Detection of newly expressed proteins in biotech crops (GMO monitoring)
• Food safety screening and quality control during food processing and marketing
• Biotechnology product testing and disease indexing where specific protein biomarkers are analysed
• Development and validation of immunoassay-based kits (ELISA and LFD manufacturers)

Who should use this standard

• Food testing laboratories and quality assurance teams
• Regulatory and inspection authorities
• Diagnostic and kit manufacturers (ELISA, LFD)
• Researchers in food safety, molecular biomarker analysis and biotechnology
• Producers and processors implementing protein-based testing for compliance or product claims

Related standards

• ISO 16577 - Molecular biomarker analysis - Terms and definitions
• ISO/IEC 17025 - General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

Keywords: ISO 21572:2019, immunochemical methods, protein detection, ELISA, lateral flow devices, molecular biomarker analysis, food safety, allergen testing, matrix effects, limits of detection.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21572
Third edition
2019-10
Foodstuffs — Molecular biomarker
analysis — Immunochemical methods
for the detection and quantification of
proteins
Produits alimentaire — Analyse des biomarqueurs moléculaires —
Méthodes immunochimiques pour la détection et la quantification des
protéines
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Fax: [phone]
Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Laboratory equipment . 2
7 Sampling . 2
8 Procedure. 2
8.1 General . 2
8.2 Preparation of sample solution . 2
8.3 Extraction . 3
8.4 Preparation of calibration curves, positive controls, and reference materials . 3
8.5 Assay procedure . 3
9 Interpretation and expression of results . 3
9.1 General . 3
9.2 Quantitative and semi-quantitative analysis . 4
9.3 Qualitative analysis . 4
10 Specific parameters that can influence results . 4
10.1 General . 4
10.2 Special considerations . 5
10.2.1 Selectivity . 5
10.2.2 Extraction efficiency . 5
10.2.3 Matrix effects. 5
10.2.4 Assay applicability . 5
10.2.5 Hook effect . 5
10.2.6 Parallelism/linearity . 5
10.2.7 Limits of detection . 6
10.2.8 Limits of quantification . 6
11 Confirming method . 6
12 Test report . 6
Annex A (informative) Detection of a protein by ELISA . 8
Annex B (informative) Detection of a protein or proteins by lateral flow devices .19
Bibliography .26
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 21572:2013), which has been technically
revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:
— the title has been changed to specify that the document is focused on immunochemical protein
detection methods;
— an introduction has been added;
— terms, definitions and references have been updated;
— the text has been modified to improve the document’s applicability to general protein analysis
applications.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved

Introduction
Analytical techniques based on highly specific immunochemical-binding interactions have become
key tools for analysing many different chemical and macromolecular analytes, including proteins.
Methods utilizing these techniques are widely accepted in the scientific and regulatory communities.
Immunochemical assay methods are most commonly used to detect (presence or absence) and/
or quantify specific protein analytes such as allergenic proteins, disease marker proteins or newly
expressed proteins in biotech crops.
Prior to analysis, samples generally need to be ground or processed in a manner that facilitates
extraction of the analyte from the sample matrix. An important step in analytical method development
is therefore the selection of a suitable extraction buffer that does not interfere with the analytical
method performance and that ensures an appropriate level of analyte stability during the analytical
process.
The immunochemical assay process generally incorporates at least two steps:
— binding or capturing the analyte of interest present in samples with an antibody targeted specifically
to the analyte;
— detection of the antibody-analyte complex using a technique that signals the specific interaction.
Once an analytical method has been developed and optimized, it should be validated to demonstrate
that its performance is reliable and suitable for the intended use and to characterize the method
limitations. This involves performing several experiments with real samples to evaluate parameters
such as accuracy, precision, sensitivity, selectivity and the detection or quantification limits. Validation
also allows for the establishment of method performance criteria, against which routine analytical
performance can be compared to ensure that acceptable analytical results are consistently reported.
This document provides a set of general procedures and analytical considerations for using
immunochemical techniques to analyse target proteins. It discusses aspects of sample processing,
extraction, assay set-up, interpretation and reporting of results, and relevant assay performance
parameters. Two annexes are included containing example procedures that can be followed when
analysing a protein of interest (POI) in a variety of background matrices using methods based on
enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and lateral flow devices (LFDs).
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21572:2019(E)
Foodstuffs — Molecular biomarker analysis —
Immunochemical methods for the detection and
quantification of proteins
1 Scope
This document specifies performance criteria for immunochemical methods for the detection and/or
quantification of a specific protein or protein(s) of interest [POI(s)] in a specified matrix.
The methods discussed are applicable to the analysis of proteins from a variety of sample types. Some
uses for these methods include, but are not limited to, analysing proteins involved in crop and food
production, food processing, food marketing, food safety, biotechnology or disease indexing.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
conjugate
material produced by attaching two or more substances together by covalent bond via chemical groups
Note 1 to entry: Conjugates of antibodies with fluorochromes (e.g. chemical entity, such as a molecule or group,
that emits light in response to excitation by absorbed incident light), radiolabelled substances, gold or enzymes
are often used in immunoassays.
4 Principle
The target protein is extracted according to the procedure described for that specific matrix, and
a specific antibody is used to detect or measure the concentration of the POI in the sample. For the
detection of specific proteins in ingredients, the basic principle of a protein-based method is to:
— take a representative sample of the matrix;
— extract the proteins;
— detect and/or quantify the specific protein derived from the matrix under study.
5 Reagents
During the analysis, use only reagents of recognized analytical grade and only de-ionized or distilled
water or water that has been purified, or equivalent unless indicated otherwise by the manufacturer of
the reagents or the kit.
Other reagents, such as antibodies, conjugates, substrates, stop solutions and buffer components are
method specific. Refer to the method for specifics regarding reagents such as protein standards or
reference materials, antibodies or pre-coated solid surfaces, controls, and samples.
Reagents are specified in A.4.2, A.4.3, B.4.2 and B.4.3.
6 Laboratory equipment
Laboratory equipment is specified in A.5 and B.5.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document, though Annex A and Annex B do provide
sampling instructions as per the relevant methods. It is recommended that the parties concerned come
to an agreement on this subject.
8 Procedure
8.1 General
Storage conditions and the shelf-life of LFDs, antibodies, conjugate, substrate, etc. shall be clearly
specified by the provider.
Use appropriate laboratory equipment with low protein binding capacity (e.g. polypropylene tubes) to
prevent protein adsorption during the whole procedure.
For the use of this document, general requirements of quality assurance for laboratories shall be
observed (e.g. concerning calibration of apparatus, double determination, blanks, use of reference
materials, preparation of calibration curves) Carefully clean all equipment coming into direct contact
with the sample to prevent contamination. See ISO/IEC 17025 for more information.
8.2 Preparation of sample solution
Once a representative sample is obtained, prepare the sample solution. Sample preparation procedures
are described in Annexes A and B.
Grind samples as specified in the method before test portions are taken, if necessary. Powders/flour can
have swelling properties and could require more extraction solution if a manufacturer’s method does
not specify this information. If the sample is not immediately used, follow the laboratory’s procedure
for storage (e.g. −20 °C or below).
Weigh an appropriate amount of a representative test sample (as specified in A.6.6.1 and B.6.2.1) for
analysis to create a test portion for extraction. Add extraction solution and homogenize or mix.
Laboratory samples containing high amounts of fat can be non-homogeneous and a larger test portion
should be extracted to ensure that it is representative. If applicable, instructions can be found in the
sample preparation sections of Annexes A and B.
2 © ISO 2019 – All rights reserved

8.3 Extraction
Use an extraction procedure suitable for the matrix. Details of appropriate conditions for the extraction/
dilution of the test portions, controls and reference materials are provided in Annex A for ELISA and
Annex B for LFDs. Care should be taken to use extraction procedures validated for the matrix. Extracted
samples should be immediately used or treated as specified in the procedure for storage.
8.4 Preparation of calibration curves, positive controls, and reference materials
For the preparation of calibration curves, positive controls and reference materials for Annex A, it
is recommended to use matrix-matched reference materials or reference materials that have been
validated for the matrix. Calibration curves are not required for qualitative application such as LFDs.
However, positive and negative controls can be prepared at the discretion of the analyst.
8.5 Assay procedure
For a quantitative test, select the required number of wells, (e.g. in ELISA) for the test portion(s) to be
analysed, including blanks, positive controls and negative controls, and add each of them, at minimum
in duplicate and properly diluted so as to be within the range of the assay.
For a qualitative test or semi-quantitative test, select the required number of tests (e.g. ELISA or LFDs)
needed for the test portions to be analysed, including blanks, positive controls and negative controls. The
stability of the final signal can vary. Read the results in a timely manner as specified in Annexes A and B.
According to the method chosen, follow the instructions of each method for sample analyses, including
blanks, reference materials and/or measurement standards (if necessary). Allow the reaction to
occur at a specified temperature range and time. If necessary, terminate the reaction according to the
method described in A.6.6.2.7 and B.6.4.2. For example, if the ELISA method requires acquiring data
on a spectrophotometer, perform this step. In the case of qualitative tests, follow the kit instructions.
Generally, these are interpreted visually.
9 Interpretation and expression of results
9.1 General
The parameters to interpret vary depending on whether the assay is qualitative, semi-quantitative or
quantitative.
For quantitative methods, the coefficient of variation (C ) of optical density values resulting from
V
replicate measurements of a sample test solution, in general, should not exceed 15 %. The coefficient of
variation of calculated concentrations resulting from replicate measurements of a sample test solution,
in general, should not exceed 20 %.
If the coefficient of variation limit is exceeded, the analyses should be repeated on freshly prepared
sample test solution. To establish a coefficient of variation, in this case, at least three determinations
shall be carried out (e.g. values from three micro-titre wells).
Negative results shall be reported as “negative at the limit of detection” and the limit of detection (LOD)
shall be reported.
Positive results below the limit of quantification shall be reported as “positive above the limit of
detection, but below the limit of quantification”. The limits of quantification and detection shall be
reported.
9.2 Quantitative and semi-quantitative analysis
For quantitative and semi-quantitative analysis, the following parameters shall be evaluated:
— raw data of the sample test solution;
— blanks;
— reference materials or measurement standards;
— negative controls;
— % C between replicates;
V
— % C of standards;
V
— % C of control samples.
V
In accordance with ISO/IEC 17025, measurement uncertainty should be reported, where applicable.
Quantitative results shall not be reported by extrapolating above the highest or below the lowest
calibration point.
9.3 Qualitative analysis
For qualitative tests, including all applications thereof, the corresponding parameters are described in
Annexes A and B. The LOD shall always be reported. Negative results shall be reported as “negative at
the limit of detection”.
Positive results shall also report the LOD.
10 Specific parameters that can influence results
10.1 General
The performance criteria listed in the method of Annex A are a set of performance specifications
established for each method during the development, validation and routine use of the method. These
parameters shall be estimated and evaluated for each method to ensure they are reliable and of
consistently high quality. Each time a method is implemented, the data generated shall be evaluated
and compared with the established method performance criteria.
When a value (e.g. coefficient of variation of replicate determinations) does not agree with the assay
specifications, it signals that the result is atypical and warrants closer evaluation of the data. The list
of specifications shall be taken as whole. In certain instances, individual parameters may not meet the
specifications but the data are still perfectly acceptable. If any of the criteria are not met, this should,
however, be acknowledged in writing and the data evaluated to determine if the analysis of results
should be adjusted, or if a particular sample or a set of samples should be repeated. These decisions
should be based on the judgement of the technical expert interpreting the entire set of criteria.
In contrast to the method described in Annex A, the performance criteria of LFD assays as described
in Annex B are evaluated during the development of the method by the manufacturer of the kit. The
method should be evaluated for repeatability in the laboratory prior to use on test samples. Non-
performing kits shall not be used.
4 © ISO 2019 – All rights reserved

10.2 Special considerations
10.2.1 Selectivity
Adequate selectivity of the assay for a particular analyte shall be demonstrated for each POI or analyte
(protein) to be measured in each matrix to be tested. Where appropriate, cross-reactivity should be
evaluated for analogues (proteins with a similar sequence or structure). To test for the absence of
the POI in non-POI sample, assay the non-POI containing sample and POI-containing sample at the
appropriate dilutions and compare.
This is generally done during the development and validation of the method and is not necessary during
routine analysis of samples for which the method has previously been validated. Selectivity of the test
kits, either ELISA or LFD-based methods, should be addressed by the manufacturer of the kit (e.g. listed
in the manufacturer’s product inserts).
10.2.2 Extraction efficiency
Special care shall be taken to assess the influence of process parameters applied for the production of a
given laboratory sample.
In order to provide for the greatest sensitivity of the immunoassay, extraction efficiency should be
as high as possible, especially for quantitative methods. The assay performance is matrix dependent.
Extraction efficiency should be determined and documented for each matrix.
The extraction procedure shall be demonstrated to be reproducible and the method of calibration (if
applicable) should account for incomplete extraction.
10.2.3 Matrix effects
The scope of application clearly and exactly defines the matrices for which the given immunoassay
is applicable. The use of matrix matched reference materials allows for direct comparison between
reference materials and samples. However, if samples are to be analysed against reference materials
that are not the same matrix, then the matrix effects will have to be evaluated.
For example, prepare a negative extract for each sample (matrix) to be analysed by the method and
an extract of a positive control of known concentration. Prepare a series of dilutions of the positive
control in the negative extract and compare the resulting dose response curve with the calibration
curve from the method. If the two curves are different, then there is a matrix effect. Use a matrix that
most closely represents the true samples that will be tested. A dilution curve with a positive control of
known concentration should also be included as a reference. The shape of the calibration curve should
not change due to a matrix effect.
10.2.4 Assay applicability
Food processing will generally lead to degradation or denaturation of the POI, which could result in a
substantial change in immunoreactivity. Immunoassays should be evaluated for applicability to the POI
in processed products.
10.2.5 Hook effect
In an antibody-based LFD and plate format assay, a hook (saturation) effect could lead to a false-
negative result. A thorough demonstration that the working concentration range comfortably covers
the practical need of POI test samples is necessary.
10.2.6 Parallelism/linearity
For quantitative analyses, the expected dynamic range of the immunoassay should be explicitly stated
in the scope of applications for all matrices covered by it. The relationship of the instrument response to
known POI concentration may not be linear and shall be established for each quantitative immunoassay
method by the manufacturer. This relationship is typically hyperbolic if the POI concentration is plotted
on a linear scale or sigmoidal with a logarithmic concentration scale. Either a 4-parameter logistic or
5-parameter logistic regression model provides the best fit for an ELISA calibration curve, with the
linear portion in the centre of the sigmoidal curve representing the optimal region for quantitative
analysis. Other regression models (e.g. linear, quadratic, logit-log, spline-fit, third order polynomial)
may also be suitable to fit limited portions of the calibration curve.
A minimum of four calibration points, reflecting the usable portion of the curve, shall be evaluated
for quantification purposes, although a 4-parameter logistic fit requires at least five points and a
5-parameter logistic fit requires at least six points.
10.2.7 Limits of detection
Results should not be interpreted below the LOD. In this case, reporting of results shall be stated
according to applicable method as described in 9.1 to 9.3.
10.2.8 Limits of quantification
The limits of quantification for each set of calibrants (or dilutions) shall be stated explicitly.
The estimated concentration of unknown sample test solutions shall be interpolated and not
extrapolated.
Results shall not be extrapolated below the limit of quantification or above the highest or below the
lowest calibration points.
11 Confirming method
To establish the credibility of assays, another method such as western blot, high-performance liquid
chromatography (HPLC), mass spectrometry (MS) or a functional assay can be used to measure
split analytical samples of known concentration. The results of both methods are then qualitatively/
quantitatively compared. This is especially important for immunoassays, since antibodies could cross
react with other analytes present in a matrix.
12 Test report
The test report shall contain at least the following information:
a) all information needed to identify the laboratory;
b) all information needed to identify the laboratory sample;
c) reference to this document, i.e. ISO 21572, and to the method used, and an indication of whether it
was a qualitative, quantitative or semi-quantitative method;
d) LOD;
e) lower and/or upper limits of quantification;
f) date and type of sampling procedure used (if known);
g) date of sample receipt;
h) analysis start date or other appropriate documentation;
i) amount of the test portion;
j) amount of the test sample;
k) results and the units used to report them;
6 © ISO 2019 – All rights reserved

l) any special points observed during testing;
m) if known, limitations should be also listed such as possible cross-reactants or selectivity of
each method;
n) any operation not specified in this method or considered to be optional, but that can have an effect
on the results.
Annex A
(informative)
Detection of a protein by ELISA
A.1 General
ELISAs have been successfully and routinely used for qualitative or quantitative detection of protein
analytes.
Most of the commercial ELISA methods are applicable to samples where little or no treatment and
processing have been performed, and thus the POIs have not been denatured. Heating, steaming and
drying are just a few examples of conditions to which food ingredients are subjected during processing,
which will denature proteins, and thus impact or greatly diminish the ability of the immunological
reagents used in the ELISAs to bind to the specific proteins in their non-native states. Selectivity of the
method should be reported since, in certain cases, ELISAs will also react with similar proteins.
ELISA methods are routinely utilized in a qualitative manner for presence or absence testing and
for quantification purposes. Applicability to different matrices (e.g. grain, leaf) and crops are
clearly identified by the kit manufacturer in the kit documentation and shall be supported by the
manufacturer’s method validation. The limit of detection (LOD) is defined under these parameters. The
LOD for an ELISA kit is usually established by the kit manufacturer to be consistent with the expression
in the lowest expressing variety. Cross-reactivity with other proteins is examined. ELISA kits are
commercially available worldwide.
The alternate use of kits, on other crops and matrices (e.g. foods), shall be supported by independent
validation and LOD determination by the laboratory performing the off-label testing.
A.2 Scope of the method
This annex outlines a generic example of a procedure for using ELISA to determine if the POI is present,
and to quantitate the amount of the POI present in the sample. The method is applicable to samples
where little or no treatment or processing has been carried out, and, thus, the POI is not denatured. For
example, high temperatures at which food ingredients are processed can impact the ability to detect
the POI. Each manufacturer shall supply the ELISA procedure with the kit and specify what matrix
can be tested using the ELISA along with acceptance and rejection criteria that have been established
through development and validation of the method.
A.3 Principle
A direct sandwich ELISA is used for detection of a POI as follows and as shown in Figures A.1 to A.4.
— Step 1: The surface of a micro titre plate is coated with a specific capture antibody.
— Step 2: When the sample of interest is added, the capture antibody binds the antigen. Unbound
components of the sample are removed by washing.
— Step 3: After washing, a polyclonal antibody, covalently linked (for example) to horseradish
peroxidase (HRP) is added, which is specific for a second antigenic site on the bound POI.
— Step 4: After washing, a tetramethylbenzidine (TMB) chromogenic substrate for horseradish
peroxidase is added. The horseradish peroxidase generates a colour signal that is proportional to
the concentration of the antigen in a linear range. To stop the colour development, a stop solution is
added. The degree of colour produced is measured at a wavelength of 450 nm.
8 © ISO 2019 – All rights reserved

Figure A.1 — Step 1
Figure A.2 — Step 2
Figure A.3 — Step 3
Figure A.4 — Step 4
A.4 Reagents
A.4.1 General
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and
deionized or distilled water.
Any deviation from the defined performance criteria can indicate a lack of reagent stability. For
example, turbid buffer or turbid conjugate solutions should not be used.
All kit components should be stored at approximately 2 °C to 8 °C. The shelf-life of the kit components is
indicated by an expiration date.
The antibody conjugate stock solution (A.6.3.1) and the antibody conjugate working solution (A.6.3.2)
can be stored at 2 °C to 8 °C according to the kit instructions for dilution and storage. The diluted
wash buffer should also be stored according to the manufacturer’s instructions or according to the
laboratory’s established standard procedures.
A.4.2 Reagents and materials usually provided with the test kit
A.4.2.1 Extraction buffer.
A.4.2.2 Assay buffer.
10 © ISO 2019 – All rights reserved

A.4.2.3 Coated strip wells or plates.
Not all kits contain coated strip wells or plates. Coating the strip wells or plates with antibody can
be done by the user as an additional step. Users shall follow the manufacturer’s instructions for the
preparation of coating buffer and strip well or plate coating steps.
A.4.2.4 A conjugated detection antibody.
A.4.2.5 Conjugate diluent buffer.
A.4.2.6 Chromogenic substrate.
A.4.2.7 Stop solution.
A.4.2.8 Wash buffer concentrate.
A.4.2.9 Matrix matched negative and positive reference materials.
A.4.3 Chemicals not supplied with the test kit
A.4.3.1 Alcohol, such as methanol, volume concentration of 70 %, or ethanol, volume concentration
of 95 %.
A.4.3.2 Detergent for ultrasonic bath (optional).
A.5 Laboratory equipment
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
A.5.1 Refrigerator, set to an operating range of approximately 2 °C to 8 °C.
A.5.2 Polypropylene conical centrifuge tubes, sealable, e.g. 15 ml.
A.5.3 Plastic wrap or aluminium foil (optional).
A.5.4 Plastic tape to prevent strip movement during plate washing (optional).
A.5.5 Wash bottle, e.g. of volume of 500 ml.
A.5.6 Precision pipettes, capable of delivering e.g. 20 μl to 500 μl.
A.5.7 Small sample mixer.
A.5.8 Balance, capable of weighing to the nearest 0,01 g.
A.5.9 Centrifuge, capable for producing a relative centrifugal force (RCF) of at least 5 000g.
A.5.10 Microtitre plate reader, capable of reading absorbance at 450 nm or the wavelength specified
in the kit.
A.5.11 Incubator oven or water bath, capable of maintaining 37 °C (if required).
A.5.12 Sieve of aperture size of 450 μm, or equivalent (optional).
A.5.13 Sieve of aperture size of 150 μm (100 mesh), or equivalent (optional).
A.5.14 Multi-channel pipette, e.g. of 50 μl to 300 μl, (optional).
A.5.15 Reagent reservoirs for multi-channel dispensing (optional).
A.5.16 Automated plate washer (optional).
A.5.17 Test tube rack for 15 ml centrifuge tubes (optional).
A.5.18 Ultrasonic bath (optional).
A.6 Procedure
WARNING — Precautions should be taken when using acidic stop solutions or chromogenic
substrate solutions containing tetramethylbenzidine (TMB). Standard laboratory ventilation is
sufficient.
A.6.1 Limitations of the procedure
For thermally processed food samples and composite food samples, the method may not be fit for
purpose, unless specifically designed for the matrix.
The ELISA test kit is designed to give optimum performance at ambient temperatures of between 15 °C
and 30 °C. The absorbance of the highest reference material should be greater than 0,8 optical density
(OD) and should not fall outside the linear range of the reader. At temperatures greater than 30 °C,
OD values will rise more rapidly and a reduced substrate incubation time could be necessary. At low
temperatures (less than 15 °C), the substrate incubation time should be increased.
A.6.2 Sampling
A.6.2.1 Sample preparation
Take a homogeneous test sample from the laboratory sample in duplicate.
For whole grains, the amount of test portion taken will influence the LOD and limit of quantification
of the method. For raw grain, it is typical that 2 000 g is blended and ground until fine enough to be
sieved. For quantitative analysis, it is typical that a particle size of less than 150 μm should be obtained
and less than 450 μm for qualitative analysis. To avoid contamination, care should be taken during the
sieving step. Furthermore, care should be taken to avoid excessive heating. The action of the blender
will both mix and grind the sample. From the ground material, approximately 100 g should be taken and
passed through a sieve of 450 μm pore size (A.5.12). At least 90 % of this sample should pass through
the 450 μm sieve. For a qualitative assay, this material can be used directly. For a quantitative assay,
the sieved material should be further sieved using a sieve of 150 μm pore size (A.5.13). The material
passing through the 450 μm sieve has been shown to be homogeneous. Therefore, it is necessary to
sieve only enough material to provide an analytical sample through the 150 μm sieve.
This procedure is typical for a large grain such as maize or soybean. Certain samples can consist of
material that should be handled frozen or are already a homogenate.
12 © ISO 2019 – All rights reserved

A.6.2.2 Measures to avoid contamination during sample preparation
A.6.2.2.1 General
The ELISA test system is a sensitive technique capable of detecting very small quantities of POIs. For
this reason, it is imperative that all equipment used to process samples be thoroughly cleaned between
sample batches. The procedures given in A.6.2.2.2 and A.6.2.2.3 involve a first step of the physical
removal of as much particulate material as possible. The second step, a wash with alcohol, is to denature
and render non-reactive any protein that remains on the equipment.
This procedure is typical for blenders that cannot be washed in a commercial washing operation.
A.6.2.2.2 Grinder or blender cleaning
Brush clean with a soft bristle brush.
Rinse with alcohol (this may be stored and dispensed from a spray or squirt bottle). Two rinses or
sprays are recommended. Then rinse thoroughly with water.
Air dry or, if rapid reuse is required, use a flow of air such as from a commercial hair dryer.
Periodically wash the brush and soak it in an alcohol solution (A.4.3.1). Dry the brush before subsequent
use. Wipe with a soft cloth or laboratory towel.
A.6.2.2.3 Sieve cleaning
Sieves tend to become caked with powder. Sharply tap sieves on hard surfaces to dislodge caked
material.
Brush the sieves with clean soft bristle brushes. Soak the sieves in alcohol for at least 5 min and rinse
thoroughly with water. Air dry or, if rapid reuse is required, use a flow of air such as from a commercial
hair dryer.
An alternative method is to use an ultrasonic bath followed by air drying, or to wash the sieve with hot
water and detergent in a dishwasher.
Periodically wash the brush and soak it in an alcohol solution (A.4.3.1). Dry the brush before subsequent
use. Wipe with a soft cloth or laboratory towel.
A.6.2.2.4 Cleanliness of work area
Avoid dust contamination in the work area. Do not allow dust from one processing to contaminate
equipment to be used in a subsequent processing. For optimum performance, run assay in a room
separated from the facility where sample grinding and preparation is conducted to avoid potential dust
contamination.
A.6.3 Preparation of antibody conjugate
A.6.3.1 Antibody conjugate stock solution
Prepare the antibody conjugate (A.4.2.4) as per the kit instructions.
Store the antibody conjugate stock solution at 2 °C to 8 °C for no longer than the expiration date of the
kit, as per the manufacturer’s instructions.
A.6.3.2 Antibody conjugate working solution
Add the conjugate stock solution (A.6.3.1) to the conjugate diluent buffer (A.4.2.5) according to the
method used.
Store the antibody conjugate working solution at 2 °C to 8 °C for no longer than the expiration date of
the kit.
A.6.4 Preparation of wash buffer
Prepare the wash buffer as per the manufacturers’ instructions or to a laboratory standard operating
procedure (SOP).
A.6.5 Assay procedure
Allow all reagents to reach room temperature.
Remove the coated strips (A.4.2.3) and strip holder or the ELISA plate from the foil bag. Always seal
the foil bag each time after removing the appropriate number of strips. Typically, 10 to 12 wells are
required for reference materials and assay blanks. Each plate shall have its own standards and controls.
A typical procedure is summarized in A.7.
A.6.6 Test performance
A.6.6.1 Extraction of test portion and reference standard
The test portions and negative and positive reference materials are extracted under the same conditions
in duplicate.
A typical process is illustrated as follows.
Weigh out 0,5 g ± 0,01 g of each reference material and the test portion into individual 15 ml
polypropylene centrifuge tubes. When weighing, weigh out each reference material in increasing order
of concentration. Subsequently, weigh out the test portions. To avoid contamination, clean the spatula
by wiping it with an alcohol-soaked tissue (A.4.3.1) followed by drying, or use a disposable spatula
between each reference material and test portion.
Add extraction buffer (A.4.2.1) into each centrifuge tube.
Mix the test portion or reference material with extraction buffer by shaking vigorously and agitating
(vortex) until they become a homogeneous mixture.
Defatted flour and protein isolate need a prolonged time of mixing, sometimes more than 15 min. Full
fat flour easily becomes a homogenous mixture (in less than 5 min).
Centrifuge the mixtures at approximately 5 000g for 15 min, preferably at 4 °C.
Carefully remove approximately 1 ml supernatant of each sample solution and standard reference
extract and place each int
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21572
Troisième édition
2019-10
Produits alimentaire — Analyse
des biomarqueurs moléculaires —
Méthodes immunochimiques pour
la détection et la quantification des
protéines
Foodstuffs — Molecular biomarker analysis — Immunochemical
methods for the detection and quantification of proteins
Numéro de référence
©
ISO 2019
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
Fax: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Matériel de laboratoire . 2
7 Échantillonnage . 2
8 Mode opératoire. 2
8.1 Généralités . 2
8.2 Préparation de la solution d’échantillon . 2
8.3 Extraction . 3
8.4 Préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de
référence . 3
8.5 Mode opératoire d’analyse . 3
9 Interprétation et expression des résultats . 3
9.1 Généralités . 3
9.2 Analyse quantitative et semi-quantitative . 4
9.3 Analyse qualitative. 4
10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats . 4
10.1 Généralités . 4
10.2 Considérations particulières . 5
10.2.1 Sélectivité . 5
10.2.2 Efficacité de l’extraction . 5
10.2.3 Effets de matrice . 5
10.2.4 Applicabilité de l’analyse . 6
10.2.5 Effet crochet . 6
10.2.6 Parallélisme/Linéarité . 6
10.2.7 Limites de détection . . 6
10.2.8 Limites de quantification . 6
11 Méthode de confirmation . 6
12 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Détection d’une protéine par ELISA . 8
Annexe B (informative) Détection de protéine(s) à l’aide de dispositifs
d’immunochromatographie .20
Bibliographie .28
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 21572:2013) qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— le titre a été modifié pour spécifier que le présent document concerne les méthodes immunochimiques
de détection des protéines;
— une introduction a été ajoutée;
— les termes, définitions et références ont été mis à jour;
— le texte a été modifié pour améliorer l’applicabilité du présent document aux applications générales
d’analyse des protéines.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés

Introduction
Les techniques analytiques reposant sur les interactions des liaisons immunochimiques hautement
spécifiques sont devenues des outils indispensables pour analyser de nombreux analytes chimiques
et macromoléculaires différents, notamment les protéines. Les méthodes utilisant ces techniques sont
communément reconnues dans les communautés scientifique et réglementaire. Les méthodes d’analyse
immunochimique sont couramment utilisées pour détecter (présence ou absence) et/ou quantifier les
analytes protéiques spécifiques tels que les protéines allergènes, les protéines marqueurs de maladies
ou les protéines nouvellement exprimées dans les cultures biotechnologiques.
Avant l’analyse, les échantillons nécessitent généralement d’être broyés ou transformés de manière
à faciliter l’extraction de l’analyte hors de la matrice des échantillons. Lors du développement de la
méthode analytique, il est donc essentiel de choisir un tampon d’extraction approprié qui n’interfère
pas avec le bon déroulement de la méthode analytique et qui assure un niveau approprié de stabilité des
analytes pendant l’analyse.
L’analyse immunochimique comprend généralement au moins deux étapes:
— la liaison ou capture de l’analyte d’intérêt présent dans les échantillons avec un anticorps ciblant
spécifiquement l’analyte;
— la détection du complexe anticorps-analyte à l’aide d’une technique qui signale l’interaction
spécifique.
Une fois la méthode analytique développée et optimisée, il convient de la valider pour démontrer que
ses performances sont fiables et adaptées à l’usage prévu et pour caractériser ses limites. Cela implique
d’effectuer plusieurs expériences sur des échantillons réels pour évaluer certains paramètres tels que
l’exactitude, la fidélité, la sensibilité, la sélectivité et les limites de détection ou de quantification. La
validation permet également d’établir les critères de performance de la méthode en fonction desquels
les performances analytiques de routine peuvent être comparées pour l’obtention systématique de
résultats analytiques acceptables.
Le présent document fournit un ensemble de modes opératoires généraux et de considérations
analytiques applicables à l’utilisation de techniques immunochimiques pour analyser les protéines
cibles. Il donne des informations sur le traitement des échantillons, l’extraction, la configuration de
l’analyse, l’interprétation et le compte-rendu des résultats, ainsi que sur les paramètres de performance
d’analyse. Il comprend deux annexes qui contiennent des exemples de modes opératoires qui peuvent
être suivies lors de l’analyse d’une protéine d’intérêt (POI) dans plusieurs matrices de référence en
utilisant des méthodes reposant sur des essais immuno-enzymatiques (ELISA) et des dispositifs
d’immunochromatographie (LFD).
NORME INTERNATIONALE ISO 21572:2019(F)
Produits alimentaire — Analyse des biomarqueurs
moléculaires — Méthodes immunochimiques pour la
détection et la quantification des protéines
1 Domaine d’application
Le présent document énonce des critères de performances pour les méthodes immunochimiques de
détection et/ou de quantification d’une protéine spécifique ou de protéine(s) d’intérêt (POI) dans une
matrice donnée.
Les méthodes décrites sont applicables à l’analyse de protéines provenant de divers types d’échantillons.
Certaines utilisations de ces méthodes comprennent, entre autres, l’analyse des protéines impliquées
dans la production végétale et agroalimentaire, la transformation des aliments, la commercialisation
des produits alimentaires, la sécurité des aliments, les biotechnologies ou l’indexation des maladies.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 16577, ainsi que les suivants,
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
conjugué
matériel produit en liant deux substances ou plus par liaison covalente par l’intermédiaire de groupes
chimiques
Note 1 à l'article: Les conjugués d’anticorps couplés à des fluorochromes (par exemple entité chimique telle
qu’une molécule ou un groupe, qui émet de la lumière en réponse à une excitation par absorption de lumière
incidente), des substances radiomarquées, de l’or ou des enzymes sont souvent utilisés dans les immunoanalyses.
4 Principe
La protéine cible est extraite selon le mode opératoire décrit pour cette matrice spécifique et un
anticorps spécifique est utilisé pour détecter ou mesurer la concentration de la POI présente dans
l’échantillon. La détection de protéines spécifiques dans les ingrédients selon une méthode fondée sur
les protéines repose sur les principes de base suivants:
— prélèvement d’un échantillon représentatif de la matrice;
— extraction des protéines;
— détection et/ou quantification de la protéine spécifique dérivée de la matrice étudiée.
5 Réactifs
Au cours de l’analyse, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
désionisée, distillée, purifiée ou ayant subi un traitement équivalent, sauf indication contraire du
fabricant des réactifs ou du kit.
D’autres réactifs, tels que les anticorps, les conjugués, les substrats, les solutions de blocage et
les tampons sont propres à la méthode. Pour des cas spécifiques de réactifs, tels que des étalons
protéiniques ou des matériaux de référence, des anticorps libres ou sensibilisés sur une surface solide,
des contrôles et des échantillons, se référer à la méthode concernée.
Les réactifs sont spécifiés en A.4.2, A.4.3, B.4.2 et B.4.3.
6 Matériel de laboratoire
Le matériel de laboratoire est spécifié en A.5 et B.5.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document, bien que
l’Annexe A et l’Annexe B donnent des instructions d’échantillonnage conformément aux méthodes
appropriées. Il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
8 Mode opératoire
8.1 Généralités
Les conditions de stockage et la durée de conservation des dispositifs d’immunochromatographie, des
anticorps, du conjugué, du substrat, etc., doivent être clairement spécifiées par le fournisseur.
Utiliser un matériel de laboratoire approprié ayant une faible capacité de liaison des protéines (par
exemple tubes en polypropylène) afin d’empêcher l’adsorption des protéines pendant toute la durée du
mode opératoire.
Dans le cadre de l’utilisation du présent document, les exigences générales relatives à l’assurance qualité
des laboratoires doivent être respectées (par exemple étalonnage de l’appareillage, dosage en double,
essais à blanc, utilisation de matériaux de référence, préparation de courbes d’étalonnage). Nettoyer
avec soin l’ensemble de l’équipement se trouvant en contact direct avec l’échantillon afin d’éviter toute
contamination. Voir l’ISO/IEC 17025 pour plus d’informations.
8.2 Préparation de la solution d’échantillon
Une fois qu’un échantillon représentatif est obtenu, préparer la solution d’échantillon. Les modes
opératoires de préparation de l’échantillon sont décrits dans les Annexes A et B.
Si nécessaire, broyer les échantillons tel que spécifié dans la méthode avant de prélever les prises
d’essai. Les poudres et la farine peuvent présenter des propriétés de gonflement et sont susceptibles de
requérir un volume de solution d’extraction plus élevé si la méthode du fabricant ne précise pas cette
information. Si l’échantillon n’est pas utilisé immédiatement, respecter le mode opératoire de stockage
de votre laboratoire (par exemple −20 °C ou inférieur).
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés

Peser une quantité appropriée (telle que spécifiée en A.6.6.1 et B.6.2.1) d’un échantillon pour essai
représentatif pour analyse en vue d’obtenir une prise d’essai pour extraction. Ajouter la solution
d’extraction, puis homogénéiser ou mélanger.
Les échantillons pour laboratoire renfermant d’importantes quantités de matières grasses peuvent
ne pas s’avérer suffisamment homogènes; il convient, par conséquent, d’extraire une prise d’essai plus
importante pour garantir sa représentativité. Le cas échéant, des instructions peuvent être trouvées
dans les sections relatives à la préparation des échantillons des Annexes A et B.
8.3 Extraction
Suivre un mode opératoire d’extraction adapté à la matrice. Les détails des conditions requises pour
l’extraction ou la dilution des prises d’essai, des contrôles et des matériaux de référence sont indiqués
à l’Annexe A pour la méthode ELISA et à l’Annexe B pour les dispositifs d’immunochromatographie. Il
convient de suivre soigneusement les modes opératoires d’extraction validés pour la matrice. Il convient
d’utiliser immédiatement les échantillons extraits ou de les traiter conformément au mode opératoire
de stockage.
8.4 Préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de
référence
Pour la préparation des courbes d’étalonnage, des contrôles positifs et des matériaux de référence
pour l’Annexe A, il est recommandé d’utiliser des matériaux de référence adaptés à la matrice ou
des matériaux de référence qui ont été validés pour la matrice. Des courbes d’étalonnage ne sont pas
requises pour une application qualitative telle que les dispositifs d’immunochromatographie. Toutefois,
des contrôles positifs et négatifs peuvent être préparés à la discrétion de l’analyste.
8.5 Mode opératoire d’analyse
Pour un essai quantitatif, sélectionner le nombre de puits requis (par exemple dans la méthode ELISA)
pour la (ou les) prise(s) d’essai à analyser, y compris les blancs, les contrôles positifs et les contrôles
négatifs, et ajouter chacun d’entre eux au moins en double, en les diluant correctement pour qu’ils se
situent dans la gamme de l’analyse.
Pour un essai qualitatif ou semi-quantitatif, sélectionner le nombre requis d’essais (par exemple
dispositifs d’immunochromatographie ou méthode ELISA) nécessaires pour les prises d’essai à analyser,
y compris les blancs, les contrôles positifs et les contrôles négatifs. La stabilité du signal final peut
varier. Relever les résultats aux intervalles de temps spécifiés dans les Annexes A et B.
Selon la méthode choisie, respecter les instructions de chaque méthode pour l’analyse des échantillons,
y compris pour les blancs, les matériaux de référence et/ou les étalons de mesure (si nécessaire). Laisser
la réaction se dérouler pendant le laps de temps et dans la plage de température indiqués. Si nécessaire,
terminer la réaction selon la méthode décrite en A.6.6.2.7 et B.6.4.2. Par exemple, si la méthode ELISA
requiert l’acquisition de données sur un spectrophotomètre, effectuer cette étape. En cas d’essais
qualitatifs, respecter les instructions fournies avec le kit. Ces essais sont généralement interprétés
visuellement.
9 Interprétation et expression des résultats
9.1 Généralités
Les paramètres à interpréter varient selon que l’analyse est qualitative, semi-quantitative ou
quantitative.
Pour les méthodes quantitatives, il convient que le coefficient de variation (C ) des valeurs de densité
V
optique résultant de mesures en double d’une solution d’essai d’échantillon ne dépasse pas, en général,
15 %. De manière générale, il convient que le coefficient de variation des concentrations calculées
résultant de mesures en double d’une solution d’essai d’échantillon ne dépasse pas 20 %.
Si la limite du CV est dépassée, il convient de répéter les analyses avec une solution d’essai d’échantillon
fraîchement préparée. Dans ce cas, trois dosages au moins doivent être réalisés pour établir un CV (par
exemple les valeurs de trois puits de microtitration).
Les résultats négatifs doivent être rapportés comme « négatifs à la limite de détection » et la limite de
détection doit être rapportée.
Les résultats positifs situés sous la limite de quantification doivent être rapportés comme étant
« positifs au-dessus de la limite de détection, mais en deçà de la limite de quantification ». Les limites de
quantification et de détection doivent être rapportées.
9.2 Analyse quantitative et semi-quantitative
Les paramètres suivants doivent être évalués pour les analyses quantitatives et semi-quantitatives:
— données brutes obtenues sur la solution d’essai d’échantillon;
— blancs;
— matériaux de référence ou étalons de mesure;
— contrôles négatifs;
— % C entre les réplicats;
V
— % C des étalons;
V
— % C des échantillons de contrôle.
V
Conformément à l’ISO/IEC 17025, il convient, le cas échéant, de consigner l’incertitude de mesure.
Les résultats quantitatifs ne doivent pas être rapportés en extrapolant les chiffres au-delà du point le
plus haut ou en deçà du point le plus bas de la courbe d’étalonnage.
9.3 Analyse qualitative
Pour les essais qualitatifs et toutes les applications s’y rapportant, les paramètres correspondants sont
décrits dans les Annexes A et B. La limite de détection doit être rapportée. Les résultats négatifs doivent
être rapportés comme étant « négatifs à la limite de détection ».
Les résultats positifs doivent également inclure la limite de détection.
10 Paramètres spécifiques pouvant influer sur les résultats
10.1 Généralités
Les critères de performances répertoriés dans la méthode figurant à l’Annexe A constituent un
ensemble de spécifications de performances établies pour chaque méthode au cours du développement,
de la validation et de l’utilisation en routine de la méthode. Ces paramètres doivent être estimés et
évalués pour chaque méthode pour s’assurer qu’ils sont fiables et toujours de grande qualité. À
chaque exécution d’une méthode, évaluer les données générées, puis les comparer avec les critères de
performance définis pour la méthode.
Lorsqu’une valeur (par exemple, le coefficient de variation entre des mesures en double) ne répond
pas aux spécifications d’analyse, le résultat est indiqué comme atypique et une évaluation plus fine des
données est engagée. La liste des spécifications doit être considérée globalement, car si des paramètres,
dans certains cas, peuvent ne pas répondre aux spécifications, les données peuvent néanmoins
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés

demeurer parfaitement acceptables. Lorsqu’un critère quelconque n’est pas satisfait, il convient de le
noter par écrit et d’évaluer les données afin de déterminer s’il convient d’ajuster l’analyse des résultats
ou s’il convient de soumettre à un nouvel essai un échantillon particulier ou un ensemble d’échantillons.
Il convient que de telles décisions dépendent du jugement de l’expert technique interprétant l’ensemble
des critères.
Contrairement à la méthode décrite à l’Annexe A, les critères de performance des essais
d’immunochromatographie tels que décrits à l’Annexe B sont évalués au cours du développement de la
méthode par le fabricant du kit. Il convient d’évaluer la répétabilité de la méthode dans le laboratoire
avant de l’utiliser sur des échantillons pour essai. Les kits donnant de mauvais résultats ne doivent pas
être utilisés.
10.2 Considérations particulières
10.2.1 Sélectivité
L’adéquation de la sélectivité de l’analyse pour un analyte particulier doit être prouvée pour chaque
POI ou analyte (protéine) à mesurer dans chaque matrice soumise à essai. Le cas échéant, il convient
d’évaluer la réactivité croisée lorsqu’il existe des analogues (protéines ayant une séquence ou une
structure similaire). Pour déceler l’absence de POI dans un échantillon n’en contenant pas, analyser
l’échantillon ne contenant pas de POI et un échantillon en contenant selon les dilutions appropriées,
puis comparer les résultats.
Cela est généralement fait au cours du développement et de la validation de la méthode et ne s’avère pas
nécessaire pendant l’analyse de routine d’échantillons pour lesquels la méthode a été préalablement
validée. Il convient que le fabricant du kit fasse état de la sélectivité des kits d’essai, qu’ils utilisent la
méthode ELISA ou l’immunochromatographie (par exemple dans les notices d’utilisation des produits
du fabricant).
10.2.2 Efficacité de l’extraction
Un soin particulier doit être apporté à l’évaluation de l’impact des paramètres du processus appliqué à
la production d’un échantillon pour laboratoire donné.
Pour garantir la sensibilité optimale de l’immunoanalyse, il convient que l’efficacité de l’extraction soit
optimale, en particulier pour les méthodes quantitatives. Les performances de l’analyse dépendent de
la matrice. Il convient de déterminer et de documenter l’efficacité de l’extraction pour chaque matrice.
La preuve de la reproductibilité du mode opératoire d’extraction doit être apportée et il convient que la
méthode d’étalonnage (le cas échéant) tienne compte d’une extraction incomplète.
10.2.3 Effets de matrice
Le domaine d’application définit avec clarté et exactitude les matrices auxquelles l’immunoanalyse
s’applique. L’utilisation de matériaux de référence adaptés à la matrice permet une comparaison
directe entre les matériaux de référence et les échantillons. Toutefois, si les échantillons à analyser sont
comparés à des matériaux de référence présentant une autre matrice, les effets de matrice devront être
évalués.
Par exemple, préparer un extrait négatif pour chaque échantillon (matrice) à analyser par la méthode
et un extrait d’un contrôle positif de concentration connue. Préparer une série de dilutions du contrôle
positif dans l’extrait négatif et comparer la courbe dose-réponse obtenue avec la courbe d’étalonnage
issue de la méthode. Si les deux courbes sont différentes, alors il existe un effet de matrice. Utiliser une
matrice représentant au mieux les échantillons réels qui seront soumis à essai. Il convient également
d’inclure, en tant que référence, une courbe de dilution d’un contrôle positif de concentration connue. Il
convient que l’aspect de la courbe d’étalonnage ne soit pas modifié par les effets de matrice.
10.2.4 Applicabilité de l’analyse
La transformation des aliments entraîne en général une dégradation ou une dénaturation de la POI, qui
est susceptible de provoquer une variation substantielle de l’immunoréactivité. Il convient d’évaluer
l’applicabilité des immunoanalyses à la POI dans les produits transformés.
10.2.5 Effet crochet
Lors de l’analyse avec dispositif d’immunochromatographie basé sur les anticorps dans un format
plaque, un effet crochet (saturation) pourrait produire un résultat faux négatif. Il est nécessaire
de démontrer que la plage de concentration de travail couvre parfaitement le besoin pratique des
échantillons pour essai de POI.
10.2.6 Parallélisme/Linéarité
Pour les analyses quantitatives, il convient que la plage dynamique attendue pour l’immunoanalyse soit
indiquée de manière explicite dans le domaine d’application de l’ensemble des matrices concernées. La
relation entre la réponse de l’instrument et la concentration en POI connue peut ne pas être linéaire et
doit être établie, pour chaque méthode d’immunoanalyse quantitative, par le fabricant. Cette relation
est généralement de type hyperbolique si la concentration en POI est représentée avec une échelle
linéaire, ou de type sigmoïdal avec une échelle de concentration logarithmique. Un modèle de régression
logistique à 4 paramètres ou à 5 paramètres est la meilleure option pour une courbe d’étalonnage de
type ELISA, la partie linéaire située au centre de la courbe sigmoïdale représentant la zone optimale
pour l’analyse quantitative. D’autres modèles de régression (par exemple linéaire, quadratique, logit-
log, spline, polynomial du troisième ordre) peuvent également convenir pour des parties limitées de la
courbe d’étalonnage.
Un minimum de quatre points d’étalonnage, reflétant la partie utilisable de la courbe, doit être évalué
à des fins de quantification, même si un ajustement logistique à 4 paramètres requiert au moins cinq
points et qu’un ajustement logistique à 5 paramètres requiert au moins six points.
10.2.7 Limites de détection
Il convient de ne pas interpréter les résultats en deçà de la limite de détection. Dans ce cas, les résultats
doivent être rapportés conformément à une méthode applicable telle que décrite en 9.1 à 9.3.
10.2.8 Limites de quantification
Les limites de quantification de chaque série d’étalons (ou de dilutions) doivent être indiquées de
manière explicite.
La concentration estimée de solutions d’essai d’échantillon inconnues doit être interpolée et non
extrapolée.
Les résultats situés en deçà de la limite de quantification ou au-delà ou en deçà des points d’étalonnage
supérieurs et inférieurs ne doivent pas être extrapolés.
11 Méthode de confirmation
La crédibilité des analyses peut être établie via d’autres méthodes, telles que la technique par western
blot, la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), la spectrométrie de masse (SM),
ou via une analyse fonctionnelle, afin de mesurer des fractions d’échantillons de concentration connue.
Comparer ensuite les résultats des deux méthodes sur les plans qualitatif et/ou quantitatif. Cet aspect
revêt une importance particulière pour les immunoanalyses, car les anticorps sont susceptibles de
réagir de façon croisée avec les autres analytes présents dans la matrice.
6 © ISO 2019 – Tous droits réservés

12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comporter au moins les informations suivantes:
a) toutes les informations nécessaires à l’identification du laboratoire;
b) toutes les informations nécessaires à l’identification de l’échantillon pour laboratoire;
c) une référence au présent document, c’est-à-dire l’ISO 21572, et à la méthode utilisée, en précisant
s’il s’agit d’une méthode qualitative, quantitative ou semi-quantitative;
d) la limite de détection;
e) les limites supérieure et/ou inférieure de quantification;
f) la date et le type de mode opératoire d’échantillonnage (s’ils sont connus);
g) la date de réception de l’échantillon;
h) la date de mise en analyse ou toute autre documentation appropriée;
i) la quantité de la prise d’essai;
j) la quantité de l’échantillon pour essai;
k) les résultats et les unités dans lesquelles ils sont exprimés;
l) tout point particulier observé pendant l’exécution de l’essai;
m) les limites, si elles sont connues, telles que les éventuelles substances provoquant des réactions
croisées ou la sélectivité de chaque méthode;
n) toute opération non spécifiée dans cette méthode ou considérée comme facultative mais pouvant
avoir une influence sur les résultats.
Annexe A
(informative)
Détection d’une protéine par ELISA
A.1 Généralités
Les méthodes ELISA sont utilisées en routine avec succès pour la détection qualitative ou quantitative
des analytes de protéines.
La plupart des méthodes ELISA commerciales sont applicables à des échantillons peu ou pas traités
et transformés et, de ce fait, dont les POI n’ont pas été dénaturées. Le chauffage, l’ébouillantage
et le séchage ne sont que quelques exemples de conditions auxquelles sont soumis les ingrédients
alimentaires pendant la transformation et qui vont dénaturer les protéines et ainsi influencer ou
fortement diminuer la capacité des réactifs immunologiques utilisés dans les méthodes ELISA à se lier
aux protéines spécifiques à l’état non natif. Il convient de consigner la sélectivité de la méthode car,
dans certains cas, les méthodes ELISA vont également réagir avec des protéines similaires.
Les méthodes ELISA sont utilisées en routine de manière qualitative pour les essais de présence ou
d’absence, mais aussi à des fins de quantification. L’applicabilité à différentes matrices (par exemple les
graines, les feuilles) et cultures est clairement identifiée par le fabricant du kit dans la documentation
fournie avec le kit et doit être étayée par les données de validation de la méthode du fabricant. La limite
de détection (LOD) est définie dans le cadre de ces paramètres. La limite de détection pour un kit ELISA
est en général établie par le fabricant du kit de façon à être conforme à l’expression observée dans la
variété présentant la plus faible expression. La réactivité croisée avec d’autres protéines est examinée.
Les kits ELISA sont disponibles dans le commerce dans le monde entier.
Une utilisation autre de ces kits, sur d’autres cultures et matrices (par exemple des aliments), doit
être étayée par une validation et une détermination de la limite de détection réalisées de manière
indépendante par le laboratoire en charge des essais non indiqués.
A.2 Domaine d’application de la méthode
La présente annexe spécifie un exemple générique de mode opératoire d’utilisation d’une méthode
ELISA pour déterminer si la POI est présente, et pour quantifier la quantité de POI présente dans
l’échantillon. La méthode est applicable aux échantillons peu ou pas traités ou transformés et dont
la POI n’est donc pas dénaturée. Par exemple, les températures élevées auxquelles les ingrédients
alimentaires sont transformés peuvent influer sur la capacité à détecter la POI. Chaque fabricant doit
fournir le mode opératoire de la méthode ELISA avec le kit et spécifier quelle matrice peut être analysée
avec la méthode ELISA ainsi que les critères d’acceptation et de rejet qui ont été définis au cours du
développement et de la validation de la méthode.
A.3 Principe
Une méthode ELISA directe en sandwich est utilisée pour détecter une POI, comme suit et comme
illustré aux Figures A.1 à A.4.
— Étape 1: la surface d’une plaque de microtitration est sensibilisée par un anticorps spécifique de
capture.
— Étape 2: lors de l’ajout de l’échantillon d’intérêt, l’anticorps de capture se lie à l’antigène. Les éléments
non liés de l’échantillon sont éliminés au lavage.
8 © ISO 2019 – Tous droits réservés

— Étape 3: après lavage, un anticorps polyclonal, spécifique d’un second site antigénique sur la POI
fixée et lié par covalence (par exemple) à la peroxydase de raifort (HRP), est ajouté.
— Étape 4: après lavage, le tétraméthylbenzidine (TMB), un substrat chromogénique pour peroxydase
de raifort, est ajouté. La peroxydase de raifort génère un signal coloré proportionnel à la concentration
de l’antigène dans une plage linéaire. Pour stopper le développement de la couleur, une solution de
blocage est ajoutée. Le degré de couleur produit est mesuré à une longueur d’onde de 450 nm.
Figure A.1 — Étape 1
Figure A.2 — Étape 2
Figure A.3 — Étape 3
Figure A.4 — Étape 4
10 © ISO 2019 – Tous droits réservés

A.4 Réactifs
A.4.1 Généralités
Sauf indication contraire, au cours de l’analyse, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l’eau désionisée ou distillée.
Tout écart par rapport aux critères de performances définis peut indiquer un manque de stabilité
du réactif. Par exemple, il convient de ne pas utiliser de tampons troubles ni de solutions troubles de
conjugués.
Il convient de conserver tous les composants du kit entre environ 2 °C et 8 °C. La durée de conservation
des composants du kit est indiquée par une date limite d’utilisation.
Conformément aux instructions de dilution et de stockage fournies avec le kit, la solution mère
d’anticorps conjugué (A.6.3.1) et la solution de travail d’anticorps conjugué (A.6.3.2) peuvent être
conservées entre 2 °C et 8 °C. Il convient également de conserver le tampon de lavage dilué conformément
aux instructions du fabricant ou aux modes opératoires normalisés du laboratoire.
A.4.2 Réactifs et matériel généralement fournis avec le kit d’essai
A.4.2.1 Tampon d’extraction.
A.4.2.2 Tampon d’analyse.
A.4.2.3 Barrettes ou plaques de puits sur lesquels des anticorps sont fixés.
Tous les kits ne contiennent pas forcément des barrettes ou des plaques de puits sur lesquels des
anticorps sont fixés. La fixation d’un anticorps sur les puits d’une barrette ou d’une plaque peut être
réalisée par l’utilisateur lors d’une étape supplémentaire. Les utilisateurs doivent suivre les instructions
du fabricant relatives aux étapes de préparation du tampon de fixation et de fixation sur les puis des
barrettes ou des plaques.
A.4.2.4 Anticorps de détection conjugué.
A.4.2.5 Tampon de diluant du conjugué.
A.4.2.6 Substrat chromogénique.
A.4.2.7 Solution de blocage.
A.4.2.8 Tampon de lavage concentré.
A.4.2.9 Matériaux de référence positifs et négatifs adaptés à la matrice.
A.4.3 Produits chimiques non fournis avec le kit d’essai
A.4.3.1 Alcool, par exemple du méthanol, d’une concentration volumique de 70 %, ou de l’éthanol,
d’une concentration volumique de 95 %.
A.4.3.2 Détergent, pour bain à ultrasons (en option).
A.5 Matériel de laboratoire
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
A.5.1 Réfrigérateur, réglé sur une plage de fonctionnement d’environ 2 °C à 8 °C.
A.5.2 Tubes à centrifuger coniques en polypropylène, avec capuchon à vis, de 15 ml par exemple.
A.5.3 Emballage en plastique ou en aluminium (en option).
A.5.4 Ruban en plastique pour empêcher des mouvements de barrettes au cours du lavage de la
plaque (en option).
A.5.5 Flacon de lavage, d’un volume de 500 ml par exemple.
A.5.6 Pipettes de précision permettant un prélèvement compris, par exemple, entre 20 µl et 500 µl.
A.5.7 Petit agitateur pour échantillons.
A.5.8 Balance, permettant des pesées à 0,01 g près.
A.5.9 Centrifugeuse capable de générer une force centrifuge relative (FCR) d’au moins 5 000g.
A.5.10 Lecteur de plaque de microtitration capable de lire l’absorbance à 450 nm ou à la longueur
d’onde spécifiée dans le kit.
A.5.11 Four à incubation ou bain-marie capable de maintenir une température de 37 °C (si nécessaire).
A.5.12 Tamis d’une ouverture de 450 µm ou équivalent (en option).
A.5.13 Tamis d’une ouverture de 150 µm (100 mailles), ou équivalent (en option).
A.5.14 Pipette multicanaux, de 50 µl à 300 µl par exemple (en option).
A.5.15 Réservoirs à réactif pour distributeur multicanaux (en option).
A.5.16 Laveur de plaque automatisé (en option).
A.5.17 Portoir de tubes à essai pour tubes à centrifuger de 15 ml (en option).
A.5.18 Bain à ultrasons (en option).
A.6 Mode opératoire
AVERTISSEMENT — Il convient de prendre des précautions lors de l’utilisation de solutions de
blocage acides ou de solutions de substrats chromogéniques contenant du tétraméthylbenzidine
(TMB). La ventilation standard de laboratoire est suffisante.
A.6.1 Limites du mode opératoire
Pour les échantillons de produits alimentaires transformés thermiquement et les échantillons
composites de produits alimentaires, la méthode peut ne pas être adaptée, à moins qu’elle ne soit
spécifiquement conçue pour la matrice.
Le kit d’essai ELISA est conçu dans l’optique d’obtenir les meilleurs résultats à une température
ambiante située entre 15 °C et 30 °C. Il convient que l’absorbance du matériau de référence le plus
élevé soit supérieure à une densité optique (DO) de 0,8 et ne se situe pas en dehors de la plage linéaire
12 © ISO 2019 – Tous droits réservés

du lecteur. Au-dessus de 30 °C, les valeurs de DO augmentent plus rapidement et une diminution de
la durée d’incubation du substrat pourrait s’avérer nécessaire. À basses températures (inférieures à
15 °C), il convient d’augmenter la durée d’incubation du su
...