ISO 16954:2015

Dentistry — Test methods for dental unit waterline biofilm treatment

ISO 16954:2015 provides type test methods for evaluating the effectiveness of treatment methods intended to prevent or inhibit the formation of biofilm or to remove biofilm present in dental unit procedural water delivery systems under laboratory conditions. It does not apply to devices intended to deliver sterile procedural water or sterile solution. It also does not apply to lines, tubing, or hoses that deliver compressed air within the dental unit. It does not establish specific upper limits for bacterial contamination or describe test methods to be used in clinical situations. It also does not establish test methods for evaluating any deleterious side effects potentially caused by treatment methods. The test methods provided in ISO 16954:2015 can be used to test other dental equipment that delivers non-sterile water to the oral cavity.

Médecine bucco-dentaire — Méthodes d'essais pour le traitement du biofilm dans les conduites d'eau de l'unit dentaire

L'ISO 16954:2015 propose des méthodes d'essai classiques pour évaluer l'efficacité de méthodes de traitement destinées à prévenir ou inhiber la formation de biofilm ou à éliminer le biofilm présent dans les systèmes d'alimentation en eau à usage opératoire de l'unit dentaire dans des conditions de laboratoire. Elle ne s'applique pas aux dispositifs conçus pour fournir de l'eau à usage opératoire stérile ou une solution stérile. Elle ne s'applique pas non plus aux tubulures, tuyaux ou conduites envoyant de l'air comprimé dans l'unit dentaire. L'ISO 16954:2015 n'établit pas de limites supérieures spécifiques pour la contamination bactérienne et ne décrit pas les méthodes d'essai à utiliser dans un contexte clinique. Elle n'établit pas non plus les méthodes d'essai permettant d'évaluer les effets secondaires délétères potentiellement causés par des méthodes de traitement. Les méthodes d'essai décrites dans l'ISO 16954:2015 peuvent être utilisées pour soumettre à essai tout autre matériel dentaire envoyant de l'eau non stérile dans la cavité buccale.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 17-Jun-2015
• ICS: 11.060.20 - Dental equipment
• Technical Committee: ISO/TC 106/SC 6 - Dental equipment
• Drafting Committee: ISO/TC 106/SC 6/WG 2 - Dental patient chair and dental unit
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 09-Sep-2020
• Completion Date: 09-Sep-2020

RELATIONS

• Replaces: ISO/TS 11080:2009 - Dentistry — Essential characteristics of test methods for the evaluation of treatment methods intended to improve or maintain the microbiological quality of dental unit procedural water
• Effective Date: 05-Nov-2015

Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16954
First edition
2015-07-01
Dentistry — Test methods for dental
unit waterline biofilm treatment
Médecine bucco-dentaire — Méthodes d’essais pour le traitement du
biofilm dans les conduites d’eau de l’unit dentaire
Reference number
ISO 16954:2015(E)
ISO 2015
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ISO 16954:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015, Published in Switzerland

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ii © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 16954:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Treatment methods ........................................................................................................................................................................................... 3

5 Test water and bacterial challenge suspensions ................................................................................................................. 3

5.1 Test water .................................................................................................................................................................................................... 3

5.1.1 Reagents .................................................................................................................................................................................. 3

5.1.2 Preparation of hardness stock solution 1 .................. ................................................................................. 3

5.1.3 Preparation of hardness stock solution 2 .................. ................................................................................. 3

5.1.4 Preparation of test water prior to inoculation ....................................................................................... 3

5.2 Bacterial challenge............................................................................................................................................................................... 4

5.3 Inoculated test water ......................................................................................................................................................................... 4

6 Test apparatus ......................................................................................................................................................................................................... 4

6.1 Test apparatus design ....................................................................................................................................................................... 5

6.1.1 General...................................................................................................................................................................................... 5

6.1.2 Considerations specific to antimicrobial materials and materials which

prevent microbial adhesion.................................................................................................................................... 6

6.2 Test apparatus operation ............................................................................................................................................................... 6

6.2.1 Flow rates ............................................................................................................................................................................... 6

6.2.2 Flow patterns (on-off cycles) ................................................................................................................................ 6

6.2.3 Test environment temperature and preconditioning period .................................................... 7

7 Test procedures ..................................................................................................................................................................................................... 7

7.1 Testing sequence ................................................................................................................................................................................... 7

7.2 Biofilm prevention or inhibition .............................................................................................................................................. 7

7.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 7

7.2.2 Pretreatment of the test apparatuses ............................................................................................................ 8

7.2.3 Concurrent exposure to inoculated test water and the treatment method

for biofilm prevention or inhibition ................................................................................................................ 8

7.2.4 Microbiological sampling and testing ............................................................................................................ 8

7.2.5 Test duration ....................................................................................................................................................................... 8

7.2.6 Analysis of results ........................................................................................................................................................... 9

7.3 Biofilm removal ...................................................................................................................................................................................... 9

7.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 9

7.3.2 Initial microbiological sampling and testing ........................................................................................... 9

7.3.3 Application of the biofilm removal treatment method ................................................................10

7.3.4 Final microbiological sampling and testing ...........................................................................................10

7.3.5 Analysis of results ........................................................................................................................................................10

8 Microbiological sampling and testing .........................................................................................................................................11

8.1 Enumeration of bacteria levels in procedural water ...........................................................................................11

8.1.1 Sampling...............................................................................................................................................................................11

8.1.2 Total viable count test procedure ...................................................................................................................11

8.1.3 Alternative total viable count test procedure ......................................................................................11

8.2 Biofilm on waterline surfaces .................................................................................................................................................12

8.2.1 Sampling...............................................................................................................................................................................12

8.2.2 Biofilm assessment test procedure ...............................................................................................................12

9 Test Report ...............................................................................................................................................................................................................13

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

© ISO 2015 – All rights reserved iii
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ISO 16954:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers

to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 106, Dentistry, Subcommittee SC 6, Dental equipment.

This first edition of ISO 16954:2015 cancels and replaces the first edition of ISO/TS 11080:2009, of which

it constitutes a technical revision.
iv © ISO 2015 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16954:2015(E)
Dentistry — Test methods for dental unit waterline
biofilm treatment
1 Scope

This International Standard provides type test methods for evaluating the effectiveness of treatment

methods intended to prevent or inhibit the formation of biofilm or to remove biofilm present in dental

unit procedural water delivery systems under laboratory conditions.

This International Standard does not apply to devices intended to deliver sterile procedural water or sterile

solution. It also does not apply to lines, tubing, or hoses that deliver compressed air within the dental unit.

This International Standard does not establish specific upper limits for bacterial contamination

or describe test methods to be used in clinical situations. It also does not establish test methods for

evaluating any deleterious side effects potentially caused by treatment methods.

The test methods provided in this International Standard can be used to test other dental equipment

that delivers non-sterile water to the oral cavity.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 1942, Dentistry — Vocabulary

ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 7494-1, Dentistry — Dental units — Part 1: General requirements and test methods

ISO 7494-2, Dentistry — Dental units — Part 2: Water and air supply
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis

IEC 60601-1, Medical electrical equipment — Part 1: General requirements for basic safety and essential

performance
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in IEC 60601-1, ISO 1942, ISO 7494-1,

and ISO 7494-2 and the following apply.
3.1
biofilm

structured community of microorganisms inhabiting a self-developed extracellular biopolymeric matrix

attached to a surface
© ISO 2015 – All rights reserved 1
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ISO 16954:2015(E)
3.2
dental unit

combination of interconnected dental equipment and dental instruments constituting a functional

assembly for use in the provision of dental treatment
[SOURCE: ISO 1942:2009, 2.86]
3.3
dental unit procedural water delivery system

system of components of a dental unit which convey water from a supply source to one or more outlets

used for dental treatment
3.4
procedural water
water supplied by the dental unit for use in the oral cavity

EXAMPLE Handpiece procedural water, multifunctional syringe water, scaler procedural water, or rinse cup

water.
[SOURCE: ISO 7494-2:2003, 3.1]
3.5
surrogate dental unit water system

test apparatus which accurately recreates the procedural water delivery system of a dental unit, including

design, construction, configuration, and operation of all water-bearing elements of the procedural water

delivery system, but not necessarily including other dental unit components which do not directly come

in contact with or control the flow of procedural water
3.6
test water

water having specified chemical and physical characteristics used for testing prior to the addition of the

specified bacterial challenge suspension
3.7
bacterial challenge suspension

consortium of specified bacteria suspended in a nutrient growth medium or buffered solution used to

inoculate test water
3.8
inoculated test water

prepared aqueous suspension used in testing, containing specified amounts of sterilized test water and

one or more bacterial challenge suspension(s)
3.9
test apparatus for the control group

apparatus used in testing in which no treatment method is applied and no antimicrobial material is

present in the waterline components
3.10
test apparatus for the test group

apparatus used in testing in which a treatment specified by the dental unit manufacturer is applied and

any antimicrobial materials specified by the manufacturer are present in the waterline components,

unless otherwise specified in the test requirements
2 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 16954:2015(E)
4 Treatment methods

Depending upon the specific technical approach of a treatment method and its intended benefits, the

performance objectives of a dental unit procedural water delivery system treatment method can include

one or both of the following:

— prevention or inhibition of biofilm formation on surfaces within the dental unit procedural water

delivery system;

— removal of biofilm from surfaces within the dental unit procedural water delivery system.

This International Standard specifies separate test methods for each of the above performance

objectives. These requirements can be expanded upon, for example to include additional replicates

or test scenarios. Additions to the test method shall follow the general principles of this International

Standard and be fully described in the test report.
5 Test water and bacterial challenge suspensions
5.1 Test water
This subclause specifies the preparation of test water prior to inoculation.
5.1.1 Reagents
5.1.1.1 Water, in accordance with ISO 3696:1987, grade 3.

5.1.1.2 Calcium chloride (CaCl ), or an equivalent molar quantity of a calcium chloride hydrate.

5.1.1.3 Magnesium chloride (MgCl ), or an equivalent molar quantity of a magnesium chloride hydrate.

5.1.1.4 Sodium bicarbonate (NaHCO ).

5.1.1.5 Tryptic soy broth (TSB), 1/3-strength, 10,0 g tryptic soy medium per litre broth.

5.1.1.6 Sodium hydroxide (NaOH), 1 mol/l.
5.1.1.7 Hydrochloric acid (HCl), 1 mol/l.
5.1.2 Preparation of hardness stock solution 1

Dissolve 74,0 g of calcium chloride (5.1.1.2) and 31,7 g of magnesium chloride (5.1.1.3) in 1,00 l water

(5.1.1.1). Hardness stock solution 1 shall be sterilized by heat or filter-sterilized using a 0,2 μm microfilter

and used within 24 h or stored at (5 ± 3) °C for up to 6 months.
5.1.3 Preparation of hardness stock solution 2

Dissolve 56,0 g of sodium bicarbonate (5.1.1.4) in 1,00 l water (5.1.1.1). Hardness stock solution 2 shall be

filter-sterilized using 0,2 μm microfilter and used within 24 h or stored at (5 ± 3) °C for up to 6 months.

Hardness stock solution 2 is not to be heat sterilized.
5.1.4 Preparation of test water prior to inoculation

For each litre of test water to be prepared, add 1,00 ml of 1/3-strength TSB (5.1.1.5) and 1,80 ml of

hardness stock solution 1 (5.1.2) to 1,00 l water (5.1.1.1) and steam sterilize. After the sterilized solution

has cooled, for each litre of test water add 4,00 ml of hardness stock solution 2 which has been filter-

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ISO 16954:2015(E)

sterilized using a 0,2 μm microfilter. Adjust the pH to 7,0 to 8,0, measured according to ISO 10523, by

adding sodium hydroxide (5.1.1.6) or hydrochloric acid (5.1.1.7). The test water shall be used within

24 h or stored at (5 ± 3) °C for up to one week.

NOTE 1 The hardness of the prepared test water is approximately 1,8 mmol of calcium ions per litre (equivalent

to approximately 180 mg/l as CaCO ). This corresponds to the upper limit of the generally accepted range for

[17]
hard water.

NOTE 2 The test water has a concentration of approximately 10 mg TSB per litre, which yields a total organic

carbon (TOC) level of approximately 4 mg/l, although the exact TOC level might vary somewhat. This approximate

[1]

TOC level is consistent with the recommended upper limit of 4 mg/l for TOC in chlorinated drinking water and

is included in the test water to reduce the time for biofilm formation.
5.2 Bacterial challenge

Bacterial challenge suspensions used to inoculate the test water shall be prepared with the following

bacteria from the American Type Culture Collection (ATCC) or an international authorized ATCC distributor:

a) Pseudomonas aeruginosa (ATCC #700888);
b) Klebsiella pneumoniae (ATCC #13882).

Alternate strains of P. aeruginosa and K. pneumoniae (i.e. different ATCC numbers for the same bacterium

species) can be substituted if the specified strains are not available, provided that the isolation source

indicated by ATCC is water or a water system.

The bacterium species shall be separately reconstituted in sterilized dilute TSB, having a concentration

of 0,3 g TSB per litre. The reconstituted cultures shall be used within eight transfer passages. Cultivation

of the bacteria for inoculating test water shall be performed one day before preparing the inoculated

test water in accordance with 5.3.

Compliance with appropriate laboratory safety practices is critical when working with these bacteria,

including the handling of waste that can be contaminated with these bacteria.
5.3 Inoculated test water

On days of test apparatus operation inoculated test water shall be prepared within two hours before

the commencement of the daily flow program specified in 6.2.2 by inoculating sterilized test water (5.1)

with both of the reconstituted bacterial cultures (5.2), to achieve a concentration of 5 × 10 CFU/ml to

2 2 3

5 × 10 CFU/ml of each of the bacteria and a total bacterial concentration of 10 CFU/ml to 10 CFU/ml

in the inoculated test water. The temperature of the sterilized test water at the time of inoculation shall

be (23 ± 3) °C.

To ensure accurate concentrations of each bacterium species in the inoculated test water, it can be useful

to centrifuge and re-suspend each of the reconstituted bacterial cultures in sterile phosphate buffer

and determine the approximate bacterial concentration using turbidimetric measurements. Using these

results, the volume of each of the single-species bacterial suspensions to be added to the test water can

be calculated. Alternatively, other methods for achieving the specified inoculation range can be used.

6 Test apparatus

The test apparatuses shall consist of a specified number of either dental units or surrogate dental unit

water systems which closely replicate the dental unit procedural water system.

In order to achieve reproducible results, all components of the test apparatuses which are in contact

with the procedural water shall be new each time the test procedure for biofilm prevention or inhibition

4 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 16954:2015(E)

(7.2) or the sequence of test procedures for biofilm prevention or inhibition (7.2) and for biofilm removal

(7.2) is performed.

NOTE As specified in 7.3.1, the test procedure for biofilm removal (7.3) is performed after first developing

biofilm in the test apparatuses per the test procedure for biofilm prevention or inhibition (7.2).

6.1 Test apparatus design
6.1.1 General

If the test apparatuses consist of dental units, the dental units shall represent the most challenging

model or configuration (when more than one model or configuration is available from the manufacturer).

Length of waterlines, number of branch waterlines and likelihood of stagnation are among the factors

that shall be considered in determining the most challenging model or configuration.

If the test apparatuses consist of surrogate dental unit water systems, the surrogate dental unit water

systems must be able to simulate the basic clinical performance parameters of a functioning dental

unit, including as described in 6.2. The surrogate dental unit water systems must represent the most

challenging model or configuration of the dental unit which the surrogate dental unit water systems are

intended to represent (when more than one model or configuration is available from the manufacturer).

Surrogate dental unit water systems shall accurately recreate the procedural water delivery system,

including design, construction, configuration and operation of the water-bearing elements of the

procedural water delivery system. Other components which do not directly come in contact with or

control the flow of procedural water need not be included, such as structural and decorative components.

The components of surrogate dental unit water systems shall be subject to the same environmental

conditions (i.e. light exposure and temperature) as components in the dental units which they represent.

Any air gap system or other backflow prevention device required to comply with the backflow prevention

requirements of ISO 7494-2 for isolating the procedural water from the incoming water shall be included

in the test apparatuses.

Critical elements to be recreated by the surrogate dental unit water systems includes the following:

— configuration of waterlines (placement of components, arrangement of branch lines, dead legs, etc.);

— tubing diameter(s);
— tubing length(s);
— tubing material(s);

— other components which contact procedural water or regulate flow (control blocks, valves, fittings, etc.);

— location of any water treatment devices (filters, automatic or passive treatment systems).

Dental units or surrogate dental unit water systems shall include at least one hose which in normal

use supplies procedural water to a handpiece and one hose which in normal use supplies procedural

water to a multifunctional (air/water) syringe. Hoses which normally supply procedural water to other

instruments that are attached to the dental unit can be included in the dental units or surrogate dental

unit water systems. Dental handpieces or other instruments or attachments that are normally removed

from the dental unit and sterilized between patients shall be disconnected from the hose and not used

in this test if practical.
EXAMPLE At point C according to ISO 14457:2012, Figure A.1.

Cuspidor bowl rinse waterlines shall be disconnected from dental units or excluded from surrogate

dental unit water systems. Cuspidor cupfill waterlines can be included in dental units or surrogate

dental unit water systems.

NOTE Cuspidor waterlines are permitted to be excluded based on the assumption that other waterlines will

tend to be more challenging test environments for the removal, prevention, and inhibition of biofilm.

© ISO 2015 – All rights reserved 5
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ISO 16954:2015(E)

6.1.2 Considerations specific to antimicrobial materials and materials which prevent

microbial adhesion

If the dental units or surrogate dental unit water systems to be tested include any antimicrobial materials

or materials which prevent microbial adhesion in contact with the procedural water, the following

modifications to the test apparatuses shall be implemented.
Test apparatuses for evaluating biofilm prevention or inhibition:

— Test apparatuses for the control group: Any antimicrobial materials or materials which prevent

microbial adhesion in the dental units or surrogate dental unit water systems in the control

group shall be replaced with materials that do not contain the antimicrobial agent(s) or adhesion

preventive effect, but otherwise closely represent the antimicrobial material.

— Test apparatuses for the test group: The dental units or surrogate dental unit water systems in the

test group shall include (if applicable) the antimicrobial material(s) or material(s) which prevent

microbial adhesion.
Test apparatuses for evaluating biofilm removal:

— Test apparatuses for the test group: Any antimicrobial materials or materials which prevent

microbial adhesion in the dental units or surrogate dental unit water systems in the test group shall

be replaced with materials that do not contain the antimicrobial agent(s) or adhesion preventive

effect, but otherwise closely represent the antimicrobial material. This is essential to evaluating the

ability of the test treatment method to remove biofilm.
6.2 Test apparatus operation
6.2.1 Flow rates

The flow rate of the handpiece procedural water shall be adjusted to (30 ± 3) ml/min.

The water flow rate of the multifunctional (air/water) syringe(s) shall be adjusted to (60 ± 6) ml/min.

If the test apparatuses include other instruments or devices supplied with procedural water, the flow

rate(s) of those instruments or devices shall be adjusted according to manufacturer recommendations.

All flow rates shall be set prior to the start of the test. Flow rates shall be checked and adjusted if

necessary at least once per week throughout the test period.
6.2.2 Flow patterns (on-off cycles)

The test apparatus waterlines shall be operated five consecutive days per week and set idle with no

operation for two consecutive days per week. On days of waterline operation, inoculated test water shall

be freshly prepared according to 5.3 and supplied to the test apparatuses. The water flow pattern shall

be controlled by an automated daily flow program consisting of 30 cycles, which periodically operate

the test apparatus waterlines according to the following schedule.

— The handpiece procedural water shall be operated for 30 sec per cycle. If more than one handpiece

supplying procedural water is present, only one headpiece procedural waterline shall be operated

during each cycle. The selected headpiece procedural waterline shall change sequentially with

each cycle, assuring that each headpiece procedural waterline is operated approximately equally

throughout the daily flow program.

— The syringe water shall be operated for 30 sec per cycle. If more than one syringe is present, only one

syringe shall be operated during each cycle. The selected syringe shall change sequentially with each

cycle, assuring that each syringe is operated approximately equally throughout the daily flow program.

— There shall be a period of 9 min per cycle without any water flow.
6 © ISO 2015 – All rights reserved
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...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16954
Première édition
2015-07-01
Médecine bucco-dentaire —
Méthodes d’essais pour le traitement
du biofilm dans les conduites d’eau
de l’unit dentaire
Dentistry — Test methods for dental unit waterline biofilm treatment
Numéro de référence
ISO 16954:2015(F)
ISO 2015
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ISO 16954:2015(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2015, Publié en Suisse

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ISO 16954:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Méthodes de traitement ................................................................................................................................................................................ 3

5 Eau d’essai et suspensions d’inoculum bactérien .............................................................................................................. 3

5.1 Eau d’essai................................................................................................................................................................................................... 3

5.1.1 Réactifs ..................................................................................................................................................................................... 3

5.1.2 Préparation de la solution mère de dureté 1 ........................................................................................... 3

5.1.3 Préparation de la solution mère de dureté 2 ........................................................................................... 3

5.1.4 Préparation de l’eau d’essai avant l’ensemencement ...................................................................... 4

5.2 Inoculum bactérien ............................................................................................................................................................................. 4

5.3 Eau d’essai ensemencée .................................................................................................................................................................. 4

6 Appareillage d’essai .......................................................................................................................................................................................... 4

6.1 Conception de l’appareillage d’essai .................................................................................................................................... 5

6.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 5

6.1.2 Considérations propres aux agents antimicrobiens et aux agents

empêchant l’adhésion microbienne ................................................................................................................ 6

6.2 Fonctionnement de l’appareillage d’essai ....................................................................................................................... 6

6.2.1 Débits ......................................................................................................................................................................................... 6

6.2.2 Profils d’écoulement (cycles marche/arrêt) ............................................................................................ 7

6.2.3 Température de l’environnement d’essai et période de préconditionnement .......... 7

7 Modes opératoires d’essai .......................................................................................................................................................................... 7

7.1 Ordre des essais ..................................................................................................................................................................................... 7

7.2 Prévention ou inhibition du biofilm ..................................................................................................................................... 7

7.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

7.2.2 Prétraitement des appareils d’essai ................................................................................................................ 8

7.2.3 Exposition simultanée à l’eau d’essai ensemencée et à la méthode de

traitement pour la prévention ou l’inhibition du biofilm ............................................................. 8

7.2.4 Échantillonnage et essais microbiologiques ............................................................................................ 8

7.2.5 Durée de l’essai ................................................................................................................................................................. 9

7.2.6 Analyse des résultats .................................................................................................................................................... 9

7.3 Élimination du biofilm ...................................................................................................................................................................... 9

7.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9

7.3.2 Échantillonnage et essais microbiologiques initiaux ....................................................................10

7.3.3 Application de la méthode de traitement pour l’élimination du biofilm .....................10

7.3.4 Échantillonnage et essais microbiologiques finaux ........................................................................10

7.3.5 Analyse des résultats .................................................................................................................................................11

8 Échantillonnage et essais microbiologiques ........................................................................................................................11

8.1 Dénombrement des concentrations bactériennes dans l’eau à usage opératoire .....................11

8.1.1 Échantillonnage .............................................................................................................................................................11

8.1.2 Mode opératoire d’essai pour le dénombrement total de colonies viables ...............12

8.1.3 Autre mode opératoire d’essai pour le dénombrement total de colonies viables 12

8.2 Caractérisation du biofilm sur les surfaces des canalisations d’eau .....................................................12

8.2.1 Échantillonnage .............................................................................................................................................................12

8.2.2 Mode opératoire d’essai pour la caractérisation du biofilm ...................................................12

9 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................13

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
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ISO 16954:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les

références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration

du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par

l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour

information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de

la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant

les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations

supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 106, Médecine bucco-dentaire, sous-

comité SC 6, Matériel dentaire.

Cette première édition de l’ISO 16954:2015 annule et remplace la première édition de l’ISO/TS 11080:2009

qui a fait l’objet d’une révision technique.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16954:2015(F)
Médecine bucco-dentaire — Méthodes d’essais pour le
traitement du biofilm dans les conduites d’eau de l’unit
dentaire
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale propose des méthodes d’essai classiques pour évaluer l’efficacité de

méthodes de traitement destinées à prévenir ou inhiber la formation de biofilm ou à éliminer le biofilm

présent dans les systèmes d’alimentation en eau à usage opératoire de l’unit dentaire dans des conditions

de laboratoire.

Elle ne s’applique pas aux dispositifs conçus pour fournir de l’eau à usage opératoire stérile ou une

solution stérile. Elle ne s’applique pas non plus aux tubulures, tuyaux ou conduites envoyant de l’air

comprimé dans l’unit dentaire.

La présente Norme internationale n’établit pas de limites supérieures spécifiques pour la contamination

bactérienne et ne décrit pas les méthodes d’essai à utiliser dans un contexte clinique. Elle n’établit pas

non plus les méthodes d’essai permettant d’évaluer les effets secondaires délétères potentiellement

causés par des méthodes de traitement.

Les méthodes d’essai décrites dans la présente Norme internationale peuvent être utilisées pour

soumettre à essai tout autre matériel dentaire envoyant de l’eau non stérile dans la cavité buccale.

2 Références normatives

Les documents suivants, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent

document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée

s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y

compris les éventuels amendements).
ISO 1942, Médecine bucco-dentaire — Vocabulaire

ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai

ISO 7494-1, Médecine bucco-dentaire — Units dentaires — Partie 1: Exigences générales et méthodes d’essai

ISO 7494-2, Médecine bucco-dentaire Units dentaires — Partie 2: Alimentation en eau et en air

ISO 10523, Qualité de l’eau — Détermination du pH
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique

IEC 60601-1, Appareils électromédicaux — Partie 1: Exigences générales pour la sécurité de base et les

performances essentielles
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’IEC 60601-1, l’ISO 1942,

l’ISO 7494-1 et l’ISO 7494-2, ainsi que les suivants s’appliquent.
3.1
biofilm

communauté structurée de micro-organismes vivant dans une matrice biopolymère extracellulaire

synthétisée par la matrice et adhérente à une surface
© ISO 2015 – Tous droits réservés 1
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ISO 16954:2015(F)
3.2
unit dentaire

ensemble de matériel dentaire et d’instruments dentaires interconnectés, constituant un ensemble

fonctionnel utilisable dans le traitement dentaire
[SOURCE: ISO 1942:2009, 2.86]
3.3
système d’alimentation en eau à usage opératoire de l’unit dentaire

système de composants d’un unit dentaire qui transporte de l’eau d’une source d’alimentation vers une

ou plusieurs sorties utilisées pour les soins dentaires
3.4
eau à usage opératoire

eau fournie par l’unit dentaire et destinée à être utilisée dans la cavité buccale

EXEMPLE Eau à usage opératoire de la pièce à main, eau de seringue multifonctionnelle, eau à usage

opératoire du détartreur ou eau de remplissage du gobelet.
[SOURCE: ISO 7494-2:2003, 3.1]
3.5
système d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire

appareil d’essai qui recrée avec précision le système d’alimentation en eau à usage opératoire d’un

unit dentaire, notamment la conception, la construction, la configuration et le fonctionnement de tous

les éléments aquifères du système d’alimentation en eau à usage opératoire, mais pas nécessairement

d’autres composants de l’unit dentaire qui ne sont pas en contact direct avec l’écoulement d’eau à usage

opératoire ou ne le contrôle pas
3.6
eau d’essai

eau ayant des caractéristiques physico-chimiques spécifiées, utilisée pour les essais avant l’ajout de la

suspension d’inoculum bactérien spécifiée
3.7
suspension d’inoculum bactérien

consortium de bactéries spécifiées en suspension dans un milieu de culture nutritif ou une solution

tampon, utilisé pour ensemencer l’eau d’essai
3.8
eau d’essai ensemencée

suspension aqueuse préparée, utilisée lors des essais et contenant des quantités spécifiées d’eau d’essai

stérilisée et une ou plusieurs suspension(s) d’inoculum bactérien
3.9
appareillage d’essai pour le groupe témoin

appareillage utilisé lors d’essais au cours desquels aucune méthode de traitement n’est appliquée et

aucun agent antimicrobien n’est ajouté dans les composants de la canalisation d’eau

3.10
appareillage d’essai pour le groupe d’essai

appareillage utilisé lors d’essais au cours desquels une méthode de traitement spécifiée par le fabricant

de l’unit dentaire est appliquée et des agents antimicrobiens spécifiés par le fabricant sont ajoutés dans

les composants de la canalisation d’eau, sauf si les exigences d’essai indiquent le contraire

2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 16954:2015(F)
4 Méthodes de traitement

Selon l’approche technique spécifique d’une méthode de traitement et de ses bénéfices attendus, les

objectifs de performance d’un système d’alimentation en eau à usage opératoire d’un unit dentaire

peuvent inclure l’un des objectifs suivants, ou les deux:

— prévention ou inhibition de la formation de biofilm sur les surfaces du système d’alimentation en

eau à usage opératoire de l’unit dentaire;

— élimination du biofilm des surfaces du système d’alimentation en eau à usage opératoire de

l’unit dentaire.

La présente Norme internationale spécifie différentes méthodes d’essai adaptées à chacun des objectifs

de performance susmentionnés. Ces exigences peuvent être élargies, par exemple pour inclure d’autres

réplicats ou scénarios d’essai. Tout ajout à la méthode d’essai doit être conforme aux principes généraux

de la présente Norme internationale et être décrit en détail dans le rapport d’essai.

5 Eau d’essai et suspensions d’inoculum bactérien
5.1 Eau d’essai
Ce paragraphe spécifie la préparation de l’eau d’essai avant l’ensemencement.
5.1.1 Réactifs
5.1.1.1 Eau, de qualité 3 conformément à l’ISO 3696:1987.

5.1.1.2 Chlorure de calcium (CaCl ), ou quantité molaire équivalente de chlorure de calcium hydraté.

5.1.1.3 Chlorure de magnésium (MgCl ), ou quantité molaire équivalente de chlorure de

magnésium hydraté.
5.1.1.4 Bicarbonate de sodium (NaHCO ).

5.1.1.5 Bouillon trypticase soja (TSB), concentration 1/3, 10,0 g de bouillon trypticase soja par litre.

5.1.1.6 Hydroxyde de sodium (NaOH), 1 mol/l.
5.1.1.7 Acide chlorhydrique (HCl), 1 mol/l.
5.1.2 Préparation de la solution mère de dureté 1

Dissoudre 74,0 g de chlorure de calcium (5.1.1.2) et 31,7 g de chlorure de magnésium (5.1.1.3) dans 1,00 l

d’eau (5.1.1.1). La solution mère de dureté 1 doit être stérilisée à la chaleur ou stérilisée par filtration sur

un micromètre de 0,2 µm et utilisée dans les 24 heures ou conservée à (5 ± 3) °C pendant 6 mois maximum.

5.1.3 Préparation de la solution mère de dureté 2

Dissoudre 56,0 g de bicarbonate de sodium (5.1.1.4) dans 1,00 l d’eau (5.1.1.1). La solution mère de dureté

2 doit être stérilisée par filtration sur un microfiltre de 0,2 µm et utilisée dans les 24 h ou conservée à

(5 ± 3) °C pendant 6 mois maximum. La solution mère de dureté 2 ne doit pas être stérilisée à la chaleur.

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ISO 16954:2015(F)
5.1.4 Préparation de l’eau d’essai avant l’ensemencement

Pour chaque litre d’eau d’essai à préparer, ajouter 1,00 ml de TSB de concentration 1/3 (5.1.1.5) et

1,80 ml de solution mère de dureté 1 (5.1.2) à 1,00 l d’eau (5.1.1.1) et stériliser à la vapeur. Une fois que la

solution stérilisée a refroidi, ajouter, pour chaque litre d’eau d’essai, 4,00 ml de solution mère de dureté 2

stérilisée par filtration sur un microfiltre de 0,2 µm. Ajuster le pH entre 7,0 et 8,0, mesuré conformément

à l’ISO 10523, en ajoutant de l’hydroxyde de sodium (5.1.1.6) ou de l’acide chlorhydrique (5.1.1.7). L’eau

d’essai doit être utilisée dans les 24 h ou doit être conservée à (5 ± 3) ˚C pendant 1 semaine maximum.

NOTE 1 La dureté de l’eau d’essai préparée est d’environ 1,8 mmol d’ions calcium par litre (soit environ 180 mg/l

[17]

de CaCO ). Cela correspond à la limite supérieure de la plage généralement acceptable pour l’eau dure .

NOTE 2 L’eau d’essai a une concentration d’environ 10 mg de TSB par litre, ce qui produit une teneur en carbone

organique total (COT) d’environ 4 mg/l, bien que la teneur exacte en COT puisse varier un peu. Cette teneur

approximative en COT est conforme à la limite supérieure recommandée de 4 mg/l pour le COT présent dans l’eau

[1]

potable chlorée et est incluse dans l’eau d’essai pour réduire la durée de formation du biofilm.

5.2 Inoculum bactérien

Les suspensions d’inoculum bactérien utilisées pour ensemencer l’eau d’essai doivent être préparées

avec les bactéries suivantes provenant de l’American Type Culture Collection (ATCC) ou d’un distributeur

international ATCC agréé:
a) Pseudomonas aeruginosa (ATCC #700888);
b) Klebsiella pneumoniae (ATCC #13882).

D’autres souches de P. aeruginosa et K. pneumoniae (c’est-à-dire d’autres numéros ATCC provenant de la

même espèce bactérienne) peuvent être utilisées en remplacement si les souches spécifiées ne sont pas

disponibles, à condition que la source d’isolement indiquée par l’ATCC soit de l’eau ou un milieu aqueux.

Les espèces bactériennes doivent être cultivées séparément dans un TSB dilué stérilisé ayant une

concentration de 0,3 grammes de TSB par litre. Les cultures doivent être utilisées dans les huit (8)

repiquages. La culture des bactéries inoculant l’eau d’essai doit être réalisée un jour avant de préparer

l’eau d’essai ensemencée selon 5.3.

Le respect des pratiques appropriées de sécurité du laboratoire est crucial lors de l’utilisation de ces

bactéries, notamment lors de la manipulation de déchets susceptibles d’être contaminés par ces bactéries.

5.3 Eau d’essai ensemencée

Les jours de fonctionnement de l’appareillage d’essai, l’eau d’essai ensemencée doit être préparée dans

les deux (2) heures précédant le début du programme de débit journalier spécifié en 6.2.2. Pour ce faire,

ensemencer l’eau d’essai stérilisée (5.1) avec les deux cultures bactériennes (5.3), de façon à obtenir une

1 2

concentration de 5 × 10 UFC/ml à 5 x 10 UFC/ml pour chaque culture bactérienne et une concentration

2 3

bactérienne totale de 10 UFC/ml à 10 UFC/ml dans l’eau d’essai ensemencée. La température de l’eau

d’essai stérilisée lors de l’ensemencement doit être de (23 ± 3) °C.

Pour garantir des concentrations exactes de chaque espèce bactérienne dans l’eau d’essai ensemencée,

il peut être utile de centrifuger chacune des cultures bactériennes et de les remettre en suspension

dans un tampon phosphate stérile et de déterminer la concentration bactérienne approximative à l’aide

de mesures turbidimétriques. À l’appui de ces résultats, le volume de chaque suspension bactérienne

monospécifique à ajouter à l’eau d’essai peut être calculé. D’autres méthodes peuvent également être

utilisées pour obtenir l’intervalle d’ensemencement spécifié.
6 Appareillage d’essai

L’appareillage d’essai doit comprendre un nombre spécifié d’units dentaires ou de systèmes d’essai

d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire qui reproduisent fidèlement le système d’approvisionnement

en eau à usage opératoire de l’unit dentaire.
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ISO 16954:2015(F)

Pour obtenir des résultats reproductibles, tous les composants de l’appareillage d’essai en contact avec

l’eau à usage opératoire doivent être neufs chaque fois que le mode opératoire d’essai pour la prévention

ou l’inhibition du biofilm (7.2) ou la séquence des modes opératoires d’essai pour la prévention ou

l’inhibition du biofilm (7.2) et pour l’élimination des biofilms (7.2) est réalisé.

NOTE Le mode opératoire d’essai pour l’élimination du biofilm (7.3) est réalisé après le premier développement

du biofilm dans les appareils d’essai par le mode opératoire d’essai pour la prévention ou l’inhibition du biofilm

(7.2), tel que spécifié en 7.3.1.
6.1 Conception de l’appareillage d’essai
6.1.1 Généralités

Si l’appareillage d’essai comprend des units dentaires, ces derniers doivent représenter le modèle ou

la configuration le/la plus complexe (lorsque plusieurs modèles ou configurations sont proposé(e)s

par le fabricant). La longueur des canalisations d’eau, le nombre canalisations d’eau de dérivation et la

propension à la stagnation figurent parmi les facteurs à prendre en compte lors de la détermination du

modèle ou de la configuration le/la plus complexe.

Si l’appareillage d’essai comprend des systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire, ces

derniers doivent pouvoir reproduire les paramètres de performance clinique de base d’un unit dentaire

en fonctionnement, notamment comme décrit en 6.2. Les systèmes d’essai d’approvisionnement en

eau de l’unit dentaire constituent le modèle ou la configuration le/la plus complexe de l’unit dentaire

que les systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire sont destinés à représenter

(lorsque plusieurs modèles ou configurations sont proposé(e)s par le fabricant). Les systèmes d’essai

d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire doivent recréer avec précision le système d’alimentation

en eau à usage opératoire, y compris la conception, la construction, la configuration et le fonctionnement

des éléments aquifères du système d’alimentation en eau à usage opératoire. Les autres composants

qui ne sont pas en contact direct avec l’écoulement d’eau à usage opératoire ou qui ne le contrôlent pas

n’ont pas besoin d’être inclus, par exemple les composants structurels et décoratifs. Les composants

des systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire doivent être soumis aux mêmes

conditions environnementales (par exemple, exposition à la lumière et température) que les composants

des units dentaires qu’ils représentent.

Tout système d’espacement ou tout autre dispositif de prévention du reflux devant être conforme aux

exigences de prévention du reflux de l’ISO 7494-2 pour isoler l’eau à usage opératoire de l’eau d’entrée

doit être inclus dans l’appareillage d’essai.

Les éléments cruciaux devant être recréés par les systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit

dentaire comprennent:

— la configuration des canalisations d’eau (placement des composants, agencements des dérivations,

espaces morts, etc.),
— le(s) diamètre(s) des tuyaux,
— la ou les longueur(s) des tuyaux,
— le(s) matériau(x) des tuyaux,

— les autres composants qui sont en contact avec l’eau à usage opératoire ou qui régulent le débit

(blocs de contrôle, vannes, raccords, etc.)

— l’emplacement des dispositifs de traitement des eaux (filtres, systèmes de traitement

automatiques ou passifs).

Les units dentaires ou les systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire doivent inclure

au moins une pièce à main distribuant de l’eau à usage opératoire et une seringue multifonctionnelle

(air/eau). Les autres instruments fixés à l’unit dentaire peuvent être inclus dans les units dentaires ou

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ISO 16954:2015(F)

dans les systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire. Les pièces à main dentaires ou

les autres instruments raccordés à l’unit dentaire doivent être déconnectés de la conduite si possible.

EXEMPLE Au point C selon l’ISO 14457:2012, Figure A.1.

Les canalisations d’eau de rinçage du crachoir doivent être déconnectées des units dentaires ou exclues

des systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire. Les canalisations d’eau de rinçage

du crachoir peuvent être incluses dans les units dentaires ou les systèmes d’essai d’approvisionnement

en eau de l’unit dentaire.

NOTE Les canalisations d’eau du crachoir peuvent être exclues en partant de l’hypothèse selon laquelle les

autres canalisations d’eau auront tendance à être des environnements d’essai plus complexes pour l’élimination,

la prévention et l’inhibition du biofilm.
6.1.2 Considérations propres aux agents antimicrobiens et aux agents empêchant
l’adhésion microbienne

Si les units dentaires ou les systèmes d’essai d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire devant

être soumis à essai comprennent des agents antimicrobiens ou des agents empêchant l’adhésion

microbienne en contact avec l’eau à usage opératoire, les modifications suivantes doivent être apportées

à l’appareillage d’essai.
Appareillage d’essai pour évaluer la prévention ou l’inhibition du biofilm:

— Appareillage d’essai pour le groupe témoin: Les agents antimicrobiens ou les agents empêchant

l’adhésion microbienne dans les units dentaires ou dans les systèmes d’essai d’approvisionnement

en eau de l’unit dentaire du groupe témoin doivent être remplacés par des agents qui ne contiennent

pas l’/les agent(s) antimicrobien(s) ou l’/les agent(s) empêchant l’adhésion microbienne, mais doivent

représenter fidèlement l’agent antimicrobien.

— Appareillage d’essai pour le groupe d’essai: Les units dentaires ou les systèmes d’essai

d’approvisionnement en eau de l’unit dentaire du groupe d’essai doivent inclure (le cas échéant) l’/

les agent(s) antimicrobien(s) ou l’/les agent(s) empêchant l’adhésion microbienne.

Appareillage d’essai pour évaluer l’élimination du biofilm:

— Appareillage d’essai pour le groupe d’essai: Les agents antimicrobiens ou les agents empêchant

l’adhésion microbienne dans les units dentaires ou dans les systèmes d’essai d’approvisionnement

en eau de l’unit dentaire du groupe d’essai doivent être remplacés par des agents qui ne contiennent

pas l’/les agent(s)
...