ISO 18363-3:2017

Animal and vegetable fats and oils — Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS — Part 3: Method using acid transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol

ISO 18363-3:2017 specifies a procedure for the simultaneous determination of 2-MCPD esters (bound 2-MCPD), 3‐MCPD esters (bound 3‐MCPD) and glycidyl esters (bound glycidol) in a single assay, based on acid catalysed ester cleavage and derivatization of cleaved (free) analytes with phenylboronic acid (PBA) prior to GC/MS analysis. ISO 18363-3:2017 is applicable to solid and liquid fats and oils. For all three analytes the limit of quantification (LOQ) is 0,1 mg/kg and the limit of detection (LOD) is 0,03 mg/kg.

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des esters de chloropropanediols (MCPD) et d'acides gras et des esters de glycidol et d'acides gras par CPG/SM — Partie 3: Méthode par transestérification acide et mesure du 2-MCPD, du 3-MCPD et du glycidol

ISO 18363-3:2017 spécifie un mode opératoire permettant la détermination simultanée des esters de 2-MCPD (2-MCPD lié), des esters de 3-MCPD (3-MCPD lié) et des esters de glycidol (glycidol lié) en un seul essai, basé sur le clivage des esters par catalyse acide et la dérivatisation des analytes clivés (libres) à l'acide phénylboronique (PBA) avant analyse par CPG/SM. ISO 18363-3:2017 est applicable aux corps gras solides et liquides. Pour l'ensemble des trois analytes, la limite de quantification (LOQ) est de 0,1 mg/kg et la limite de détection (LOD) est de 0,03 mg/kg.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 06-Dec-2017
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9060 - Close of review
• Start Date: 03-Jun-2028

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18363-3
First edition
2017-12
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of fatty-acid-bound
chloropropanediols (MCPDs) and
glycidol by GC/MS —
Part 3:
Method using acid transesterification
and measurement for 2-MCPD,
3-MCPD and glycidol
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des
esters de chloropropanediols (MCPD) et d'acides gras et des esters de
glycidol et d'acides gras par CPG/SM —
Partie 3: Méthode par transestérification acide et mesure pour le
2-MCPD, le 3-MCPD et le glycidol
Reference number
ISO 18363-3:2017(E)
©
ISO 2017

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ISO 18363-3:2017(E)

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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
5.1 Standard and reference compounds . 2
5.2 Standard solutions . 3
5.2.1 General. 3
5.2.2 Stock solutions (1 mg/ml) . 3
5.2.3 Working solutions . 3
5.3 Other reagents . 4
5.4 Reagent solutions . 4
6 Apparatus . 5
7 Sample . 5
7.1 Sampling . 5
7.2 Preparation of the test sample . 5
8 Procedure. 6
8.1 Test sample preparation . 6
8.2 Preparation of the calibration curve . 7
8.3 Gas chromatography/mass spectrometry references . 7
9 Expression of results . 8
9.1 Quantification of 3-MCPD esters . 8
9.2 Quantification of 2-MCPD esters . 9
9.3 Quantification of glycidyl esters . 9
10 Precision .10
10.1 General .10
10.2 Repeatability .10
10.3 Between-day reproducibility .10
11 Test report .11
Annex A (informative) Construction of the calibration curves .12
Annex B (informative) Results of the interlaboratory test .16
Bibliography .18
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ISO 18363-3:2017(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils.
A list of all parts in the ISO 18363 series can be found on the ISO website.
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ISO 18363-3:2017(E)

Introduction
The ISO 18363 series is a family of International Standards which can be used for the determination of
ester-bound MCPD and glycidol. This introduction describes the methods specified in the three documents
currently published or proposed so that the analyst can decide which methods are suitable for application.
The detailed application of each method is contained within the scope of the individual method.
ISO 18363-1 is a differential method equivalent to the DGF standard C-VI 18 (10) and identical to AOCS
Official Method Cd 29c-13. Briefly, it is based on a fast alkaline catalysed release of 3-MCPD and glycidol
from the ester derivatives. Glycidol is subsequently converted into induced 3-MCPD. It consists of two
parts. The first part (A) allows the determination of the sum of ester-bound 3-MCPD and ester-bound
glycidol, whereas the second part (B) determines ester-bound 3-MCPD only. Both assays are based
on the release of the target analytes 3-MCPD and glycidol from the ester-bound form by an alkaline
catalysed alcoholysis carried out at room temperature. In part A, an acidified sodium chloride solution
is used to stop the reaction and subsequently convert the glycidol into induced 3-MCPD. Thus, 3-MCPD
and glycidol become indistinguishable in part A. In part B, the reaction stop is achieved by the addition
of an acidified chloride-free salt solution which also prevents the conversion of glycidol into induced
MCPD. Thereby, part B allows the determination of the genuine 3-MCPD content. Finally, the glycidol
content of the sample is proportional to the difference of both assays (A – B) and can be calculated
when the transformation ratio from glycidol to 3-MCPD has been determined. ISO 18363-1 is applicable
to the fast determination of ester-bound 3-MCPD and glycidol in refined and non-refined vegetable oils
and fats. ISO 18363-1 can also apply to animal fats and used frying oils and fats, but a validation study
has to be undertaken before the analysis of these matrices. Any free analytes within the sample would
be included in the results, but the document does not allow the distinction between free and bound
analytes. However, as of publication, research has not shown any evidence of a free analyte content as
high as the esterified analyte content in refined vegetable oils and fats. In principle, ISO 18363-1 can
also be modified in such a way that the determination of 2-MCPD is feasible, but again, a validation
study has to be undertaken before the analysis of this analyte.
ISO 18363-2 (proposed) will represent AOCS Official Method Cd 29b-13. Briefly, it will be based on a slow
alkaline release of MCPD and glycidol from the ester derivatives. Glycidol is subsequently converted
into 3-MBPD. ISO 18363-2 will consist of two sample preparations that differ in the use of internal
standards. Both preparations will be used for the determination of ester-bound 2-MCPD and 3-MCPD.
In part A, a preliminary result for ester-bound glycidol will be determined. Because the 3-MCPD present
in the sample will be converted to some minor extent into induced glycidol by the sample preparation,
part B will serve to quantify this amount of induced glycidol that is subsequently subtracted from the
preliminary glycidol result of part A. By the use of isotopically labelled free MCPD isomers in assay A
and isotopically labelled ester-bound 2-MCPD and 3-MCPD in part B, the efficiency of ester cleavage will
be able to be monitored. Both assays A and B will be based on the release of the target analytes 2-MCPD,
3-MCPD, and glycidol from the ester-bound form by a slow alkaline catalysed alcoholysis in the cold.
In both sample preparations, the reaction will be stopped by the addition of an acidified concentrated
sodium bromide solution so as to convert the unstable and volatile glycidol into 3-MBPD which shows
comparable properties to 3-MCPD with regard to its stability and chromatographic performance.
Moreover, the major excess of bromide ions will prevent the undesired formation of 3-MCPD from
glycidol in the case of samples which contain naturally occurring amounts of chloride. ISO 18363-2
will be applicable to the determination of ester-bound 3-MCPD, 2-MCPD, and glycidol in refined and
unrefined vegetable oils and fats. It will also apply to animal fats and used frying oils and fats, but a
validation study will have to be undertaken before the analysis of these matrices. Any free analytes
within the sample would be included in the results, but the document will not allow the distinction
between free and bound analytes. However, as of publication of this document, research has not shown
any evidence of a free analyte content as high as the esterified analyte content in vegetable oils and fats.
This document represents AOCS Official Method Cd 29a-13. Briefly, it is based on the conversion
of glycidyl esters into 3-MBPD esters and a slow acid catalysed release of MCPD and MBPD from the
ester derivatives. This document is based on a single sample preparation in which glycidyl esters are
converted into MBPD monoesters, and subsequently, the free analytes 2-MCPD, 3-MCPD, and 3-MBPD
are released by a slow acid catalysed alcoholysis. The 3-MBPD represents the genuine content of bound
glycidol. This document can be applied for the determination of ester-bound 2-MCPD, 3-MCPD, and
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ISO 18363-3:2017(E)

glycidol in refined and non-refined vegetable oils and fats. It can also apply to animal fats and used
frying oils and fats, but a validation study has to be undertaken before the analysis of these matrices.
The method is suited for the analysis of bound (esterified) analytes, but if required, this document
can be also performed without the initial conversion of glycidyl esters. In such a setup, both free and
bound 2-MCPD and 3-MCPD forms would be included in the results and the amount of free analytes can
be calculated as a difference between two determinations performed in both setups. However, as of
publication of this document, research has not shown any evidence of a free analyte content as high as
the esterified analyte content in vegetable oils and fats.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18363-3:2017(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol
by GC/MS —
Part 3:
Method using acid transesterification and measurement
for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol
1 Scope
This document specifies a procedure for the simultaneous determination of 2-MCPD esters (bound
2-MCPD), 3-MCPD esters (bound 3-MCPD) and glycidyl esters (bound glycidol) in a single assay, based
on acid catalysed ester cleavage and derivatization of cleaved (free) analytes with phenylboronic
acid (PBA) prior to GC/MS analysis.
This document is applicable to solid and liquid fats and oils. For all three analytes the limit of
quantification (LOQ) is 0,1 mg/kg and the limit of detection (LOD) is 0,03 mg/kg.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
3.1
bound 2-MCPD
amount of 2-MCPD cleaved from its esterified (bound) forms by acid catalysed transesterification
according to the reference method
Note 1 to entry: The content of 2-MCPD is calculated and reported as a mass fraction, in milligrams per
kilogram (mg/kg).
3.2
bound 3-MCPD
amount of 3-MCPD cleaved from its esterified (bound) forms by acid catalysed transesterification
according to the reference method
Note 1 to entry: The content of 3-MCPD is calculated and reported as a mass fraction, in milligrams per
kilogram (mg/kg).
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ISO 18363-3:2017(E)

3.3
bound glycidol
amount of glycidol cleaved from its esterified (bound) forms by acid catalysed transesterification
according to the reference method
Note 1 to entry: The content of glycidol is calculated and reported as a mass fraction, in milligrams per
kilogram (mg/kg).
4 Principle
The oil/fat sample is dissolved in tetrahydrofuran, and the internal standards (pentadeuterated 3-MCPD
diester and pentadeuterated glycidyl ester) are added. During the first step of sample preparation,
glycidyl esters are converted into 3-MBPD monoesters by the addition of an acidified solution of sodium
bromide. Upon completion of the reaction, the organic phase, containing 2- and 3-MCPD esters and
3-MBPD esters, is separated and evaporated to dryness. In the second step the residue is dissolved
in tetrahydrofuran and the acid transesterification is initiated by the addition of an acid alcoholic
solution. After 16 h incubation at 40 °C, the sample mixture is neutralized and the fatty acid methyl
esters generated during the transesterification are removed. Finally, the purified sample [containing
cleaved (free) analytes] is derivatized with phenylboronic acid prior to GC/MS analysis.
The quantification of 2- and 3-MCPD esters (expressed as bound 2- and 3-MCPD) is based on the
2-MCPD/3-MCPD-d5 and 3-MCPD/3-MCPD-d5 signal ratio, respectively. The quantification of glycidyl
esters (expressed as bound glycidol) is based on the 3-MBPD/3-MBPD-d5 signal ratio.
This method allows the simultaneous quantification of all three analytes in a single assay.
5 Reagents
WARNING — This document requires handling of hazardous substances. Technical,
organizational, and personal safety measures shall be followed.
Unless otherwise stated, analytically pure reagents shall be used. Water shall comply with grade 3 of
ISO 3696.
5.1 Standard and reference compounds
5.1.1 1,2-Dipalmitoyl-3-chloropropanediol (PP-3-MCPD), purity ≥ 95 % (e.g. from a supplier or
synthesized from 3-MCPD and palmitoyl chloride as described by Reference [1]).
NOTE 1,2-Dipalmitoyl-3-chloropropanediol can be substituted by 1,2-dioleyl-3-chloropropanediol or other
fatty acid diesters of 3-MCPD with similar chain length (C16-C18 are preferred as they are the most abundant in
the majority of oils/fats).
5.1.2 1,3-Dipalmitoyl-2-chloropropanediol (PP-2-MCPD), purity ≥ 95 % (e.g. synthesized from
2-MCPD and palmitoyl chloride as described by Reference [1]).
NOTE In analogy with the recommendations given for PP-3-MCPD, 1,3-dipalmitoyl-2-chloropropanediol can
be substituted by other fatty acid diesters of 2-MCPD with similar chain length (C16-C18 are preferred as they
are the most abundant in the majority of oils/fats).
5.1.3 Pentadeuterated 1,2-dipalmitoyl-3-chloropropanediol (PP-3-MCPD-d5), purity ≥ 95 %.
NOTE The same consideration applied to 1,2-dipalmitoyl-3-chloropropanediol is valid also for its
pentadeuterated analogue, see the Note in 5.1.1.
5.1.4 Glycidyl palmitate (Gly-P), purity ≥ 98 %.
2 © ISO 2017 – All rights reserved

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NOTE Glycidyl palmitate can be substituted by glycidyl oleate or other fatty acid esters of glycidol with
similar chain length (C16-C18 are preferred as they are the most abundant in the majority of oils/fats).
5.1.5 Pentadeuterated glycidyl palmitate (Gly-P-d5), purity ≥ 98 %.
NOTE The same consideration applied to glycidyl palmitate is valid also for its pentadeuterated analogue,
see the Note in 5.1.4.
5.2 Standard solutions
5.2.1 General
All standard solutions can be prepared with either toluene (5.3.5) or tetrahydrofuran (5.3.1). Toluene is
preferred for standard solutions containing glycidyl esters.
5.2.2 Stock solutions (1 mg/ml)
a) Weigh 10 mg of PP-3-MCPD (5.1.1) in a 10 ml volumetric flask. Fill up to the mark, making sure that
the standard is completely dissolved in the solvent.
b) Weigh 10 mg of PP-2-MCPD (5.1.2) in a 10 ml volumetric flask. Fill up to the mark, making sure that
the standard is completely dissolved in the solvent.
c) Weigh 10 mg of PP-3-MCPD-d5 (5.1.3) in a 10 ml volumetric flask. Fill up to the mark, making sure
that the standard is completely dissolved in the solvent.
d) Weigh 10 mg of Gly-P (5.1.4) in a 10 ml volumetric flask. Fill up to the mark, making sure that the
standard is completely dissolved in the solvent.
e) Weigh 10 mg of Gly-P-d5 (5.1.5) in a 10 ml volumetric flask. Fill up to the mark, making sure that
the standard is completely dissolved in the solvent.
NOTE Stock solutions are stable for at least three months when stored at −18 °C.
5.2.3 Working solutions
a) Calibration I (PP-3-MCPD, 55 μg/ml). Pipette 550 μl of the stock solution [5.2.2 a)] into a 10 ml
volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
b) Calibration II (PP-3-MCPD, 5,5 μg/ml). Pipette 1 ml of the Calibration I solution [5.2.3 a)] into a
10 ml volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
c) Calibration III (PP-2-MCPD, 55 μg/ml). Pipette 550 μl of the stock solution [5.2.2 b)] into a 10 ml
volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
d) Calibration IV (PP-2-MCPD, 5,5 µg/ml). Pipette 1 ml of the Calibration III solution [5.2.3 c)] into a
10 ml volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
e) Calibration V (Gly-P, 100 µg/ml). Pipette 1 ml of the stock solution [5.2.2 d)] into a 10 ml volumetric
flask and fill up to the mark with the solvent.
f) Calibration VI (Gly-P, 10 µg/ml). Pipette 1 ml of the Calibration V solution [5.2.3 e)] into a 10 ml
volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
g) Internal standard I (PP-3-MCPD-d5, 40 µg/ml). Pipette 400 µL of the stock solution [5.2.2 c)] into a
10 ml volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
h) Internal standard II (Gly-P-d5, 50 µg/ml). Pipette 500 µL of the stock solution [5.2.2 e)] into a 10 ml
volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
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ISO 18363-3:2017(E)

NOTE 1 As an alternative to the preparation of separate standard solutions for each analyte, the three [5.2.3 a),
c), and e)] can be combined in one single standard solution at high concentration of all three analytes (“mixed
Calibration I”). To prepare the mixed solution, pipette 550 μl of PP-3-MCPD stock solution [5.2.2 a)], 550 μl of
PP-2-MCPD stock solution [5.2.2 b)], and 1 ml of Gly-P stock solution [5.2.2 d)] into a 10 ml volumetric flask and
fill up to the mark with the solvent. Also, the solutions 5.2.3 b), d), and f) can be combined in one single standard
solution at low concentration of all three analytes (“mixed Calibration II”). To prepare the mixed solution, pipette
1 ml of mixed Calibration I into a 10 ml volumetric flask and fill up to the mark with the solvent.
NOTE 2 The internal standard solutions [5.2.3 g and h)] can also be combined in a single solution (“mixed
internal standard”). To prepare the mixed solution, pipette 400 μl of PP-3-MCPD-d5 [5.2.2 c)] and 500 μl of
Gly-P-d5 [5.2.2 e)] into a 10 ml volumetric flask and fill up to the mark with solvent.
5.3 Other reagents
5.3.1 Tetrahydrofuran, anhydrous.
5.3.2 Methanol, analytical grade.
5.3.3 n-Heptane, analytical grade.
5.3.4 Acetone, analytical grade.
5.3.5 Toluene, analytical grade.
5.3.6 Water, ultra-pure (e.g. obtained by using a purification system).
5.3.7 Sulfuric acid, purity ≥ 95 %.
5.3.8 Sodium hydrogen carbonate, purity ≥ 99 %.
5.3.9 Sodium sulfate, purity ≥ 99 %.
5.3.10 Phenylboronic acid, purity ≥ 97 %.
5.3.11 Sodium bromide, purity ≥ 99,5 %.
5.4 Reagent solutions
5.4.1 Acid aqueous solution of sodium bromide [sodium bromide 3 mg/ml, sulfuric acid 5 %
(volume fraction)]. Prepare a concentrated aqueous solution of sodium bromide by dissolving 1 g of
sodium bromide (5.3.11) in 10 ml of ultrapure water (5.3.6). Transfer 180 μl of the concentrated solution
into an empty conical flask. Add 0.3 ml of sulfuric acid (5.3.7) and 5,5 ml of ultra-pure water (5.3.6).
Shake vigorously.
It is advisable to freshly prepare the solution on daily basis.
5.4.2 Sodium hydrogen carbonate solution (0,6 %, mass concentration). Weigh 0,6 g of sodium
hydrogen carbonate (5.3.8) in a 100 ml volumetric flask and fill up to the mark with ultra-pure water
(5.3.6). Use an ultrasonic bath (6.3) to ensure the complete dissolution of the reagent.
NOTE As an alternative, the solution can be prepared by dilution of the sodium hydrogen carbonate
saturated solution (5.4.4).
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5.4.3 Sulfuric acid/methanol solution (1,8 %,volume fraction). Pipette 1,8 ml of sulfuric acid (5.3.7)
in a 100 ml volumetric flask and fill up to the mark with methanol (5.3.2).
It is advisable to freshly prepare the solution on daily basis.
5.4.4 Sodium hydrogen carbonate solution (saturated). Weigh 9,6 g of sodium hydrogen carbonate
(5.3.8) in a 100 ml volumetric flask and fill up to the mark with ultra-pure water (5.3.6). Use an ultrasonic
bath (6.3) to ensure the dissolution of the reagent.
NOTE The saturated solution of sodium hydrogen carbonate can be substituted with a solution of the exact
concentration (9 %, mass concentration) to improve the robustness of the method.
5.4.5 Sodium sulfate solution (20 %, mass concentration. Weigh 20 g of sodium sulfate (5.3.9) in a
100 ml volumetric flask and fill up to the mark with ultra-pure water (5.3.6). Use an ultrasonic bath (6.3)
to ensure the complete dissolution of the reagent.
5.4.6 Phenylboronic acid solution (saturated). Weigh 3 g of phenylboronic acid (5.3.10) and add
12 ml of an acetone (5.3.4)/ultra-pure water (5.3.6) mixture (19/1 volume fraction). Shake vigorously.
NOTE The phenylboronic acid does not dissolve completely in the solvent mixture. Only the supernatant is
used for the derivatization step (8.1.6).
6 Apparatus
6.1 Vortex mixer.
6.2 Oven, capable of 45 °C ± 5 °C.
6.3 Ultrasonic bath.
6.4 Evaporation unit (nitrogen).
6.5 Centrifuge.
6.6 GC/MS equipment consisting of
a) capillary gas chromatograph coupled with a quadrupole mass selective detector and data
processing system, and
b) bonded, poly(dimethylsiloxane) capillary column (e.g. 30 m length x 0,25 mm i.d. x 1,0 µm film
thickness).
7 Sample
7.1 Sampling
Sampling is not part of this method. A recommended sampling method is given in ISO 5555.
7.2 Preparation of the test sample
Liquid samples shall be used without additional treatment. Solid or turbid fats shall carefully be melted
at approximately 80 °C in a drying oven or water bath. For high-melting fats, the temperature shall
carefully be inc
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18363-3
Première édition
2017-12
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination des esters
de chloropropanediols (MCPD) et
d'acides gras et des esters de glycidol
et d'acides gras par CPG/SM —
Partie 3:
Méthode par transestérification acide
et mesure du 2-MCPD, du 3-MCPD et
du glycidol
Animal and vegetable fats and oils — Determination of fatty-acid-
bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS —
Part 3: Method using acid transesterification and measurement for
2-MCPD, 3-MCPD and glycidol
Numéro de référence
ISO 18363-3:2017(F)
©
ISO 2017

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ISO 18363-3:2017(F)

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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 18363-3:2017(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
5.1 Composés étalons et composés de référence . 2
5.2 Solutions étalons . 3
5.2.1 Généralités . 3
5.2.2 Solutions stock (1 mg/ml) . 3
5.2.3 Solutions de travail . 3
5.3 Autres réactifs . 4
5.4 Solutions de réactifs . 4
6 Appareillage . 5
7 Échantillon . 6
7.1 Échantillonnage . 6
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai . 6
8 Mode opératoire. 6
8.1 Préparation de l’échantillon pour essai . 6
8.2 Préparation de la droite d’étalonnage . 7
8.3 Références relatives à la chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de
masse (CPG/SM) . 7
9 Expression des résultats. 8
9.1 Quantification des esters de 3-MCPD . 8
9.2 Quantification des esters de 2-MCPD . 9
9.3 Quantification des esters de glycidol .10
10 Fidélité .11
10.1 Généralités .11
10.2 Répétabilité .11
10.3 Reproductibilité entre jours .11
11 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Construction des droites d’étalonnage .12
Annexe B (informative) Résultats de l’essai interlaboratoire .16
Bibliographie .18
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ISO 18363-3:2017(F)

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d'origines animale et végétale.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 18363 se trouve sur le site Web de l’ISO.
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ISO 18363-3:2017(F)

Introduction
La série ISO 18363 est une famille de Normes internationales pouvant être utilisée pour la détermination
des esters de MCPD et de glycidol. La présente introduction décrit les méthodes spécifiées dans les trois
documents actuellement publiés ou proposés, afin de permettre à l’analyste de décider des méthodes
appropriées en fonction de son application. L’application détaillée de chaque méthode figure dans le
domaine d’application de la méthode concernée.
L’ISO 18363-1 est une méthode différentielle équivalente à la norme C-VI 18 (10) de la DGF et identique
à la méthode officielle Cd 29c-13 de l’AOCS. En résumé, elle repose sur la libération rapide par catalyse
alcaline de 3-MCPD et de glycidol à partir de leurs dérivés esters. Le glycidol est par la suite converti
en 3-MCPD. Elle comprend deux parties. La première partie (A) permet de déterminer la somme des
esters de 3-MCPD et des esters de glycidol, tandis que la seconde partie (B) ne détermine que les esters
de 3-MCPD. Les deux analyses reposent sur la libération des analytes cibles, le 3-MCPD et le glycidol,
à partir des esters par alcoolyse en présence d’un catalyseur alcalin à température ambiante. Dans
la partie A, une solution acidifiée de chlorure de sodium est utilisée pour interrompre la réaction qui
induit par la suite la conversion du glycidol en 3-MCPD. Il n’est par conséquent plus possible de faire la
distinction entre le 3-MCPD et le glycidol dans la partie A. Dans la partie B, la réaction est interrompue
par ajout d’une solution saline acidifiée exempte de chlorure qui évite aussi la conversion du glycidol
en MCPD. La partie B permet donc de déterminer la véritable teneur en 3-MCPD. Enfin, la teneur en
glycidol de l’échantillon est proportionnelle à la différence entre les deux analyses (A – B) et peut être
calculée lorsque le coefficient de transformation du glycidol en 3-MCPD a été déterminé. L’ISO 18363-1
est applicable à la détermination rapide des esters de 3-MCPD et de glycidol dans les corps gras d’origine
végétale raffinés et non raffinés. L’ISO 18363-1 peut également s’appliquer aux graisses animales et aux
huiles de friture usagées, mais une étude de validation doit être menée avant de procéder à l’analyse de
ces matrices. Les analytes libres éventuellement contenus dans l’échantillon sont habituellement inclus
dans les résultats, mais le document ne permet pas de faire la distinction entre les analytes libres et
les analytes liés. Néanmoins, les études disponibles au moment de la publication ne révèlent aucune
teneur en analytes libres aussi élevée que la teneur en analytes estérifiés dans les corps gras d’origine
végétale raffinés. En principe, la présente partie de l’ISO 18363-1 peut également être modifiée de façon
à permettre la détermination du 2-MCPD, mais une fois encore, une étude de validation doit être menée
avant d’analyser cet analyte.
L’ISO 18363-2 (proposé) correspondra à la méthode officielle Cd 29b-13 de l’AOCS. En résumé,
elle reposera sur une libération alcaline lente de MCPD et de glycidol à partir des formes esters. Le
glycidol est par la suite converti en 3-MBPD. L’ISO 18363-2 comprend deux préparations d’échantillons
qui se distinguent par l’utilisation d’étalons internes. Les deux préparations seront utilisées pour la
détermination des esters de 2-MCPD et de 3-MCPD. Un résultat préliminaire pour les esters de glycidol
sera déterminé dans la partie A. Comme le 3-MCPD présent dans l’échantillon sera partiellement
converti en glycidol lors de la préparation de l’échantillon, la partie B servira à quantifier la teneur
en glycidol issue de cette transformation qui est ensuite soustraite du résultat préliminaire obtenu
pour le glycidol dans la partie A. L’utilisation d’isomères isotopiques de MCPD libres dans l’analyse A
et de formes isotopiques d’esters de 2-MCPD et de 3-MCPD dans la partie B permettra de surveiller le
rendement du clivage des esters. Les analyses A et B reposeront toutes les deux sur la libération des
analytes cibles, 2-MCPD, 3-MCPD et glycidol à partir des esters dans le cadre d’une alcoolyse lente en
présence d’un catalyseur alcalin dans le froid. Dans les deux préparations d’échantillons, la réaction
sera interrompue par l’ajout d’une solution acidifiée et concentrée de bromure de sodium de façon à
transformer le glycidol instable et volatil en 3-MBPD qui présente des propriétés comparables au 3-MCPD
en matière de stabilité et de performances chromatographiques. De plus, l’excès important d’ions
bromure empêchera la formation non souhaitée de 3-MCPD à partir du glycidol dans les échantillons
contenant naturellement des quantités de chlorure. L’ISO 18363-2 sera applicable à la détermination
des esters de 3-MCPD, de 2-MCPD et de glycidol dans les corps gras d’origine végétale raffinés et non
raffinés. Elle s’appliquera également aux graisses animales et aux huiles de friture usagées, mais une
étude de validation devra être menée avant de procéder à l’analyse de ces matrices. Les analytes libres
éventuellement contenus dans l’échantillon seraient inclus dans les résultats, mais le document ne
permettra pas de faire la distinction entre les analytes libres et les analytes liés. Néanmoins, les études
disponibles au moment de la publication du présent document ne révèlent aucune teneur en analytes
libres aussi élevée que la teneur en analytes estérifiés dans les corps gras d’origine végétale.
© ISO 2017 – Tous droits réservés v

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ISO 18363-3:2017(F)

Le présent document correspond à la méthode officielle Cd 29a-13 de l’AOCS. En résumé, elle repose sur
la transformation des esters de glycidol en esters de 3-MBPD et une libération lente par catalyse acide
du MCPD et du MBPD à partir des formes esters. Le présent document repose sur la préparation d’un
échantillon unique dans lequel les esters de glycidol sont transformés en monoesters de MBPD puis les
analytes libres 2-MCPD, 3-MCPD et 3-MBPD sont libérés par alcoolyse lente en présence d’un catalyseur
acide. Le 3-MBPD représente la véritable teneur en glycidol issu des formes esters. Le présent document
peut être appliqué pour la détermination des esters de 2-MCPD, 3-MCPD et glycidol dans les corps gras
d’origine végétale raffinés et non raffinés. Il peut également s’appliquer également aux graisses animales
et aux huiles de friture usagées, mais une étude de validation doit être menée avant de procéder à
l’analyse de ces matrices. La méthode est adaptée à l’analyse d’analytes liés (estérifiés), mais si cela
est exigé, le présent document peut également être réalisé sans la transformation initiale des esters de
glycidol. Dans cette configuration, les formes libres et liées du 2-MCPD et du 3-MCPD seraient toutes
deux incluses dans les résultats et la teneur en analytes libres peut être calculée comme la différence
entre deux déterminations réalisées dans les deux configurations. Néanmoins, les études disponibles
au moment de la publication du présent document ne révèlent aucune teneur en analytes libres aussi
élevée que la teneur en analytes estérifiés dans les corps gras d’origine végétale.
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NORME INTERNATIONALE ISO 18363-3:2017(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination
des esters de chloropropanediols (MCPD) et d'acides gras
et des esters de glycidol et d'acides gras par CPG/SM —
Partie 3:
Méthode par transestérification acide et mesure du
2-MCPD, du 3-MCPD et du glycidol
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire permettant la détermination simultanée des esters
de 2-MCPD (2-MCPD lié), des esters de 3-MCPD (3-MCPD lié) et des esters de glycidol (glycidol lié) en
un seul essai, basé sur le clivage des esters par catalyse acide et la dérivatisation des analytes clivés
(libres) à l’acide phénylboronique (PBA) avant analyse par CPG/SM.
Le présent document est applicable aux corps gras solides et liquides. Pour l’ensemble des trois analytes,
la limite de quantification (LOQ) est de 0,1 mg/kg et la limite de détection (LOD) est de 0,03 mg/kg.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
3.1
2-MCPD lié
quantité de 2-MCPD clivé à partir de ses formes estérifiées (liées) par transestérification en présence
d’un catalyseur acide conformément à la méthode de référence
Note 1 à l'article: La teneur en 2-MCPD est calculée et consignée sous forme de fraction massique, exprimée en
milligrammes par kilogramme (mg/kg).
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ISO 18363-3:2017(F)

3.2
3-MCPD lié
quantité de 3-MCPD clivé à partir de ses formes estérifiées (liées) par transestérification en présence
d’un catalyseur acide conformément à la méthode de référence
Note 1 à l'article: La teneur en 3-MCPD est calculée et consignée sous forme de fraction massique, exprimée en
milligrammes par kilogramme (mg/kg).
3.3
glycidol lié
quantité de glycidol clivé à partir de ses formes estérifiées (liées) par transestérification en présence
d’un catalyseur acide conformément à la méthode de référence
Note 1 à l'article: La teneur en glycidol est calculée et consignée sous forme de fraction massique, exprimée en
milligrammes par kilogramme (mg/kg).
4 Principe
L’échantillon de corps gras est dissout dans du tétrahydrofurane et les étalons internes (diester
de 3-MCPD pentadeutérié et ester de glycidol pentadeutérié) sont ajoutés. Durant la première étape
de préparation de l’échantillon, les esters de glycidol sont transformés en monoesters de 3-MBPD par
l’addition d’une solution acidifiée de bromure de sodium. À la fin de la réaction, la phase organique,
contenant les esters de 2-MCPD et de 3-MCPD et les esters de 3-MBPD, est séparée et évaporée à sec.
Dans la deuxième étape, le résidu est dissous dans du tétrahydrofurane et la transestérification
acide est initiée par l’ajout d’une solution alcoolique acide. Après 16 h d’incubation à 40 °C, le mélange
d’échantillon est neutralisé et les esters méthyliques d’acides gras générés durant la transestérification
sont éliminés. Enfin, l’échantillon purifié (contenant les analytes clivés [libres]) est soumis à une
dérivatisation avec de l’acide phénylboronique avant analyse par CPG/SM.
La quantification des esters de 2- et 3-MCPD (exprimés sous forme de 2- et 3-MCPD liés) est
basée respectivement sur le rapport des signaux 2-MCPD/3-MCPD-d5 et 3-MCPD/3-MCPD-d5. La
quantification des esters de glycidol (exprimés sous forme de glycidol lié) est basée sur le rapport de
signaux 3-MBPD/3-MBPD-d5.
Cette méthode permet la quantification simultanée des trois analytes en un seul essai.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — Le présent document nécessite la manipulation de substances dangereuses.
Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et du personnel doivent être
suivies.
Sauf indication contraire, des réactifs analytiquement purs doivent être utilisés. L’eau doit être de
qualité 3 conformément à l’ISO 3696.
5.1 Composés étalons et composés de référence
5.1.1 1,2-Dipalmitoyl-3-chloropropanediol (PP-3-MCPD), pureté ≥ 95 % (par exemple, obtenu
auprès d’un fournisseur ou synthétisé à partir de 3-MCPD et de chlorure de palmitoyle comme décrit par
[1]
la Référence ).
NOTE Le 1,2-dipalmitoyl-3-chloropropanediol peut être remplacé par le 1,2-dioléyl-3-chloropropanediol ou
d’autres diesters d’acide gras du 3-MCPD de longueur de chaîne similaire (les C16-C18 sont préférés car ils sont
les plus abondants dans la plupart des corps gras).
5.1.2 1,3-Dipalmitoyl-2-chloropropanediol (PP-2-MCPD), pureté ≥ 95 % (par exemple, synthétisé à
[1]
partir de 2-MCPD et de chlorure de palmitoyle comme décrit par la Référence ).
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ISO 18363-3:2017(F)

NOTE Par analogie avec les recommandations fournies pour le PP-3-MCPD, le 1,3-dipalmitoyl-2-
chloropropanediol peut être remplacé par d’autres diesters d’acide gras du 2-MCPD de longueur de chaîne
similaire (les C16-C18 sont préférés car ils sont les plus abondants dans la plupart des huiles/graisses).
5.1.3 1,2-Dipalmitoyl-3-chloropropanediol pentadeutérié (PP-3-MCPD-d5), pureté ≥ 95 %.
NOTE La même considération que celle appliquée au 1,2-dipalmitoyl-3-chloropropanediol est également
valable pour son analogue pentadeutérié, voir Note en 5.1.1.
5.1.4 Palmitate de glycidyle (Gly-P), pureté ≥ 98 %.
NOTE Le palmitate de glycidyle peut être remplacé par l’oléate de glycidyle ou d’autres esters d’acide gras du
glycidol de longueur de chaîne similaire (les C16-C18 sont préférés car ils sont les plus abondants dans la plupart
des huiles/graisses).
5.1.5 Palmitate de glycidyle pentadeutérié (Gly-P-d5), pureté ≥ 98 %.
NOTE La même considération que celle appliquée au palmitate de glycidyle est également valable pour son
analogue pentadeutérié, voir Note en 5.1.4.
5.2 Solutions étalons
5.2.1 Généralités
Toutes les solutions étalons peuvent être préparées avec du toluène (5.3.5) ou du tétrahydrofurane (5.3.1).
Le toluène est préféré pour les solutions étalons contenant des esters de glycidol.
5.2.2 Solutions stock (1 mg/ml)
a) Peser 10 mg de PP-3-MCPD (5.1.1) dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’à la marque, en
s’assurant que l’étalon soit totalement dissout dans le solvant.
b) Peser 10 mg de PP-2-MCPD (5.1.2) dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’à la marque, en
s’assurant que l’étalon soit totalement dissout dans le solvant.
c) Peser 10 mg de PP-3-MCPD-d5 (5.1.3) dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’à la marque,
en s’assurant que l’étalon soit totalement dissout dans le solvant.
d) Peser 10 mg de Gly-P (5.1.4) dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’à la marque, en
s’assurant que l’étalon soit totalement dissout dans le solvant.
e) Peser 10 mg de Gly-P-d5 (5.1.5) dans une fiole jaugée de 10 ml. Compléter jusqu’à la marque, en
s’assurant que l’étalon soit totalement dissout dans le solvant.
NOTE Les solutions stock sont stables pendant au moins trois mois lorsqu’elles sont stockées à −18 °C.
5.2.3 Solutions de travail
a) Étalonnage I (PP-3-MCPD, 55 μg/ml). Pipeter 550 μl de la solution stock [5.2.2 a)] dans une fiole
jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
b) Étalonnage II (PP-3-MCPD, 5,5 μg/ml). Pipeter 1 ml de la solution Étalonnage I [5.2.3 a)] dans une
fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
c) Étalonnage III (PP-2-MCPD, 55 μg/ml). Pipeter 550 μl de la solution stock [5.2.2 b)] dans une fiole
jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
d) Étalonnage IV (PP-2-MCPD, 5,5 µg/ml). Pipeter 1 ml de la solution Étalonnage III [5.2.3 c)] dans une
fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
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e) Étalonnage V (Gly-P, 100 µg/ml). Pipeter 1 ml de la solution stock [5.2.2 d)] dans une fiole jaugée
de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
f) Étalonnage VI (Gly-P, 10 µg/ml). Pipeter 1 ml de la solution Étalonnage V [5.2.3 e)] dans une fiole
jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
g) Étalon interne I (PP-3-MCPD-d5, 40 µg/ml). Pipeter 400 µl de la solution stock [5.2.2 c)] dans une
fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
h) Étalon interne II (Gly-P-d5, 50 µg/ml). Pipeter 500 µl de la solution stock [5.2.2 e)] dans une fiole
jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
NOTE 1 Plutôt que de préparer des solutions étalons séparées pour chaque analyte, les trois [5.2.3 a), c) et
e)] peuvent être combinées en une seule solution étalon à concentration élevée des trois analytes («Étalonnage
mixte I»). Pour préparer la solution mixte, pipeter 550 μL de solution stock de PP-3-MCPD [5.2.2 a)], 550 μl de
solution stock de PP-2-MCPD [5.2.2 b)] et 1 ml de solution stock de Gly-P [5.2.2 d)] dans une fiole jaugée de 10 ml
et compléter jusqu’à la marque avec le solvant. Les solutions 5.2.3 b), d) et f) peuvent également être combinées
en une solution étalon unique à faible concentration des trois analytes («Étalonnage mixte II»). Pour préparer
la solution mixte, pipeter 1 ml de Étalonnage mixte I dans une fiole jaugée 10 ml et compléter jusqu’à la marque
avec le solvant.
NOTE 2 Les solutions étalons internes [5.2.3 g et h)] peuvent également être combinées en une seule solution
(«étalon interne mixte»). Pour préparer la solution mixte, pipeter 400 μL de PP-3-MCPD-d5 [5.2.2 c)] et 500 μl de
Gly-P-d5 [5.2.2 e)] dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter jusqu’à la marque avec le solvant.
5.3 Autres réactifs
5.3.1 Tétrahydrofurane, anhydre.
5.3.2 Méthanol, qualité analytique.
5.3.3 n-Heptane, qualité analytique.
5.3.4 Acétone, qualité analytique.
5.3.5 Toluène, qualité analytique.
5.3.6 Eau, ultra-pure (par exemple, obtenue à l’aide d’un système de purification).
5.3.7 Acide sulfurique, pureté ≥ 95 %.
5.3.8 Hydrogénocarbonate de sodium, pureté ≥ 99 %.
5.3.9 Sulfate de sodium, pureté ≥ 99 %.
5.3.10 Acide phénylboronique, pureté ≥ 97 %.
5.3.11 Bromure de sodium, pureté ≥ 99,5 %.
5.4 Solutions de réactifs
5.4.1 Solution aqueuse acidifiée de bromure de sodium [bromure de sodium 3 mg/ml, acide
sulfurique 5 % (fraction volumique)]. Préparer une solution aqueuse concentrée de bromure de sodium
en dissolvant 1 g de bromure de sodium (5.3.11) dans 10 ml d’eau ultrapure (5.3.6). Transférer 180 µl
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de la solution concentrée dans une fiole conique vide. Ajouter 0,3 ml d’acide sulfurique (5.3.7) et 5,5 ml
d’eau ultrapure (5.3.6). Agiter vigoureusement.
Il est conseillé de préparer une solution fraîche chaque jour.
5.4.2 Solution d’hydrogénocarbonate de so
...