ISO 11213:1995
(Main)Modified starch — Determination of acetyl content — Enzymatic method
Modified starch — Determination of acetyl content — Enzymatic method
Applies to modified starch, both granular and soluble in cold water. The methods specified enable to measure total and free acetyl contents; bound acetyl content is calculated as the difference of the two values. Total content is determined by heating the sample with dilute hydrochloric acid and converting the acetate with adenosine-5-triphosphate (ATP) and coenzyme A (CoA) to acetyl-CoA. The methods are suitable for determining acetyl contents up to 2 % (m/m).
Amidon modifié — Dosage de l'acétyle — Méthode enzymatique
La présente Norme internationale prescrit une méthode enzymatique pour le dosage de l'acétyle contenu dans l'amidon modifié, granulaire ou soluble dans l'eau froide. Les teneurs en acétyle total et libre sont déterminées et la teneur en acétyle lié est calculée. La méthode convient pour déterminer des teneurs en acétyle jusqu'à 2 % (m/m).
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
ISO
STANDARD
11213
First edition
1995-02-01
Modified starch - Determination of acetyl
content - Enzymatic method
Amidon modifie - Dosage de I ’acbtye - M6 thode enzyma tique
Reference nmber
ISO 11213:1995(E)
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ISO 11213:1995(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 11213 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 93, Starch (including derivatives and by-products).
Annexes A, B and C of this International Standard are for information only.
0 ISO 1995
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronie or mechanrcal, rncluding photocopying and
mrcrofilm, without permisston In writing from the publisher.
lnternatronal Organizatron for Standardization
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Printed in Switzerland
ii
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INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO ISO 11213:1995(E)
Modified starch - Determination of acetyl content -
Enzymatic method
then reacts with oxaloacetate to form citrate in the
1 Scope
presence of citrate synthase (CS).
This International Standard specifies an enzymatic
The oxaloacetate required for the reaction is formed
method for the determination of the acetyl content
from malate and nicotinamide adenine dinucleotide
of modified starch, both granular and soluble in cold
(NAD) in the presence of malate-dehydrogenase
water. Total and free acetyl contents are determined
(MDH). In this reaction, the NAD is reduced to NADH
and the bound acetyl content is calculated.
and the formation of NADH tan be determined by
measuring the increase in absorbance at a specified
The method is suitable for determining acetyl con-
wavelength. (See reference [1] in annex C.)
tents up to 2 % (m/m).
The free acetyl content is determined by making a
2 Normative references
Suspension of the modified starch in water, filtering,
and determining the acetyl content of the filtrate as
The following Standards contain provisions which,
already described. The bound acetyl content is calcu-
through reference in this text, constitute provisions
lated by subtracting the free acetyl content from total
of this International Standard. At the time of publi-
acetyl content.
cation, the editions indicated were valid. All Standards
are subject to revision, and Parties to agreements
4 Reagents and materials
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
The reagents used shall be of recognized analytical
cent editions of the Standards indicated below.
grade, unless otherwise specified. The water used
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
shall comply with the specifications of ISO 3696,
rently valid International Standards.
grade 2. The enzymes used shall be of a quality
equivalent to the relevant enzymes of Boehringer
ISO 1666: 1973, Starch - Determination of moisture
Mannheim?
content - Oven-drying methods.
NOTE 1 Suitable test kits which are commercially avail-
ISO 3696: 1987, Water for analytical laboratory use -
able tan be used.
Specification and test methods.
4.1 Hydrochlorit acid, 1 mol/1 solution.
3 Principle
4.2 Sodium hydroxide, 5 mol/1 Solution.
The total acetyl content is determined by heating the
Sample with dilute hydrochloric acid which hydrolyses
the acetyl fraction and solubilizes the starch. In the
4.3 Buffer Solution.
presence of the enzyme acetyl-CoA synthetase (ACS),
In about 70 ml of water, dissolve the following re-
acetate is converted with adenosine-5-triphosphate
agents:
(ATP) and coenzyme A (CoA) to acetyl-Co-A. The latter
1) This information is given for the convenience of users of this International Standard and does no ’t constitute an endorsement
by ISO of the products named.
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0 ISO
ISO 11213:1995(E)
7,5 g of triethanolamine;
5 Apparatus
420 mg of L-malic acid;
Usual laboratory apparatus and in particular the fol-
lowing.
210 mg of magnesium chloride hexahydrate
(MgCI,.GH,O) .
5.1 Conical flasks, of capacity 250 ml, equipped
with screw taps.
Add as much potassium hydroxide 5 mol/1 Solution as
necessary in Order to obtain a pH of 8,4. The volume
Boiling water bath, equipped with a shaker.
5.2
required is about 8 ml.
5.3 Volumetric flasks, of capacity 200 ml.
The Solution is stable for 1 year when at
+ 4 “C.
5.4 Micropipettes or syringes.
5.5 Molecular absorption spectrometer, suita ble
4.4 ATB-CoA-NAD Solution.
for Operation at 340 nm.
In 20 ml of water, dissolve the following reagents:
5.6 Cuvettes, of quartz glass or other materials
at 340 nm, with a thickness of
500 mg of crystallized disodium salt trihydrate of transparent
adenosine-5 ’-triphosphate [ATP-Na,H,.3H,O; IO mm + 0,l mm.
-
98 % (dm)];
5.9 Sieve, with an aperture of 800 Pm.
500 mg of anhydrous sodium hydrogen carbonate;
5.8 Blade mill.
50 mg of lyophilized trilithium salt of coenzyme A
[about 85 % (m/m) CoA];
5.9 Water bath, capable of being thermostatically
controlled between 20 “C and 25 “C.
250 mg of lyophilized free acid monohydrate of
nicotinamide adenine dinucleotide
6 Preparation of the Sample
[--NAD.H,O > 98 % (m/m)].
Sieve through a 800 Pm sieve (5.7). If material does
The Solution is stable for 1 week when stored at
not pass through the sieve, grind the Sample with a
+ 4 “C.
blade mill (5.8) so that it will completely pass through
the 800 Pm sieve. Homogenize the Sample.
4.5 MDH-CS Suspension .
7 Procedure
of
Disperse about 1 100 U (international units)
malate-dehydrogenase (MDH from pig heart;
7,l Hydrolysis of acetyl groups
EC 1 .l .1.37) and about 270 U of citrate synthase (CS
from pig heart; EC 4.1.37) in 0,4 ml of ammonium
7.1.1 Dispersion of granular starch
sulfate Solution, c[(NH&SOJ = 3,2 mol/l.
Weigh, to the nearest 1 mg, approximately 1 g of the
The Solution is sta ble for 1 year when stored at
prepared Sample and place it in a conical flask (5.1).
+ 4 “C.
Add 50 ml of hydrochloric acid (4.1) while agitating to
NOTE 2 One international unit catalyses
ensure good dispersion. Continue as described in
(1 u>
1 pmol/min at 25 “C from the relevant Substrate.
7.1.3.
.
7.12 Dispersion of pregelatinized starch
4.6 ACS Solution.
Add 50 ml of hydrochloric acid (4.1) to a conical flask
(5.1). Introduce a magnetic stirrer and Start agitation.
Dissolve 20 mg of lyophilizate containing 5 mg of
Slowly and carefully add about 1 g of the prepared
acetyl-coenzyme A synthetase (ACS from yeast;
Sample. Ensure a good, lump-free dispersion. Deter-
EC 6.2.1 .l; z 16 U) in 0,4 ml of water.
mine the mass 0% the test Portion by weighing by
differente to the nearest 1 mg.
The Solution is stable for 5 d when stored at + 4 “C.
2
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0 ISO
ISO 11213:1995(E)
7.1.3 Hydrolysis and filtration anhydrous sodium acetate. Then transfer to a
1 000 ml volumetric flask. Place the volumetric flask
Seal the conical flask tightly with the screw cap and
in the water bath (5.9) for temperature equilibration
place it in the boiling water bath (5.2) with the shaker
between 20 “C and 25 “C. Control the temperature
operating for 30 min.
and make up to the mark with distilled water. Con-
tinue as described in 7.4.
Remove the flask and cool to about 20 “C + 5 “C by
immersing it in an ice bath. Open the flask when its
7.4 Enzymatic determination of acetic acid
content is fully cooled, add 10 ml of sodium hydroxide
Solution (4.2), mix, and wash the contents quantitat-
Carry out the enzymatic determination of acetic acid
ively into a 200 ml volumetric flask (5.3). Place the
according to the following analytical arrangement and
volumetric flask in the water bath (5.9) for tempera-
conditions:
ture equilibration between 20 “C and 25 “C. Control
the temperature and make up to the mark with dis-
- wavelength: 340 nm;
tilled water. Filter through a suitable filter Paper. Re-
ject the first 20 ml to 30 ml of filtrate and directly use
- temperature: 20 “C to 25 “C.
the remaining Solution as the test Solution in the
enzymatic determination, as described in 7.4.
Read the absorbances against a cuvette (5.6) filled
with water.
7.2 Free acetate
NOTE 3 Measurements tan also be made at the follow-
ing wavelengths with the corresponding molar absorption
7.2.1 Dispersion of granul ar starch
coefficients (H) used in the calculations:
Disperse IO g of the prepare ?d Sample, while stirring,
- Hg, 365 nm: H = 3,4 I~mmol-km- ‘;
in 100 ml of distilled water in a conical flask (5.1).
- Hg, 334 nm: 3t = 6,18 I~mmol%m- ‘.
Continue as described in 7.2.3.
Pipette into cuvettes (5.6) the volumes of reagents
7.2.2 Dispersion of pregelatinized starch
indicated in the analytical arrangement in table 1.
Add about 100 ml of distilled water to a conical flask
(5.1). Introduce a magnetic stirrer and Start agitation.
8 Expression of results
Slowl
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11213
Première édition
1995-02-01
Amidon modifié - Dosage de I’acétyle -
Méthode enzymatique
- Determination of acetyl content - Enzymatic method
Modified s tarch
Numéro de référence
ISO 11213:1995(F)
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ISO 11213:1995(F)
Avant-propos
LIS0 (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec NS0 participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 11213 a été élaborée par le comité technique
ISO/K 93, Amidon (amidons, fécules), dérivés et sous-produits.
Les annexes A, B et C de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 11213:1995(F)
Amidon modifié - Dosage de I’acétyle - Méthode
enzymatique
hydrolyse la fraction acétyle et dissout l’amidon. En
1 Domaine d’application
présence de l’enzyme acétyle-CoA synthétase (ACS),
l’acétate est converti avec I’adénosine-5-triphosphate
La présente Norme internationale prescrit une mé-
(ATP) et la coenzyme A (CoA) en acétyle-CO-A. Ce
thode enzymatique pour le dosage de I’acétyle
dernier réagit ensuite avec I’oxaloacétate pour former
contenu dans l’amidon modifié, granulaire ou soluble
du citrate en présence de citrate de synthase (CS).
dans l’eau froide. Les teneurs en acétyle total et libre
sont déterminées et la teneur en acétyle lié est cal-
L’oxyloacétate nécessaire à la réaction est formé à
culée.
partir de malate et de nicotinamide-adénine-
dinucléotide (NAD) en présence de malate-
La méthode convient pour déterminer des teneurs en
déshydrogénase (MDH). Dans cette réaction, le NAD
acétyle jusqu’à 2 % (m/m).
est réduit en NADH et la formation de NADH peut
être déterminée en mesurant l’augmentation de I’ab-
2 Références normatives sorbance à une longueur d’onde prescrite. (Voir réfé-
rence [l] citée dans l’annexe C.)
Les normes suivantes contiennent des dispositions
La teneur en acétyle libre est déterminée en réalisant
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
une suspension de l’amidon modifié dans l’eau, en
tuent des dispositions valables pour la présente
filtrant, puis en déterminant la teneur en acétyle du
Norme internationale. Au moment de la publication,
filtrat comme indiqué ci-dessus. La teneur en acétyle
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
lié est calculée en soustrayant la teneur en acétyle li-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
bre de la teneur en acétyle total.
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes
4 Réactifs et matériaux
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possèdent le registre des Normes internationales en
Les réactifs utilisés doivent avoir une qualité analyti-
vigueur à un moment donné.
que reconnue, sauf prescription contraire. L’eau utili-
sée doit être conforme aux spécifications de
ISO 1666:1973, Amidon et fécule - Détermination
I’ISO 3696, qualité 2. Les enzymes utilisées doivent
de l’humidité - Méthodes par séchage à l’étuve.
être de qualité équivalente aux enzymes correspon-
dantes de Boehringer Mannheim’).
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
- Spécifica tion et méthodes d’essai.
que
NOTE 1 Des kits d’essai appropriés disponibles dans le
commerce peuvent être utilisés.
3 Principe
4.1 Acide chlorhydrique, solution à 1 mol/l.
La teneur en acétyle total est déterminée en chauffant
l’échantillon avec de l’acide chlorhydrique dilué qui
4.2 Hydroxyde de sodium, solution à 5 mol/l.
1) Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
I’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
---------------------- Page: 3 ----------------------
63 ISO
11213:1995(F)
ISO
4.3 Solution tampon. 4.6 Solution d’ACS.
Dissoudre 20 mg de lyophilisat contenant 5 mg
Dissoudre dans environ 70 ml d’eau les réactifs sui-
d’acétyle-coenzyme A synthétase (ACS prélevé dans
la levure; EC 6.2.1 .l ; N 16 U) dans 0,4 ml d’eau.
7,5 g de triéthanolamine;
La solution est stable pendant 5 jours si on la
conserve à + 4 “C.
420 mg d’acide L-malique;
210 mg de chlorure de magnésium hexahydraté
.
(MgCI,,GH,O)
5 Appareillage
Ajouter la quantité suffisante de solution d’hydroxyde
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
de potassium à 5 mol/1 jusqu’à obtention d’un pH de
8,4. Le volume nécessaire est d’environ 8 ml.
5.1 Fioles coniques, de 250 ml de capacité, munies
de bouchons à vis.
La solution est stable pendant 1 an si on la conserve
à + 4 “C.
5.2 Bain-marie bouillant, avec agitateur.
5.3 Fioles jaugées, de 200 ml de capacité.
4.4 Solution d’ATP-CoA-NAD.
5.4 Micropipettes ou seringues.
Dissoudre dans 20 ml d’eau les réactifs suivants:
5.5 Spectromètre d’absorption moléculaire, per-
500 mg de sel disodique trihydraté cristallisé
mettant des mesurages à 340 nm.
d’adénosine-5’-triphosphate [ATP-Na,H,,3H,O;
98 % (miin)];
5.6 Cuves, en quartz ou autre matériau transparent
500 mg d’hydrogénocarbonate de sodium
à 340 nm, de 10 mm & 0,l mm d’épaisseur.
anhydre;
5.7 Tamis, de 800 prn d’ouverture de mailles.
50 mg de sel de trilithium lyophilisé de coenzyme
A [environ 85 % (titi) de CoA];
5.8 Broyeur à couteaux.
250 mg d’acide libre monohydraté lyophilisé de
nicotinamide-adénine-dinucléotide 5.9 Bain d’eau thermostaté, dont la température
[Q-NAD,H,O > 98 % (&II)]. peut être réglée entre 20 “C et 25 “C.
La solution est stable pendant 1 semaine si on la
conserve à + 4 “C.
6 Préparation de l’échantillon
Passer l’échantillon au tamis de 800 prn (5.7). Si né-
cessaire, broyer l’échantillon au moyen du broyeur à
4.5 Suspension de MDH-CS.
couteaux (5.8) de manière que le matériau passe sans
refus le tamis de 800 prn. Rendre l’échantillon bien
Disperser environ 1 100 U (Unité internationale) de
homogène.
malate-déshydrogénase (MDH prélevé sur du cœur
de porc; EC 1 .l J.37) et environ 270 U de citrate de
synthase (CS prélevé sur du cœur de porc; EC 4.1.37)
dans 0,4 ml d’une solution de sulfate d’ammonium,
7 Mode opératoire
c[(NH&SO~] = 3,2 mol/l.
7.1 Hydrolyse des groupements acétyles
La solution est stable pendant 1 an si on la conserve
à + 4 “C.
7.1 .‘ll Dispersion de l’amidon granulaire
NOTE 2 Une Unité internationale (1 U) catalyse la réac-
Peser, à 1 mg près, environ 1 g de l’échantillon pré-
tion de 1 pmol à 25 “C de substrat correspondant par mi-
nute. paré et l’introduire dans une fiole conique (5.1).
2
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0 ISO ISO 11213:1995(F)
Ajouter 50 ml d’acide chlorhydrique (4.1) tout en agi- 7.2.3 Dissolution et filtration
tant pour assurer une bonne dispersion. Continuer
Fermer la fiole conique et agiter pendant 30 min.
comme décrit en 7.1.3.
Transvaser le contenu de la fiole conique quantita-
7.1.2 Dispersion de l’amidon gonflant
tivement dans une fiole jaugée de 200 ml (5.3).
Ajouter 50 ml d’acide chlorhydrique (4.1) dans une Transférer la fiole jaugée dans le bain d’eau (5.9) pour
équilibrer la température entre 20 “C et 25 “C.
fiole conique (5.1). Placer un agitateur magnétique et
Contrôler la température et compléter avec de l’eau
commencer l’agitation. Introduire lentement et soi-
distillée jusqu’au trait repère. Filtrer au travers d’un
gneusement environ 1 g de l’échantillon préparé.
S’assurer que la dispersion se fait correctement et papier filtre approprié. Rejeter les premiers 20 ml à
sans grumeaux. Déterminer la masse de la prise 30 ml de filtrat et utiliser directement la solution res-
d’essai en pesant par différence à 1 mg près. tante comme solution d’essai dans le dosage enzy-
matique, comme décrit en 7.4.
7.1.3 Hydrolyse et filtration
Fermer la fiole conique en vissant le bouchon et la
7.3 Essai de contrôle
placer sous agitation dans le bain-marie bouillant (5.2)
pendant 30 min.
Pour contrôler la méthode, l’essai peut être réalisé sur
Sortir la fiole et la laisser refroidir à environ
un matériau de référence tel que l’acétate de sodium
20 “C + 5 “C en la plongeant dans un bain de glace.
anhydre [teneur en acétyle = 52,4 % (I&I)]. Pour ce
Ouvrir la fiole lorsque son contenu est complètement
faire, peser, à 0,l mg près, environ 100 mg d’acétate
refroidi, ajouter 10 ml de solution d’hydroxyde de so-
de sodium anhydre. Transférer ensuite dans une fiole
dium (4.2), mélanger et transvaser le contenu quanti-
jaugée de 1 000 ml. Placer la fiole jaugée dans le bain
tativement dans une fiole jaugée de 200 ml (5.3). d’eau (5.9) pour équilibrer la température entre 20 “C
Transférer la fiole jaugée dans le bain d’eau (5.9) pour et 25 “C. Contrôler la température et compléter avec
équilibrer la température entre 20 “C et 25 “C.
de l’eau distillée jusqu’au trait repère. Continuer
Contrôler la température et compléter avec de l’eau
comme décrit en 7.4.
distillée jusqu’au trait repère. Filtrer au travers d’un
papier filtre approprié. Rejeter les premiers 20 ml à
30 ml de filtrat et utiliser directement la solution res-
74 . Dosage enzymatique de l’acide acétique
tante comme solution d’essai dans le dosage enzy-
matique, comme décrit en 7.4.
Effectuer le dosage enzymatique de l’acide acétique
selon le schéma d’analyse ci-après dans les condi-
7.2 Acétate libre
tions suivantes:
7.2.1 Dispersion
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11213
Première édition
1995-02-01
Amidon modifié - Dosage de I’acétyle -
Méthode enzymatique
- Determination of acetyl content - Enzymatic method
Modified s tarch
Numéro de référence
ISO 11213:1995(F)
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ISO 11213:1995(F)
Avant-propos
LIS0 (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec NS0 participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 11213 a été élaborée par le comité technique
ISO/K 93, Amidon (amidons, fécules), dérivés et sous-produits.
Les annexes A, B et C de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d’information.
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Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
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Amidon modifié - Dosage de I’acétyle - Méthode
enzymatique
hydrolyse la fraction acétyle et dissout l’amidon. En
1 Domaine d’application
présence de l’enzyme acétyle-CoA synthétase (ACS),
l’acétate est converti avec I’adénosine-5-triphosphate
La présente Norme internationale prescrit une mé-
(ATP) et la coenzyme A (CoA) en acétyle-CO-A. Ce
thode enzymatique pour le dosage de I’acétyle
dernier réagit ensuite avec I’oxaloacétate pour former
contenu dans l’amidon modifié, granulaire ou soluble
du citrate en présence de citrate de synthase (CS).
dans l’eau froide. Les teneurs en acétyle total et libre
sont déterminées et la teneur en acétyle lié est cal-
L’oxyloacétate nécessaire à la réaction est formé à
culée.
partir de malate et de nicotinamide-adénine-
dinucléotide (NAD) en présence de malate-
La méthode convient pour déterminer des teneurs en
déshydrogénase (MDH). Dans cette réaction, le NAD
acétyle jusqu’à 2 % (m/m).
est réduit en NADH et la formation de NADH peut
être déterminée en mesurant l’augmentation de I’ab-
2 Références normatives sorbance à une longueur d’onde prescrite. (Voir réfé-
rence [l] citée dans l’annexe C.)
Les normes suivantes contiennent des dispositions
La teneur en acétyle libre est déterminée en réalisant
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
une suspension de l’amidon modifié dans l’eau, en
tuent des dispositions valables pour la présente
filtrant, puis en déterminant la teneur en acétyle du
Norme internationale. Au moment de la publication,
filtrat comme indiqué ci-dessus. La teneur en acétyle
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
lié est calculée en soustrayant la teneur en acétyle li-
norme est sujette à révision et les parties prenantes
bre de la teneur en acétyle total.
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes
4 Réactifs et matériaux
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possèdent le registre des Normes internationales en
Les réactifs utilisés doivent avoir une qualité analyti-
vigueur à un moment donné.
que reconnue, sauf prescription contraire. L’eau utili-
sée doit être conforme aux spécifications de
ISO 1666:1973, Amidon et fécule - Détermination
I’ISO 3696, qualité 2. Les enzymes utilisées doivent
de l’humidité - Méthodes par séchage à l’étuve.
être de qualité équivalente aux enzymes correspon-
dantes de Boehringer Mannheim’).
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analyti-
- Spécifica tion et méthodes d’essai.
que
NOTE 1 Des kits d’essai appropriés disponibles dans le
commerce peuvent être utilisés.
3 Principe
4.1 Acide chlorhydrique, solution à 1 mol/l.
La teneur en acétyle total est déterminée en chauffant
l’échantillon avec de l’acide chlorhydrique dilué qui
4.2 Hydroxyde de sodium, solution à 5 mol/l.
1) Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
I’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
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63 ISO
11213:1995(F)
ISO
4.3 Solution tampon. 4.6 Solution d’ACS.
Dissoudre 20 mg de lyophilisat contenant 5 mg
Dissoudre dans environ 70 ml d’eau les réactifs sui-
d’acétyle-coenzyme A synthétase (ACS prélevé dans
la levure; EC 6.2.1 .l ; N 16 U) dans 0,4 ml d’eau.
7,5 g de triéthanolamine;
La solution est stable pendant 5 jours si on la
conserve à + 4 “C.
420 mg d’acide L-malique;
210 mg de chlorure de magnésium hexahydraté
.
(MgCI,,GH,O)
5 Appareillage
Ajouter la quantité suffisante de solution d’hydroxyde
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
de potassium à 5 mol/1 jusqu’à obtention d’un pH de
8,4. Le volume nécessaire est d’environ 8 ml.
5.1 Fioles coniques, de 250 ml de capacité, munies
de bouchons à vis.
La solution est stable pendant 1 an si on la conserve
à + 4 “C.
5.2 Bain-marie bouillant, avec agitateur.
5.3 Fioles jaugées, de 200 ml de capacité.
4.4 Solution d’ATP-CoA-NAD.
5.4 Micropipettes ou seringues.
Dissoudre dans 20 ml d’eau les réactifs suivants:
5.5 Spectromètre d’absorption moléculaire, per-
500 mg de sel disodique trihydraté cristallisé
mettant des mesurages à 340 nm.
d’adénosine-5’-triphosphate [ATP-Na,H,,3H,O;
98 % (miin)];
5.6 Cuves, en quartz ou autre matériau transparent
500 mg d’hydrogénocarbonate de sodium
à 340 nm, de 10 mm & 0,l mm d’épaisseur.
anhydre;
5.7 Tamis, de 800 prn d’ouverture de mailles.
50 mg de sel de trilithium lyophilisé de coenzyme
A [environ 85 % (titi) de CoA];
5.8 Broyeur à couteaux.
250 mg d’acide libre monohydraté lyophilisé de
nicotinamide-adénine-dinucléotide 5.9 Bain d’eau thermostaté, dont la température
[Q-NAD,H,O > 98 % (&II)]. peut être réglée entre 20 “C et 25 “C.
La solution est stable pendant 1 semaine si on la
conserve à + 4 “C.
6 Préparation de l’échantillon
Passer l’échantillon au tamis de 800 prn (5.7). Si né-
cessaire, broyer l’échantillon au moyen du broyeur à
4.5 Suspension de MDH-CS.
couteaux (5.8) de manière que le matériau passe sans
refus le tamis de 800 prn. Rendre l’échantillon bien
Disperser environ 1 100 U (Unité internationale) de
homogène.
malate-déshydrogénase (MDH prélevé sur du cœur
de porc; EC 1 .l J.37) et environ 270 U de citrate de
synthase (CS prélevé sur du cœur de porc; EC 4.1.37)
dans 0,4 ml d’une solution de sulfate d’ammonium,
7 Mode opératoire
c[(NH&SO~] = 3,2 mol/l.
7.1 Hydrolyse des groupements acétyles
La solution est stable pendant 1 an si on la conserve
à + 4 “C.
7.1 .‘ll Dispersion de l’amidon granulaire
NOTE 2 Une Unité internationale (1 U) catalyse la réac-
Peser, à 1 mg près, environ 1 g de l’échantillon pré-
tion de 1 pmol à 25 “C de substrat correspondant par mi-
nute. paré et l’introduire dans une fiole conique (5.1).
2
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0 ISO ISO 11213:1995(F)
Ajouter 50 ml d’acide chlorhydrique (4.1) tout en agi- 7.2.3 Dissolution et filtration
tant pour assurer une bonne dispersion. Continuer
Fermer la fiole conique et agiter pendant 30 min.
comme décrit en 7.1.3.
Transvaser le contenu de la fiole conique quantita-
7.1.2 Dispersion de l’amidon gonflant
tivement dans une fiole jaugée de 200 ml (5.3).
Ajouter 50 ml d’acide chlorhydrique (4.1) dans une Transférer la fiole jaugée dans le bain d’eau (5.9) pour
équilibrer la température entre 20 “C et 25 “C.
fiole conique (5.1). Placer un agitateur magnétique et
Contrôler la température et compléter avec de l’eau
commencer l’agitation. Introduire lentement et soi-
distillée jusqu’au trait repère. Filtrer au travers d’un
gneusement environ 1 g de l’échantillon préparé.
S’assurer que la dispersion se fait correctement et papier filtre approprié. Rejeter les premiers 20 ml à
sans grumeaux. Déterminer la masse de la prise 30 ml de filtrat et utiliser directement la solution res-
d’essai en pesant par différence à 1 mg près. tante comme solution d’essai dans le dosage enzy-
matique, comme décrit en 7.4.
7.1.3 Hydrolyse et filtration
Fermer la fiole conique en vissant le bouchon et la
7.3 Essai de contrôle
placer sous agitation dans le bain-marie bouillant (5.2)
pendant 30 min.
Pour contrôler la méthode, l’essai peut être réalisé sur
Sortir la fiole et la laisser refroidir à environ
un matériau de référence tel que l’acétate de sodium
20 “C + 5 “C en la plongeant dans un bain de glace.
anhydre [teneur en acétyle = 52,4 % (I&I)]. Pour ce
Ouvrir la fiole lorsque son contenu est complètement
faire, peser, à 0,l mg près, environ 100 mg d’acétate
refroidi, ajouter 10 ml de solution d’hydroxyde de so-
de sodium anhydre. Transférer ensuite dans une fiole
dium (4.2), mélanger et transvaser le contenu quanti-
jaugée de 1 000 ml. Placer la fiole jaugée dans le bain
tativement dans une fiole jaugée de 200 ml (5.3). d’eau (5.9) pour équilibrer la température entre 20 “C
Transférer la fiole jaugée dans le bain d’eau (5.9) pour et 25 “C. Contrôler la température et compléter avec
équilibrer la température entre 20 “C et 25 “C.
de l’eau distillée jusqu’au trait repère. Continuer
Contrôler la température et compléter avec de l’eau
comme décrit en 7.4.
distillée jusqu’au trait repère. Filtrer au travers d’un
papier filtre approprié. Rejeter les premiers 20 ml à
30 ml de filtrat et utiliser directement la solution res-
74 . Dosage enzymatique de l’acide acétique
tante comme solution d’essai dans le dosage enzy-
matique, comme décrit en 7.4.
Effectuer le dosage enzymatique de l’acide acétique
selon le schéma d’analyse ci-après dans les condi-
7.2 Acétate libre
tions suivantes:
7.2.1 Dispersion
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.