Milk and milk products -- Determination of alkaline phosphatase activity

ISO 11816-1|IDF 155-1:2013 specifies a fluorimetric method for the determination of alkaline phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) activity in raw and heat-treated whole milk, semi-skimmed milk, skimmed milk and flavoured milks. This method is applicable to milk and milk-based drinks from cows, sheep and goats. It is also applicable to milk powder after reconstitution. The instrument can read activities up to 7 000 milliunits per litre (mU/l). If the activity is higher than 7 000 mU/l, it is diluted with alkaline phosphatase-free milk so as to obtain a measurement not higher than 7 000 mU/l.

Lait et produits laitiers -- Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline

L'ISO 11816-1|FIL 155-1:2013 spécifie une méthode fluorimétrique pour la détermination de l'activité de la phosphatase alcaline (ALP, EC 3.1.3.1) dans les laits crus et traités thermiquement entiers, demi-écrémés, écrémés et dans les laits aromatisés. La méthode est applicable au lait et aux boissons ŕ base de lait de vache, de brebis et de chčvre. Elle est également applicable au lait en poudre aprčs reconstitution. L'appareillage peut lire des activités jusqu'ŕ 7 000 milliunités par litre (mU/l). Si l'activité est supérieure ŕ 7 000 mU/l, une dilution avec du lait exempt de phosphatase alcaline (7.1) est effectuée de façon ŕ obtenir un mesurage ne dépassant pas 7 000 mU/l.

General Information

Status
Published
Publication Date
21-Oct-2013
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
16-Aug-2013
Completion Date
22-Oct-2013
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ISO 11816-1:2013 - Milk and milk products -- Determination of alkaline phosphatase activity
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ISO 11816-1:2013 - Lait et produits laitiers -- Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11816-1
IDF
155-1
Third edition
2013-11-01
Milk and milk products —
Determination of alkaline
phosphatase activity —
Part 1:
Fluorimetric method for milk and
milk-based drinks
Lait et produits laitiers — Détermination de l’activité de la
phosphatase alcaline —
Partie 1: Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base de lait
Reference numbers
ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)
ISO and IDF 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO/IDF 2013

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form or

by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior written

permission. Permission can be requested from either ISO or IDF at the respective address below or ISO’s member body in the

country of the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

4 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 3

7 Preparations ............................................................................................................................................................................................................. 3

7.1 Alkaline phosphatase-free milk ................................................................................................................................................ 3

7.2 Preparation of test sample ............................................................................................................................................................ 4

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Verification of instrument performance ........................................................................................................................... 4

8.2 Reagent controls to test the suitability of ready-to-use working substrate (4.3) ......................... 5

8.3 Calibration .................................................................................................................................................................................................. 5

8.4 Determination ......................................................................................................................................................................................... 6

8.5 Test sample-related controls ...................................................................................................................................................... 6

9 Calculation and expression of results ............................................................................................................................................. 7

9.1 Calibration ratio ..................................................................................................................................................................................... 7

9.2 Calculation .................................................................................................................................................................................................. 8

9.3 Expression of test results ............................................................................................................................................................... 8

10 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 8

10.1 Collaborative test .................................................................................................................................................................................. 8

10.2 Repeatability ............................................................................................................................................................................................. 8

10.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................... 8

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

Annex A
(informative)

Collaborative trials ..........................................................................................................................................................................................10

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................13

© ISO and IDF 2013 – All rights reserved iii
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ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national

standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally

carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which

a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.

International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part

in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all

matters of electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2. www.iso.org/directives

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received. www.iso.org/patents

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and

milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and IDF.

This third edition of ISO 11816-1|IDF 155-1 cancels and replaces the second edition (ISO 11816-1:2006),

which has been technically revised.

ISO 11816|IDF 155 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products —

Determination of alkaline phosphatase activity:
— Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
— Part 2: Fluorimetric method for cheese
iv © ISO and IDF 2013 – All rights reserved
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ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)
Foreword

IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector

worldwide. IDF membership comprises National Committees in every member country as well as

regional dairy associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of

IDF have the right to be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work.

IDF collaborates with ISO in the development of standard methods of analysis and sampling for milk and

milk products.

The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International

Standards adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for

endorsement prior to publication as an International Standard. Publication as an International Standard

requires approval by at least 50 % of IDF National Committees casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

ISO 11816-1|IDF 155-1 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical

Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published

jointly by IDF and ISO.

All work was carried out by the Joint ISO-IDF Project Group on Determination of alkaline phosphatase

activity – fluorimetric method, of the Standing Committee on Analytical Methods for Processing Aids and

Indicators, under the aegis of its project leader, Ms. Eileen Garry (USA).

This third edition of ISO 11816-1|IDF 155-1 cancels and replaces IDF 155-1:2006, which has been

technically revised.

ISO 11816|IDF 155 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products —

Determination of alkaline phosphatase activity:
— Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
— Part 2: Fluorimetric method for cheese
© ISO and IDF 2013 – All rights reserved v
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ISO 11816-1:2013(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 155-1:2013(E)
Milk and milk products — Determination of alkaline
phosphatase activity —
Part 1:
Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
1 Scope

This part of ISO 11816|IDF 155 specifies a fluorimetric method for the determination of alkaline

phosphatase (ALP, EC 3.1.3.1) activity in raw and heat-treated whole milk, semi-skimmed milk, skimmed

milk and flavoured milks. This method is applicable to milk and milk-based drinks from cows, sheep and

goats. It is also applicable to milk powder after reconstitution.

The instrument can read activities up to 7 000 milliunits per litre (mU/l). If the activity is higher than

7 000 mU/l, it is diluted with alkaline phosphatase-free milk (7.1) so as to obtain a measurement not

higher than 7 000 mU/l.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
alkaline phosphatase (ALP) activity

activity of the alkaline phosphatase present in the product, determined by the specified procedure

Note 1 to entry: The alkaline phosphatase activity is expressed as milliunits of enzyme activity per litre of

sample (mU/l).
2.2
unit of alkaline phosphatase activity

amount of alkaline phosphatase enzyme that catalyses the transformation of 1 µmol of substrate per minute

3 Principle

The alkaline phosphatase activity of the sample is measured by a continuous fluorimetric direct

kinetic assay. A non-fluorescent aromatic monophosphoric ester substrate, 2’-[2-benzothiazolyl]-6’-

hydroxybenzothiazole phosphate, in the presence of any alkaline phosphatase derived from the sample,

undergoes hydrolysis of its phosphate radical, producing a highly fluorescent product. Fluorimetric

measurement of alkaline phosphatase (ALP) activity is measured at 38 °C over a 3-min period when

using Fluorophos®. This includes pre-incubation of substrate and sample, followed by multiple kinetic

readings of the reaction rate.

NOTE Although this is a 3-min test, the first minute is an equilibration period to ensure that the sample is at

38 °C. Measurements of activity are actually made from the beginning of the second minute to the end of the third

minute (i.e. over a 2-min period).
4 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or

demineralized water, or water of equivalent purity.
© ISO and IDF 2013 – All rights reserved 1
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ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)

4.1 Fluorophos® substrate, in bottles, each containing 144 mg of Fluorophos® substrate powder,

molecular weight 580 grams per mole.

This is a non-fluorescent aromatic monophosphoric ester substrate, 2’-[2-benzothiazolyl]-6’-

hydroxybenzothiazole phosphate (Fluorophos®). The Fluorophos® substrate remains stable for

two years from the date of manufacture, provided it is stored in unopened bottles at between 2 °C and

8 °C; protect against light.

4.2 Substrate buffer solution, diethanolamine (DEA) buffer solution, c(DEA) = 2,4 mol/l, with pH

10,0, in bottles of 240 ml each. The substrate buffer solution remains stable for two years from the date

of manufacture, provided it is stored in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C; protect against light.

4.3 Working substrate

Allow the Fluorophos® substrate (4.1) and the substrate buffer solution (4.2) to come to room

temperature. Add the content of one bottle of substrate buffer solution (240 ml) (4.2) to that of one bottle

of Fluorophos® substrate (144 mg) (4.1), and mix well by inversion for 3 min to create ~1,0 millimolar

(pH 10) solution. Use amber glass to protect against light.

Allow the obtained solution to stand at room temperature for at least 30 min prior to use.

Use the A/D (analogue-to-digital) test given in 8.2 to test the suitability of the ready-to-use working substrate.

Do not use the working substrate if a reading above 1 200 FLU (fluorescence units) is obtained (8.2).

The working substrate remains stable for 60 days when protected from light and stored at between 2 °C

and 8 °C, or for 8 h when stored at 38 °C.

NOTE The volume of the working substrate (240 ml) obtained is sufficient for approximately 115 tests.

4.4 Calibrator solutions, Fluoroyellow®(FY) [2’-(2-benzothiazolyl)-6’-hydroxybenzothiazole] in

substrate buffer solution (4.2).

The calibrator solutions remain stable for 18 months from the date of manufacture, provided they are

stored in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C. Mix gently prior to use to ensure optimal results.

4.4.1 Calibrator solution A, containing 0 μmol/l of Fluoroyellow®.
4.4.2 Calibrator solution B, containing 17,24 × 10 μmol/l of Fluoroyellow®.
4.4.3 Calibrator solution C, containing 34,48 × 10 μmol/l of Fluoroyellow®.

4.5 Daily instrument control solution, containing 34,48 x10 µmol/l of Fluoroyellow®.

The daily instrument control solution remains stable for 18 months from the date of manufacture,

provided it is stored in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C. Mix gently prior to use to ensure

optimal results.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.

1) The reagents specified in 4.1 to 4.5 and the apparatus specified in 5.1 to 5.4 (except 5.3.3) comprise the Fluorophos

Test System, which is the trade name of a product supplied by Advanced Instruments, Inc., Two Technology Way,

Norwood, Massachusetts 02062, USA. The manufacturer may change the packaging configurations supplied with

Fluorophos Test system. The user should refer to the manufacturer’s instructions for preparing reagents if different

from those specified herein. Fluorophos and Fluoroyellow are trademarks of Advanced Instruments, Inc. This

information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO

or IDF of the products named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

2 © ISO and IDF 2013 – All rights reserved
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ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)

5.1 Filter fluorimeter, with thermostatically controlled cuvette holder, capable of operating at

38 °C ± 1 °C and right-angle optics, allowing excitation at a wavelength of 440 nm and emission at between

520 nm and 560 nm [e.g. Fluorophos® instrument ].
5.2 Cuvettes, disposable, of non-fluorescent glass.
5.3 Pipettes
5.3.1 Fixed-volume dispenser, capable of dispensing 2,0 ml.
5.3.2 Positive-displacement or air displacement pipette, of capacity 0,075 ml.

Follow strict instructions for pipetting technique as this is a critical step in generating accurate results.

Ensure that piston of pipette bore is tightly secured prior to use.
5.3.3 Pipettes, of capacity 2 ml and 3 ml.

5.4 Incubator block, capable of maintaining a temperature of 38 °C ± 1 °C, suitable for holding cuvettes.

5.5 Suitable laboratory-grade film.
5.6 Vortex mixer.

5.7 Water bath, capable of maintaining a temperature of 63 °C ± 1 °C and 95 °C ± 1 °C.

5.8 One-mark volumetric flasks, of capacity 100 ml.
6 Sampling

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 11816|IDF 155. A recommended sampling

method is given in ISO 707|IDF 50.

A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or

changed during transport or storage.
7 Preparations
7.1 Alkaline phosphatase-free milk

Prepare phosphatase-free milk of the type to be tested by carefully dispensing the desired portion of

milk into a test tube or suitable container, ensuring that no milk touches the rim or sides of the container.

Place the tube or container with the milk portion in the water bath (5.7) set at 95 °C. Preheat the milk

portion to 95 °C, before starting its 5-min heating period at that temperature. Check the temperature by

using a thermometer or thermistor probe placed in the centre of the tube or container. When the milk

portion reaches 95 °C, immediately start its 5-min heating period. Cool the whole portion rapidly after

the heating period.

Test the thus-treated milk portion to ensure that its ALP activity is less than 10 mU/l.

© ISO and IDF 2013 – All rights reserved 3
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ISO 11816-1:2013(E)
IDF 155-1:2013(E)
7.2 Preparation of test sample
7.2.1 General
Carefully mix all test samples prior to use.
NOTE It is usually not necessary to prewarm test samples.
7.2.2 Pasteurized test samples
Use pasteurized test samples as delivered, in amounts as required.
7.2.3 Dilution of test samples with high ALP values

Prepare dilutions of the test samples of milk using phosphatase-free milk (7.1) in order to bring their

ALP levels within the analytical range of assay (<7 000 mU/l). Mix the diluted solutions well.

8 Procedure
8.1 Verification of instrument performance
8.1.1 General

It is important to check instrument performance for drift, stray light and stability prior to analysing test

samples. Follow good laboratory practice principles when operating the filter fluorimeter (5.1).

Quality control tests include
a) the daily A/D test, used to check the proper functioning of the equipment,

b) the daily instrument control test, using the daily instrument control solution (4.5) to monitor any

electronic or optical drift in the fluorimeter, and

c) the use of external positive, negative and normal controls, described in 8.1.3, which are recommended

for monitoring daily instrument precision parameters.
8.1.2 A/D tests

8.1.2.1 When using the Fluorophos® instrument, perform the A/D tests daily before testing commence

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11816-1
FIL
155-1
Troisième édition
2013-11-01
Lait et produits laitiers —
Détermination de l’activité de la
phosphatase alcaline —
Partie 1:
Méthode fluorimétrique pour le lait et
les boissons à base de lait
Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase
activity —
Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks
Numéros de référence
ISO 11816-1:2013(F)
FIL 155-1:2013(F)
ISO et FIL 2013
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ISO 11816-1:2013(F)
FIL 155-1:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO/FIL 2013

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO ou à

la FIL, à l’une ou l’autre des adresses ci-après, ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office Fédération Internationale du Lait

Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B • B-1030 Brussels

Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
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Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2013 – Tous droits réservés
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ISO 11816-1:2013(F)
FIL 155-1:2013(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

3 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

4 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

6 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 3

7 Préparations ............................................................................................................................................................................................................. 3

7.1 Lait exempt de phosphatase alcaline ................................................................................................................................... 3

7.2 Préparation de l’échantillon pour essai ............................................................................................................................. 4

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Vérification des performances de l’appareillage ....................................................................................................... 4

8.2 Contrôles de réactifs pour évaluer l’adéquation du substrat de travail prêt à l’emploi (4.3) .

8.3 Étalonnage .................................................................................................................................................................................................. 5

8.4 Détermination ......................................................................................................................................................................................... 6

8.5 Contrôles relatifs aux échantillons pour essai ............................................................................................................. 7

9 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................... 7

9.1 Rapport d’étalonnage ........................................................................................................................................................................ 7

9.2 Calcul ............................................................................................................................................................................................................... 8

9.3 Expression des résultats d’essai .............................................................................................................................................. 8

10 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 8

10.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 8

10.2 Répétabilité ................................................................................................................................................................................................ 9

10.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................... 9

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9

Annexe A
(informative)

Essais interlaboratoires .............................................................................................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................13

© ISO et FIL 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11816-1:2013(F)
FIL 155-1:2013(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2, www.iso.

org/directives.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les

références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration

du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues,

www.iso.org/brevets.

Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour

information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité

SC 5, Lait et produits laitiers et la Fédération internationale du Lait (FIL). Il est publié conjointement par

l’ISO et la FIL.

Cette troisième édition de l’ISO 11816-1|FIL 155-1 annule et remplace la deuxième édition

(ISO 11816-1:2006), qui a fait l’objet d’une révision technique.

L’ISO 11816|FIL 155 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits

laitiers — Détermination de l’activité de la phosphatase alcaline:
— Partie 1: Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base de lait
— Partie 2: Méthode fluorimétrique pour le fromage
iv © ISO et FIL 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11816-1:2013(F)
FIL 155-1:2013(F)
Avant-propos

La FIL (Fédération Internationale du Lait) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité

National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités

permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l’ISO et avec pour

l’élaboration de méthodes normalisées d’analyse et d’échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.

La tâche principale des Comités permanents est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de

Normes internationales ayant reçu l’approbation des Comités permanents sont soumis aux Comités

Nationaux pour entérinement avant publication comme Normes internationales. Leur publication

comme Normes internationales requiert l’approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants.

L’attention est attirée sur le fait que certains éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de brevets. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de

propriété et averti de leur existence.

Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour

information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.

L’ISO 11816-1|FIL 155-1 a été élaborée par la Fédération Internationale du Lait (FIL) et par le comité

technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée

conjointement par la FIL et l’ISO.

L’ensemble des travaux a été réalisé par le Groupe de projet mixte ISO-FIL relatif à la Détermination de

l’activité de la phosphatase alcaline — méthode fluorimétrique, du Comité permanent chargé des Méthodes

analytiques pour les aides et indicateurs de procédés industriels, sous la conduite de son chef de projet,

Mme Eileen Garry (États-Unis).

Cette troisième édition de l’ISO 11816-1|FIL 155-1 annule et remplace la FIL 155-1:2006, qui a fait l’objet

d’une révision technique.

L’ISO 11816|FIL 155 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits

laitiers — Détermination de l’activité de la phosphatase alcaline:
— Partie 1: Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base de lait
— Partie 2: Méthode fluorimétrique pour le fromage
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ISO 11816-1:2013(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 155-1:2013(F)
Lait et produits laitiers — Détermination de l’activité de la
phosphatase alcaline —
Partie 1:
Méthode fluorimétrique pour le lait et les boissons à base
de lait
1 Domaine d’application

La présente partie de l’ISO 11816|FIL 155 spécifie une méthode fluorimétrique pour la détermination

de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP, EC 3.1.3.1) dans les laits crus et traités thermiquement

entiers, demi-écrémés, écrémés et dans les laits aromatisés. La méthode est applicable au lait et aux

boissons à base de lait de vache, de brebis et de chèvre. Elle est également applicable au lait en poudre

après reconstitution.

L’appareillage peut lire des activités jusqu’à 7 000 milliunités par litre (mU/l). Si l’activité est supérieure

à 7 000 mU/l, une dilution avec du lait exempt de phosphatase alcaline (7.1) est effectuée de façon à

obtenir un mesurage ne dépassant pas 7 000 mU/l.
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

2.1
activité de la phosphatase alcaline (ALP)

activité de la phosphatase alcaline présente dans un produit, déterminée suivant le mode opératoire spécifié

Note 1 à l’article: L’activité de la phosphatase alcaline est exprimée en milliunités d’activité enzymatique par litre

d’échantillon (mU/l).
2.2
unité d’activité de la phosphatase alcaline

quantité d’enzyme phosphatase alcaline qui catalyse la transformation de 1 µmol de substrat par minute

3 Principe

L’activité de la phosphatase alcaline de l’échantillon se mesure en effectuant un essai cinétique

direct fluorimétrique continu. Un substrat d’ester monophosphorique aromatique non fluorescent,

2’-[2-benzothiazolyl]-6’-hydroxybenzothiazole phosphate, en présence de phosphatase alcaline issue de

l’échantillon, subit une hydrolyse de son radical phosphate et produit un composé hautement fluorescent.

Le mesurage fluorimétrique de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) est effectué à 38 °C sur une

période de 3 min lorsque l’on utilise le Fluorophos®. Ce mesurage comprend la préincubation du substrat

et de l’échantillon, suivie de plusieurs lectures cinétiques de la vitesse de réaction.

NOTE Bien que l’essai dure 3 min, la première minute est une période d’équilibration afin de s’assurer que

l’échantillon est à 38 °C. Les mesurages d’activité sont en effet réalisés du début de la deuxième minute à la fin de

la troisième minute (c’est-à-dire sur une période de 2 min).
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4 Réactifs

Sauf spécification contraire, utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue et de

l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.

4.1 Substrat Fluorophos® , en flacons, contenant chacun 144 mg de poudre de substrat Fluorophos®,

masse moléculaire 580 g/mol.

Il s’agit d’un substrat d’ester monophosphorique aromatique non fluorescent, 2’-[2-benzothiazolyl]-6’-

hydroxybenzothiazole phosphate (Fluorophos®). Le substrat Fluorophos® reste stable pendant 2 ans

après sa date de fabrication lorsqu’il est conservé, dans le flacon non ouvert, entre 2 °C et 8 °C; garder à

l’abri de la lumière.

4.2 Solution tampon de substrat, solution tampon de diéthanolamine (DEA), c(DEA) = 2,4 mol/l, pH 10,0,

en flacons de 240 ml. La solution tampon de substrat reste stable pendant 2 ans après sa date de fabrication

lorsqu’elle est conservée, dans le flacon non ouvert, entre 2 °C et 8 °C; garder à l’abri de la lumière.

4.3 Substrat de travail

Amener le substrat Fluorophos® (4.1) et la solution tampon de substrat (4.2) à température ambiante.

Ajouter le contenu d’un flacon de solution tampon de substrat (240 ml) (4.2) à un flacon de substrat

Fluorophos (144 mg) (4.1), puis mélanger avec soin en retournant le récipient pendant 3 min pour

créer une solution d’environ 1,0 millimole (pH 10). Utiliser un verre ambré pour protéger de la lumière.

Laisser la solution ainsi obtenue reposer à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.

Utiliser l’essai A/D (analogique/numérique) donné en 8.2 pour vérifier que le substrat de travail prêt

pour utilisation est bon. Ne pas utiliser le substrat de travail en cas d’obtention d’une valeur supérieure

à 1200 FLU (unités de fluorescence) (8.2).

Le substrat de travail reste stable pendant 60 jours lorsqu’il est conservé à l’abri de la lumière entre 2 °C

et 8 °C, ou pendant 8 h lorsqu’il est conservé à 38 °C.

NOTE Le volume de substrat de travail obtenu (240 ml) suffit pour effectuer environ 115 essais.

4.4 Solutions étalons, Fluoroyellow® (FY) [2’-(2-benzothiazolyl)-6’-hydroxybenzothiazole] dans une

solution tampon de substrat (4.2).

Les solutions étalons restent stables pendant 18 mois après leur date de fabrication lorsqu’elles sont

conservées dans des flacons non ouverts entre 2 °C et 8 °C. Mélanger doucement avant utilisation pour

obtenir des résultats optimaux.
4.4.1 Solution étalon A, contenant 0 μmol/l de Fluoroyellow®.
4.4.2 Solution étalon B, contenant 17,24 × 10 μmol/l de Fluoroyellow®.
4.4.3 Solution étalon C, contenant 34,48 × 10 μmol/l de Fluoroyellow®.

1) Les réactifs spécifiés en 4.1 à 4.5 et les appareils spécifiés en 5.1 à 5.4 (sauf 5.3.3) sont disponibles sous

l’appellation commerciale «Fluorophos Test System» et sont fournis par Advanced Instruments, Inc., Two Technology

Way, Norwood, Massachusetts 02062, États-Unis. La configuration des emballages fournis avec le Fluorophos Test

System peut être modifiée par le fabricant. II convient que l’utilisateur se réfère aux instructions du fabricant pour

la préparation des réactifs s’ils se révèlent différents de ceux spécifiés dans le présent document. Fluorophos et

Fluoroyellow sont des marques déposées de Advanced Instruments, Inc. Cette information est donnée à l’intention

des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuvent ou recommandent

l’emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils

conduisent aux mêmes résultats.
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4.5 Solution de contrôle quotidien des instruments, contenant 34,48 × 10 µmol/l de Fluoroyellow®.

La solution de contrôle quotidien des instruments reste stable pendant 18 mois après sa date de

fabrication lorsqu’elle est conservée dans des flacons non ouverts entre 2 °C et 8 °C. Mélanger doucement

avant utilisation pour obtenir des résultats optimaux.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.

5.1 Fluorimètre à filtre, avec un support de cuvettes à contrôle thermostatique, capable de fonctionner

à 38 °C ± 1 °C et avec une optique à angle droit, permettant une excitation à une longueur d’onde de

440 nm et une émission entre 520 nm et 560 nm [appareillage Fluorophos® par exemple].

5.2 Cuvettes, jetables, en verre non fluorescent.
5.3 Pipettes
5.3.1 Pipette à volume fixe, permettant de délivrer 2,0 ml.

5.3.2 Pipette à déplacement positif ou pipette à piston, de 0,075 ml de capacité.

Suivre à la lettre les instructions de la technique de pipetage car cette étape est cruciale pour l’obtention

de résultats précis. Veiller à bien immobiliser le piston de l’alésage de la pipette avant utilisation.

5.3.3 Pipettes, de 2 ml et 3 ml de capacité.

5.4 Bloc d’incubation, pouvant maintenir une température de 38 °C ± 1 °C et pouvant contenir des cuvettes.

5.5 Film de qualité pour laboratoire approprié.
5.6 Agitateur/mélangeur Vortex.

5.7 Bain d’eau, pouvant maintenir une température de 63 °C ± 1 °C et 95 °C ± 1 °C.

5.8 Fioles jaugées à un trait, de 100 ml de capacité.
6 Échantillonnage

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 11816|FIL 155.

Une méthode d’échantillonnage recommandée est fournie dans l’ISO 707|FIL 50.

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou

modifié lors du transport ou de l’entreposage.
7 Préparations
7.1 Lait exempt de phosphatase alcaline

Préparer du lait exempt de phosphatase, du même type que l’échantillon à analyser, en versant avec soin

la quantité de lait voulue dans un tube à essai ou dans un récipient adapté, en veillant à ce que le lait ne

touche pas le bord ou les côtés du récipient.
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Placer le tube ou le récipient contenant le lait dans le bain d’eau (5.7) réglé à 95 °C. Préchauffer le lait à

95 °C avant de démarrer la période de chauffage de 5 min à cette température. Contrôler la température

à l’aide d’un thermomètre ou d’une sonde à thermistance, placée au centre du tube ou du récipient. Dès

que la température du lait atteint 95 °C, démarrer la période de chauffage de 5 min. À l’issue de cette

période de chauffage, refroidir le lait rapidement.

Soumettre à essai le lait ainsi traité afin de s’assurer que son activité ALP est inférieure à 10 mU/l.

7.2 Préparation de l’échantillon pour essai
7.2.1 Généralités
Mélanger soigneusement tous les échantillons pour essai avant utilisation.
NOTE Il est généralement inutile de préchauffer les échantillons pour essai.
7.2.2 Échantillons pour essai pasteurisés

Utiliser les échantillons pour essai pasteurisés tels que livrés, dans les quantités requises.

7.2.3 Dilution d’échantillons pour essai avec des valeurs d’ALP élevées

Préparer des dilutions des échantillons de lait en utilisant du lait exempt de phosphatase (7.1), de

manière que leurs niveaux d’ALP se situent dans la plage analytique de l’essai (<7 000 mU/l). Mélanger

soigneusement les solutions diluées.
8 Mode opératoire
8.1 Vérification des performances de l’appareillage
8.1.1 Généralités

Il est important de vérifier les performances de l’appareillage en matière d’écarts, de lumière parasite

et de stabilité avant de procéder à l’analyse des échantillons pour essai. Veiller à utiliser le fluorimètre à

filtre (5.1) conformément aux principes de bonnes pratiques de laboratoire.
Les essais réalisés dans le cadre du contrôle qualité comprennent:

a) l’essai quotidien A/D utilisé pour vérifier le bon fonctionnement de l’équipement,

b) l’essai pour le contrôle quotidien de l’appareillage en utilisant la solution de contrôle quotidien de

l’instrument (4.5) pour identifier tout écart électronique ou optique du fluorimètre, et

c) l’utilisation de contrôles externes positifs, négatifs et normaux, décrits en 8.1.3, qui sont recommandés

dans le cadre de la surveillance quotidienne des paramètres de fidélité de l’appareillage.

8.1.2 Essais A/D

8.1.2.1 Si l’on utilise l’appareillage Fluorophos®, effectuer les essais A/D quotidiennement avant de

commencer l’essai proprement dit.

8.1.2.2 Accéder à l’essai A/D via le menu «SETUP». Appuyer sur «SETUP», puis sélectionner l’option

de menu «A/D Test» en appuyant sur < ou > . Sans rien mettre dans le support de cuvettes, appuyer sur

«START». Attendre que les chiffres apparaissant à l’écran se stabilisent. Il convient que l’affichage indique

302 ± 4. Si le résultat se situe en dehors de cet intervalle, nettoyer les filtres d’excitation et d’émission,

puis répéter l’essai A/D.
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8.1.2.3 Introduire 2,0 ml de la solution de contrôle quotidien des instruments (4.5) dans une

cuvette étiquetée. Placer la cuvette dans le bloc d’incubation (5.4) réglé à 38 °C pendant 20 min. Insérer

la cuvette préchauffée dans le support de cuvette. Fermer le couvercle. Une fois l’affichage stabilisé,

enregistrer la valeur affichée, dont il convient qu’elle se situe à 602 ± 12. Si tel n’est pas le cas, utiliser le

petit tournevis fourni pour tourner délicatement la vis du potentiomètre située à gauche de l’appareillage,

dans le sens horaire ou dans le sens inverse, selon les besoins, jusqu’à ce que la valeur 602 s’affiche.

Laisser les chiffres affichés se stabiliser pendant 15 min.
8.1.3 Contrôles

Effectuer les contrôles positif, négatif et PhosphaCheck-N en utilisant une base de lait en poudre avec

phosphatase et conservateur.

Les contrôles de pasteurisation PhosphaCheck® restent stables pendant 18 mois à compter de la

date de fabrication lorsqu’ils sont conservés dans des flacons non ouverts et non reconstitués à une

température comprise entre 2 °C et 8 °C. Une fois reconstitués, les contrôles sont stables pendant 3 jours

à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas congeler.

Laisser les contrôles arriver à température ambiante. Reconstituer les contrôles de pasteurisation

PhosphaCheck® avant utilisation. Retirer le bouchon en métal et caoutchouc. Ajouter 3,0 ml d’eau

déionisée à température ambiante.

Remettre en place le bouchon et mélanger doucement en retournant le récipient pendant 1 min puis

laisser reposer pendant 15 min. Ne pas agiter ni laisser mousser les contrôles. Mélanger doucement

avant chaque utilisation pour obtenir des résultats optimaux.

Étalonner un canal inutilisé avec le contrôle négatif, puis analyser les trois solutions de contrôle

(solutions positive, négative et PhosphaCheck-N™) en ajoutant 75 µl de chaque solution de contrôle à

2 ml de substrat préchauffé. Réaliser l’essai ALP (activité de la phosphatase alcaline).

La valeur du contrôle négatif doit être inférieure à 10 mU/l, celle du contrôle normal PhosphaCheck-N™ doit

être comprise entre 10 mU/l et 40 mU/l et celle du contrôle positif doit être égale à 500 mU/l ± 100 mU/l.

Ces contrôles peuvent être utilisés tous les jours pour contrôler la fidélité de l’appareillage.

8.2 Contrôles de réactifs pour évaluer l’adéquation du substrat de travail prêt à

l’emploi (4.3)

Transférer 2,0 ml du substrat de travail (4.3) dans une cuvette étiquetée. Placer la cuvette dans le bloc

chauffant (5.4) réglé à 38 °C pendant 20 min. Insérer la cuvette préchauffée contenant le substrat de travail

dans le support de cuvette. Fermer le couvercle. Une fois l’affichage stabilisé, enregistrer la valeur affichée.

Un substrat fraîchement préparé en mode A/D génère, en règle générale, à lui seul une valeur d’environ

650 FLU, qui augmente à mesure que le temps s’écoule. Ne pas utiliser le substrat de travail en cas

d’obtention d’une valeur supérieure à 1 200 FLU.
8.3 Étalonnage

Les courbes d’étalonnage sont généralement stables. Toutefois, réétalonner l’appareillage, qui a été

étalonné lors de l’installation du fluorimètre, chaque fois que des opérations d’entretien (remplacement

de la lampe ou du filtre par exemple) sont susceptibles d’influer sur l’étalonnage enregistré ou lorsque

les valeurs de contrôle donnent des résultats inacceptables.

2) Les contrôles et les instructions de contrôle des performances de l’appareillage sont disponibles auprès de

Advanced Instruments Inc., Two Technology Way, Norwood, MA 02062, États-Unis. Cette information est donnée

à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuvent ou

recommandent l’emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est

démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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Si des changements se sont produits au niveau de la courbe d’étalonnage, réétalonner l’appareillage à

l’aide d’un nouveau lot de solutions étalons A, B et C (4.4.1, 4.4.2 et 4.4.3). Établir une courbe d’étalonnage

pour chaque type de produit à soumettre à essai.

Mélanger les solutions étalons A, B et C en retournant doucement le récipient avant utilisation. À l’aide de

la pipette (5.3.3), transférer 2,0 ml des solutions étalons A, B et C (respectivement 4.4.1, 4.4.2 et 4.4.3),

et cela en double, dans six cuvettes étiquetées (5.2). Placer les cuvettes dans le bloc d’incubation (5.4) et

préchauffer à 38 °C pendant 20 min.

À l’aide de la pipette à déplacement positif ou de la pipette à piston (5.3.2), ajouter dans chacune des

six cuvettes 0,075 ml de lait sans phosphatase alcaline (7.1). Couvrir les cuvettes avec le film de qualité

pour laboratoire approprié (5.5). Utiliser l’agitateur/mélangeur Vortex (5.6) pendant 5 s ou retourner

doucement les cuvettes pour mélanger le contenu, puis replacer ces dernières dans le bloc d’incubation

(5.4). Terminer l’étalonnage dans les 10 min suivant l’ajout de l’échantillon pour essai à l’étalon.

En commençant par la solution étalon A, appliquer le mode opératoire d’étalonnage suivant. Essuyer

l’extérieur de chaque cuvette avec un chiffon doux, puis la placer dans le fluorimètre à filtre (5.1). Avec

le Fluorophos®, appuyer sur «CALIB», puis sélectionner le menu «ALP Dairy». Dérouler le menu, puis

appuyer sur «ENTER» lorsque le produit à étalonner apparaît. En commençant par la solution étalon A

(4.4.1), insérer la solution A dans le fluorimètre, puis appuyer sur «START». Une fois le mesurage terminé,

mesurer la seconde solution étalon A.

Suivre le même mode opératoire pour les solutions étalons B (4.4.2) et C (4.4.3). Le Fluorophos® calcule

automatiquement la quantité de fluorescence obtenue avec les solutions étalons B et C par rapport à la

solution étalon A, afin d’établir le rapport d’étalonnage dans l’appareillage.
Une fois l’étalonnage te
...

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