Foodstuffs -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -- Quantitative nucleic acid based methods

ISO 21570:2005 provides the overall framework of quantitative methods for the detection of genetically modified organisms (GMO) in foodstuffs, using the polymerase chain reaction (PCR). It defines general requirements for the specific amplification of DNA target sequences in order to quantify the relative GMO-derived DNA content and to confirm the identity of the amplified DNA sequence. Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in ISO 21570:2005 are intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories. ISO 21570:2005 has been established for food matrices, but is also applicable to other matrices, e.g. feed and plant samples from the environment.

Produits alimentaires -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés -- Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques

L'ISO 21570:2005 fournit un cadre général auquel doit satisfaire toute méthode quantitative de détection des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans les produits alimentaires utilisant la PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Elle définit les exigences générales relatives à l'amplification spécifique de séquences cibles d'ADN, afin de quantifier la teneur relative en ADN dérivé d'OGM et de confirmer l'identité de la séquence d'ADN amplifiée. Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans l'ISO 21570:2005 ont pour but de garantir l'obtention de résultats comparables, exacts et reproductibles, dans différents laboratoires. L'ISO 21570:2005 a été élaborée pour les matrices de produits alimentaires, mais elle est aussi applicable à d'autres matrices, par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes issus de l'environnement.

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02-Nov-2005
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9093 - International Standard confirmed
Start Date
03-Sep-2020
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ISO 21570:2005 - Foodstuffs -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -- Quantitative nucleic acid based methods
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ISO 21570:2005 - Produits alimentaires -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés -- Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21570
First edition
2005-11-01
Foodstuffs — Methods of analysis for the
detection of genetically modified
organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
Reference number
ISO 21570:2005(E)
ISO 2005
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21570:2005(E)
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Published in Switzerland
ii © ISO 2005 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 21570:2005(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................. v

Introduction ....................................................................................................................................................... vi

1 Scope ..................................................................................................................................................... 1

2 Normative references ........................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

4 Principle................................................................................................................................................. 2

4.1 General................................................................................................................................................... 2

4.2 Amplification, detection and confirmation of PCR products ........................................................... 2

4.3 Quantitation of PCR products ............................................................................................................. 2

5 Reagents................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus and equipment ................................................................................................................... 2

7 Guidelines concerning the procedure................................................................................................ 3

7.1 General................................................................................................................................................... 3

7.2 Target sequence stability..................................................................................................................... 3

7.3 Calibration of the analysis ................................................................................................................... 3

7.4 Quantitation considerations ................................................................................................................ 3

7.5 Quality assurance requirements ......................................................................................................... 3

8 Interpretation......................................................................................................................................... 4

9 Expression of results ........................................................................................................................... 4

10 Test report ............................................................................................................................................. 5

Annex A (informative) Target taxon-specific methods................................................................................... 6

A.1 Target taxon-specific method for the absolute quantitation of the adh1 gene DNA of

maize using real-time PCR................................................................................................................... 6

Annex B (informative) Screening methods.................................................................................................... 12

B.1 Screening method for the relative quantitation of the 35S-promoter DNA of soya bean line

GTS 40-3-2 using real-time PCR........................................................................................................ 12

Annex C (informative) Construct-specific methods ..................................................................................... 20

C.1 Construct-specific method for the quantitation of soya bean line GTS 40-3-2 DNA using

real-time PCR (Method 1) ................................................................................................................... 20

C.2 Construct-specific method for the quantitation of soya bean line GTS 40-3-2 DNA using

real-time PCR (Method 2) ................................................................................................................... 27

C.3 Construct-specific method for the quantitation of Event176 maize DNA using real-time

PCR....................................................................................................................................................... 34

C.4 Construct-specific method for the quantitation of soya bean line GTS 40-3-2 DNA using

real-time PCR ...................................................................................................................................... 41

C.5 Construct-specific method for the quantitation of maize line MON 810 DNA using

real-time PCR ...................................................................................................................................... 49

C.6 Construct-specific method for the quantitation of maize line Event176 DNA using

real-time PCR ...................................................................................................................................... 56

C.7 Construct-specific method for the quantitation of maize line Bt11 DNA using real-time

PCR....................................................................................................................................................... 63

© ISO 2005 – All rights reserved iii
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ISO 21570:2005(E)

C.8 Construct-specific method for the quantitation of maize line GA21 DNA using real-time

PCR....................................................................................................................................................... 71

C.9 Construct-specific method for the quantitation of maize line T25 DNA using real-time PCR .... 78

Annex D (informative) Event-specific methods ............................................................................................. 87

D.1 Event-specific method for the absolute and relative quantitation of maize line Bt11 DNA

based on real-time PCR...................................................................................................................... 87

D.2 Event-specific method for the relative quantitation of maize line MON 810 DNA using

real-time PCR....................................................................................................................................... 93

Bibliography ................................................................................................................................................... 100

iv © ISO 2005 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 21570:2005(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 21570 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee

CEN/TC 275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,

Food products, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna

Agreement).
© ISO 2005 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 21570:2005(E)
Introduction

The search for ingredients of genetically modified origin is performed by means of the following successive (or

simultaneous) steps. After sample collection, nucleic acids are extracted from the test portion. Extracted

nucleic acids can be further purified, simultaneously or after the extraction process. Afterwards, they are

quantified (if necessary), diluted (if necessary) and subjected to analytical procedures (such as PCR). These

steps are detailed in the present and in the following International Standards:

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — Quantitative nucleic acid based methods

Further information about definitions and general items involving the steps cited above are collected in:

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — General requirements and definitions.

The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that

compliance with this document may involve the use of a patent concerning the PCR technology.

ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.

ISO has been informed that Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. and Hoffman-La Roche hold

patent rights concerning PCR technology. The companies have assured the ISO that they are willing to

negotiate licences under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout

the world. In this respect, the statements of the holders of these patent rights are registered with ISO.

Information may be obtained from:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404,
USA
and
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501,
USA

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be subject of patent rights

other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

vi © ISO 2005 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21570:2005(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Quantitative nucleic acid based methods
1 Scope

This International Standard provides the overall framework of quantitative methods for the detection of

genetically modified organisms (GMOs) in foodstuffs, using the polymerase chain reaction (PCR).

It defines general requirements for the specific amplification of DNA target sequences, in order to quantify the

relative GMO-derived DNA content and to confirm the identity of the amplified DNA sequence.

Guidelines, minimum requirements and performance criteria laid down in this International Standard are

intended to ensure that comparable, accurate and reproducible results are obtained in different laboratories.

This International Standard has been established for food matrices, but is also applicable to other matrices,

e.g. feed and plant samples from the environment.
Specific examples of methods are provided in Annexes A to D.
2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced

document (including any amendments) applies.

ISO 21569:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived

products — Nucleic acid extraction

ISO 24276:— , Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions

ISO Guide 32, Calibration in analytical chemistry and use of certified reference materials

3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 24276 apply.

1) To be published.
© ISO 2005 – All rights reserved 1
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ISO 21570:2005(E)
4 Principle
4.1 General

Quantitative analysis consists of the quantitation of target DNA sequences in the test samples. Each method

specifies the target sequences(s).
[1],[2] [3],[4]
Quantitation may be performed using competitive or real-time PCR .

A quantitative analysis should clearly express the quantity of the target genetic element, relative to the

quantity of a specific reference, appropriate calibrants and controls, and be within the dynamic range of the

analytical method used and the test portion analysed.
The analysis generally consists of
⎯ amplification of one or more specific target sequences,
⎯ detection and confirmation of the specificity of the PCR product(s), and
⎯ quantitation of the amplified fragments relative to calibrants.

NOTE In the case of real-time PCR analysis, amplification, detection and confirmation occur simultaneously.

4.2 Amplification, detection and confirmation of PCR products

See ISO 21569 for the principles of amplification, detection and confirmation of the DNA sequences.

4.3 Quantitation of PCR products

The principle of quantitation is usually to determine the ratio (expressed as a percent) of two DNA target

sequences; i.e. a sequence representing the genetically modified organism of interest and an (endogenous)

target taxon-specific sequence. However, in some cases, quantitation can also be carried out relative to a

specified amount of food matrix (e.g. when detecting GM microorganisms in foods).

Calibrants (calibration materials) used for quantitation should be traceable to certified reference materials

(CRMs), if available. If not available, other suitable reference material should be used. Example guidance is

provided in Reference [5]. Information on validation studies and measurement uncertainty has been gathered

[6],[7],[8],[9]
from international studies .
5 Reagents

All reagents and materials used in the analysis should be identical, or equivalent, to those specified in the

method. Otherwise, all reagents and materials should be of molecular biology grade. These reagents shall be

stored and used as recommended by the supplier or according to the laboratory quality assurance

specifications. For a list of reagents, see the specific annex.
6 Apparatus and equipment
See Annexes A to D and ISO 24276.
2 © ISO 2005 – All rights reserved
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ISO 21570:2005(E)
7 Guidelines concerning the procedure
7.1 General

General considerations relevant to PCR amplification for the detection of GMOs are described in ISO 21569.

Annexes A to D specify PCR detection methods together with details of their scope of application. The

demonstrated performance characteristics for each method are detailed.

The concentration of the DNA sequence of interest should be within the dynamic range of the method.

NOTE A target taxon specific monitor run can be undertaken to determine whether the template DNA is of sufficient

quality (length and structural integrity), purity and quantity to allow the detection and quantitation of a GMO belonging to

the target taxon. This may be of particular relevance when DNA is extracted from composite or highly processed matrices.

The DNA extracted from each test portion should be analysed at least in duplicate.

Appropriate controls shall be included (see ISO 24276:—, Table 1).
7.2 Target sequence stability

The allelic and copy number stability of the target sequence should be considered for cultivars of different

geographic and phylogenic origins.
7.3 Calibration of the analysis

An appropriate number of calibration points and replicates covering the range of quantitation shall be applied

[e.g. four calibration points with two replicates (altogether 4 × 2 values) or six calibration points with one

measurement at each point (altogether 6 values)]. The quality of the calibration influences the measurement

[9]
uncertainty .

As an alternative to genomic DNA calibration reference materials, for example, a dilution series of a plasmid

or synthetic dsDNA containing the target sequence may be used, provided that it is demonstrated to perform

in an equivalent way to the genomic DNA reference material and the genomic DNA extracted from the sample.

7.4 Quantitation considerations
PCR methods should be appropriately designed to minimize the variability.

NOTE Depending on the method used and/or the material analysed, the presence of stacked genes can lead to

overestimation of the true GMO content.
For the determination of the limit of quantitation (LOQ), see ISO 24276.

Calculation of the GMO content based on copy numbers of target sequences per haploid genome is

influenced by the homo- and heterozygosity of the species under investigation. For details, see Annexes A to

Use of the ∆∆C (cycle of threshold) method is only valid if the amplification efficiencies of the target

taxon-specific assay and the GMO-specific assay are very similar.
7.5 Quality assurance requirements

Consistency between measurements is desirable to obtain reliable estimates of target sequence quantities.

However, knowledge of the relative standard deviation of repeatability of the method is required to establish

whether the measurements are consistent (see the ISO 5725 series for details). To calculate the relative

standard deviation of repeatability, the number of separate measurements per laboratory sample may exceed

what is feasible in practice in terms of acceptable costs. Consequently, if a specified GMO-derived DNA is to

be reported (in percent), a feasible solution should require the following as a minimum:

© ISO 2005 – All rights reserved 3
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ISO 21570:2005(E)
a) within test portion consistency:
⎯ through rejection of measurements

⎯ through maximum deviation observed between dilutions and individual measurements equals the

value expected from the corresponding dilution factor ± 33 %;
b) between test portion consistency:

⎯ estimated relative GMO-derived DNA concentrations obtained under a) for each test portion should

not differ by values greater than −50 % to +100 % of the estimated quantity value (equal to a ∆C of 1

in real-time PCR) (i.e. for two test portions, measurements of 1,0 % and 2,0 % are acceptable,

measurements of 0,9 % and 2,1 % are not).

In order to guarantee accuracy of the measurements, a reference material (RM), preferably certified (CRM),

for the quantity of the event concerned, with an appropriate level of metrological reliability and with reasonable

similarity of matrix shall be selected and analysed. In the absence of a CRM, in-house RM may be prepared

by a procedure demonstrating stability, homogeneity and traceability, and ensuring the absence of bias. The

quantified uncertainty shall fulfil the required uncertainty for the calibration (see ISO Guide 32).

8 Interpretation
The PCR result will be either
a) fit for quantitation of the target sequence provided
⎯ the result is positive according to ISO 21569:2005, 8.1,
⎯ the observable inhibition of the reaction is negligible,
⎯ the analysis produces an unambiguous measurement value,
⎯ the target sequence content is within the dynamic range of the method, and
⎯ the analysis is calibrated in an acceptable way (see 7.3), or

b) not fit for quantitation of the target sequence if any of the conditions listed above are not fulfilled.

The measurement uncertainty shall be sufficiently small to enable the laboratory to draw the relevant

conclusions.

Annexes A to D describe the measurement of the target DNA quantities. These quantities can be used to

calculate the GMO content. These calculations usually take into consideration relevant biological factors, such

as the homo- or heterozygosity of the target sequences.

If the GM target sequence content or the taxon-specific target sequence content is below the limit of

quantitation, the result shall only be expressed qualitatively.

NOTE Stating that the GMO-derived DNA content is below the practical LOQ accompanied by a specification of that

LOQ is considered to be a qualitative expression of the result.
9 Expression of results

The results shall clearly state the quantity of the GM target sequence relative to the target taxon-specific

sequence. The results should also provide values for the measurement uncertainty, such as the standard

4 © ISO 2005 – All rights reserved
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ISO 21570:2005(E)

deviation or relative standard deviation. Furthermore, the LOD and LOQ of the method and the practical LOD

and LOQ should be reported.

The target sequences may or may not be detected, or the quantity of at least one of them may be below the

limit of quantitation. Table 1 describes the four alternative cases and the corresponding expression of the

result to be included into the test report.
Table 1 — Expression of results
Result Expression of the result
Target taxon-specific sequence is not See ISO 21569.
detected.
“For species x, DNA was not detected.”
Target taxon-specific sequence is According to ISO 21569.
detected but GM target sequence is not
“For species x, GMO-derived DNA was not detected.”
detected.
In addition, if applicable, add: “The practical limit of detection is X %.”
(Specify unit used.)
The target taxon-specific sequence and For each GMO, state:
the GM target sequence are both detected
“GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by detection of
but the quantity is below the LOQ of at
(specify target sequence) derived from (specify species) was detected.”
least one of the target sequences.

In addition, if applicable: “The practical limit of quantitation is X %.” (Specify

unit used.)
The target taxon-specific sequence and For each GMO, state:
the GM target sequence are both detected
“The content of GMO (specify the GMO) derived DNA as determined by
and the quantity is above the LOQ for both
detection of (specify target sequence) derived from (specify species) is
target sequences.
X ± uncertainty %.” (Specify unit used.)

The GMO-derived DNA content may also be reported as being above or below a specific value, taking into

account the measurement uncertainty.
10 Test report

The test report shall be written in accordance with ISO 24276 and ISO 21569 and shall contain at least the

following additional information:
a) LOQ of the method and the matrix used to establish it;
b) the practical LOQ;
c) a reference to the method which has been used for the extraction of DNA;
d) the reference material used;
e) the results expressed according to Clause 9.
© ISO 2005 – All rights reserved 5
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ISO 21570:2005(E)
Annex A
(informative)
Target taxon-specific methods

A.1 Target taxon-specific method for the absolute quantitation of the adh1 gene DNA

of maize using real-time PCR
A.1.1 Introduction

This annex describes a method for the specific amplification and quantitation of the taxon-specific

(housekeeping) maize (Zea mays) adh1 gene (coding for alcohol dehydrogenase 1) for determination of the

content of maize DNA, or for testing for the presence/absence of detectable PCR inhibitors in DNA solutions

extracted from products containing maize-derived DNA, e.g. foods.
For limitations, see A.1.8.
A.1.2 Validation status and performance characteristics
A.1.2.1 General

The method has been optimized for DNA extracted from pure ground maize kernels, maize leaves and

[10] [11]
certified reference materials (IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 series ) .

The reproducibility of the described method has been tested in a collaborative trial using unknown samples

(U1 to U6) consisting of wild type maize DNA at different corresponding copy number of the target sequence

(see A.1.2.2), and in other collaborative trials in combination with methods specific for GM maize events, e.g.

Bt11 (see D.1).
[11]
The copy number of the target sequence per haploid genome is estimated to be 1 .
[11]
The allelic stability of the target sequence has been established .
A.1.2.2 Collaborative trial

The method has been validated in a collaborative trial organized by the European Commission's Joint

Research Centre (EC-JRC), Institute for Health and Consumer Protection (IHCP), in agreement with the

[12]
international harmonized protocol .
[13]

Six samples (S1-S6) of wild type maize DNA (extracted from leaf material containing known absolute copy

numbers (183 486, 61 162, 20 387, 6 796, 2 265, 755) of haploid maize genomes were used to establish a

calibration curve for absolute quantitation of haploid maize genomes in unknown samples. The absolute copy

numbers in the known samples were determined by dividing the sample DNA mass (determined by

fluorometric quantitation of dsDNA with PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) by the published

[14]
average 1C value for maize genomes (2,725 pg) .
[13]

Six samples (U1-U6) of wild type maize DNA (extracted from leaf material ) were used as unknown

samples. The expected copy numbers in the unknown samples were determined in the same way as those of

the known samples.
The results of the collaborative trial validation are summarized in Table A.1
6 © ISO 2005 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 21570:2005(E)

The method has also been validated in combination with event-specific methods for several maize GMO, e.g.

for Bt11 sweet maize. See References [15] and [16] and D.1 for details on the combined (relative quantitation)

trial.
Table A.1 — Validation data
Sample
U1 U2 U3 U4 U5 U6
Number of participating laboratories 12 12 12 12 12 12
Number of laboratories having returned results 10 10 10 10 10 10
Number of invalid laboratories 1 1 1 1 1 1
Number of retained laboratories 9 9 9 9 9 9
Number of samples per laboratory 4 4 4 4 4 4
Number of Cochran outliers 1 1 1 1 — —
Number of Grubbs outliers — 1 1 1 1 1
Number of accepted samples 35 34 34 34 35 35
Expected copy number value 7 339 18 349 36 697 55 046 91 743 146 788
Mean copy number value 9 985 23 885 46 918 75 161 100 541 122 080
Bias of true value (%) 36,1 30,2 27,9 36,5 9,6 −16,8
1 318,59 1 463,60 5 796,58 4 539,57 11 306,89 14 843,41
Repeatability standard deviation s
13,21 6,13 12,35 6,04 11,25 12,16
Repeatability relative standard deviation (%)
2 013,12 2 083,57 6 145,39 6 806,85 14 592,04 17 777,70
Reproducibility standard deviation s
20,16 8,72 13,10 9,06 14,51
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21570
Première édition
2005-11-01
Produits alimentaires — Méthodes
d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés
et des produits dérivés — Méthodes
quantitatives basées sur l'utilisation
des acides nucléiques
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Quantitative nucleic acid
based methods
Numéro de référence
ISO 21570:2005(F)
ISO 2005
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 21570:2005(F)
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Version française parue en 2006
Publié en Suisse
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ISO 21570:2005(F)
Sommaire Page

Avant-propos...................................................................................................................................................... v

Introduction ....................................................................................................................................................... vi

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Références normatives ........................................................................................................................ 1

3 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

4 Principe.................................................................................................................................................. 2

4.1 Généralités ............................................................................................................................................ 2

4.2 Amplification, détection et confirmation des produits PCR............................................................. 2

4.3 Quantification des produits PCR ........................................................................................................ 2

5 Réactifs .................................................................................................................................................. 2

6 Appareillage et équipements............................................................................................................... 2

7 Lignes directrices relatives au mode opératoire............................................................................... 3

7.1 Généralités ............................................................................................................................................ 3

7.2 Stabilité de la séquence cible.............................................................................................................. 3

7.3 Étalonnage de l'analyse ....................................................................................................................... 3

7.4 Considérations relatives à la quantification ...................................................................................... 3

7.5 Exigences relatives à l'assurance qualité .......................................................................................... 4

8 Interprétation......................................................................................................................................... 4

9 Expression des résultats ..................................................................................................................... 5

10 Rapport d'essai ..................................................................................................................................... 5

Annexe A (informative) Méthodes spécifiques du taxon cible ...................................................................... 6

A.1 Méthode spécifique du taxon cible pour la quantification absolue de l'ADN du gène adh1

du maïs par PCR en temps réel........................................................................................................... 6

Annexe B (informative) Méthodes de criblage .............................................................................................. 13

B.1 Méthode de criblage pour la quantification relative de l'ADN du promoteur 35S de la

lignée de soja GTS 40-3-2 par PCR en temps réel........................................................................... 13

Annexe C (informative) Méthodes construit-spécifiques du gène.............................................................. 21

C.1 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de soja

GTS 40-3-2 par PCR en temps réel (Méthode 1) .............................................................................. 21

C.2 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de soja

GTS 40-3-2 par PCR en temps réel (Méthode 2) .............................................................................. 28

C.3 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de maïs

Événement176 par PCR en temps réel ............................................................................................. 36

C.4 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de soja

GTS 40-3-2 par PCR en temps réel.................................................................................................... 43

C.5 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs

MON 810 par PCR en temps réel ....................................................................................................... 52

C.6 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs

Événement176 par PCR en temps réel ............................................................................................. 60

C.7 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs

Bt11 par PCR en temps réel............................................................................................................... 68

C.8 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs

GA21 par PCR en temps réel ............................................................................................................. 76

C.9 Méthode construit-spécifique du gène pour la quantification de l'ADN de la lignée de maïs

T25 par PCR en temps réel ................................................................................................................ 84

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ISO 21570:2005(F)

Annexe D (informative) Méthodes événement-spécifiques.......................................................................... 93

D.1 Méthode événement-spécifique pour la quantification absolue et relative de l'ADN de la

lignée de maïs Bt11 par PCR en temps réel..................................................................................... 93

D.2 Méthode événement-spécifique pour la quantification relative de l'ADN de la lignée

de maïs MON 810 par PCR en temps réel....................................................................................... 100

Bibliographie .................................................................................................................................................. 107

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ISO 21570:2005(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 21570 a été élaborée par le Comité européen de normalisation (CEN), le comité technique CEN/TC 275,

Analyse des produits alimentaires — Méthodes horizontales, en collaboration avec le comité technique

ISO/TC 34, Produits alimentaires, conformément à l'Accord sur la coopération technique entre l'ISO et le CEN

(Accord de Vienne).
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ISO 21570:2005(F)
Introduction

La recherche d'ingrédients d'origine génétiquement modifiée est réalisée au moyen des étapes successives

(ou simultanées) suivantes. Après la collecte d'échantillons, des acides nucléiques sont extraits de la prise

d'essai. Les acides nucléiques extraits peuvent faire l'objet d'une purification plus poussée au cours du

processus d'extraction ou une fois ce dernier achevé. Ensuite, ils sont quantifiés (si besoin est), dilués (si

besoin est) et soumis à des modes opératoires analytiques (comme la PCR). Ces étapes sont décrites en

détail dans la présente Norme internationale et dans les Normes internationales suivantes:

ISO 21569, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques

ISO 21570, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques

D'autres informations concernant les définitions et les aspects généraux évoqués dans les étapes ci-avant

sont réunies dans:

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions

L'Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l'attention sur le fait que la conformité avec le

présent document peut impliquer l'utilisation d'un brevet relatif à la technologie PCR.

L'ISO ne prend pas position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d'application du droit de

propriété industrielle concerné.

L'ISO a été informée qu'Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. et Hoffman-La Roche détiennent

des droits de propriété industrielle relatifs à la technologie PCR. Ces sociétés ont garanti à l'ISO qu'elles

souhaitent négocier des licences à des conditions raisonnables et non discriminatoires avec les demandeurs

du monde entier. À cet égard, les déclarations des détenteurs de ces droits de propriété industrielle sont

enregistrées auprès de l'ISO. Il est possible d'obtenir des informations aux adresses suivantes:

Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404,
États-Unis
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501,
États-Unis

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de droits

de propriété industrielle ou de droits analogues autres que ceux identifiés ci-avant. L'ISO ne saurait être tenue

pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

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NORME INTERNATIONALE ISO 21570:2005(F)
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation
des acides nucléiques
1 Domaine d'application

La présente Norme internationale fournit un cadre général auquel doit satisfaire toute méthode quantitative de

détection des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans les produits alimentaires utilisant la PCR

(réaction de polymérisation en chaîne).

Elle définit les exigences générales relatives à l'amplification spécifique de séquences cibles d'ADN, afin de

quantifier la teneur relative en ADN dérivé d'OGM et de confirmer l'identité de la séquence d'ADN amplifiée.

Les lignes directrices, les exigences minimales et les critères de performance exposés dans la présente

Norme internationale ont pour but de garantir l'obtention de résultats comparables, exacts et reproductibles,

dans différents laboratoires.

La présente Norme internationale a été élaborée pour les matrices de produits alimentaires, mais elle est

aussi applicable à d'autres matrices, par exemple des aliments pour animaux et des échantillons de plantes

issus de l'environnement.
Des exemples de méthodes spécifiques figurent dans les Annexes A à D.
2 Références normatives

Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les

références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du

document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.

ISO 21569:2005, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques

ISO 21571, Produits alimentaires — Méthode d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276:— , Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions

ISO Guide 32, Étalonnage en chimie analytique et utilisation de matériaux de référence certifiés

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 24276 s'appliquent.

1) Paru depuis la publication de la version anglaise du présent document.
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ISO 21570:2005(F)
4 Principe
4.1 Généralités

Une analyse quantitative consiste à dénombrer les séquences d'ADN cibles dans les échantillons pour essai.

Chaque méthode spécifie la ou les séquence(s) cible(s).
[1], [2] [3], [4]

Cette quantification peut être réalisée en utilisant une PCR compétitive ou en temps réel .

Il convient qu'une analyse quantitative indique clairement la quantité de l'élément génétique cible, rapportée à

la quantité d'une référence spécifique, de matériaux pour l'étalonnage et de témoins appropriés et qu'elle soit

comprise dans les limites de la plage dynamique de la méthode analytique utilisée et de la prise d'essai

analysée.
L'analyse comprend généralement
⎯ l'amplification d'une ou de plusieurs séquences cibles spécifiques,
⎯ la détection et la confirmation de la spécificité du ou des produit(s) PCR et

⎯ la quantification des fragments amplifiés par rapport aux matériaux pour l'étalonnage.

NOTE Dans les analyses par PCR en temps réel, l'amplification, la détection et la confirmation sont simultanées.

4.2 Amplification, détection et confirmation des produits PCR

Pour les principes d'amplification, de détection et de confirmation des séquences d'ADN, se référer à

l'ISO 21569.
4.3 Quantification des produits PCR

Le principe de la quantification consiste généralement à déterminer le rapport (exprimé en pourcentage) de

deux séquences d'ADN cibles, l'une représentant l'organisme génétiquement modifié visé et l'autre étant

spécifique (endogène) du taxon ciblé. Cependant, dans certains cas, la quantification peut également être

rapportée à une quantité spécifiée de matrice de produit alimentaire (par exemple lors de la détection de

micro-organismes génétiquement modifiés dans les produits alimentaires).

Il convient de relier les matériaux pour l'étalonnage utilisés pour la quantification à des matériaux de référence

certifiés (MRC), quand ceux-ci sont disponibles. Si ce n'est pas le cas, il convient d'utiliser d'autres matériaux

de référence appropriés. Voir l'exemple fourni dans la Référence [5]. Les informations relatives aux études de

[6], [7], [8], [9]

validation et à l'incertitude de mesure ont été rassemblées dans le cadre d'études internationales .

5 Réactifs

Il convient que tous les réactifs et matériaux utilisés dans l'analyse soient identiques ou équivalents à ceux

spécifiés dans la méthode. En l'absence de spécification, il convient que tous les réactifs et matériaux soient

de qualité «biologie moléculaire». Ces réactifs doivent être conservés et utilisés selon les recommandations

du fournisseur ou conformément aux spécifications d'assurance qualité du laboratoire. Une liste des réactifs

est donnée dans une annexe spécifique.
6 Appareillage et équipements
Voir les Annexes A à D et l'ISO 24276.
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ISO 21570:2005(F)
7 Lignes directrices relatives au mode opératoire
7.1 Généralités

Les principes généraux concernant l'amplification par PCR pour la détection des OGM sont décrits dans

l'ISO 21569.

Les Annexes A à D spécifient les méthodes de détection PCR ainsi que les détails de leur domaine

d'application. Les caractéristiques de performance démontrées pour chaque méthode sont exposées en détail.

Il convient que la concentration de la séquence d'ADN visée soit comprise dans les limites de la plage

dynamique de la méthode.

NOTE Une séquence de surveillance spécifique du taxon cible peut être réalisée pour déterminer si la matrice d'ADN

est de qualité (longueur et intégrité structurale), de pureté et de quantité suffisantes pour permettre la détection et la

quantification d'un OGM appartenant au taxon cible. Cela peut se révéler particulièrement important lorsque l'ADN est

extrait de matrices composites ou très transformées.

Il convient de répéter au moins une fois les analyses de l'ADN extrait de chaque prise d'essai.

Des témoins appropriés doivent être inclus (voir l'ISO 24276, Tableau 1).
7.2 Stabilité de la séquence cible

Si des cultivars d'origines géographiques et phylogénétiques différentes sont utilisés, il convient de prendre

en compte l'invariance en nombre de copies et l'invariance allélique des séquences cibles.

7.3 Étalonnage de l'analyse

Pour couvrir la plage de quantification, on doit utiliser un nombre approprié de points d'étalonnage et de

répétitions [par exemple quatre points d'étalonnage avec deux répétitions (au total 4 × 2 valeurs) ou six points

d'étalonnage avec un mesurage à chaque point (au total 6 valeurs)]. La qualité de l'étalonnage a un impact

[9]
direct sur l'incertitude de mesure .

Pour remplacer les matériaux de référence pour l'étalonnage d'ADN génomique, il est possible d'utiliser, par

exemple, une série de dilutions d'un ADNdb plasmidique ou synthétique contenant la séquence cible, à

condition de démontrer que la méthode d'action de la série est équivalente à celle du matériau de référence

d'ADN génomique ou de l'ADN génomique prélevé sur l'échantillon.
7.4 Considérations relatives à la quantification

Il convient de concevoir les méthodes PCR de manière à réduire le plus possible la variabilité.

NOTE Selon la méthode utilisée et/ou le matériau analysé, la présence d'un empilage de gènes peut mener à une

surévaluation de la teneur réelle en OGM.

Pour la détermination de la limite de quantification (LQ), se référer à l'ISO 24276.

L'homozygosité et l'hétérozygosité de l'espèce étudiée a un impact direct sur le calcul de la teneur en OGM

basé sur les nombres de copies des séquences cibles par génome haploïde. Pour plus de détails, voir les

Annexes A à D.

L'utilisation de la méthode ∆∆C (du cycle seuil) est valable uniquement si les rendements d'amplification du

dosage cible spécifique du taxon et du dosage d'OGM spécifique sont fortement similaires.

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ISO 21570:2005(F)
7.5 Exigences relatives à l'assurance qualité

Pour obtenir des estimations fiables des quantités de séquences cibles, il est souhaitable que les mesurages

soient cohérents. Cependant, pour déterminer la cohérence des mesurages (pour plus de détails, voir

l'ISO 5725), l'écart-type relatif de répétabilité de la méthode doit être connu. Pour calculer l'écart-type relatif

de répétabilité, le nombre de mesurages distincts par échantillon de laboratoire peut dépasser ce qui est

réalisable dans la pratique en termes de coûts acceptables. En conséquence, si un ADN dérivé d'OGM

spécifié doit être consigné (en pour-cent), il convient de prendre en compte les exigences minimales

suivantes pour trouver une solution réaliste:
a) dans la cohérence de la prise d'essai:
⎯ les mesurages < LQ doivent être rejetés; et

⎯ l'écart maximal observé entre les dilutions et les mesurages individuels doit être égal à la valeur

attendue du facteur de dilution correspondant ± 33 %;
b) entre la cohérence de la prise d'essai:

⎯ il convient que les concentrations relatives estimées d'ADN dérivé d'OGM obtenues en a) pour

chaque prise d'essai ne présentent pas de valeurs supérieures à −50 % ou à +100 % de la quantité

estimée (égale à un ∆C de 1 dans la PCR en temps réel) (en d'autres termes, pour deux prises

d'essai, des mesurages de 1,0 % et de 2,0 % sont acceptables alors que des mesurages de 0,9 % et

de 2,1 % ne le sont pas).

Afin de garantir l'exactitude des mesurages, un matériau de référence (MR), de préférence certifié (MRC)

pour la quantité de l'événement concerné avec un niveau approprié de fiabilité métrologique et une similarité

raisonnable de matrice doit être sélectionné et analysé. En l'absence d'un MRC, il est possible de préparer un

MR validé en laboratoire par le biais d'un mode opératoire ayant démontré sa stabilité, son homogénéité et sa

traçabilité et garantissant l'absence de biais. L'incertitude quantifiée doit satisfaire l'incertitude requise pour

l'étalonnage (voir ISO Guide 32).
8 Interprétation
Le résultat de la PCR sera
a) adapté à la quantification de la séquence cible, à condition que
⎯ le résultat soit positif conformément au paragraphe 8.1 de l'ISO 21569:2005,
⎯ l'inhibition observable de la réaction soit négligeable,
⎯ l'analyse produise une valeur de mesurage sans ambiguïté,

⎯ la teneur de la séquence cible soit comprise dans les limites de la plage dynamique de la méthode,

et que
⎯ l'analyse soit étalonnée de façon acceptable (voir en 7.3), ou

b) ne sera pas adapté à la quantification de la séquence cible si l'une quelconque des conditions

énumérées ci-avant n'est pas satisfaite.

L'incertitude de mesure doit être suffisamment faible pour que le laboratoire puisse tirer les conclusions

appropriées.

Le mesurage des quantités d'ADN cibles est décrit dans les Annexes A à D. Ces quantités peuvent être

utilisées pour calculer la teneur en OGM. Ces calculs tiennent généralement compte des facteurs biologiques

pertinents comme l'homozygosité ou l'hétérozygosité des séquences cibles.

Si la teneur de la séquence cible génétiquement modifiée ou de la séquence cible spécifique du taxon est

inférieure à la limite de quantification, les résultats doivent être exprimés uniquement qualitativement.

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ISO 21570:2005(F)

NOTE Le fait d'indiquer que la teneur en ADN dérivé d'OGM est inférieure à la LQ pratique et de spécifier cette LQ

est considéré comme une expression qualitative du résultat.
9 Expression des résultats

Les résultats doivent clairement établir la quantité de la séquence cible génétiquement modifiée rapportée à la

séquence spécifique du taxon cible. Il convient également que les résultats fournissent des valeurs pour

l'incertitude de mesure telles que l'écart-type ou l'écart-type relatif. En outre, il convient que la limite de

détection (LD) et la limite de quantification (LQ) de la méthode ainsi que la LD et la LQ pratiques soient

documentées.

Les séquences cibles peuvent ou non être détectées, ou la quantité d'au moins l'une d'entre elles peut être

inférieure à la limite de quantification. Le Tableau 1 décrit les quatre cas possibles et l'expression du résultat

correspondante qui doit être incluse dans le rapport d'essai.
Tableau 1 — Expression des résultats
Résultat Expression du résultat
Séquence spécifique du taxon cible non Voir l'ISO 21569.
détectée.
«ADN non détecté pour l'espèce x.»
Séquence spécifique du taxon cible Conformément à l'ISO 21569.
détectée mais séquence cible
«ADN dérivé d'OGM non détecté pour l'espèce x».
génétiquement modifiée non détectée.
De plus, si nécessaire, ajouter: «La limite de détection pratique est X %.»
(Spécifier l'unité utilisée.)
La séquence spécifique du taxon cible et Pour chaque OGM, indiquer:
la séquence cible génétiquement modifiée
«ADN dérivé d'OGM (spécifier l'OGM) tel que déterminé par la détection de
sont toutes les deux détectées, mais leur
(spécifier la séquence cible) dérivée de (spécifier l'espèce) a été détecté.»
quantité est inférieure à la limite de

quantification d'au moins l'une des De plus, si nécessaire: «La limite de quantification pratique est X %.»

(Spécifier l'unité utilisée.)
séquences cibles.
La séquence spécifique du taxon cible et Pour chaque OGM, indiquer:
la séquence cible génétiquement modifiée
«La teneur en ADN dérivé d'OGM (spécifier l'OGM) telle que déterminée par
sont toutes les deux détectées et leur
la détection de (spécifier la séquence cible) dérivée de (spécifier l'espèce)
quantité est supérieure à la limite de
est X ± incertitude %.» (Spécifier l'unité utilisée.)
quantification des deux séquences cibles.

La teneur en ADN dérivé d'OGM peut également être déclarée comme étant supérieure ou inférieure à une

valeur spécifique, en prenant en compte l'incertitude de mesure.
10 Rapport d'essai

Le rapport d'essai doit être rédigé conformément à l'ISO 24276 et à l'ISO 21569 et doit contenir au moins les

informations complémentaires suivantes:
a) la LQ de la méthode et la matrice utilisée pour déterminer cette dernière;
b) la LQ pratique;
c) une référence à la méthode utilisée pour l'extraction de l'ADN;
d) le matériau de référence utilisé;
e) les résultats exprimés conformément à l'Article 9.
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Annexe A
(informative)
Méthodes spécifiques du taxon cible
A.1 Méthode spécifique du taxon cible pour la quantification absolue de l'ADN du
gène adh1 du maïs par PCR en temps réel
A.1.1 Introduction

La présente annexe décrit une méthode d'amplification et de quantification spécifiques du gène adh1 (codant

pour l'alcool déshydrogénase 1) du maïs (Zea mays) spécifique du taxon (domestique) pour la détermination

de la teneur en ADN du maïs ou pour l'analyse visant à déterminer la présence/l'absence d'inhibiteurs de PCR

détectables dans les solutions d'ADN extraites des produits contenant un ADN dérivé du maïs, par exemple

les produits alimentaires.
Pour les limites, voir en A.1.8.
A.1.2 Statut de la méthode et caractéristiques de performance
A.1.2.1 Généralités
La méthode a été optimisée pour l'ADN extrait de grains de maïs broyés purs, de
...

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