ISO/TR 13843:2000
(Main)Water quality — Guidance on validation of microbiological methods
Water quality — Guidance on validation of microbiological methods
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la validation des méthodes microbiologiques
Le présent Rapport technique traite de la validation des méthodes microbiologiques. L'accent est mis sur les méthodes quantitatives sélectives, dans lesquelles l'estimation quantitative repose sur le comptage des particules, soit directement à l'aide d'un microscope, soit indirectement en se basant sur la croissance (multiplication) des colonies ou l'apparition d'une turbidité. Les principes et les modes opératoires entrant dans le domaine d'application sont généralement présence/absence (P/A), le nombre le plus probable (NPP), le comptage de colonies et le comptage (microscopique) direct. Le présent Rapport technique n'est pas applicable à la validation des méthodes dites rapides ou modernes, qui dépendent le plus souvent du mesurage des produits ou des modifications résultant de l'activité microbienne, mais lesquelles ne concernent pas la détection de particules individuelles.
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TECHNICAL ISO/TR
REPORT 13843
First edition
2000-06-01
Water quality — Guidance on validation of
microbiological methods
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la validation des méthodes
microbiologiques
Reference number
ISO/TR 13843:2000(E)
©
ISO 2000
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ISO/TR 13843:2000(E)
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ISO/TR 13843:2000(E)
Contents Page
Foreword.iv
1 Scope .1
2 Terms and definitions .1
3 Arrangement of the document .8
4 Basic concepts.8
4.1 General.8
4.2 Validation.8
4.3 Detectors .11
4.4 Performance characteristics .11
4.5 Specifications.11
5 Limitations and characteristic features of microbiological methods .12
5.1 Recovery of the analyte .12
5.2 Sample variance.12
5.3 Particle distribution and overdispersion.12
5.4 Interactions in the detector.12
5.5 Robustness .13
5.6 Spurious errors.13
5.7 Control and guidance charts.13
6 Mathematical models of variation.14
6.1 Unavoidable basic variation — The Poisson distribution .14
6.2 Overdispersion — The negative binomial model .17
6.3 Statistical and practical limits .20
6.4 General tests for randomness — Detection of overdispersion .21
7 Specifications — Current practice.21
8 Specifications — Recommended approach.22
9 Determination and expression of performance characteristics .23
9.1 General.23
9.2 Categorical characteristics related to specificity and selectivity.23
9.3 Working limits .24
9.4 Working range of MPN procedures.25
9.5 Precision.25
10 Procedures and steps of validation.26
10.1 General.26
10.2 Primary validation.26
10.3 Secondary validation.28
11 Designs for determining specifications .28
11.1 A general model for basic quantitative specifications .28
11.2 Precision of the entire analytical procedure.29
11.3 Categorical characteristics.29
11.4 Unplanned data.29
Annex A Statistical procedures and computer programs.30
Annex B Numerical examples .34
Annex C Example of a validation experiment.45
Bibliography.46
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ISO/TR 13843:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted
by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In exceptional circumstances, when a technical committee has collected data of a different kind from that which is
normally published as an International Standard ("state of the art", for example), it may decide by a simple majority
vote of its participating members to publish a Technical Report. A Technical Report is entirely informative in nature
and does not have to be reviewed until the data it provides are considered to be no longer valid or useful.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this Technical Report may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TR 13843 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
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TECHNICAL REPORT ISO/TR 13843:2000(E)
Water quality — Guidance on validation of microbiological
methods
1 Scope
This Technical Report deals with validation of microbiological methods, with particular emphasis on selective
quantitative methods in which the quantitative estimate is based on counting of particles either directly, with the aid
of a microscope, or indirectly, on the basis of growth (multiplication) into colonies or turbidity.
The principles and procedures within this scope are commonly known as the presence/absence (P/A), most
probable number (MPN), colony count and direct (microscopic) count.
This Technical Report does not apply to the validation of the so-called rapid or modern methods which mostly
depend on measuring products or changes due to microbial activity but do not address the detection of individual
particles.
2 Terms and definitions
For the purposes of this Technical Report, the following terms and definitions apply.
2.1
accuracy of measurement
closeness of the agreement between a test result and the accepted reference value
NOTE The term “accuracy”, when applied to a set of test results, involves a combination of random components and a
common systematic error or bias component.
[ISO 3534-1:1993, 3.11]
2.2
analyte
measurand
particular quantity subjected to measurement
NOTE 1 See reference [5].
NOTE 2 In microbiology the analyte is ideally defined as a list of taxonomically defined species. In many cases, in practice
the analyte can only be defined by group designations less accurate than taxonomic definitions.
2.3
analytical portion
test portion
volume of particle suspension inoculated into a detector unit
NOTE Examples of a detector unit are agar plate, membrane filter, test tube, microscopic grid square.
2.4
application range
range of particle concentrations routinely subjected to measurement by a method
© ISO 2000 – All rights reserved 1
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ISO/TR 13843:2000(E)
2.5
categorical characteristic
method performance characteristic numerically expressed as a relative frequency based on P/A or +/� classification
2.6
CFU, deprecated
colony-forming unit, deprecated
CFP, deprecated
colony-forming particle, deprecated
NOTE The term was originally introduced to convey the idea that a colony may originate not only from a single cell but from
a solid chain or aggregate of cells, a cluster of spores, a piece of mycelium, etc. It mistakenly equates the number of colonies
observed to the number of living entities seeded on the medium. Growth unit, viable particle, propagule (2.27) and germ (2.13)
are terms with similar meanings but convey the original idea better and apply not only to colony-count methods but also to MPN
and P/A.
2.7
coefficient of variation
CV
relative standard deviation
for a non-negative characteristic, the ratio of the standard deviation to the average
NOTE 1 The ratio may be expressed as a percentage.
NOTE 2 The term "relative standard deviation" is sometimes used as an alternative to "coefficient of variation", but this use is
not recommended.
[ISO 3534-1:1993, 2.35]
NOTE 3 In this Technical Report the term coefficient of variation (CV) is used when the relative standard deviation is
expressed in percent (CV % = 100 RSD).
2.8
collaborative test
method or laboratory performance test where several laboratories join in an experiment planned and co-ordinated
by a leader laboratory
NOTE Collaborative tests are mainly of two types. Intercalibration exercises are made to allow laboratories to compare
their analytical results with those of other participating laboratories.
Method performance tests produce precision estimates (repeatability, reproducibility) out of data accumulated when several
participating laboratories study identical samples with a strictly standardized method.
2.9
confirmed [verified] colony count
x
presumptive colony count corrected for false positives
k
x= pc= c
n
where
c is the presumptive count;
p is the true positive rate;
n is the number of presumptive positives isolated for confirmation;
k is the number confirmed.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
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ISO/TR 13843:2000(E)
2.10
control chart
two-dimensional scattergram for monitoring method performance with control values obtained by a Type A study
NOTE In control charts the horizontal axis is usually in the time scale or ordinate scale and the control variable is the mean
or some precision measure (s, CV, RSD).
2.11
detector
particle detector
plate of solid matrix or a tube of liquid containing a nutrient medium for counting or detecting living microbial
particles
2.12
detection set
detector set
combination of plates or tubes on which quantitative estimation of microbial concentration in a sample is based
NOTE The detection set is the set of plates or tubes utilized for numerical estimation of a single value.
EXAMPLES Parallel plates of a suspension, plates from consecutive dilutions, 3 � 5 tube MPN system, microtitre plate.
2.13
germ
living entity capable of producing growth in a nutrient medium
cf. propagule (2.27)
2.14
guidance chart
two-dimensional scattergram for presenting method performance data (quantity or precision) with arbitrary guide
values or guide values obtained by Type B reasoning
NOTE In guidance charts, the horizontal axis is usually the colony count per detector.
2.15
heterogeneous Poisson distribution
distribution arising when the mean of a Poisson distribution varies randomly from occasion to occasion
NOTE 1 See reference [11].
NOTE 2 See also negative binomial distribution (2.19).
2.16
limit of detection
particle number x (per analytical portion) where the probability p of a negative result equals 5 %
0
NOTE 1 Probability of a positive result p(+) = 1 – p .
0
NOTE 2 a) Calculation of x via Poisson distribution:
��
11��
x= ln = ln = ln 20 = 3,00
� �
��
��
��
p 0,05
��
0
b) Calculation of x via negative binomial distribution:
2
��
�u
22
p � 1
��0 ��uu
�� 0,05��1 20 1
x�� �
22 2
uu u
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2.17
limit of determination
lowest average particle concentration x per analytical portion where the expected relative standard uncertainty,
equals a specified value (RSD)
NOTE a) Calculation of x via Poisson distribution:
1
x �
2
RSD
� �
b) Calculation of x via negative binomial distribution:
1
x= , given overdispersion factor = u
2
2
RSD � u
� �
2.18
linearity
linear dependence of the signal on concentration of the analyte
cf. proportionality (2.28)
2.19
negative binomial distribution
a particular "overdispersed" statistical distribution of counts
NOTE 1 Its variance can be expressed as
2
22
=+� �
� u
where ��is the mean.
NOTE 2 In this Technical Report the square of the overdispersion factor (u) is substituted for the inverse of the exponent
(1/k) of the standard formula for the negative binomial distribution.
2.20
overdispersion
variation in excess of Poisson randomness
NOTE It is detected qualitatively by the Poisson index of dispersion, and measured quantitatively by estimating the
parameter u (overdispersion factor) of the negative binomial distribution.
2.21
overdispersion factor
u
additional random uncertainty of determination in excess of the Poisson distribution, measured in terms of relative
standard deviation
2.22
overlap error
crowding error
systematic depression of colony counts due to confluence of colonies
NOTE Quantitatively, overlap error depends primarily on the fraction of available growth space occupied by colonial
growth.
2.23
parallel counts
particle or colony numbers in equal analytical portions drawn from the same suspension
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2.24
Poisson distribution
fully random distribution of particle numbers when sampling a perfectly mixed suspension
NOTE The probability P(k) of observing exactly k units in a test portion when the mean equals � is calculated from
k
�
��
Pk��=
e
k!
2.25
precision
closeness of agreement between independent test results obtained under stipulated conditions
NOTE Precision does not relate to the true value or the specified value. It is usually expressed in terms of imprecision and
computed as a standard deviation of the test results.
2.26
primary validation
full validation
establishment of the specifications for the performance of a new method and/or experimental verification that a
method meets theoretically derived quality criteria
2.27
propagule
a viable entity, vegetative cell, group of cells, spore, spore cluster, or a piece of fungal mycelium capable of growth
in a nutrient medium
cf. germ (2.13)
2.28
proportionality
agreement of observed particle counts with the volume (or dilution) of a series of analytical portions from a common
root suspension
2
NOTE Proportionality is computed for statistical evaluation as the log-likelihood ratio statistic G with n–1 degrees of
freedom.
2.29
qualitative method
method of analysis whose response is either the presence or absence of the analyte in a certain amount of sample
NOTE See reference [10].
2.30
recovery
general term for the number of particles estimated in a test portion or sample, with the understanding that there is a
true (although unknown) number of particles of which 100 % or less are "recovered" by the detector
2.31
relative accuracy
degree of correspondence between the response obtained by the reference method and the response obtained by
the alternative method on identical samples
NOTE See reference [10].
2.32
relative difference
d
difference between two measured values divided by their mean
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2xx�
xx� ��
AB
AB
d= =
xx �x
AB
dd%1� 00
NOTE For all practical purposes, the same value results from the calculation d =ln(x )–ln(x ).
A B
2.33
relative recovery
ratio (A/B) of colony counts obtained by two methods tested on equal test portions of the same suspension, where
B is the reference (when applicable)
2.34
relative standard deviation
RSD
estimate of the standard deviation of a population from a sample of n results divided by the mean of that sample
s
RSD =
x
cf. coefficient of variation (2.7)
2.35
repeatability
closeness of the agreement between the results of successive measurements of the same measurand carried out
under the same conditions of measurement
NOTE 1 See Guide to the expression of uncertainty in measurement [6].
NOTE 2 Repeatability is computed as r =2,8s , where s is the repeatability standard deviation.
r r
2.36
reproducibility
closeness of the agreement between the results of measurements on the same measurand carried out under
changed conditions of measurement
NOTE 1 See Guide to the expression of uncertainty in measurement [6].
NOTE 2 Reproducibility is computed as R =2,8 s ,
R
where
s is the reproducibility standard deviation usually compounded from the between-laboratories standard deviation s and
R L
repeatability standard deviation s :
r
22
ss��s
RrL
2.37
robustness
insensitivity of an analytical method to small changes in procedure
NOTE 1 See reference [23].
NOTE 2 To examine the robustness it is advisable to “abuse” the method in a controlled way.
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2.38
secondary validation
demonstration by experiment that an established method functions according to its specifications in the user's
hands
2.39
apparent selectivity
F
ratio of the number of target colonies to the total number of colonies in the same sample volume
F =lg(t/n)
where
t is the apparent concentration of presumptive target types estimated by counting colonies;
n is the concentration of total colonies.
2.40
sensitivity
fraction of the total number of positive cultures or colonies correctly assigned in the presumptive inspection
2.41
specificity
fraction of the total number of negative cultures or colonies correctly assigned in the presumptive inspection
2.42
standard uncertainty
uncertainty of the result of a measurement expressed as a standard deviation
NOTE See reference [5].
2.43
type A evaluation
�of uncertainty� method of evaluation of uncertainty by the statistical analysis of a series of observations
EXAMPLE Observations may be e.g. standard deviation, relative standard deviation.
NOTE 1 See references [5] and [6].
NOTE 2 Repeatability and reproducibility are often estimated by carrying out collaborative method performance tests where
several laboratories study "identical" samples provided by a central organizer [15].
2.44
type B evaluation
�of uncertainty� method of evaluation of uncertainty by means other than the statistical analysis of series of
observations e.g. from assumed probability distributions based on experience or other information
NOTE See references [5] and [6].
2.45
uncertainty
�of measurement� parameter, associated with the result of a measurement, that characterizes the dispersion of the
values that could reasonably be attributed to the measurand
NOTE See reference [6].
2.46
uncertainty
�of counting� relative standard deviation of results of repeated counting of the colonies or particles of the same
plate(s) or field(s) under stipulated conditions
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ISO/TR 13843:2000(E)
EXAMPLE Stipulated conditions may be e.g. the same person or different persons in one laboratory, or different
laboratories.
2.47
validation range
range of mean number of particles per analytical portion for which obeyance of validation specifications (particularly
linearity) have been acceptably demonstrated
NOTE It is usually expressed as the range of "reliable" colony counts.
3 Arrangement of the document
The first part (clauses 4 to 8) of this Technical Report contains informative material on basic principles,
characteristics and limitations of microbiological methods, as well as on general aspects of validation. The second
half (clauses 9 to 11) is the actual validation document, containing specifications and recommended procedures for
their determination.
Old and new concepts and principles are not completely defined in the body of this Technical Report. Three
annexes are attached. Annex A details the statistical formulae most relevant to this document, annex B contains
numerical examples and annex C gives detailed plans for two validation experiments.
Statistical tests in the ordinary sense are not central to the ideas. Mathematical calculations are used mainly for the
purpose of providing convenient summaries of data and statistical distributions provide guidance values. A table of
2
the � distribution is the guide most frequently consulted.
The two BASIC programmes given in annex A are easily copied into desk-top computers or programmable pocket
calculators to help with the basic calculations most frequently needed.
4 Basic concepts
4.1 General
As far as particle statistics is concerned, microscopic counts obey the same laws as viable counts but they are, with
the exception of microcolony methods, free from the biological problems associated with growth. Differential stains,
specifically labelled complexes or other agents used for finding the target do not change the metrological principles.
The same validation principles as with selective colony methods can be applied.
Plaque counts of bacteriophages are in most respects similar to bacterial colony counts.
4.2 Validation
4.2.1 General
Validation means a process providing evidence that a method is capable of serving its intended purpose: to detect
or quantify a specified microbe or microbial group with adequate precision and accuracy. The total count methods
do not have a definable target group and can only be validated in relation to other methods or against theoretical
expectations of precision.
Validation is classified as primary or secondary according to its purpose.
4.2.2 Primary validation
Primary validation is an exploratory process with the aim of establishing the operational limits and performance
characteristics of a new, modified or otherwise inadequately characterized method. It should result in numerical and
descriptive specifications for the performance and include a detailed and unambiguous description of the target of
interest (positive colony, tube or plaque).
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ISO/TR 13843:2000(E)
Primary validation characteristically proceeds by the use of specially designed test schemes.
A laboratory developing an in-house method or a variant of an existing standard should carry out the steps of
primary validation.
It is imperative that technicians involved in primary validation have considerable experience with other
microbiological methods.
4.2.3 Secondary validation
Secondary validation (also called verification) takes place when a laboratory proceeds to implement a method
developed elsewhere. Secondary validation focuses on gathering evidence that the laboratory is able to meet the
specifications established in primary validation. Presently, specifications are not available for most of the methods.
Results of external quality assurance (see 4.2.8) may have to be used as the first step towards complete secondary
validation.
Typically, secondary validation uses selected and simplified forms of the same procedures used in primary
validation, but possibly extended over a longer time. Natural samples are the optimal test materials and the work
need only address the procedure within the operational limits set by primary validation.
4.2.4 Analytical quality control (AQC)
Application of valid methods in their specified reliable limits does not automatically ensure valid results. Analytical
quality control (AQC) used in connection with daily routine analyses is necessary. It controls the ability to use a
method successfully.
AQC is a continuous process. Guidance charts, with limits derived from method specifications (from primary
validation) or from theoretical considerations are the principal tools.
The methods of AQC are extensions of the routine analytical process, e.g. replications at different levels, or simply
calculations not ordinarily performed on routine data. In addition, reference materials, intercalibrations and spiked
samples are used.
Analytical quality control is needed in connection with primary and secondary validation. Only results reliable in the
AQC sense should be used for derivation of validation criteria and performance characteristics.
International and national working groups have produced numerous documents on analytical quality control of
microbiological methods (e.g. references [1, 2, 3, 4, 7, 8, 20, 21, 24, 26]). Standards manuals also contain sections
on that subject. Although vital to validation, the methods of analytical quality control are not detailed in this
Technical Report. In everything that follows, it is assumed that laboratories have the appropriate analytical controls
and internal and external quality assurance systems in operation.
4.2.5 Equivalent methods
It is necessary to apply two methods in parallel on the same samples when developing an in-house method, and
also when
...
RAPPORT ISO/TR
TECHNIQUE 13843
Première édition
2000-06-01
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour
la validation des méthodes
microbiologiques
Water quality — Guidance on validation of microbiological methods
Numéro de référence
ISO/TR 13843:2000(F)
©
ISO 2000
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ISO/TR 13843:2000(F)
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ImpriméenSuisse
ii © ISO 2000 – Tous droits réservés
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ISO/TR 13843:2000(F)
Sommaire Page
Avant-propos.iv
1 Domaine d'application.1
2 Termes et définitions.1
3 Organisation du document.8
4 Concepts de base .8
4.1 Généralités .8
4.2 Validation.8
4.3 Détecteurs .11
4.4 Caractéristiques de performance.12
4.5 Spécifications.12
5 Limites et caractéristiques des méthodes microbiologiques.12
5.1 Rendement de l’analyte.12
5.2 Variance de l’échantillon.13
5.3 Distribution et surdispersion des particules .13
5.4 Interactions dans le détecteur.13
5.5 Robustesse.13
5.6 Erreurs parasites .14
5.7 Cartes de contrôle et guides .14
6 Modèles mathématiques de variation.15
6.1 Variation de base inévitable — Distribution de Poisson .15
6.2 Surdispersion — Modèle binomial négatif.18
6.3 Limites statistiques et pratiques.21
6.4 Essais généraux à caractère aléatoire — Détection de la surdispersion .22
7 Spécifications — Pratique actuelle.22
8 Spécifications — Approche recommandée .23
9 Détermination et expression des caractéristiques de performance .24
9.1 Généralités .24
9.2 Caractéristiques catégoriques liées à la spécificité et à la sélectivité .24
9.3 Limites de travail.26
9.4 Gamme de travail des méthodes NPP .26
9.5 Fidélité .27
10 Méthodes et étapes de validation .28
10.1 Généralités .28
10.2 Validation primaire.28
10.3 Validation secondaire.30
11 Modèles de détermination des spécifications.30
11.1 Modèle général pour les spécifications quantitatives de base.30
11.2 Fidélité de l’intégralité de la méthode analytique.31
11.3 Caractéristiques de catégories .31
11.4 Données non planifiées .31
Annexe A Méthodes statistiques et programmes informatiques statistiques .32
Annexe B Exemples numériques.35
Annexe C Exemple d’expérience de validation .45
Bibliographie .46
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ISO/TR 13843:2000(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comité membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
Exceptionnellement, lorsqu'un comité technique a réuni des données de nature différente de celles qui sont
normalement publiées comme Normes internationales (ceci pouvant comprendre des informations sur l'«état de la
technique», par exemple), il peut décider, à la majorité simple de ses membres, de publier un Rapport technique.
Les Rapports techniques sont de nature purement informative et ne doivent pas nécessairement être révisés avant
que les données fournies ne soient plus jugées valables ou utiles.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent Rapport technique peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas
avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TR 13843 a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 4, Méthodes
microbiologiques.
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RAPPORT TECHNIQUE ISO/TR 13843:2000(F)
Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la validation des
méthodes microbiologiques
1 Domaine d'application
Le présent Rapport technique traite de la validation des méthodes microbiologiques. L’accent est mis sur les
méthodes quantitatives sélectives, dans lesquelles l’estimation quantitative repose sur le comptage des particules,
soit directement à l’aide d’un microscope, soit indirectement en se basant sur la croissance (multiplication) des
colonies ou l’apparition d’une turbidité.
Les principes et les modes opératoires entrant dans le domaine d’application sont généralement présence/absence
(P/A), le nombre le plus probable (NPP), le comptage de colonies et le comptage (microscopique) direct.
Le présent Rapport technique n’est pas applicable à la validation des méthodes dites rapides ou modernes, qui
dépendent le plus souvent du mesurage des produits ou des modifications résultant de l’activité microbienne, mais
lesquelles ne concernent pas la détection de particules individuelles.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent Rapport technique, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
exactitude d’un mesurage
étroitesse de l’accord entre le résultat d’essai et la valeur de référence acceptée
NOTE Le terme «exactitude», appliqué à un ensemble de résultats d’essai implique une combinaison de composantes
aléatoires et une erreur systématique commune ou une composante de biais.
[ISO 3534-1:1993, 3.11]
2.2
analyte
quantité mesurée
quantité particulière soumise au mesurage
NOTE 1 Voir référence [5].
NOTE 2 En microbiologie, l’analyte est de préférence défini par une liste d’espèces définies de manière taxonomique. Dans
de nombreux cas pratiques, l’analyte peut uniquement être défini par des désignations de groupe moins précises que les
définitions taxonomiques.
2.3
prise analytique
prise d’essai
volume d'une suspension de particules inoculé dans une unité de détecteur
NOTE Exemples d’unité de détecteur: boîte de gélose, membrane filtrante, tube d’essai, grille carrée microscopique.
2.4
gamme d’application
gamme de concentrations de particules soumise en routine au mesurage par une méthode
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ISO/TR 13843:2000(F)
2.5
caractéristique de catégorie
caractéristique de performance de la méthode exprimée numériquement sous forme de fréquence relative basée
sur une classification P/A ou +/–
2.6
UFC, terme rejeté
unité formant colonies, terme rejeté
PFC, terme rejeté
particule formant colonies, terme rejeté
NOTE Ces termes ont été introduits à l’origine pour communiquer l’idée qu’une colonie peut provenir non seulement d’une
seule cellule mais également d’une chaîne solide ou d’un agrégat de cellules, d’un groupe de spores, d’un morceau de
mycélium, etc. Par erreur, le nombre de colonies observé est égal au nombre d’entités vivantes ensemencées dans le milieu.
L’unité de croissance, la particule viable, la propagule (2.27) et le germe (2.13) sont des termes ayant une signification
similaire, mais qui transmettent mieux l’idée initiale et s’appliquent non seulement aux méthodes de comptage des colonies
mais aussi aux NPP et P/A.
2.7
coefficient de variation
CV
écart-type relatif
pour un caractère non négatif, rapport de l’écart-type à la moyenne
NOTE 1 Ce rapport peut être exprimé en pourcentage.
NOTE 2 Le terme «écart-type relatif» est parfois utilisé à la place de «coefficient de variation», mais cet usage n’est pas
recommandé.
[ISO 3534-1:1993, 2.35]
NOTE 3 Dans le présent Rapport technique, le terme coefficient de variation (CV) est utilisé lorsque l'écart-type relatif est
exprimé en pourcentage (CV % = 100 RSD).
2.8
étude collaborative
essai des performances de la méthode ou du laboratoire pour lequel plusieurs laboratoires se regroupent pour
réaliser une expérience planifiée et coordonnée par un laboratoire leader
NOTE Il existe principalement deux types d’études collaboratives: les exercices d'intercalibration sont effectués pour
permettre aux laboratoires de comparer leurs résultats analytiques à ceux des autres laboratoires participants; les essais de
performance de la méthode fournissent des estimations de fidélité (répétabilité, reproductibilité) d’après des données recueillies
lorsque plusieurs laboratoires participants étudient des échantillons identiques à l’aide d’une méthode strictement normalisée.
2.9
comptage de colonies confirmé [vérifié)
x
comptage de colonies présumé, corrigé des faux positifs
k
xp��c c
n
où
c est le comptage présumé;
p est le taux de vrais positifs;
n est le nombre de positifs présumés isolés pour confirmation;
k est le nombre confirmé.
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ISO/TR 13843:2000(F)
2.10
carte de contrôle
graphique de dispersion à deux dimensions pour le contrôle des performances de la méthode avec des valeurs de
contrôle obtenues à l’aide d’une étude de type A
NOTE Dans les cartes de contrôle, l’axe horizontal représente en général l’échelle de temps ou l’échelle ordinaire et la
variable de contrôle représente la moyenne, ou une certaine mesure de fidélité (s, CV, RSD).
2.11
détecteur
détecteur de particules
boîte de matrice solide ou tube de liquide contenant un milieu nutritif pour le dénombrement ou la détection de
particules microbiennes vivantes
2.12
série de détection
série de détecteurs
combinaison de boîtes ou de tubes sur laquelle est basée l’estimation quantitative de la concentration microbienne
de l’échantillon
NOTE La série de détection est la série de boîtes ou de tubes utilisée dans le cadre de l’estimation numérique d’une seule
valeur.
EXEMPLES Boîtes parallèles d’une suspension, boîtes de dilutions consécutives, système NPP 3 � 5 tubes, microplaque.
2.13
germe
entité vivante capable de produire une croissance dans un milieu nutritif
cf. propagule (2.27)
2.14
carte guide
graphique de dispersion à deux dimensions présentant les données relatives aux performances de la méthode
(quantité ou fidélité) à l’aide de valeurs guides arbitraires ou de valeurs guides obtenues par un raisonnement de
type B
NOTE Dans les cartes guide, l’axe horizontal représente en général le comptage de colonies par détecteur.
2.15
distribution de Poisson hétérogène
distribution qui se présente lorsque la moyenne de la distribution de Poisson varie aléatoirement d’un cas à l’autre
NOTE 1 Voir référence [11].
NOTE 2 Voir également distribution binomiale négative (2.19).
2.16
limite de détection
nombre x de particules (par prise analytique) lorsque la probabilité, p , d’un résultat négatif est égale à 5 %
0
NOTE 1 La probabilité d’un résultat positif est p(+) = 1 – p .
0
NOTE 2 a) Calcul de x par la distribution de Poisson:
��11
��
x,��ln ln � ln 20� 3 00
��
��
��
��
p,005
��
0
b) Calcul de x par la distribution binomiale négative:
2
��
�u
22
p �1
��0 �uu
�� 00, 5��1 20 1
x�� �
22 2
uu u
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ISO/TR 13843:2000(F)
2.17
limite de détermination
concentration de particules moyenne la plus faible, x, par prise analytique lorsque l’incertitude type relative prévue
est égale à une valeur spécifiée (RSD)
NOTE a) Calcul de x par la distribution de Poisson:
1
x �
2
RSD
��
b) Calcul de x par la distribution binomiale négative:
1
x �
2
2
��RSD � u
où u est le facteur de surdispersion.
2.18
linéarité
dépendance linéaire du signal en fonction de la concentration de l’analyte
cf. proportionnalité (2.28)
2.19
distribution binomiale négative
distribution statistique particulière «surdispersée» des comptages
NOTE 1 Sa variance peut être exprimée comme étant
2 2 2
� =� + u �
où � est la moyenne.
NOTE 2 Dans le présent Rapport technique, le carré du facteur de surdispersion (u) est substitué par l’inverse de l’exposant
(1/k) de la formule normalisée de la distribution binomiale négative.
2.20
surdispersion
variation excédentaire du caractère aléatoire de Poisson
NOTE Elle est détectée qualitativement par l’indice de dispersion de Poisson et mesurée quantitativement lors de
l’estimation du paramètre u (facteur de surdispersion) de la distribution binomiale négative.
2.21
facteur de surdispersion
u
incertitude aléatoire supplémentaire de la détermination excédentaire de la distribution de Poisson, mesurée en
termes d'écart-type relatif
2.22
erreur de chevauchement
erreur de saturation
dépression systématique des comptages de colonies due à la confluence de colonies
NOTE Quantitativement, l’erreur de chevauchement dépend essentiellement de la fraction de l’espace de croissance
disponible occupé par une croissance de colonies.
2.23
comptages parallèles
nombre de particules ou de colonies dans des prises analytiques égales provenant de la même suspension
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2.24
distribution de Poisson
distribution entièrement aléatoire des nombres de particules lors de l'échantillonnage d’une suspension
parfaitement homogénéisée
NOTE La probabilité P(k) d’observer exactement k unités dans une prise d’essai, lorsque la moyenne est égale à μ,se
calculeàl’aidedelaformule suivante:
k
�
��
Pk()� e
k!
2.25
fidélité
étroitesse de l’accord entre des résultats d’essai indépendants obtenus dans des conditions stipulées
NOTE La fidélité n’a pas de rapport avec la valeur vraie ou la valeur spécifiée. Elle est généralement exprimée en termes
d’imprécision et calculée comme un écart-type des résultats d’essai.
2.26
validation primaire
validation totale
détermination des spécifications de performance d’une nouvelle méthode et/ou vérification expérimentale qu’une
méthode répond bien aux critères de qualité dérivés théoriquement
2.27
propagule
entité viable, cellule végétative, groupe de cellules, spores, groupe de spores ou morceau de mycélium fongique
capable de croître dans un milieu nutritif
cf. germe (2.13)
2.28
proportionnalité
correspondance des comptages de particules effectués avec un volume (ou une dilution) d’une série de prises
analytiques à partir d’une suspension à racine commune
NOTE La proportionnalité est calculée pour une évaluation statistique comme le coefficient de vraisemblance-log
2
statistique G avec n–1 degrés de liberté.
2.29
méthode qualitative
méthode d’analyse dont la réponse est soit la présence, soit l’absence de l’analyte dans une certaine quantité
d’échantillon
NOTE 1 Voir référence [10].
2.30
rendement
terme général désignant le nombre de particules estimé dans une prise d’essai ou dans un échantillon, sachant
qu’il y a un nombre réel (même s'il est inconnu) de particules dont 100 % ou moins est «récupéré» par le détecteur
2.31
exactitude relative
degré de correspondance entre la réponse obtenue par la méthode de référence et la réponse obtenue par l'autre
méthode sur des échantillons identiques
NOTE 1 Voir référence [10].
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2.32
différence relative
d
différence entre deux mesures, divisée par leur moyenne
xx� 2��xx�
AB
AB
d��
xx �x
AB
d %=100 d
NOTE Pour des raisons pratiques, les mêmes valeurs résultent du calcul d =ln(x )– ln(x ).
A B
2.33
rendement relatif
rapport (A/B) des comptages de colonies obtenus par deux méthodes soumises à l’essai sur des prises d’essai
équivalentes d’une même suspension, où B = la référence (si possible)
2.34
écart-type relatif
RSD
estimation de l'écart-type d’une population d’un échantillon de n résultats divisé par la moyenne de cet échantillon
s
RSD �
x
cf. coefficient de variation (2.7)
2.35
répétabilité
étroitesse de l’accord entre les résultats des mesurages successifs de la même quantité, effectués dans les
mêmes conditions de mesurage
NOTE 1 Voir le Guide pour l’expression de l’incertitude de mesure [6].
NOTE 2 La répétabilité est calculée comme étant r=2,8s,où s est l'écart-type de répétabilité.
r r
2.36
reproductibilité
étroitesse de l’accord entre les résultats des mesurages de la même quantité, effectués dans des conditions de
mesurage variables
NOTE 1 Voir le Guide pour l’expression de l’incertitude de mesure [6].
NOTE 2 La reproductibilité est calculée comme étant R =2,8s ,où s est l'écart-type de reproductibilité, généralement
R R
composé par l’écart-type interlaboratoires s et l'écart-type de répétabilité, s ,àsavoir:
L r
22
ss��s
RrL
2.37
robustesse
insensibilité d’une méthode d'analyse aux faibles modifications de la méthode
NOTE 1 Voir référence [23].
NOTE 2 Pour étudier la robustesse, il est recommandé «d’abuser» de la méthode de manière contrôlée.
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2.38
validation secondaire
démonstration par expérience qu’une méthode établie fonctionne bien selon ses spécifications dans les mains de
l’utilisateur
2.39
sélectivité apparente
F
rapport entre le nombre de colonies cibles et le nombre total de colonies dans le même volume d’échantillon
F =lg(t/n)
où
t est la concentration apparente de cibles types présumées, estimées lors du comptage de colonies;
n est la concentration du nombre total de colonies.
2.40
sensibilité
fraction du nombre total de cultures ou de colonies positives correctement attribuées lors de l'analyse de
présomption
2.41
spécificité
fraction du nombre total de cultures ou de colonies négatives correctement attribuées lors de l'analyse de
présomption
2.42
incertitude-type
incertitude du résultat d’une mesure exprimée sous forme d'un écart-type
NOTE Voir référence [5].
2.43
évaluation de type A
�de l’incertitude� méthode d’évaluation de l’incertitude par l’analyse statistique d’une série d’observations
EXEMPLE De telles observations peuvent être, par exemple, l’écart-type, l’écart-type relatif.
NOTE 1 Voir références [5] et [6].
NOTE 2 La répétabilité et la reproductibilité sont souvent estimées à l’aide d’essais collaboratifs des performances de la
méthode au cours desquels plusieurs laboratoires étudient des échantillons «identiques» fournis par un organisateur central
[15].
2.44
évaluation de type B
�de l’incertitude� méthode d’évaluation de l’incertitude par d’autres moyens que l’analyse statistique d’une série
d’observations, par exemple à partir de distributions de probabilité supposées, basées sur l’expérience ou sur
d’autres informations
NOTE Voir références [5] et [6].
2.45
incertitude
�de mesure� paramètre associé au résultat de mesure, qui caractérise la dispersion des valeurs qui pourrait être
raisonnablement attribuée à la quantité mesurée
NOTE Voir référence [6].
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ISO/TR 13843:2000(F)
2.46
incertitude
�de comptage� écart-type relatif des résultats des comptages répétés des colonies ou des particules d’une ou des
mêmes boîtes ou d’un ou des mêmes champs dans des conditions stipulées
EXEMPLE De telles conditions peuvent être, par exemple, la même personne ou des personnes différentes dans un
même laboratoire ou dans différents laboratoires.
2.47
gamme de validation
gamme du nombre moyen de particules par prise analytique pour laquelle la conformité aux spécifications de
validation (en particulier la linéarité) a été démontrée de manière acceptable
NOTE La gamme de validation est habituellement exprimée comme la gamme de comptages «fiables» des colonies.
3 Organisation du document
La première partie (articles 4 à 8) du présent Rapport technique contient des informations relatives aux principes
fondamentaux, aux caractéristiques et aux limites des méthodes microbiologiques, ainsi qu’aux aspects généraux
de la validation. La seconde partie (articles 9 à 11) représente le document de validation en lui-même avec les
spécifications et les modes opératoires recommandés pour leur détermination.
Les concepts et les principes, anciens et nouveaux, ne sont pas définis en intégralité dans le corps du présent
Rapport technique. Trois annexes sont jointes. L’annexe A donne le détail des formules statistiques les plus
utilisées dans le document, l’annexe B fournit des exemples numériques et l’annexe C donne les plans détaillés de
deux essais de validation.
Les essais statistiques, au sens commun du terme, ne sont pas une composante essentielle. Les calculs
mathématiques servent principalement à présenter des résumés pratiques de données et les distributions
2
statistiques donnent des valeurs guides. Un tableau de la distribution du � est l’aide la plus fréquemment
consultée.
Les deux programmes en BASIC donnés à l’annexe A peuvent être copiés facilement sur des ordinateurs de
bureau ou des calculatrices de poche programmables pour aider aux calculs de base les plus fréquemment
utilisés.
4 Concepts de base
4.1 Généralités
Pour ce qui est des calculs statistiques des particules, les comptages microscopiques obéissent aux mêmes lois
que les comptages viables mais, à l’exception des méthodes de comptage des microcolonies, ils ne présentent pas
de problèmes liés à la croissance. Les colorants de différenciation, en particulier les complexes spécialement
conçus à cet effet, ou autres agents utilisés pour identifier l’organisme cible ne modifient pas les principes
métrologiques. Les mêmes principes de validation que pour les méthodes sélectives de comptage des colonies
peuvent être appliqués.
Dans la plupart des cas, les comptages de plages de bactériophages sont similaires aux comptages de colonies
bactériennes.
4.2 Validation
4.2.1 Généralités
La validation est un processus qui permet de démontrer qu’une méthode remplit la fonction à laquelle elle est
destinée: détecter ou quantifier un microbe ou un groupe microbien donné avec la fidélité et l’exactitude requises.
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ISO/TR 13843:2000(F)
Les méthodes de comptage total n’ont pas de groupe cible définissable et elles ne peuvent être validées qu’en
relation avec d’autres méthodes ou par rapport à des probabilités théoriques de fidélité.
Selon son objet, la validation est classée primaire ou secondaire.
4.2.2 Validation primaire
La validation primaire est un processus exploratoire dont l’objectif est de déterminer les limites opérationnelles et
les caractéristiques de performance d’une méthode nouvelle, modifiée ou insuffisamment détaillée. Il convient que
cette validation se traduise par des spécifications numériques et descriptives des performances et comprenne une
description détaillée et univoque de la cible concernée (colonie, plage ou tube positifs).
La validation primaire s’effectue en général au moyen de plans d’essais spécialement conçus à cet effet.
Il convient qu’un laboratoire développant sa propre méthode ou une variante d’une norme existante suive les
étapes de la validation primaire.
Il est impératif que les techniciens qui doivent procéder à une validation primaire aient une
...
Questions, Comments and Discussion
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