ISO 11731:2017
(Main)Water quality — Enumeration of Legionella
Water quality — Enumeration of Legionella
ISO 11731:2017 specifies culture methods for the isolation of Legionella and estimation of their numbers in water samples. These methods are applicable to all kinds of water samples including potable, industrial, waste and natural waters. These methods can be used for water related matrices, e.g. biofilms, sediments, etc. Not all Legionella species are culturable; therefore, the methods described in this document do not recover all species of Legionella.
Qualité de l'eau — Dénombrement des Legionella
ISO 11731:2017 spécifie des méthodes de culture pour l'isolement des Legionella et leur dénombrement dans des échantillons d'eau. Ces méthodes sont applicables à tous les types d'échantillons d'eau, y compris les eaux potables, industrielles, usées et naturelles. Elles peuvent également être utilisées pour les matrices liées à l'eau (biofilms, sédiments, etc.). Toutes les espèces de Legionella n'étant pas cultivables, les méthodes décrites dans le présent document peuvent ne pas retrouver la totalité des espèces de Legionella.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11731
Second edition
2017-05
Water quality — Enumeration of
Legionella
Qualité de l’eau — Dénombrement des Legionella
Reference number
©
ISO 2017
© ISO 2017, Published in Switzerland
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ii © ISO 2017 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Examination. 2
4.3 Confirmation . 2
5 Apparatus and glassware . 2
6 Culture media and reagents . 3
7 Sampling . 4
8 Procedure. 4
8.1 Samples . 4
8.2 Concentration of water samples . 5
8.2.1 General. 5
8.2.2 Membrane filtration and direct placing of the membrane filter on culture media 5
8.2.3 Membrane filtration followed by a washing procedure . 5
8.3 Sample pre-treatment . 6
8.3.1 Heat treatment. 6
8.3.2 Acid treatment . 6
8.4 Culture . 6
8.4.1 General. 6
8.4.2 Samples with a high concentration of Legionella species and a low
concentration of interfering microorganisms . 6
8.4.3 Samples with a low concentration of Legionella species and a low
concentration of interfering microorganisms . 6
8.4.4 Samples with a high concentration of interfering microorganisms . 7
8.4.5 Samples with an extremely high concentration of interfering microorganisms . 7
8.4.6 Incubation . 7
8.4.7 Examination of the plates . 7
8.5 Confirmation of presumptive Legionella colonies on culture media: BCYE agar and
BCYE–cys agar . 8
9 Expression of results . 8
10 Test report . 9
11 Quality assurance .10
11.1 General .10
11.2 Performance testing of Legionella culture media .10
11.3 Preparing working culture and test suspension for performance testing .10
Annex A (informative) Legionella species .12
Annex B (normative) Culture media .14
Annex C (normative) Diluents .20
Annex D (normative) Acid solution.21
Annex E (informative) Scraping or rubbing the bacteria from membrane filters .22
Annex F (informative) Centrifugation technique .23
Annex G (informative) Indirect immunofluorescent antibody assay for the identification of
Legionella species .24
Annex H (informative) Performance data .27
Annex I (informative) Pre-treatment of water related matrices .31
Annex J (normative) Decision matrix .32
Bibliography .38
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This second edition of ISO 11731 cancels and replaces ISO 11731:1998 and ISO 11731-2:2004, which
have been technically revised.
Introduction
After the first recognized outbreak of Legionnaires’ disease in 1976, the isolated bacterium was named
Legionella pneumophila. Legionellae are widely found in natural and artificial aquatic environments,
soils, composts and can cause legionellosis. Legionellae can grow intracellularly in protozoa like
Acanthamoeba castellanii, Hartmannella species or Naegleria species. At least 61 different Legionella
species have been described. In 26 of these species, some strains infecting humans have been reported.
Legionella pneumophila can be subtyped into at least 15 different serogroups; nine other species also
can be subtyped into at least two separate serogroups. Monitoring for legionellae is important for
public health reasons to identify environmental sources which can pose a risk of legionellosis, such
as evaporative cooling towers, hot- and cold-water distribution systems in buildings and associated
equipment such as spa pools, dental units, air conditioning units, etc. Monitoring is also important for
validation of control measures and ongoing verification that controls remain effective.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11731:2017(E)
Water quality — Enumeration of Legionella
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified and competent staff.
1 Scope
This document specifies culture methods for the isolation of Legionella and estimation of their numbers
in water samples.
These methods are applicable to all kinds of water samples including potable, industrial, waste and
natural waters. These methods can be used for water related matrices, e.g. biofilms, sediments, etc.
Not all Legionella species are culturable; therefore, the methods described in this document do not
recover all species of Legionella.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses
ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
Legionella
genus of microorganisms normally capable of growth on buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar
containing L-cysteine and iron(III) salts
Note 1 to entry: For a more detailed description of Legionella species, see Annex A.
4 Principle
4.1 General
Legionellae in the water sample are concentrated by membrane filtration, diluted or directly plated
depending on the origin/characteristics of the sample. The desired level of detection can vary depending
on (inter)national legislation and the reason for sampling or investigation. Samples expected to contain
high numbers of legionellae, such as those obtained during outbreak investigations, can be processed
with and/or without the concentration steps. To reduce the growth of the concentrated non-target
bacteria, which can interfere with the recovery of the target legionellae, portions of the water samples
are also subjected to heat treatment, acid treatment or a combination of both treatments.
Dilution is necessary when high concentrations of Legionella and/or other bacteria are expected.
Separate portions of the diluted sample should be pre-treated; one with heat and a second with acid
solution or, in case of extremely contaminated samples, with a combination of acid solution and heat
before culturing on selective media.
Treated and/or untreated portions of the sample are transferred onto plates of the chosen culture
medium selective for Legionella and incubated.
NOTE Mechanical treatment of the sample can enhance the recovery of Legionella.
4.2 Examination
After incubation, morphologically characteristic colonies on the selective culture media are regarded
as presumptive Legionella.
4.3 Confirmation
Presumptive colonies are confirmed as Legionella by subculture to demonstrate their growth
requirement for L-cysteine and iron(III).
NOTE If species and serotype identification are requested, further tests are needed (see Annex G). These
tests are not part of the standardized methods described in this document.
5 Apparatus and glassware
Usual laboratory equipment and in particular:
5.1 Sterile Petri dishes.
5.2 Incubator, capable of being maintained at (36 ± 2) °C.
5.3 Ultraviolet lamp, emitting light of wavelength (360 ± 20) nm.
5.4 Membrane filtration equipment, suitable for filtering water volumes of 10 ml up to 1 000 ml.
5.5 Membrane filter.
5.5.1 Membrane filter for concentration and elution, polycarbonate or polyethersulfone membrane
filters, diameter 47 mm to 142 mm with rated pore sizes of 0,2 µm; see Reference [6]. These types of
membrane filters are used for concentration followed by a washing procedure.
5.5.2 Membrane filter for direct placing on culture media, membrane filters from cellulose nitrate
or mixed cellulose esters, diameter 47 mm to 50 mm with rated pore sizes of 0,2 µm or 0,45 µm. These
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types of membrane filters are used for direct placing onto the culture media after filtration. Filters shall
be evaluated prior to use in accordance with ISO 7704.
NOTE Black membrane filters contrast better with the white Legionella colonies than light-coloured
membrane filters.
5.6 pH meter, with an accuracy of ± 0,1 at 20 °C to 25 °C.
5.7 Vortex mixer.
5.8 Ultrasonic water bath, suitable for ensuring that the level of diluent covering the membrane filter
is below the level of water in the water bath.
5.9 Water bath, capable of being maintained at (50 ± 1) °C.
5.10 Glassware, sterilized according to ISO 8199.
5.11 Dissection microscope, stereoscopic, with magnification of at least 4× and with oblique incident
illumination.
NOTE Also, a hand lens (magnification at least 4×) can be used.
5.12 Disinfected forceps, for handling of membrane filters.
NOTE Forceps with round ends are generally used in order not to damage the membrane during handling.
5.13 Screw cap sterile container, with or without sterile glass beads. To ensure maximum removal of
the legionellae from the membrane filter, sterile glass beads (diameter 2 mm to 3 mm) can be added to
the sterile container. Add sufficient glass beads to the sterile container just enough to cover the bottom of
the container.
6 Culture media and reagents
Use chemicals of analytical grade in the preparation of culture media and reagents unless otherwise
stated (see the Note). Prepare the culture media and reagents according to the instructions given in
Annexes B, C and D. Prepare culture media using distilled or demineralized water, which is free from
substances that might affect growth of microorganisms under the test conditions. The water shall
comply with the requirements of ISO 3696, grade 3.
Alternatively, use commercially available culture media and reagents prepared and used according to
the manufacturer’s instructions.
NOTE Chemicals of other grades can be used, providing they are shown to be of equal performance in the test.
6.1 Culture media.
See Annex B.
6.1.1 Buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar.
See B.1.
6.1.2 Buffered charcoal yeast extract agar without L-cysteine (BCYE–cys).
See B.2.
NOTE Blood agar (see B.6), nutrient agar (see B.7) or tryptone soy agar (see B.8) can be used instead of
BCYE–cys agar.
6.1.3 Buffered charcoal yeast extract agar with selective supplements (BCYE+AB).
See B.3.
6.1.4 Glycine vancomycin polymyxin B cycloheximide (GVPC) agar.
See B.4.
6.1.5 Modified Wadowsky Yee (MWY) agar.
See B.5.
6.2 Diluents.
See Annex C.
6.2.1 Page’s saline.
See C.1.
6.2.2 Diluted Ringer’s solution.
See C.2.
6.3 Acid solution.
See Annex D.
7 Sampling
Carry out sampling, transport and storage of the samples in accordance with ISO 19458. Take care not
to expose the samples to adverse temperature conditions (e.g. freezing or overheating).
NOTE The use of insulated containers is helpful in this regard.
8 Procedure
8.1 Samples
Due to the complex nature of different sample matrices, the laboratory shall determine the appropriate
method for each sample type. The decision matrix is provided in Annex J to determine which appropriate
method shall be undertaken. Annex J describes the requirements and provides additional options.
In order to ensure the detection of legionellae from water samples, a concentration technique by
membrane filtration (see 8.2.2 or 8.2.3) will be required in most cases. Where the concentration of
legionellae is expected to be greater than 10 colony forming units per litre (cfu/l), direct plating of
the unconcentrated sample can also be carried out. For highly contaminated samples, dilute (refer
to Annex C for suitable diluents) and use direct plating before and after the pre-treatment (see 8.3).
Record volumes of sample diluted or processed and which pre-treatment(s) has (have) been applied.
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When the number of legionellae in any given sample is not known, concentration techniques are usually
performed. Therefore, follow the procedure described in 8.2.2 or 8.2.3.
8.2 Concentration of water samples
8.2.1 General
For a general description of the membrane filtration technique, see ISO 8199. Filtration can be done by
vacuum filtration or positive pressure filtration.
The flow rate should be adjusted so as not to exceed the maximum specified by the manufacturer for
the filter size or type.
NOTE The procedure for water related matrices (swabs, sediment, etc.) is described in Annex I.
8.2.2 Membrane filtration and direct placing of the membrane filter on culture media
Filter the water sample (without treatment, after acid treatment and, if required, after heat treatment)
through a cellulose nitrate or mixed cellulose esters membrane filter (5.5.2). The acid treatment can
also be done directly on the membrane filter in the funnel (see 8.3.2). The volume filtered depends on
the particulate content of the water or the desired detection level. The filtered volume of the sample
shall be recorded. Carefully remove the membrane filter from the stand with disinfected forceps
(5.12) and place it (right-side up) directly on the culture media, ensuring that no air bubble is trapped
underneath.
NOTE Where concentration by filtration is not possible (e.g. due to a high level of deposit), the sample can be
concentrated by centrifugation (see Annex F).
8.2.3 Membrane filtration followed by a washing procedure
Filter the water sample through a polycarbonate or polyethersulfone membrane filter (5.5.1). The
volume filtered depends on the particulate content of the water or the desired detection level. The
filtered volume of the sample shall be recorded. Remove the membrane filter from the stand with
disinfected forceps (5.12). Work carefully to avoid loss of residual deposit. Place the membrane filter
(right-side down) in a screw cap sterile container with or without sterile glass beads (5.13). To wash the
microorganisms from the membrane filter, add 5 ml to 10 ml of sterile diluent (see Annex C) or sample,
and shake vigorously using a vortex mixer (5.7) for at least 2 min. Alternatively, place the container
(5.13) in an ultrasonic water bath (5.8) for a time interval that has been verified to determine the
optimum time interval for maximum recovery. Ensure that the level of diluent covering the membrane
is below the level of water in the ultrasonic water bath.
This concentrate represents the prepared sample. Record the volume of the concentrate. Membrane
filters may be cut into pieces using sterile scissors to aid elution.
Divide the concentrate into three portions. Use one portion untreated, one portion for treatment with
heat (see 8.3.1) and one portion for treatment with acid solution (see 8.3.2).
NOTE 1 Alternatively, the scraping or rubbing technique can be used for removal of the bacteria from the
membrane filter (see Annex E).
NOTE 2 Where concentration by filtration is not possible (e.g. due to a high level of deposit), the sample can be
concentrated by centrifugation (see Annex F).
NOTE 3 An additional membrane filtration can be used for the acid pre-treatment directly on the membrane
filter in the funnel.
8.3 Sample pre-treatment
8.3.1 Heat treatment
Add the sample (concentrated or unconcentrated) to a sterile container and place it in a water bath
(5.9) at (50 ± 1) °C for (30 ± 2) min. Small volumes (≤ 5 ml) should be used to ensure a short period until
the desired temperature is reached. If many samples are treated together or large sample volumes are
treated or thick-walled containers are used, monitor the temperature in a separate container similar
to that used for the sample. The time starts when the required temperature is reached. Large sample
volumes or thick-walled containers should be cooled to avoid overheating after being removed from the
water bath.
8.3.2 Acid treatment
Dilute one volume of the sample (concentrated or unconcentrated) with nine volumes of the acid
solution (see Annex D), mix well and leave it for (5,0 ± 0,5) min. If the diluted acid treated sample is used
for the calculation of the final concentration of Legionella species in the sample, the dilution should be
factored. Volumes greater than 0,1 ml can be plated to decrease the limit of detection.
Acid treatment can also be done directly on the membrane filter in the funnel. Transfer around 30 ml
acid solution (see Annex D) onto the membrane filter. Leave it for (5 ± 0,5) min and remove the acid
solution by filtration. Wash the membrane filter with at least 20 ml of the diluent (see Annex C). It is
important that the diluent does not rinse the surface of the funnel that had not been in contact with the
acid solution.
8.4 Culture
8.4.1 General
The choice of the method used for the enumeration of Legionella species depends on the
origin/characteristics of the sample and the reason of sampling or investigation. An assumption shall
be made about the expected concentration of interfering microorganisms based on experience or origin
of the sample. Also, the desired lower limit of detection level needs to be considered. A decision matrix
for choosing an appropriate method is described in detail in Annex J.
Depending on the desired detection level, it is possible to use more than one plate of the different
culture media mentioned in the following subclauses.
8.4.2 Samples with a high concentration of Legionella species and a low concentration of
interfering microorganisms
Plate the sample directly if the number of Legionella is expected to exceed 10 cfu/l. Inoculate and
spread 0,1 ml to 0,5 ml of the sample on one plate of BCYE agar (see B.1) and one plate of BCYE+AB agar
(see B.3). Record the inoculated volume.
8.4.3 Samples with a low concentration of Legionella species and a low concentration of
interfering microorganisms
8.4.3.1 Direct placing of membrane filter on culture media after membrane filtration
Filter the sample (see 8.2.2) and place the untreated membrane filter directly on one plate of BCYE agar
(see B.1). The membrane filters treated with acid solution according to 8.3.2 are placed on one or more
of the selective or highly selective plates of BCYE+AB agar (see B.3) or GVPC agar (see B.4) or MWY agar
(see B.5).
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8.4.3.2 Plating after membrane filtration with washing procedure
Inoculate and spread 0,1 ml to 0,5 ml of each concentrated portion of the sample (untreated, heat
treated and acid treated) from the membrane filtration with washing procedure (see 8.2.3) on one plate
of BCYE agar (see B.1) and on one or more of the selective or highly selective plates of BCYE+AB agar
(see B.3) or GVPC agar (see B.4) or MWY agar (see B.5). Record the inoculated volume.
8.4.4 Samples with a high concentration of interfering microorganisms
Culture samples with a high concentration of interfering microorganisms unconcentrated (direct),
concentrated (see 8.2) or diluted (1:10). Divide each subsample into three portions. Use one portion
untreated, the second portion for treatment with heat (see 8.3.1) and the third portion for treatment
with acid solution (see 8.3.2). Inoculate and spread 0,1 ml to 0,5 ml of each portion of the subsamples
on one plate of GVPC agar (see B.4) or one plate of MWY agar (see B.5). Record the inoculated volume.
8.4.5 Samples with an extremely high concentration of interfering microorganisms
Culture samples with an extremely high concentration of interfering microorganisms unconcentrated
and diluted (1:10 and 1:100) after a pre-treatment with a combination of heat and acid. For the combined
treatment first, the heat treatment (see 8.3.1) is done followed by the acid treatment (see 8.3.2). It is
important to cool the heat-treated sample to room temperature before the acid treatment is done.
Prepare dilutions directly after the acid treatment in sterile diluent (see Annex C).
Mix well by shaking, using a vortex mixer (5.7) or an ultrasonic water bath (5.8). If necessary, add
a layer (just enough to cover the bottom of the container) of sterile glass beads to the sample to aid
disaggregation of the material. Inoculate and spread 0,1 ml to 0,5 ml of each portion on one plate of
GVPC agar (see B.4) or one plate of MWY agar (see B.5). Record the inoculated volume.
8.4.6 Incubation
Allow the inoculated plates to stand until the inoculated volume has been absorbed, then invert the
plates and incubate at (36 ± 2) °C for 7 d to 10 d. Create a humid atmosphere to prevent desiccation of
the plates, for example, by placing in an enclosed container.
NOTE Validation data using artificially spiked samples have demonstrated no difference in counts between
incubation for 7 d and 10 d. Natural samples containing wild strains of Legionella can, however, require the full
incubation period of 10 d to present growth.
8.4.7 Examination of the plates
Inspect the plates for the first time either on day 2, 3, 4 or 5 followed by a final inspection at the end of
the incubation period. This is to identify samples where overgrowth has occurred. The final quantitative
result is not available until the end of the incubation period. For the range of quantitative determination,
see Table H.1. As Legionella grows slowly and can be masked by the growth of other microorganisms, it
is also recommended to use the dissection microscope with oblique incident illumination (5.11). Record
the number of each type of presumptive Legionella colony present.
In case of outbreak investigations, it is advisable for samples expected to have a high concentration of
interfering microorganisms to check the plates on day 2 to determine if dilutions are needed. Be aware
of the potentially negative impact of the conservation of the concentrate or sample for a period of two
additional days.
Colonies of Legionella are white-grey in general but can also appear in other colours. They are smooth
with an entire edge and exhibit a characteristic ground-glass appearance. Under an ultraviolet lamp
(5.3), colonies of several species (L. anisa, L. bozemanii, L. cherrii, L. dumoffii, L. gormanii, L. gratiana,
L. parisiensis, L. steigerwaltii and L. tucsonensis) autofluoresce brilliant white; L. erythra and L. rubrilucens
appear red. Colonies of L. pneumophila appear dull green often tinged with yellow. The colour of
fluorescence can help to differentiate colonies in samples containing different species of Legionella. To
avoid the possibility that Legionella cells could be killed or damaged so that they are not recoverable,
plates should not be exposed to ultraviolet light for a longer time than is necessary. It should be noted
that new species of Legionella might possess characteristics different to those described above.
8.5 Confirmation of presumptive Legionella colonies on culture media: BCYE agar and
BCYE–cys agar
Subculture from the plate(s) showing the highest counts of presumptive colonies of Legionella
(see 8.4.7) per water volume. When there is only one colony type, pick three presumptive colonies. If
more morphological different types of presumptive colonies of Legionella are growing on the plate, take
at least one colony from each type. Subculture onto a plate of BCYE agar (see B.1) and a plate of BCYE–
cys agar (see B.2 or alternative media as described in the Note in 6.1.2). Be careful not to carry over
any culture media with the colony and first inoculate a plate of BCYE–cys agar and then a plate of BCYE
agar. Incubate at (36 ± 2) °C for 2 d to 5 d. Regard as Legionella those colonies which grow on the plate of
BCYE agar (see B.1) but fail to grow on the plate of BCYE–cys agar (see B.2). Record the results for each
plate. If the initial subcultures do not confirm as Legionella, analyse further subcultures of presumptive
Legionella colonies from another type of plate (culture media or sample treatments).
L. oakridgensis and L. spiritensis require L-cysteine and iron(III) for primary isolation but sometimes
grow weakly in the absence of added L-cysteine thereafter. Accordingly, careful comparison needs to be
made of the differences in growth between supplemented and unsupplemented culture media.
NOTE Alternative procedures can be used to confirm the isolate as Legionella species providing the
suitability of the alternative procedure is verified.
For special situations like outbreak investigations, at least five presumptive colonies if only one
morphology is present, or two presumptive colonies for each type of morphology shall be confirmed.
If identification of the Legionella colonies is to be carried out (see Annex G) and included on the test
report, all typical morphologies present on any of the plates should be confirmed and the identifications
reported.
9 Expression of results
To estimate the number of colony forming units of Legionella in the original water sample, select the
plate or set of plates (from the same culture medium) showing the maximum number of confirmed
colonies per water volume. Take the dilution into account. Do not average the counts from different
methods, treatments or culture media, as these are not replicates.
Calculate the number of Legionella colony forming units in the original sample (see examples shown
below) per litre, in accordance with ISO 8199, as follows.
a
— Direct plating: C =×V
s s
V
tot
a
— Membrane filter on plate: C =×V
s s
V
tot
aV×
c
— Filtration with washing procedure (indirect filtration): C = ×V
s s
VV×
tot
aV×
s
— Plating after dilution: C = ×Df
s
V
dil
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where
C is the number of Legionella in cfu/l;
s
a is the number of calculated confirmed Legionella colonies
fraction positive confirmed
a =× totall count
fraction total confirmed
V is the (concentrated) sample volume in millilitres, ml;
c
V is the sample volume inoculated per plate or set of plates (from the same culture medium) in
millilitres, ml;
V is the total tested sample volume in millilitres, ml;
tot
V is the reference volume chosen to express the concentration of the microorganisms in the
s
sample (normally 1 000 ml);
V is the diluted sample volume inoculated per plate or set of plates (from the same culture me-
dil
dium) in millilitres, ml;
Df is the dilution factor.
The purpose of this document is to demonstrate the number of confirmed Legionella in a sample. Report
the confirmed number of Legionella colony forming units in accordance with ISO 8199. Report absence
as “not detected” in the volume examined and indicate the detection limit calculated according to the
procedure used (see Table J.1).
10 Test report
The test report shall contain at least the following information:
a) the test method used (in conjunction with Annex J), together with a reference to this document,
i.e. ISO 11731;
EXAMPLE Further specification, in conjunction with Annex J, can be done as follows:
[Matrix A; Procedure 8, 9, 10; Medium A and Medium C — GVPC].
b) all details necessary for complete identification of the sample, such as the sample site with a unique
identifier, so that, if necessary, a repeat sample can be taken from the exact location and sample
point [e.g. building location (address and postcode), floor and room number, exact location of outlet
(wash hand basin in room)], the sampling technique, the nature of the sample, the kind of water
system or plant, the temperature and the biocide concentration;
c) the date and time of collection of the sample, the date of receipt of the sample, and start and end of
the examination, any particular occurrence(s) observed during transport, storage and the course
of analysis which might have influenced the result (e.g. particulates in the sample);
d) the maximum volume used in the analysis;
e) the results expressed in accordance with Clause 9.
11 Quality assurance
11.1 General
The laboratory shall have a clearly defined quality control system to ensure that the apparatus, reagents
and techniques are suitable for the test. The use of positive controls, negative controls and blanks is
part of the test.
11.2 Performance testing of Legionella culture media
For the definition of productivity, selectivity and specificity, refer to ISO 11133. The performance of the
different Legionella culture media shall be tested according to the methods and criteria described in
ISO 11133. Preparation of the working cultures and test suspensions is described in 11.3. For plates of
BCYE agar (see B.1), only productivity can be tested. For plates of BCYE–cys agar (see B.2 or alternative
media as described in the Note of 6.1.2), only test for its inability to support growth with one of the
L. pneumophila strains is mentioned in Table 1.
11.3 Preparing working culture and test suspension for performance testing
Working cultures shall be prepared from a reference stock or stock culture of a Legionella strain.
Reconstitute and recover as recommended, and subculture onto one or several plates of BCYE agar
(see B.1) for purity. After incubation, make a suspension in sterile glycerol broth (see G.2.4) from the
resulting growth so that it is just visible to the naked eye. Dispense in 1 ml volumes for storage at
(−20 ± 5) °C.
Alternatively, use Page’s saline (see C.1) or distilled water for storage at (−70 ± 10) °C or other
appropriate freezing culture media and store at (−20 ± 5) °C or (−70 ± 10) °C as appropriate. Plate
out one suspension of each isolate onto Legionella culture medium for subsequent identification and
recording of the Legionella species. For use, allow a working culture of one (or more) isolates to thaw
at room temperature. Shake thoroughly, wait 5 min to 10 min to allow aerosols to settle. If necessary,
dilute to achieve a test suspension with the desired number of microorganisms in a specified volume in
accordance with ISO 11133.
10 © ISO 2017 – All rights reserved
Table 1 — Control strains and performance criteria
Culture Function Incuba- Control WDCM Refer- Method of Criteria Character-
media tion strains numbers ence control istic
a
media reactions
b
BCYE–cys Confirma- 2 d to 5 d/ Legionella 00107 BCYE Qualitative No
agar, tion (36 ± 2) °C pneumophila agar growth
nutrient
agar,
blood agar,
tryptone
soy agar
b
GVPC Productivity 2 d to 5 d/ Legionella 00107 BCYE Quantita- P ≥ 0,5 White-grey-
R
agar, (36 ± 2) °C pneumophila agar tive blue-purple
BCYE+AB colonies with
5 d to Legionella 00106
agar, an entire
10 d/ anisa
MWY agar edge and
(36 ± 2) °C
exhibiting a
characteristic
ground-glass
appearance
Selectivity 3 d/ Enterococcus 00009 or — Qualitative Total —
c
(36 ± 2) °C faecalis 00087 inhibition
Escherichia 00012 or — Qualitative Total or —
c
coli 00013 partial
inhibition
d
(0 to 1)
b
BCYE agar Productivity 2 d to 5 d/ Legionella 00107 Media Quantita- P ≥ 0,7 White-grey-
R
(36 ± 2) °C pneumophila batch tive blue-purple
BCYE colonies with
agar an entire
already edge and
validated exhibiting a
characteristic
ground-glass
appearance
a
Make reference to the reference strain catalogue available on http:// www .wfcc .info for information on culture
collection strain numbers and contact details.
b
Strains to be used as a minimum.
c
At least one strain of Enterocoocus faecalis (WDCM 00009 or WDCM 00087) and at least one strain of Escherichia coli
(WDCM 00012 or WDCM 00013) have to be used.
d
“0” means “no growth” and “1” means “weak growth”.
Annex A
(informative)
Legionella species
The genus Legionella belongs to the taxonomic order Legionellales, which includes the families
Coxiellaceae and Legionellaceae. Three different genera have been proposed for the Legionellaceae:
Legionella, Fluoribacter, and Tatlockia. However, the latter two generic names have never been widely
used or accepted, and the single genus Legionella is almost universally used to describe all species.
Legionellae are small Gram-negative bacilli with fastidious growth requirements. Proteins rather than
carbohydrates are used as an energy source. Legionellae are obligate aerobes and grow at temperatures
ranging from 20 °C to 42 °C.
The amino acid L-cysteine is required for the (initial) growth of Legionella species from environmental
and clinical sources. In addition, L. oakridgensis and L. spiritensis require L-cysteine and iron(III) for
primary isolation but can grow weakly in the absence of added L-cysteine thereafter. Soluble iron(III)
is required for optimal growth and for the initial isolation of the bacterium from both clinical and
environmental sources. Iron(III), L-cysteine, α-ketoglutarate, and charcoal-containing yeast extract
agar buffered with an organic buffer (BCYE agar) is the preferred growth culture medium for clinical
isolation. Clinically important, Legionella species grow best at 35 °C in humidified air on plates of
BCYE agar, usually
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11731
Deuxième édition
2017-05
Qualité de l’eau — Dénombrement des
Legionella
Water quality — Enumeration of Legionella
Numéro de référence
©
ISO 2017
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Examen . 2
4.3 Confirmation . 2
5 Appareillage et verrerie . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Mode opératoire. 5
8.1 Échantillons . 5
8.2 Concentration des échantillons d’eau . 5
8.2.1 Généralités . 5
8.2.2 Filtration sur membrane et dépôt direct de la membrane filtrante sur
milieu de culture . 5
8.2.3 Filtration sur membrane suivie d’une procédure de lavage. 5
8.3 Prétraitement de l’échantillon . 6
8.3.1 Traitement thermique . 6
8.3.2 Traitement acide . 6
8.4 Culture . 6
8.4.1 Généralités . 6
8.4.2 Échantillons ayant une forte concentration en Legionella et une faible
concentration en micro-organismes interférents . 7
8.4.3 Échantillons ayant une faible concentration en Legionella et une faible
concentration en micro-organismes interférents . 7
8.4.4 Échantillons ayant une forte concentration en micro-organismes interférents . 7
8.4.5 Échantillons ayant une très forte concentration en micro-
organismes interférents . 7
8.4.6 Incubation . 8
8.4.7 Examen des boîtes . 8
8.5 Confirmation des colonies présomptives de Legionella sur milieux de culture:
géloses BCYE et BCYE sans cys . 8
9 Expression des résultats. 9
10 Rapport d’essai .10
11 Assurance qualité .10
11.1 Généralités .10
11.2 Essais de performance des milieux de culture de Legionella .10
11.3 Préparation de la culture de travail et de la suspension pour les essais de performance .10
Annexe A (informative) Espèces de Legionella .12
Annexe B (normative) Milieux de culture .14
Annexe C (normative) Diluants .20
Annexe D (normative) Solution d’acide .21
Annexe E (informative) Retrait des bactéries par grattage ou frottement
des membranes filtrantes .22
Annexe F (informative) Technique de centrifugation .23
Annexe G (informative) Technique des anticorps par immunofluorescence indirecte pour
l’identification des espèces de Legionella .24
Annexe H (informative) Données de performance .27
Annexe I (informative) Matrices de pré-traitement liées à l’eau .32
Annexe J (normative) Matrice de décision .33
Bibliographie .39
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: Avant-propos — Informations supplémentaires.
Le présent document a été élaboré par le comité technique l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, Sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Cette seconde édition de l’ISO 11731 annule et remplace les ISO 11731:1998 et ISO 11731-2:2004, qui
ont fait l’objet d’une révision technique.
Introduction
Après la première épidémie reconnue de la maladie du légionnaire survenue en 1976, la bactérie isolée
fut appelée Legionella pneumophila. Les Legionella sont largement présentes dans les environnements
aquatiques naturels et artificiels, les sols, les composts et peuvent provoquer la légionellose. Les
Legionella peuvent se développer par voie intracellulaire dans les protozoaires tels que Acanthamoeba
castellanii, l’espèce Hartmannella ou l’espèce Naegleria. Au moins 61 différentes espèces de Legionella
ont été décrites. Dans 26 de ces espèces, plusieurs souches infectieuses pour les humains ont été
signalées. Legionella pneumophila peut être subdivisée en au moins 15 sérogroupes différents;
neuf autres espèces peuvent également être subdivisées en au moins deux sérogroupes distincts.
La surveillance des Legionella est importante pour des raisons de santé publique car elle permet
d’identifier dans l’environnement les sources qui peuvent créer un risque de légionellose, telles que les
tours de refroidissement, les systèmes de distribution d’eau chaude ou froide dans les bâtiments et les
équipements associés tels que les bassins de spas, les unités dentaires, les appareils de climatisation,
etc. La surveillance est également importante pour valider les mesures de contrôle et vérifier leur
efficacité constante.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 11731:2017(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement des Legionella
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes
de sécurité potentiels associés à son utilisation. Il incombe à ses utilisateurs d’établir des
pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à la
réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent
document le soient par du personnel dûment qualifié et compétent.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes de culture pour l’isolement des Legionella et leur
dénombrement dans des échantillons d’eau.
Ces méthodes sont applicables à tous les types d’échantillons d’eau, y compris les eaux potables,
industrielles, usées et naturelles. Elles peuvent également être utilisées pour les matrices liées à l’eau
(biofilms, sédiments, etc.).
Toutes les espèces de Legionella n’étant pas cultivables, les méthodes décrites dans le présent document
peuvent ne pas retrouver la totalité des espèces de Legionella.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 7704, Qualité de l’eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses
microbiologiques
ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
3.1
Legionella
genre de micro-organismes normalement capables de croître sur gélose tamponnée au charbon actif et
à l’extrait de levure (BCYE) contenant de la L-cystéine et des sels de fer
Note 1 à l’article: Voir l’Annexe A pour obtenir une description plus détaillée des espèces de Legionella.
4 Principe
4.1 Généralités
Selon l’origine et/ou les caractéristiques de l’échantillon, les Legionella présentes dans l’échantillon
d’eau sont concentrées par filtration sur membrane, diluées ou directement ensemencées. Le niveau
de détection souhaité peut varier en fonction de la législation (inter)nationale et de la raison de
l’échantillonnage ou de l’étude. Les échantillons suspectés de contenir des Legionella en grand nombre,
tels que ceux obtenus au cours d’études épidémiologiques, peuvent être traités avec et/ou sans étapes
de concentration. Pour réduire le développement des bactéries non cibles concentrées et susceptibles
d’interférer avec la récupération des Legionella cibles, des fractions des échantillons d’eau sont
également soumises à un traitement thermique, à un traitement acide, ou à une combinaison des deux.
Une dilution est nécessaire dès lors qu’une forte concentration en Legionella et/ou d’autres bactéries est
attendue. Il convient de traiter au préalable des fractions séparées de l’échantillon dilué: une première
fraction étant soumise à un traitement thermique, une seconde à une solution d’acide ou, dans le cas
d’échantillons fortement contaminés, à une combinaison d’une solution d’acide et d’un traitement
thermique avant culture sur milieux sélectifs.
Les fractions traitées et/ou non traitées de l’échantillon sont transférées sur des boîtes du milieu de
culture sélectif choisi pour les Legionella, et incubées.
NOTE Le traitement mécanique de l’échantillon peut améliorer la récupération des Legionella.
4.2 Examen
Après incubation, les colonies de morphologie caractéristique sur les milieux de culture sélectifs sont
considérées comme des Legionella présomptives.
4.3 Confirmation
Les colonies présomptives sont confirmées comme étant des Legionella par repiquage afin de mettre en
évidence leur besoin en L-cystéine et en fer(III) pour se développer.
NOTE Si l’identification des espèces et des sérotypes est demandée, des essais complémentaires sont requis
(voir Annexe G). Ces essais ne sont pas inclus dans les méthodes normalisées décrites dans le présent document.
5 Appareillage et verrerie
Appareillage courant de laboratoire et notamment:
5.1 Boîtes de Petri stériles.
5.2 Étuve thermostatée, pouvant être maintenue à (36 ± 2) °C.
5.3 Lampe à ultraviolets, émettant une lumière d’une longueur d’onde de (360 ± 20) nm.
5.4 Appareillage de filtration sur membrane, permettant de filtrer des volumes d’eau de 10 ml à
1 000 ml.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
5.5 Membrane filtrante.
5.5.1 Membrane filtrante pour concentration et élution, en polycarbonate ou en polyéthersulfone,
d’un diamètre de 47 mm à 142 mm, avec des pores de dimension nominale 0,2 µm (voir Référence [6]).
Ces types de membranes filtrantes sont utilisés pour la concentration suivie d’une procédure de lavage.
5.5.2 Membrane filtrante pour dépôt direct sur milieu de culture, en nitrate de cellulose ou en
esters de cellulose mixtes, d’un diamètre de 47 mm à 50 mm, avec des pores de dimension nominale
0,2 µm ou 0,45 µm. Ces types de membranes filtrantes sont destinés à être directement placés sur les
milieux de culture, après filtration. Avant leur utilisation, les filtres doivent être évalués conformément à
l’ISO 7704.
NOTE Les membranes filtrantes foncées offrent un meilleur contraste des colonies de Legionella blanches
que les membranes plus claires.
5.6 pH-mètre, d’une exactitude de ± 0,1 de 20 °C à 25 °C.
5.7 Agitateur vortex.
5.8 Bain d’eau à ultrasons, permettant de s’assurer que le niveau de diluant qui recouvre la membrane
filtrante est inférieur au niveau d’eau du bain.
5.9 Bain d’eau, pouvant être maintenu à (50 ± 1) °C.
5.10 Verrerie, stérilisée conformément à l’ISO 8199.
5.11 Microscope de dissection, stéréoscopique, permettant un grossissement d’au moins 4× et à
éclairage incident oblique.
NOTE Une loupe simple (grossissement d’au moins 4×) peut également être utilisée.
5.12 Pince stérile, pour manipuler les membranes filtrantes.
NOTE Une pince à bouts arrondis est généralement utilisée pour éviter d’endommager les membranes au
cours des manipulations.
5.13 Récipient stérile à bouchon à vis, avec ou sans billes de verre stériles. Pour extraire un maximum
de Legionella de la membrane filtrante, des billes de verre stériles (diamètre de 2 mm à 3 mm) peuvent
être ajoutées en quantité suffisante pour recouvrir le fond du récipient stérile.
6 Milieux de culture et réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser des produits chimiques de qualité analytique pour la préparation
des milieux de culture et des réactifs (voir Note). Préparer les milieux de culture et les réactifs
conformément aux instructions des Annexes B, C et D. Préparer les milieux de culture en utilisant de
l’eau distillée ou déminéralisée, exempte de substances susceptibles d’affecter la croissance des micro-
organismes dans les conditions d’essai. L’eau doit être conforme aux exigences de l’ISO 3696, Qualité 3.
Il est également possible d’utiliser des milieux de culture et des réactifs disponibles dans le commerce,
préparés et utilisés conformément aux instructions du fabricant.
NOTE D’autres qualités de produits chimiques peuvent être utilisées, sous réserve de démontrer qu’elles
engendrent une performance égale pour l’essai.
6.1 Milieux de culture.
Voir l’Annexe B.
6.1.1 Gélose tamponnée au charbon actif et à l’extrait de levure (BCYE).
Voir B.1.
6.1.2 Gélose tamponnée au charbon actif et à l’extrait de levure sans L-cystéine (BCYE sans cys).
Voir B.2.
NOTE La gélose BCYE sans cys peut être remplacée par de la gélose au sang (voir B.6), de la gélose nutritive
(voir B.7) ou de la gélose tryptone-soja (voir B.8).
6.1.3 Gélose tamponnée au charbon actif et à l’extrait de levure avec suppléments sélectifs
(BCYE+AB).
Voir B.3.
6.1.4 Gélose à base de glycine, vancomycine, polymyxine B et cycloheximide (GVPC).
Voir B.4.
6.1.5 Gélose de Wadowsky et Yee modifiée (MWY).
Voir B.5.
6.2 Diluants.
Voir l’Annexe C.
6.2.1 Solution saline de Page.
Voir C.1.
6.2.2 Solution de Ringer diluée.
Voir C.2.
6.3 Solution d’acide.
Voir l’Annexe D.
7 Échantillonnage
Procéder à l’échantillonnage, au transport et au stockage des échantillons conformément à l’ISO 19458.
Ne pas exposer les échantillons à des conditions de température défavorables (gel ou traitement
thermique excessif, par exemple).
NOTE Des récipients isolés peuvent s’avérer utiles à cet égard.
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8 Mode opératoire
8.1 Échantillons
Du fait de la nature complexe des différentes matrices d’échantillons, le laboratoire doit déterminer
la méthode appropriée à chaque type d’échantillon. L’Annexe J fournit une matrice de décision pour
déterminer la méthode appropriée à appliquer. Elle décrit également les exigences associées et suggère
des options supplémentaires.
Afin de garantir la détection des Legionella dans les échantillons d’eau, une méthode de concentration
par filtration sur membrane (voir 8.2.2 ou 8.2.3) sera requise dans la majorité des cas. Lorsque la
concentration attendue de Legionella est supérieure à 10 unités formant colonie par litre (ufc/l),
l’échantillon non concentré peut également être directement ensemencé. Pour les échantillons fortement
contaminés, diluer (voir l’Annexe C pour obtenir les diluants adaptés) et utiliser l’ensemencement direct
avant et après le prétraitement (voir 8.3). Noter les volumes d’échantillon dilués ou traités et le(s)
prétraitement(s) appliqué(s).
Lorsque le nombre de Legionella dans un échantillon donné n’est pas connu, les méthodes de
concentration sont généralement mises en œuvre. Par conséquent, suivre le mode opératoire décrit au
8.2.2 ou 8.2.3.
8.2 Concentration des échantillons d’eau
8.2.1 Généralités
Pour obtenir une description générale de la méthode de filtration sur membrane, voir l’ISO 8199. La
filtration peut être effectuée sous vide ou par pression positive.
Il convient de régler le débit de façon à ne pas dépasser la valeur maximale spécifiée par le fabricant
pour la taille ou le type du filtre.
NOTE Le mode opératoire pour les matrices liées à l’eau (écouvillons, sédiments, etc.) est décrit dans
l’Annexe I.
8.2.2 Filtration sur membrane et dépôt direct de la membrane filtrante sur milieu de culture
Filtrer l’échantillon d’eau (sans traitement, après traitement acide et, si nécessaire, après traitement
thermique) sur une membrane filtrante en nitrate de cellulose ou en esters de cellulose mixtes
(5.5.2). Le traitement acide peut également être directement effectué sur la membrane filtrante dans
l’entonnoir (voir 8.3.2). Le volume filtré dépend de la teneur en particules de l’eau ou du niveau de
détection souhaité. Le volume filtré de l’échantillon doit être noté. Retirer soigneusement la membrane
filtrante du support de filtration à l’aide d’une pince stérile (5.12) et la déposer (dessus vers le haut)
directement sur le milieu de culture, en s’assurant qu’aucune bulle d’air ne soit piégée dessous.
NOTE Lorsque la concentration par filtration est impossible (par exemple en raison d’un niveau de dépôt
élevé), l’échantillon peut être concentré par centrifugation (voir l’Annexe F).
8.2.3 Filtration sur membrane suivie d’une procédure de lavage
Filtrer l’échantillon d’eau sur une membrane filtrante en polycarbonate ou en polyéthersulfone (5.5.1).
Le volume filtré dépend de la teneur en particules de l’eau ou du niveau de détection souhaité. Le volume
filtré de l’échantillon doit être noté. Retirer la membrane filtrante du support de filtration à l’aide d’une
pince stérile (5.12). Réaliser cette opération avec soin de manière à éviter la perte de dépôt résiduel.
Placer la membrane filtrante (dessus vers le bas) dans un récipient stérile à bouchon à vis contenant ou
non des billes de verre stériles (5.13). Pour détacher les micro-organismes de la membrane filtrante,
ajouter 5 ml à 10 ml de diluant stérile (voir l’Annexe C) ou d’échantillon, et agiter vigoureusement
en utilisant un agitateur vortex (5.7) pendant au moins 2 min. Une autre méthode consiste à placer
le récipient (5.13) dans un bain d’eau à ultrasons (5.8) pendant une durée qui a été validée pour une
récupération maximale. S’assurer que le niveau de diluant qui recouvre la membrane est inférieur au
niveau d’eau dans le bain d’eau à ultra-sons.
Ce concentré représente l’échantillon préparé. Noter le volume du concentré. Afin de faciliter l’élution,
les membranes filtrantes peuvent être coupées en plusieurs morceaux à l’aide de ciseaux stériles.
Diviser le concentré en trois portions. Utiliser une portion non traitée, une portion pour le traitement
thermique (voir 8.3.1) et une portion pour le traitement à la solution d’acide (voir 8.3.2).
NOTE 1 La méthode de grattage ou de frottement peut également être utilisée pour détacher les bactéries de
la membrane filtrante (voir l’Annexe E).
NOTE 2 Lorsque la concentration par filtration est impossible (par exemple en raison d’un niveau de dépôt
élevé), l’échantillon peut être concentré par centrifugation (voir l’Annexe F).
NOTE 3 Une membrane filtrante supplémentaire peut être utilisée pour réaliser le prétraitement acide
directement sur la membrane dans l’entonnoir.
8.3 Prétraitement de l’échantillon
8.3.1 Traitement thermique
Verser l’échantillon (concentré ou non) dans un récipient stérile et placer ce récipient dans un bain
d’eau (5.9) à (50 ± 1) °C pendant (30 ± 2) min. Il convient d’utiliser de petits volumes (≤5 ml) afin de
garantir un court laps de temps jusqu’à ce que la température souhaitée soit atteinte. Si de nombreux
échantillons sont traités simultanément ou si des échantillons de gros volume sont traités ou si des
récipients à paroi épaisse sont utilisés, surveiller la température dans un récipient séparé analogue
à celui utilisé pour l’échantillon. La période de traitement débute dès que la température requise est
atteinte. Après leur retrait du bain d’eau, il convient de refroidir les échantillons de gros volume ou les
récipients à paroi épaisse afin d’éviter que le traitement thermique ne continue.
8.3.2 Traitement acide
Diluer un volume d’échantillon (concentré ou non) avec 9 volumes de solution d’acide (voir l’Annexe D),
mélanger soigneusement et laisser en contact pendant (5,0 ± 0,5) min. Si l’échantillon dilué traité à
l’acide est utilisé pour calculer la concentration finale des espèces de Legionella contenues dans cet
échantillon, il convient de tenir compte du facteur de dilution. Des volumes supérieurs à 0,1 ml peuvent
être ensemencés afin de réduire la limite de détection.
Le traitement acide peut également être effectué directement sur la membrane filtrante dans l’entonnoir.
Transvaser environ 30 ml de solution d’acide (voir l’Annexe D) sur la membrane filtrante. Laisser en
contact pendant (5 ± 0,5) min et éliminer la solution d’acide par filtration. Laver la membrane filtrante
avec au moins 20 ml du diluant (voir l’Annexe C). Il est important que le diluant ne rince pas la surface
de l’entonnoir qui n’a pas été en contact avec la solution d’acide.
8.4 Culture
8.4.1 Généralités
Le choix de la méthode utilisée pour le dénombrement des espèces de Legionella dépend de l’origine/des
caractéristiques de l’échantillon et de la raison de l’échantillonnage ou de l’étude. Une hypothèse doit
être émise concernant la concentration attendue de micro-organismes interférents, en se basant
sur l’expérience ou l’origine de l’échantillon. De plus, la limite inférieure de détection souhaitée doit
être prise en compte. L’Annexe J détaille une matrice de décision permettant de choisir une méthode
appropriée.
Selon le niveau de détection souhaité, il est possible d’utiliser plusieurs boîtes des différents milieux de
culture mentionnés aux paragraphes suivants.
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8.4.2 Échantillons ayant une forte concentration en Legionella et une faible concentration en
micro-organismes interférents
Ensemencer directement l’échantillon si le nombre attendu de Legionella dépasse 104 ufc/l. Inoculer et
étaler 0,1 ml à 0,5 ml de l’échantillon sur une boîte de gélose BCYE (voir B.1) et sur une boîte de gélose
BCYE+AB (voir B.3). Noter le volume inoculé.
8.4.3 Échantillons ayant une faible concentration en Legionella et une faible concentration en
micro-organismes interférents
8.4.3.1 Dépôt direct de la membrane filtrante sur milieu de culture après filtration sur
membrane
Filtrer l’échantillon (voir 8.2.2) et placer la membrane filtrante non traitée directement sur une boîte de
gélose BCYE (voir B.1). Les membranes filtrantes traitées à la solution d’acide selon 8.3.2 sont placées
sur une ou plusieurs boîtes de géloses sélectives ou fortement sélectives BCYE+AB (voir B.3) ou GVPC
(voir B.4) ou MWY (voir B.5).
8.4.3.2 Dépôt après filtration sur membrane suivi d’une procédure de lavage
Ensemencer et étaler 0,1 ml à 0,5 ml de chaque portion concentrée de l’échantillon (non traitée, traitée
thermiquement et traitée à l’acide) issue de la filtration sur membrane suivie d’une procédure de lavage
(voir 8.2.3) sur une boîte de gélose BCYE (voir B.1) et sur une ou plusieurs boîtes de géloses sélectives
ou fortement sélectives BCYE+AB (voir B.3) ou GVPC (voir B.4) ou MWY (voir B.5). Noter le volume
inoculé.
8.4.4 Échantillons ayant une forte concentration en micro-organismes interférents
Les échantillons ayant une forte concentration en micro-organismes interférents, sont mis en culture
non concentrés (directs), concentrés (voir 8.2) ou dilués (1:10). Diviser chaque sous-échantillon en
trois portions. Une première portion est utilisée non traitée, une deuxième portion pour le traitement
thermique (voir 8.3.1) et une troisième portion pour le traitement à la solution d’acide (voir 8.3.2).
Ensemencer et étaler 0,1 ml à 0,5 ml de chaque portion des sous-échantillons sur une boîte de gélose
GVPC (voir B.4) ou une boîte de gélose MWY (voir B.5). Noter le volume inoculé.
8.4.5 Échantillons ayant une très forte concentration en micro-organismes interférents
Les échantillons ayant une très forte concentration en micro-organismes interférents, sont mis en
culture non concentrés, et dilués (1:10 et 1:100) après un pré-traitement associé thermique et acide. Pour
le traitement associé, procéder d’abord au traitement thermique (voir 8.3.1) puis au traitement acide
(voir 8.3.2). Il est important de refroidir à température ambiante l’échantillon traité thermiquement
avant de procéder au traitement acide. Préparer des dilutions directement après le traitement acide
dans du diluant stérile (voir l’Annexe C).
Bien homogénéiser le mélange en utilisant un agitateur vortex (5.7) ou un bain d’eau à ultrasons (5.8).
Si nécessaire, ajouter à l’échantillon une couche (quantité juste suffisante pour recouvrir le fond du
récipient) de billes de verre stériles afin de faciliter la désagrégation du matériau. Ensemencer et étaler
0,1 ml à 0,5 ml de chaque portion sur une boîte de gélose GVPC (voir B.4) ou une boîte de gélose MWY
(voir B.5). Noter le volume inoculé.
8.4.6 Incubation
Laisser reposer les boîtes ensemencées jusqu’à absorption du volume inoculé, puis retourner les
boîtes et les incuber à (36 ± 2) °C pendant 7 à 10 jours. Créer une atmosphère humide afin d’éviter la
dessiccation des boîtes, en plaçant par exemple les boîtes dans un récipient fermé.
NOTE Les données de validation utilisant des échantillons dopés artificiellement n’ont démontré aucune
différence dans le dénombrement entre 7 jours et 10 jours d’incubation. Les échantillons naturels contenant des
souches sauvages de Legionella peuvent néanmoins nécessiter une période d’incubation complète de 10 jours
pour se développer.
8.4.7 Examen des boîtes
ème ème ème ème
Effectuer une première lecture des boîtes soit le 2 , soit le 3 , soit le 4 , soit le 5 jour, puis
une lecture finale au terme de la période d’incubation. Cela permet d’identifier les échantillons dans
lesquels les micro-organismes prolifèrent. Le résultat quantitatif final n’est pas disponible avant la fin
de la période d’incubation. Pour la plage de dénombrement, se reporter au Tableau H.1. Les Legionella
se développant lentement et pouvant être masquées par la croissance d’autres micro-organismes, il est
également recommandé d’utiliser un microscope de dissection à éclairage incident oblique (5.11). Noter
le nombre de chaque type de colonies présomptives de Legionella présentes.
En cas d’études épidémiologiques, pour les échantillons dont la concentration attendue en micro-
ème
organismes interférents est élevée, il est conseillé de contrôler les boîtes le 2 jour afin de déterminer
si des dilutions sont nécessaires. Il faut souligner l’impact potentiellement négatif d’une conservation
du concentré ou de l’échantillon pendant deux jours supplémentaires.
Les colonies de Legionella ont généralement une coloration blanche-grise mais peuvent également
avoir d’autres couleurs. Elles sont lisses avec un bord bien net et présentent l’aspect caractéristique du
verre dépoli. Sous lumière ultraviolette (5.3), les colonies de différentes espèces (L. anisa, L. bozemanii,
L. cherrii, L. dumoffii, L. gormanii, L. gratiana, L. parisiensis, L. steigerwaltii et L. tucsonensis) émettent une
fluorescence d’un blanc brillant; les espèces L. erythra et L. rubrilucens apparaissent rouges. Les colonies
de L. pneumophila apparaissent en vert fade, souvent teinté de jaune. La couleur de la fluorescence peut
contribuer à différencier les colonies dans les échantillons contenant différentes espèces de Legionella.
Afin d’éviter que les Legionella ne soient tuées ou si endommagées qu’elles ne soient plus récupérables,
il convient de ne pas exposer les boîtes sous lumière ultraviolette plus longtemps que nécessaire. Il
convient de noter que de nouvelles espèces de Legionella peuvent posséder des caractéristiques
différentes de celles décrites ci-dessus.
8.5 Confirmation des colonies présomptives de Legionella sur milieux de culture:
géloses BCYE et BCYE sans cys
Repiquer à partir de la (des) boîte(s) présentant le plus grand nombre de colonies présomptives de
Legionella (voir 8.4.7) par volume d’eau. S’il n’y a qu’un seul type de colonie, prélever trois colonies
présomptives. Si plusieurs types morphologiques différents de colonies présomptives de Legionella se
développent sur la boîte, prélever au moins une colonie de chaque type. Repiquer sur une boîte de gélose
BCYE (voir B.1) et une boîte de gélose BCYE sans cys (voir B.2 ou d’autres milieux décrits dans la Note
en 6.1.2). Veiller à ne pas prélever de milieu de culture avec la colonie et commencer par ensemencer
une boîte de gélose BCYE sans cys puis une boîte de gélose BCYE. Incuber à (36 ± 2) °C pendant 2 jours
à 5 jours. Considérer comme des Legionella les colonies se développant sur la boîte de gélose BCYE (voir
B.1) mais ne se développant pas sur la boîte de gélose BCYE sans cys (voir B.2). Consigner les résultats
obtenus pour chaque boîte. Si les repiquages initiaux ne sont pas confirmés comme étant des Legionella,
analyser d’autres repiquages de colonies présomptives de Legionella provenant d’un autre type de boîte
(milieux de culture ou traitements d’échantillons).
L. oakridgensis et L. spiritensis ont besoin de L-cystéine et de fer(III) pour l’isolement primaire, mais
présentent parfois un léger développement en l’absence de L-cystéine ajoutée par la suite. Il faut donc
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comparer attentivement les différences de développement entre les milieux de culture avec et sans
suppléments.
NOTE Des modes opératoires alternatifs peuvent être utilisés pour confirmer un isolat en tant que Legionella,
à condition de vérifier l’aptitude de ce mode opératoire.
Pour des situations particulières telles que des recherches d’épidémie, au moins cinq colonies
présomptives si un seul type morphologique est présent, ou deux colonies présomptives pour chaque
type morphologique, doivent être confirmées. Si l’identification des colonies de Legionella doit être
réalisée (voir l’Annexe G) et mentionnée dans le rapport d’essai, il convient de confirmer tous les types
morphologiques présents sur l’une des boîtes et de consigner les identifications dans le rapport.
9 Expression des résultats
Pour estimer le nombre d’unités formant colonie de Legionella dans l’échantillon d’eau originel,
sélectionner la boîte ou le groupe de boîtes (provenant du même milieu de culture) présentant le
nombre maximal de colonies confirmées par volume d’eau. Tenir compte de la dilution. Ne pas calculer
la moyenne des dénombrements provenant de différents traitements, méthodes ou milieux de culture
car il ne s’agit pas de déterminations répétées.
Calculer le nombre d’unités formant colonie de Legionella dans l’échantillon d’origine (voir les exemples
ci-dessous) par litre, conformément à l’ISO 8199, à l’aide de l’une des formules suivantes:
a
— Ensemencement direct: C =×V
s s
V
tot
a
— Membrane filtrante sur boîte: C =×V
s s
V
tot
aV×
c
— Filtration avec procédure de lavage (filtration indirecte): C = ×V
s s
VV×
tot
aV×
s
— Ensemencement après dilution: C = ×Df
s
V
où
C est le nombre d’ufc/l de Legionella;
s
a est le nombre calculé de colonies de Legionella confirmées;
Fraction de colonies confirmées positives
a = × Nombre total de colonies
Fraction du nombbre total de colonies confirmées
V est le volume de l’échantillon (concentré) en millilitres (ml);
c
V est le volume d’échantillon inoculé par boîte ou groupe de boîtes (provenant du même milieu
de culture) en millilitres (ml);
V est le volume total d’échantillon analysé en millilitres (ml);
tot
V est le volume de référence choisi pour exprimer la concentration des micro-organismes dans
s
l’échantillon (1 000 ml normalement);
V est le volume d’échantillon dilué, inoculé par boîte ou lot de boîtes (du même milieu de
dil
culture) en millilitres, ml;
Df est le facteur de dilution.
L’objet du présent document est de déterminer le nombre de Legionella confirmées dans un échantillon.
Noter le nombre confirmé d’unités formant colonie de Legionella conformément à l’ISO 8199. Indiquer
l’absence d’unités formant colonie de Legionella par la mention «Non détectée» dans le volume examiné
et indiquer la limite de détection calculée d’après le mode opératoire utilisé (voir Tableau J.1).
10 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit au minimum contenir les informations suivantes:
a) la méthode d’essai utilisée (en liaison avec l’Annexe J) ainsi qu’une référence au présent document
(ISO 11731);
EXEMPLE Une spécification complémentaire, en liaison avec l’Annexe J, peut être réalisée comme suit:
[Matrice A; Modes opératoires 8, 9 et 10; Milieux A et C — GVPC].
b) tous les détails nécessaires à l’identification complète de l’échantillon, tels que le lieu de prélèvement
avec un identifiant unique afin de pouvoir, si nécessaire, prélever de nouveau un échantillon
exactement aux mêmes emplacement et point d’échantillonnage [par exemple, lieu d’implantation
du bâtiment (adresse et code postal), numéro d’étage et d’appartement, lieu exact de la sortie
(lavabo d’une pièce)], la technique de prélèvement, la nature de l’échantillon, le type de système ou
d’installation d’approvisionnement en eau, la température et la concentration de biocide;
c) la date et l’heure de recueil de l’échantillon, la date de réception de l’échantillon, et les heures de
début et de fin de l’examen, tout événement particulier observé durant le transport, le stockage et
la phase d’analyse, susceptible d’avoir influé sur les résultats (par exemple présence de particules
dans l’échantillon);
d) le volume maximal utilisé pour l’analyse;
e) les résultats exprimés conformément à l’Article 9.
11 Assurance qualité
11.1 Généralités
Le laboratoire doit mettre en œuvre un système de maîtrise de la qualité clairement défini afin de
garantir que l’appareillage, les réactifs et les techniques sont adaptés à l’essai. L’utilisation de témoins
positifs, de témoins négatifs et de blancs entre dans le cadre de l’essai.
11.2 Essais de performance des milieux de culture de Legionella
Pour obtenir la définition de la productivité, de la sélectivité et de la spécificité, se reporter à
l’ISO 11133. Des essais de performance des différents milieux de culture de Legionella doivent être
réalisés conformément aux méthodes et critères spécifiés dans l’ISO 11133. La pré
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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