Milk — Determination of urea content — Enzymatic method using difference in pH (Reference method)

ISO 14637|IDF 195:2004 specifies an enzymatic method for the determination of the urea content of milk by measurement of the difference in pH.

Lait — Détermination de la teneur en urée — Méthode enzymatique par mesurage de pH différentiel (Méthode de référence)

L'ISO 14637:2004 spécifie une méthode enzymatique de détermination de la teneur en urée dans le lait par pHmétrie différentielle.

General Information

Status
Published
Publication Date
11-Oct-2004
Current Stage
9060 - Close of review
Completion Date
04-Jun-2030

Relations

Effective Date
12-Feb-2026

Overview

ISO 14637:2004 (IDF 195:2004) - "Milk - Determination of urea content - Enzymatic method using difference in pH (Reference method)" defines a laboratory reference method for measuring urea in milk. The procedure uses urease to hydrolyse urea into ammonia and carbon dioxide, and quantifies urea by measuring the resulting differential pH change with a flow‑through differential pH analyser. This International Standard was prepared jointly by ISO, IDF and AOAC and is intended for reliable, reproducible determination of urea content expressed in mg/L.

Key topics and technical requirements

  • Principle: Urease-catalysed hydrolysis of urea at pH ~6.7 produces pH change proportional to urea concentration; measured as the difference in pH between two electrodes.
  • Reagents: Specifications for buffer (pH 6.7), urease enzyme solution (activity specified), urea standard solution, and cleaning/regenerating solutions are included, with recommended storage conditions.
  • Apparatus: Requirements for a differential pH apparatus (peristaltic pumps, mixing chamber, two glass capillary flow‑through electrodes), micropipettes, water bath and analytical balance.
  • Procedure: Stepwise instructions for sample preparation, blank determination, calibration (including calculation of pH difference and slope), routine checks (stability, contamination), and electrode cleaning/regeneration.
  • Quality control: Calibration checks, blank limits (mpH ranges), and electrode maintenance procedures to ensure measurement accuracy.
  • Precision and reporting: The standard contains results from interlaboratory tests and guidance on repeatability, reproducibility and required content of the test report.

Applications and practical value

  • Dairy quality control: Routine and reference testing of milk for urea content to monitor animal health, feeding practices and milk adulteration.
  • Regulatory and reference laboratories: Use as an established reference method for method validation, interlaboratory comparisons and official control.
  • Research and method development: Basis for developing rapid screening methods and validating alternative analytical techniques against an accepted reference.

Who should use ISO 14637:2004

  • Dairy laboratory technicians and managers
  • National and regional food control authorities
  • Instrument manufacturers (differential pH analysers)
  • Researchers validating urea measurement procedures

Related standards

  • ISO 707 - recommended sampling method for milk (sampling is outside the scope of ISO 14637 but referenced)
  • Associated IDF/AOAC documents cited within the standard for collaborative context

Keywords: ISO 14637:2004, milk urea determination, enzymatic method, urease, differential pH analyser, reference method, dairy testing, urea in milk.

Standard

ISO 14637:2004 - Milk -- Determination of urea content -- Enzymatic method using difference in pH (Reference method)

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ISO 14637:2004 - Lait -- Détermination de la teneur en urée -- Méthode enzymatique par mesurage de pH différentiel (Méthode de référence)

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Frequently Asked Questions

ISO 14637:2004 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Milk — Determination of urea content — Enzymatic method using difference in pH (Reference method)". This standard covers: ISO 14637|IDF 195:2004 specifies an enzymatic method for the determination of the urea content of milk by measurement of the difference in pH.

ISO 14637|IDF 195:2004 specifies an enzymatic method for the determination of the urea content of milk by measurement of the difference in pH.

ISO 14637:2004 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 67.100.10 - Milk and processed milk products. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.

ISO 14637:2004 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to EN ISO 14637:2006. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.

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Standards Content (Sample)


INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14637
IDF
First edition
2004-10-15
Milk — Determination of urea content —
Enzymatic method using difference in pH
(Reference method)
Lait — Détermination de la teneur en urée — Méthode enzymatique
utilisant les fluctuations du pH (Méthode de référence)

Reference numbers
IDF 195:2004(E)
©
ISO and IDF 2004
IDF 195:2004(E)
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Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
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Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2004 – All rights reserved

IDF 195:2004(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 1
4 Reagents. 1
5 Apparatus. 2
6 Sampling. 3
7 Preparation of test sample. 3
8 Procedure. 3
8.1 General. 3
8.2 Blank determination. 3
8.3 Calibration. 4
8.4 Checking the calibration. 5
8.5 Determination. 5
8.6 Checking the stability. 5
8.7 Checking the contamination of the electrodes. 5
8.8 Cleaning procedure. 5
9 Maintenance of the electrodes . 5
9.1 Regeneration. 5
9.2 Strong regeneration. 6
10 Calculation and expression of results . 6
10.1 Calculation. 6
10.2 Expression of results. 6
11 Precision. 6
11.1 Interlaboratory tests. 6
11.2 Repeatability. 6
11.3 Reproducibility. 7
12 Test report. 7
Annex A (informative) Differential pH apparatus. 8
Annex B (informative) Interlaboratory tests. 9
Bibliography . 11

IDF 195:2004(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies), The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees, Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee, International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work, ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization,
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2,
The main task of technical committees is to prepare International Standards, Draft International Standards
adopted by the technical committee are circulated to the member bodies for voting, Publication as an
International standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote,
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights, ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights,
International Standard ISO 14637|IDF 195 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with
AOAC International. It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.

iv © ISO and IDF 2004 – All rights reserved

IDF 195:2004(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country, Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work, IDF collaborates with ISO and AOAC International in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products,
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting, Publication as an International Standard requires approval by at least 50% of
IDF National Committees casting a vote,
International Standard ISO 14637|IDF 195 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with
AOAC International. It is being published jointly by ISO and IDF and separately by AOAC International.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Action Team, Nitrogen compounds, of the Standing
Committee on Main components of milk, under the aegis of its project leader, Mr Ph. Trossat (FR).

INTERNATIONAL STANDARD
IDF 195:2004(E)
Milk — Determination of urea content — Enzymatic method
using difference in pH (Reference method)
1 Scope
This International Standard specifies an enzymatic method for the determination of the urea content of milk by
measurement of the difference in pH.
2 Terms and definitions
For the purpose of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
urea content
mass fraction of substances determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The urea content is expressed in milligrams per litre.
3 Principle
Urease is added to the test sample to split urea into ammonia and carbon dioxide. At pH 6,7, ammonia
immediately hydrolyses thereby releasing hydroxyl ions, and carbon dioxide liberates protons that partly
neutralize these hydroxyl ions. The balance between the ammonia and carbon dioxide hydrolysis and the
resulting neutralization induces a change in pH. The pH change varies as a function of the urea content of the
sample and is measured by using a differential pH analyser.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
4.1 Reagents for urea determination.
4.1.1 Buffer solution, pH 6,7.
Dissolve 1,777 g of potassium monohydrogenphosphate (K HPO ), 1,388 g of potassium dihydrogen-
2 4
phosphate (KH PO ), 7,600 g of potassium chloride (KCl), 1,00 g of sodium azide (NaN ), 0,010 g of
2 4 3
acetazolamide (5-acetamido-1,3,4-thiadiazole-2-sulfonamide), 1,040 g of magnesium chloride hexahydrate
1)
(MgCl◊6H O), 2 g of Triton X100, 1 g of Brij 35 and 20 ml of LM1 in a 1 000 ml volumetric flask (5.5). Dilute
2 2
to the mark with water and mix.

1) This detergent is available from Valetudo S.r.l., BG, Italy, and is an example of a suitable product available
commercially. This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute
an endorsement by ISO or IDF of this product.
IDF 195:2004(E)
The buffer solution may be kept for 6 months if stored at 4 °C.
4.1.2 Urease enzyme solution.
Dissolve 360 mg of lyophilized urease (EC 3.5.1.5) in 1 ml of a 50 % (volume fraction) aqueous solution of
2)
glycerol. The activity of the obtained urease enzyme solution shall be 2 100 units/ml ± 300 units/ml .
The urease enzyme solution may be kept for 6 months if stored at 4 °C.
4.1.3 Urea standard solution.
Dissolve 1,000 g of dry urea (N H CO) (dried under vacuum in an oven at 90 °C ± 1 °C for 1 day), 7,45 g of
2 4
potassium chloride (KCl) and 1,0 g of sodium azide (NaN ) in a 1 000 ml volumetric flask (5.5). Dilute to the
mark with water and mix.
The urea standard solution may be kept for 6 months if stored at 4 °C.
4.1.4 Zero milk.
Add 20 µl of urease solution (4.1.2) to 1 ml of raw milk. Mix and incubate the thus-prepared raw milk for
10 min in the water bath (5.3) set at 40 °C.
4.2 Reagents for cleaning and maintenance of electrodes.
4.2.1 Cleaning solution.
Dissolve 1,742 g of potassium monohydrogenphosphate (K HPO ), 1,361 g of potassium dihydrogen-
2 4
phosphate (KH PO ), 7,455 g of potassium chloride (KCl), 1,00 g of sodium azide (NaN ), 2 g of Triton X100,
2 4 3
1)
2 g of Brij 35 and 3 g of LM1 in a 1 000 ml volumetric flask (5.5). Dilute to the mark with water and mix.
The cleaning solution may be kept for 1 year if stored at room temperature.
4.2.2 Regenerating solution.
Use hydrochloric acid of concentration, c(HCl) = 0,1 mol/l.
The regenerating solution may be kept for 1 year if stored at room temperature.
4.2.3 Strong regenerating solution.
Dissolve 30 g of nitric acid (HNO ) with a mass fraction of approximately 69 %, 30 g of hydrochloric acid (HCl)
with a mass fraction of approximately 37 %, 30 g of sodium fluoride (NaF) and 1 g of Triton X100 in a
1 000 ml volumetric flask (5.5). Dilute to the mark with water and mix.
The strong regenerating solution may be kept for 1 year if stored at room temperature.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg.

2) This unit (often called the International Unit or Standard Unit) is defined as the amount of enzyme which will catalyse
the transformation of one micromole of substrate per minute under standard conditions.
2 © ISO and IDF 2004 – All rights reserved
...


NORME ISO
INTERNATIONALE 14637
FIL
Première édition
2004-10-15
Lait — Détermination de la teneur en
urée — Méthode enzymatique par
mesurage de pH différentiel (Méthode
de référence)
Milk — Determination of urea content — Enzymatic method using
difference in pH (Reference method)

Numéros de référence
FIL 195:2004(F)
©
ISO et FIL 2004
FIL 195:2004(F)
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ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
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E-mail copyright@iso.org E-mail info@fil-idf.org
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Version française parue en 2006
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés

FIL 195:2004(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 1
4 Réactifs . 1
4.1 Réactifs pour la détermination de l'urée . 1
4.2 Réactifs pour le nettoyage et l'entretien des électrodes . 2
5 Appareillage . 3
6 Échantillonnage . 3
7 Préparation de l'échantillon d'essai. 3
8 Mode opératoire . 3
8.1 Généralités . 3
8.2 Détermination du blanc. 3
8.3 Calibrage. 4
8.4 Contrôle du calibrage. 5
8.5 Détermination. 5
8.6 Contrôle de la stabilité . 5
8.7 Contrôle de la contamination de l'électrode . 5
8.8 Nettoyage. 5
9 Entretien des électrodes . 6
9.1 Régénération . 6
9.2 Régénération forte. 6
10 Calcul et expression des résultats. 6
10.1 Calcul . 6
10.2 Expression des résultats . 6
11 Fidélité . 6
11.1 Essai interlaboratoires . 6
11.2 Répétabilité. 7
11.3 Reproductibilité. 7
12 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Appareillage de mesure de pHmétrie différentielle . 8
Annexe B (informative) Résultat des essais interlaboratoires . 9
Bibliographie . 11

© ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés iii

FIL 195:2004(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 14637⎪FIL 195 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée conjointement
par l'ISO et la FIL.
iv © ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés

FIL 195:2004(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour
l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 14637⎪FIL 195 a été élaborée par la Fédération internationale de laiterie (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO/FIL/AOAC, Composants azotés dans le lait
et les produits laitiers, sous la conduite de son chef de projet, Monsieur Ph. Trossat (FR).

© ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés v

NORME INTERNATIONALE
FIL 195:2004(F)
Lait — Détermination de la teneur en urée — Méthode
enzymatique par mesurage de pH différentiel (Méthode
de référence)
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode enzymatique de détermination de la teneur en urée
dans le lait par pHmétrie différentielle.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en urée
fraction massique de substances déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente Norme
internationale
NOTE La teneur en urée est exprimée en milligrammes par litre.
3 Principe
De l'uréase est ajoutée à l'échantillon d'essai, afin d'hydrolyser l'urée en ammoniac et en dioxyde de carbone.
À pH 6,7, l'ammoniac s'hydrolyse immédiatement en dégageant des ions hydroxyle et le dioxyde de carbone
libère des protons qui neutralisent partiellement ces ions hydroxyle. L'équilibre entre l'hydrolyse de
l'ammoniac et celle du dioxyde de carbone, et la neutralisation qui en résulte, entraîne une variation du pH. Le
pH varie en fonction de la teneur en urée de l'échantillon et la variation est mesurée à l'aide d'un analyseur à
pHmétrie différentielle.
4 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée
ou déminéralisée, ou de pureté équivalente.
4.1 Réactifs pour la détermination de l'urée
4.1.1 Solution tampon, pH 6,7.
Dissoudre dans une fiole jaugée à un trait de 1 000 ml (5.5) 1,777 g de monohydrogénophosphate dipotassique
(K HPO ), 1,388 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ), 7,600 g de chlorure de potassium
2 4 2 4
(KCl), 1,00 g d'azide de sodium (NaN ), 0,010 g d'acétazolamide (5-acétamido-1,3,4-thiadiazole-2-sulfonamide),
© ISO et FIL 2004 – Tous droits réservés 1

FIL 195:2004(F)
1,040 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6H O), 2 g de Triton X 100, 1 g de Brij 35 et 20 ml de
2 2
1)
LM1 . Diluer au repère avec de l'eau et mélanger.
La solution tampon peut être conservée pendant 6 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.1.2 Solution d'enzyme d'uréase.
Dissoudre 360 mg d'uréase lyophilisée (EC 3.5.1.5) dans 1 ml d'une solution aqueuse de glycérol à 50 %
(fraction volumique). L'activité de la solution enzymatique d'uréase obtenue doit être de (2 100 ± 300)
2)
unités/ml .
La solution d'enzyme d'uréase peut être conservée pendant 6 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.1.3 Solution étalon d'urée.
Dissoudre 1 000 g d'urée (N H CO) préalablement séchée [sous vide dans une étuve à (90 ± 1) °C pendant
2 4
une journée], 7,45 g de chlorure de potassium (KCl) et 1,0 g d'azide de sodium (NaN ) dans une fiole jaugée
de 1 000 ml (5.5). Diluer au trait de jauge avec de l'eau et mélanger.
La solution étalon d'urée peut être conservée pendant 6 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.1.4 Lait zéro.
Ajouter 20 µl de solution d'uréase (4.1.2) à 1 ml de lait cru. Mélanger et faire incuber le lait cru ainsi préparé
pendant 10 min dans le bain-marie (5.3) réglé à 40 °C.
4.2 Réactifs pour le nettoyage et l'entretien des électrodes
4.2.1 Solution de nettoyage.
Dissoudre dans une fiole jaugée à un trait de 1 000 ml (5.5) 1,742 g de monohydrogénophosphate
dipotassique (K HPO ), 1,361 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ), 7,455 g de chlorure de
2 4 2 4
1)
potassium (KCl), 1,00 g d'azide de sodium (NaN ), 2 g de Triton X 100, 2 g de Brij 35 et 3 g de LM1 . Diluer
au trait de jauge avec de l'eau et mélanger.
La solution de nettoyage peut être conservée pendant une année si elle est stockée à température ambiante.
4.2.2 Solution de régénération.
Utiliser de l'acide chlorhydrique à une concentration c(HCl) = 0,1 mol/l.
La solution de régénération peut être conservée pendant une année si elle est stockée à température
ambiante.
4.2.3 Solution de régénération forte.
Dissoudre dans une fiole jaugée à un trait de 1 000 ml (5.5) 30 g d'acide nitrique (HNO ) à environ 69 %
(fraction massique), 30 g d'acide chlorhydrique (HCl) à environ 37 % (fraction massique), 30 g de fluorure de
sodium (NaF) et 1 g de Triton X 100. Diluer au trait de jauge avec de l'eau et mélanger.
La solution de régénération forte peut être conservée pendant une année si elle est stockée à température
ambiante.
1) Il est possible de se procurer ce détergent auprès de Valetudo S.r.l., BG, Italie; c'est un exemple de produit disponible
sur le marché. Cette information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs de l'ISO 14637 et ne
saurait constituer un engagement de l'ISO ni de la FIL à l'égard de ce produit.
2) Cette unité (souvent appelée Unité Internationale ou Unité Standard) est d
...

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