ISO 19250:2010
(Main)Water quality — Detection of Salmonella spp.
Water quality — Detection of Salmonella spp.
ISO 19250:2010 specifies a method for the detection of Salmonella spp. (presumptive or confirmed) in water samples. It is possible that, for epidemiological purposes or during outbreak investigations, other media are also required.
Qualité de l'eau — Recherche de Salmonella spp.
L'ISO 19250:2010 spécifie une méthode pour la recherche de Salmonella spp. (présomptives ou confirmées) dans des échantillons d'eau. À des fins épidémiologiques ou au cours d'enquêtes sur des épidémies, il peut être nécessaire d'utiliser d'autres milieux.
Kakovost vode - Določanje prisotnosti Salmonella spp.
Ta mednarodni standard opredeljuje metodo določevanja prisotnosti vrst Salmonella spp. (domnevno ali potrjeno) v vodnih vzorcih. Mogoče je, da so za epidemiološke namene ali med preiskovanjem izbruhov potrebna tudi druga sredstva.
OPOZORILO: Mogoče je, da metoda ne zajema vseh vrst Salmonella Typhy in vseh vrst Salmonella Paratyphi.
OPOMBA: Za polkvantitativni pristop se lahko izvajajo preskusi najverjetnejšega števila (MNP).
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 19250
Первое издание
2010-07-15
Качество воды. Выявление бактерий
рода Salmonella spp.
Water quality — Detection of Salmonella spp.
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава
Ссылочный номер
ISO 19250:2010(R)
©
ISO 2010
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все меры
предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами – членами ISO. В
редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просим информировать Центральный секретариат
по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2010
Все права сохраняются. Если не задано иначе, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия офиса ISO по адресу, указанному ниже, или членов ISO в стране регистрации
пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2010 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.2
5 Аппаратура.4
6 Отбор проб.4
7 Питательные среды и реактивы .4
8 Проведение анализа .5
9 Представление результатов .10
10 Протокол испытания.10
11 Обеспечение качества.11
Приложение A (нормативное) Диаграмма анализа.12
Приложение B (нормативное) Состав (рецептура) и приготовление культуральных сред и
реактивов .13
Приложение С (информативное) Результаты межлабораторного эксперимента.20
Библиография.25
© ISO 2010 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) представляет собой всемирную федерацию,
состоящую из национальных органов по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по разработке
международных стандартов обычно ведется Техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в теме, для решения которой образован данный технический комитет, имеет право
быть представленным в этом комитете. Международные организации, правительственные и
неправительственные, поддерживающие связь с ISO, также принимают участие в работе. ISO тесно
сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам
стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, установленными в Части 2
Директив ISO/IEC.
Основное назначение технических комитетов заключается в разработке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые Техническими комитетами, направляются комитетам-
членам на голосование. Для их опубликования в качестве международных стандартов требуется
одобрение не менее 75 % комитетов-членов, участвовавших в голосовании.
Внимание обращается на тот факт, что отдельные элементы данного документы могут составлять
предмет патентных прав. ISO не несет ответственность за идентификацию каких–либо или всех
подобных патентных прав.
ISO 19250 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 4,
Микробиологические методы.
Настоящее издание отменяет и заменяет ISO 6340:1995 после технического пересмотра.
iv © ISO 2010 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
Введение
Виды бактерий рода Salmonella являются бактериями, которые очень широко распространены во всем
мире. Обычно их относят к патогенным, хотя их вирулентность и патогенность колеблется в широком
диапазоне. Носителями бактерий рода Salmonella являются люди, сельскохозяйственный и домашний
скот, дикие животные, включая птиц. Люди и животные могут выделять эти бактерии, будучи
носителями без выраженных симптомов, а также во время заболевания. Поэтому невозможно
устранить их из окружающей среды. После инфицирования животных передача бактерий рода
Salmonella может вызвать серьезные заболевания.
Поскольку вода признана средством переноса инфекции, наличие или отсутствие бактерий рода
Salmonella отслеживают в воде, там где подозревают риск заражения. Salmonella может
присутствовать во всех типах бытовых и сельскохозяйственных сточных вод, пресной воды, включая
грунтовые и питьевую воду, а также морскую воду.
Обнаружение бактерий рода Salmonella в воде обычно требует этапа концентрирования. Поскольку
клетки Salmonella могут присутствовать в очень незначительном количестве и наносить вред
окружающей водной среде, обнаружение ее в воде обычно требует этапа предварительного
обогащения.
© ISO 2010 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 19250:2010(R)
Качество воды. Выявление бактерий рода Salmonella spp.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Чтобы сохранить здоровье персонала лаборатории, большое значение
имеет то, чтобы выявление бактерий рода Salmonella, и особенно видов S. enterica subsp.
enterica ser. Typhi (Salmonella ser. Typhi) и S. enterica subsp. enterica ser. Paratyphi (Salmonella ser.
Paratyphi), предпринималось только в надлежащим образом оснащенной лаборатории, под
руководством опытного микробиолога, и чтобы особо тщательный контроль осуществлялся в
отношении ликвидации всего инкубированного материала.
Пользователи данного международного стандарта должны быть знакомы с обычной
лабораторной практикой. Настоящий стандарт не преследует цели рассмотреть все вопросы,
связанные с безопасностью, если они возникают при его использовании. Пользователь сам
несет ответственность за разработку соответствующих правил техники безопасности и охраны
здоровья , а также за обеспечение соответствия условиям национальных регламентов.
ВНИМАНИЕ! Самое главное, чтобы анализ в соответствии с настоящим международным
стандартом выполнялся обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод выявления бактерий рода Salmonella spp.
(презумптивных или подтвержденных) в пробах воды. Для эпидемиологических целей или при
расширенных исследованиях могут потребоваться другие среды.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Данный метод может выявить не все бактерии Salmonella ser. Typhi и ser.
Paratyphi.
ПРИМЕЧАНИЕ Для полуколичественного анализа, можно выполнить определение наиболее вероятного числа
(MPN=НВЧ), используя соответствующие объемы пробы. Для этих случаев объем пептонной забуференной воды
берется соответствующий.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные документы обязательны для применения данного документа. Для
датированных ссылок применяется только указанное издание. Для недатированных ссылок
применяется самое последнее издание указанного документа (включая все изменения).
ISO 6579, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод
обнаружения сальмонеллы Salmonella spp.
ISO 6887-1, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для
испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований.
Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений
ISO 7218, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и
рекомендации по микробиологическим исследованиям
ISO 7704, Качество воды. Оценка мембранных фильтров, используемых для микробиологических анализов
© ISO 2010 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
ISO 8199, Качество воды. Общее руководство по подсчету микроорганизмов, выращенных методом
посева на питательной среде
ISO 19458, Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
3.1
презумптивные бактерии рода Salmonella spp.
presumptive Salmonella spp.
бактерии, которые выращивают на установленной селективной обогатительной среде и образуют
типичные или атипичные колонии на твердых селективных средах on the solid selective media
3.2
подтвержденные бактерии рода Salmonella spp.
confirmed Salmonella spp.
бактерии, которые выращивают на установленной селективной обогатительной среде и образуют
типичные и сомнительные колонии на твердых селективных средах, и которые обладают
специфичными биохимическими и серологическими признаками
ПРИМЕЧАНИЕ Специфические биохимические и серологические признаки определяются по испытаниям/,
описанным в настоящем международном стандарте.
3.3
обнаружение бактерий Salmonella
Salmonella detection
определение присутствия или отсутствия микроорганизмов Salmonella (3.4)
3.4
сальмонелла
Salmonella spp.
Salmonella
микроорганизмы, которые образуют типичные или атипичные колонии на твердых селективных средах
и обладают специфическими биохимическими и серологическими признаками
4 Сущность метода
4.1 Общие положения
Обнаружение бактерий рода Salmonella требует четырех последовательных этапов (см. также
Приложение A).
Часто требуется предварительное обогащение, чтобы позволить выявление незначительного числа
микроорганизмов Salmonella или поврежденных микроорганизмов Salmonella. Некоторые
микроорганизмы Salmonella и микроорганизмы, сублетально поврежденные, могут потребовать
дополнительного времени инкубирования (4.3). Кроме того, бактерии рода Salmonella могут
присутствовать в небольших количествах и часто сопровождаются значительно большими
количествами других бактерий семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae) или других семейств.
Следовательно, потребуется селективное обогащение.
4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде
Пептонную забуференную воду (B.1) засевают при температуре окружающей среды известным
2 © ISO 2010 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
объемом пробы или его разведений, затем термостатируют при температуре (36 ± 2) °C в течение
(18 ± 2) ч. Большие объемы можно концентрировать с помощью мембранной фильтрации и помещения
после фильтрации мембранного фильтра в пептонную забуференную воду.
ПРИМЕЧАНИЕ Для сточных вод показано, что менее продолжительная инкубация или непосредственный
посев пробы на селективную среду (4.3) дает лучшие результаты.
Для полуколичественного анализа, можно выполнить определение наиболее вероятного числа
(MPN=НВЧ), используя соответствующие объемы проб. Для этих случаев объем пептонной
забуференной воды берется соответствующий
4.3 Обогащение в селективных жидких средах
Питательную среду Раппапорта-Василиадиса (Rappaport-Vassiliadis) (соевый бульон RVS) и
тетратионат-новобиоцинный бульон Мюллера-Кауфмана (Muller-Kauffmann) (MKTTn) засевают
культурой, полученной в 4.2.
Бульон RVS термостатируют при температуре (41,5 ± 1) °C в течение (24 ± 3) Ч, а бульон MKTTn - при
температуре (37 ± 1) °C в течение (24 ± 3) ч.
Для выявления медленно растущих бактерий рода Salmonella spp., инкубируют обогатительный бульон
в течение дополнительных (24 ± 3) ч до общей продолжительности (48 ± 4) ч при температуре
(41,5 ± 1,0) °C.
ПРИМЕЧАНИЕ Виды Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi A обычно не представляют интереса в рутинном
мониторинге качества воды, но могут иметь значение в эпидемиологических исследованиях. Бульон MKTTn
используют для обогащения при инкубировании при температуре (36 ± 2) °C в течение до (24 ± 3) ч для
большинства штаммов Salmonella, включая некоторые штаммы Salmonella Paratyphi, однако, он вряд ли подойдет
для штаммов Salmonella Paratyphi C. Бульон MKTTn не используют, если подозревается наличие бактерий вида
Salmonella Typhi после использования селенит-цистинового бульона.
4.4 Посев на чашки Петри и идентификация
Культурами, полученными в 4.3, засевают две чашки с плотной (твердой) селективной средой:
a) дезоксихолатный ксилозо-лизиновый агар (агар XLD);
b) любая другая плотная селективная среда в дополнение к агару XLD и, если это возможно,
подходящую для изолирования лактоза-положительных видов Salmonella и штаммов Salmonella
Typhi и Salmonella Paratyphi — лаборатория может сама выбрать среду для использования.
Инкубируют агар XLD при температуре (36 ± 2) °C и исследуют спустя (24 ± 3) ч, чтобы проверить на
наличие колоний, которые считаются презумптивными для рода Salmonella. Инкубируют второй
селективный агар в соответствии с рекомендациями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ К сведению аналитиков, можно использовать агар с добавлением бриллиантового зеленого
(BGA), висмут-сульфитный агар, и т.д., в качестве второй среды для выделения.
4.5 Подтверждение
Колонии пересеянной культуры презумптивных бактерий Salmonella, затем высевают в соответствии с 4.4 и
подтверждают их идентичность посредством биохимических (8.5.3) и серологических (8.5.4) тестов.
© ISO 2010 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
5 Аппаратура
Обычное оборудование для микробиологических исследований (см. ISO 7218) и, в частности,
следующее.
5.1 Общие положения. За исключением имеющейся в наличии стеклянной посуды, поставляемой в
стерильном состоянии, стерилизуют стеклянную посуду в соответствии с ISO 8199. Лабораторное
оборудование однократного применения, если соответствует требуемым спецификациям, является
приемлемой альтернативой посуде многоразового использования.
5.2 Автоклав, обеспечивающий поддержание температуры (121 ± 3) °C и (115 ± 3) °C.
5.3 Водяная баня или инкубатор (термостат), обеспечивающий поддержание температуры (36 ± 2) °C.
5.4 Водяная баня или инкубатор, обеспечивающий поддержание температуры (41,5 ± 1,0) °C.
5.5 Водяные бани, обеспечивающие работу при температуре (70 ± 1) °C и при температуре от
50 °C до 55 °C.
5.6 Оборудование для мембранной фильтрации, в соответствии с ISO 8199.
5.7 Стерильные мембранные фильтры, с порами номинального размера 0,45 мкм.
Качество мембранных фильтров может зависеть от изготовителя и даже от партии. Поэтому
рекомендуется регулярно проверять качество, в соответствии с ISO 7704.
5.8 pH-метр, с точностью калибровки ± 0,1 pH при температуре от 20 °C до 25 °C.
5.9 Стерильный пинцет.
5.10 Стерильные бактериальные петли для посева, диаметром приблизительно 3 мм (объем
10 мкл), и иглы или проволока для посева культур.
6 Отбор проб
Отбор проб не является частью установленного в настоящем международном стандарте метода.
Пробы рекомендуется отбирать в соответствии с ISO 19458.
Большое значение имеет то, чтобы лаборатория получила действительно репрезентативную пробу,
которая при транспортировании или хранении не претерпела повреждений или изменений.
7 Питательные среды и реактивы
ПРИМЕЧАНИЕ Для руководства по обеспечению качества и испытаниям на соответствие требованиям,
[2] [3]
см. ISO/TS 11133-1 и ISO/TS 11133-2 .
7.1 Основные материалы. Для единообразия результатов, при приготовлении питательных сред,
используют либо обезвоженную полную среду, либо компоненты одинакового качества и реактивы
признанной аналитической чистоты.
4 © ISO 2010 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
Можно использовать реактивы других классов чистоты, при условии получения сопоставимых
результатов.
[1]
7.2 Вода, ISO 3696 , класс 3.
7.3 Питательные среды, приготовленные в соответствии с Приложением B.
7.3.1 Пептонная забуференная вода, неселективная обогатительная среда – забуференная
пептонная вода (BPW, B.1).
7.3.2 Соевый бульон Раппапорта-Василиадиса (соевый бульон RVS, B.2), селективная
обогатительная среда.
7.3.3 Дезоксихолатный ксилозо-лизиноваый агар (агар XLD, B.3).
7.3.4 Вторая селективная среда в чашках для пересеянной культуры, выбор которой оставлен
на усмотрение испытательной лаборатории. Точно следуют инструкциям изготовителя в отношении
приготовления среды для применения.
7.3.5 Питательный агар (B.4), или другой подходящий неселективный агар.
7.3.6 Трехсахарный агар с железом (агар TSI, B.5).
В качестве альтернативы можно использовать двухсахарный агар с железом.
7.3.7 Агар с мочевиной, Кристенсена (Christensen) (B.6).
7.3.8 Среда для определения активности L-лизин-декарбоксилазы (B.7).
7.3.9 Селенит-цистиновый бульон (B.8).
7.3.10 Тетраионат-новобиоциновый бульон Мюллера-Кауфмана (MKTTn, B.9).
7.3.11 Вспомогательное вещество для фильтрования (B.10).
8 Проведение анализа
См. Рисунок A.1.
8.1 Подготовка проб
Для подготовки проб, фильтрации и посева на изолирующие среды необходимо следовать
инструкциям, установленным в ISO 8199 и ISO 6887-1. Анализ начинают предпочтительно сразу же
после отбора проб. Если пробы хранят при температуре окружающей среды, исследование начинают
спустя 12 ч после отбора проб. В исключительных обстоятельствах допускается хранить пробы при
температуре (5 ± 3) °C в течение до 24 ч до анализа.
Объем анализируемой пробы зависит от типа воды. Обычно для воды из бассейнов и питьевой воды
используют объемы от 1 000 мл до 5 000 мл. При анализе загрязненных поверхностных вод и сточных
© ISO 2010 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
вод обычно используют меньшие объемы.
Если требуется разведение пробы (например, сточных вод), готовят эти разведения в соответствии с
ISO 8199.
8.2 Неселективное предварительное обогащение
8.2.1 Неселективное предварительное обогащение для объемов менее 10 мл
Засевают 50 мл BPW (B.1) при комнатной температуре пробой или разведениями пробы и инкубируют
при температуре (36 ± 2) °C в течение (18 ± 2) ч.
8.2.2 Неселективное предварительное обогащение для объемов более 10 мл
Фильтруют объем воды, соответствующий типу анализируемой воды.
Погружают мембранный фильтр в 50 мл пептонной воды BPW (B.1).
Альтернативно добавляют пробу к такому же объему BPW двойной концентрации.
Необходимо отметить, что последняя процедура не годится для минеральной воды с высоким
содержанием солей или для морской воды.
Инкубируют культуры при температуре (36 ± 2) °C в течение (18 ± 2) ч.
8.2.3 Рекомендации в отношении мутной или загрязненной воды
Для мутной или загрязненной воды можно добавить стерильное вспомогательное вещество для
фильтрования (B.10) и фильтровать пробу через стерильную абсорбирующую прокладку,
действующую как опорное основание вместо использования мембраны.
В этом случае фильтруют аликвотное количество вспомогательного вещества, обычно 15 мл, чтобы
сформировать начальный слой абсорбирующей прокладки. Смешивают вторую аликвоту, обычно
15 млl, с объемом пробы и фильтруют. Для мутных или загрязненных вод можно профильтровать
дополнительные аликвотные количества. По завершении фильтрования извлекают воронку и
осторожно переносят абсорбирующую прокладку и вспомогательное вещество в пептонную воду BPW
(B.1). Если необходимо, оставляют небольшой объем BPW, чтобы сполоснуть воронку и чтобы
конечный объем BPW составил 100 мл. Инкубируют для определения присутствия или отсутствия, или
дозируют на серии НВЧ для полуколичественного анализа.
8.3 Селективное обогащение
Доводят обогатительный бульон(ы) до равновесия с комнатной температурой, если их хранили при
более низкой температуре. Переносят 0,1 мл культуры, полученной в 8.2, в пробирку, содержащую
10 мл бульона RVS (B.2). Если также используется MKTTn (B.9), tпереносят 1 мл культуры, полученной
в 8.2, в пробирку, содержащую 10 мл бульона MKTTn.
Инкубируют засеянный бульон RVS при температуре (41,5 ± 1,0) °C в течение (24 ± 3) ч и, если
необходимо (см. 4.3), в течение (48 ± 4) ч. Необходимо следить за тем, чтобы максимальная
6 © ISO 2010 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
допустимая температура инкубации (42,5 °C) не была превышена. Инкубируют засеянный бульон
MKTTn при температуре (36 ± 2) °C в течение (24 ± 3) ч.
ПРИМЕЧАНИЕ Для бульона RVS концентрация хлорида магния и температура инкубирования оптимизированы,
чтобы получить хороший выход без потери селективности согласно Ссылке [5].
8.4 Пересев на чашки
8.4.1 Общие положения
Доводят чашки с агаром XLD и вторую селективную среду для пересева (см. ISO 6579:2002, 5.2.4.2) до
равновесия при комнатной температуре, если их хранили при более низкой температуре. При
необходимости поверхность агаровых пластинок перед использованием сушат.
8.4.2 Пересев с бульона RVS
Используя культуру, полученную в бульоне RVS производят посев, после инкубации в течение
(24 ± 3) ч и, если необходимо (см. 4.3), в течение (48 ± 4) ч, с помощью стерильной петли (5.10), на
поверхность следующих обогатительных сред, так чтобы получить хорошо изолированные колонии:
a) агар XLD (B.3);
b) дополнительная селективная среда (7.3.4).
Переворачивают чашки Петри вверх дном и помещают в термостат (инкубатор)(5.3), установленный
при температуре (36 ± 2) °C на (24 ± 3) ч для агара XLD. необходимо следовать инструкциям
изготовителя в отношении второй селективной среды для пересева.
8.4.3 Пересев с бульона MKTTn
После термостатирования при температуре (36 ± 2) °C в течение (24 ± 3) ч, используя полученную
культуру, повторяют процедуру, установленную в 8.4.2 с двумя селективными средами для пересева.
8.5 Подтверждение
8.5.1 Общие положения
Можно использовать имеющиеся в продаже наборы тест-систем для идентификации, если они
показали себя надежными, чтобы выполнить биохимический анализ бактерий рода Salmonella. Этими
наборами пользуются в соответствии с инструкциями изготовителя.
8.5.2 Выбор колоний для подтверждения
Для целей повседневного мониторинга берут для подтверждения из каждой чашки Петри с
селективной средой(8.4), не менее одной отдельной колонии, считающейся типичными или
презумптивными микроорганизмами Salmonella. Если первая колония не подтвердилась какSalmonella,
тогда берут еще четыре колонии.
© ISO 2010 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
На агаре XLD типичные колонии Salmonella обычно имеют чёрный центр и слегка прозрачную зону
красноватого оттенка, связанные с цветовыми изменениями индикатора. При эпидемиологических
исследованиях рекомендуется, чтобы были идентифицированы по крайней мере пять колоний. Если в
одной чашке имеется меньше чем пять типичных или сомнительных колоний, используют все
типичные или сомнительные колонии для подтверждения.
ПРИМЕЧАНИЕ Признание колоний Salmonella в большей степени вопрос опыта микробиолога; их внешний вид
может изменяться не только от серотипа к серотипу, но и от партии к партии используемой селективной среды.
Shigella, Providencia и H S-отрицательные колонии Salmonella spp.(например, Salmonella Paratyphi A) имеют
2
розовый цвет и темно-розовой серединой; лактоза-положительные виды Salmonella, выращенные на XLD, имеют
желтый цвет с почернением или без него; Энтеробактерии (Enterobacteriaceae), например, Escherichia coli,
Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, и Serratia имеют непрозрачные колонии желтого цвета.
Выполняют посев штрихом на поверхность предварительно высушенных “неселективных” агаровых
сред в чашках (например, питательный агар, B.4) с целью получения хорошо изолированных колоний.
Инкубируют засеянные чашки при температуре (36 ± 2) °C в течение (24 ± 3) ч.
Если посев на чашки не дал хорошо различимых колоний, повторяют процедуру, так чтобы получить
отдельные одиночные колонии. Изолированные колонии используют для биохимического и, при
необходимости, серологического подтверждения. Если для идентификации используют биохимические
наборы, необходимо следовать инструкциям изготовителя.
8.5.3 Биохимическое подтверждение
8.5.3.1 Общие положения
С помощью бактериологической проволоки для посева засевают среды, установленные в 8.5.3.2 -
8.5.3.4 каждой из культур, полученных из колоний, выбранных в 8.5.2.
8.5.3.2 Агар TSI
Штрихуют поверхность косого агара TSI (B.5) и накалывают полоски между штрихами. Инкубируют при
температуре (36 ± 2) °C в течение (24 ± 3) ч. Описывают внешний вид среды по образцу, приведенному
в Таблице 1.
Таблица 1 — Описание изменений в среде
Внешний вид Описание
Полосы между штрихами
Желтые (кислота) Глюкозо-положительные (ферментация глюкозы)
Красные или без изменений Глюкозо-отрицательные (отсутствует ферментация
(щелочь) углеводов)
Черные Образование сероводорода
Пузырьки или трещины Выделение газа из глюкозы
Косой агар
Лактозо- или сахарозо-положительный (использовались
Желтый
лактоза или сахароза)
Красные или без изменений Лактозо- или сахарозо-отрицательный (не использовались ни
(щелочь) лактоза, ни сахароза)
8 © ISO 2010 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 19250:2010(R)
Типичные культуры рода Salmonella дают щелочной (красный) косой агар, выделение газа (пузырьки) и
кислотные (желтые) полоски между штрихами, с образованием (примерно в 90 % случаев)
сероводорода (почернение агара).
При изолировании лактозо-положительных культур Salmonella косой агар TSI приобретает желтую
окраску. Таким образом, предварительное подтверждение культур Salmonella не должно базироваться
на результатах теста только на агаре TSI.
8.5.3.3 Агар с мочевиной
Штрихуют поверхность косого агара с мочевиной (B.6). Инкубируют при температуре (36 ± 2) °C в
течение периода до 24 ч и исследуют через определенные промежутки времени. Если реакция
положительная, то при гидролизе мочевины выделяется аммиак, который изменяет цвет фенолового
красного на розовый, а затем на сочно-вишневый. Эта реакция часто уже заметна спустя 2 ч - 4 ч.
Типичные культуры Salmonella показывают отрицательную реакцию, т.е. цвет не меняется.
8.5.3.4 Среда для определения активности L-лизин-декарбоксилазы
Осуществляют посев глубоко под поверхность жидкой среды для определения активности L-лизин-
декарбоксилазы (B.7). Инкубируют при температуре (36 ± 2) °C в течение (24 ± 3) ч. Типичные культуры
Salmonella дают лиловый цвет после инкубирования.
8.5.3.5 Интерпретация биохимических тестов
Salmonella обычно дает реакции, приведенные в Таблице 2.
Таблица 2 — Биохимические реакции Salmonella
Штаммы Salmonella
a
Тест Подраздел Реакция дающие реакцию
b
%
TSI глюкоза(образование кислоты) 8.5.3.2 + 100,0
c
TSI глюкоза (выделение газа) 8.5.3.2 + 91,9
d
TSI лактоза 8.5.3.2 − 99,2
TSI сахароза 8.5.3.2 − 99,5
e
TSI сероводород 8.5.3.2 + 91,6
Гидролиз мочевины 8.5.3.3 − 99,0
f
L-Лизин- декарбоксилирование 8.5.3.4 + 94,6
a
См. Ссылку [8].
b
Эти цифры указывают только на то, что не все штаммы Salmonella дают реакции, помеченные знаком + или −. Это может
меняться в зависимости от географических зон и от источника воды.
c
Бактерии Salmonella Typhi являются анаэробными.
d
Штамм Salmonella enterica subsp. arizonae дает положительные или отрицательные реакции на лактозу, но всегд
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19250
First edition
2010-07-15
Water quality — Detection of Salmonella
spp.
Qualité de l'eau — Recherche de Salmonella spp.
Reference number
ISO 19250:2010(E)
©
ISO 2010
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2010
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2010 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .2
4 Principle.2
4.1 General .2
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium .2
4.3 Enrichment in selective liquid media .2
4.4 Plating out and recognition.3
4.5 Confirmation .3
5 Apparatus.3
6 Sampling.4
7 Culture media and reagents .4
8 Procedure.5
8.1 Preparation of the sample .5
8.2 Non-selective pre-enrichment.5
8.3 Selective enrichment.5
8.4 Plating out .6
8.5 Confirmation .6
9 Expression of results.9
10 Test report.9
Annex A (normative) Diagram of procedure .10
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents.11
Annex C (informative) Results of the interlaboratory trial.18
Bibliography.23
© ISO 2010 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 19250 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This edition cancels and replaces ISO 6340:1995, which has been technically revised.
iv © ISO 2010 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
Introduction
Salmonella species are bacteria which are widely distributed all over the world. They are usually classified as
pathogens, although their virulence and pathogenesis vary widely. The natural hosts of Salmonella include
humans, agricultural and domestic livestock, and wild animals including birds. Humans and animals can
excrete these bacteria while carrying them asymptomatically as well as during disease. It is therefore
impossible to eliminate them from the environment. Following the infection of humans, the transmission of
Salmonella can cause severe disease.
Since water is a recognized vehicle of infection, the presence or absence of Salmonella is monitored in water
where there is perceived to be a risk of infection. Salmonella can be present in all types of domestic and
agricultural waste water, freshwaters, including ground and drinking waters, as well as sea water.
The detection of Salmonella in water usually requires a concentration step. Since Salmonella cells can be
present in low numbers and injured in the aqueous environment, their detection in water usually requires a
pre-enrichment step.
© ISO 2010 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 19250:2010(E)
Water quality — Detection of Salmonella spp.
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Salmonella, and especially S. enterica subsp. enterica ser. Typhi (Salmonella ser. Typhi) and
S. enterica subsp. enterica ser. Paratyphi (Salmonella ser. Paratyphi), be undertaken only in properly
equipped laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care be taken in the
disposal of all incubated materials.
Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory practice. This
standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It is
the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure
compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the detection of Salmonella spp. (presumptive or
confirmed) in water samples. It is possible that, for epidemiological purposes or during outbreak investigations,
other media are also required.
WARNING — It is possible that the method does not recover all Salmonella ser. Typhi and ser.
Paratyphi.
NOTE For a semi-quantitative approach, most probable number (MPN) tests can be performed using appropriate
sample volumes. For these cases, the volume of the buffered peptone water is adjusted accordingly.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6579, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella
spp.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses
ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
© ISO 2010 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
presumptive Salmonella spp.
bacteria which grow in the selective enrichment medium specified, and form typical or atypical colonies on the
solid selective media
3.2
confirmed Salmonella spp.
bacteria which grow in the selective enrichment medium specified, and form typical and suspicious colonies
on the solid selective media, and which display specfic biochemical and serological characteristics
NOTE The specific biochemical and serological characteristics are determined by tests specified in this International
Standard.
3.3
Salmonella detection
determination of the presence or absence of Salmonella (3.4)
3.4
Salmonella spp.
Salmonella
microorganisms which form typical or atypical colonies on solid selective media and which display specific
biochemical and serological characteristics
4 Principle
4.1 General
The detection of Salmonella necessitates four successive stages (see also Annex A).
Pre-enrichment is often necessary to permit detection of low numbers of Salmonella or injured Salmonella.
Some Salmonella and those which are sublethally injured may require additional incubation time (4.3).
Furthermore, Salmonella can be present in small numbers and are often accompanied by considerably Iarger
numbers of other members of Enterobacteriaceae or of other families. Therefore, selective enrichment is
necessary.
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium
Buffered peptone water (B.1) is inoculated at ambient temperature with a known volume of the sample or its
dilutions, then incubated at (36 ± 2) °C for (18 ± 2) h. Larger volumes can be concentrated using membrane
filtration and the membrane filter is then added to buffered peptone water.
NOTE For waste water it has been shown that shorter incubation times or direct inoculation of the sample in selective
medium (4.3) produce better results.
For a semi-quantitative approach, MPN tests can be performed using appropriate sample volumes. In these
cases, adjust the volumes of the buffered peptone water accordingly.
4.3 Enrichment in selective liquid media
Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS broth) and Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth
(MKTTn) are inoculated with the culture obtained in 4.2.
The RVS broth is incubated at (41,5 ± 1) °C for (24 ± 3) h and the MKTTn broth at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h.
2 © ISO 2010 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
To detect slow-growing Salmonella spp., incubate the enrichment broth for a further (24 ± 3) h to a total of
(48 ± 4) h at (41,5 ± 1,0) °C.
NOTE Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi A are usually not important in routine water quality monitoring, but
can be relevant in epidemiological investigations. MKTTn broth is used for enrichment with incubation at (36 ± 2) °C for up
to (24 ± 3) h and recovers most strains of Salmonella, including some strains of Salmonella Paratyphi, but is not thought to
be able to recover strains of Salmonella Paratyphi C. MKTTn broth is not used if Salmonella Typhi is suspected after the
use of selenite cystine broth.
4.4 Plating out and recognition
From the cultures obtained in 4.3, two selective solid media are inoculated:
a) xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar);
b) any other solid selective medium complementary to XLD agar and, if applicable, appropriate for the
isolation of lactose-positive Salmonella and Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi strains — the
laboratory may choose which medium to use.
Incubate the XLD agar at (36 ± 2) °C and examine after (24 ± 3) h to check for the presence of colonies which
are considered to be presumptive Salmonella. Incubate the second selective agar according to the
manufacturer's recommendations.
NOTE For information, brilliant green agar (BGA), bismuth sulfite agar, etc., can be used as the second plating-out
medium.
4.5 Confirmation
Subculture colonies of presumptive Salmonella, then plate out as described in 4.4 and confirm their identity by
means of appropriate biochemical (8.5.3) and serological (8.5.4) tests.
5 Apparatus
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
5.1 General. Except for disposable glassware which is delivered sterile, sterilize glassware as specified in
ISO 8199. Disposable apparatus is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable
specifications.
5.2 Autoclave, capable of being maintained at (121 ± 3) °C and at (115 ± 3) °C.
5.3 Water bath or incubator, capable of being maintained at (36 ± 2) °C.
5.4 Water bath or incubator, capable of being maintained at (41,5 ± 1,0) °C.
5.5 Water baths, capable of operating at (70 ± 1) °C and at 50 °C to 55 °C.
5.6 Membrane filtration apparatus, as specified in ISO 8199.
5.7 Sterile membrane filters, with a nominal pore size of 0,45 µm.
The quality of membrane filters may vary from brand to brand or even from batch to batch. It is therefore
advisable to check the quality on a regular basis, as specified in ISO 7704.
© ISO 2010 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
5.8 pH-meter, with an accuracy of calibration of ± 0,1 pH at 20 °C to 25 °C.
5.9 Sterile forceps.
5.10 Sterile loops, approximate diameter 3 mm (10 µl volume), and inoculation needle or wire.
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. Samples should be taken in
accordance with ISO 19458.
It is important the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or changed
during transport or storage.
7 Culture media and reagents
[2] [3]
NOTE For guidelines on quality assurance and performance testing, see ISO/TS 11133-1 and ISO/TS 11133-2 .
7.1 Basic materials. For uniformity of results, in the preparation of media, either use a dehydrated
complete medium or use constituents of uniform quality and reagents of recognized analytical grade.
Other grades of reagents may be used provided they can be shown to produce comparable results.
[1]
7.2 Water, ISO 3696 , grade 3.
7.3 Culture media, prepared in accordance with Annex B.
7.3.1 Buffered peptone water, non-selective pre-enrichment medium buffered peptone water (BPW, B.1).
7.3.2 Rappaport-Vassiliadis broth with soya (RVS broth, B.2), selective enrichment medium.
7.3.3 Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar, B.3).
7.3.4 Second solid selective plating-out medium, whose choice is left to the discretion of the testing
laboratory. Follow the manufacturer's instructions precisely regarding its preparation for use.
7.3.5 Nutrient agar (B.4), or other appropriate non-selective agar.
7.3.6 Triple sugar and iron agar (TSI agar, B.5).
As an alternative, iron and two sugar agar may be used.
7.3.7 Urea agar, Christensen (B.6).
7.3.8 L-Lysine decarboxylation medium (B.7).
7.3.9 Selenite cystine broth (B.8).
7.3.10 Muller-Kaufmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn, B.9).
7.3.11 Filter aid (B.10).
4 © ISO 2010 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
8 Procedure
See Figure A.1.
8.1 Preparation of the sample
For the preparation of the sample, filtration and inoculation on isolation media, follow the instructions as
specified in ISO 8199 and ISO 6887-1. Start the examination preferably immediately after taking the samples.
If the samples are kept at ambient temperatures, start the examination within 12 h after sampling. Under
exceptional circumstances, it is allowable for the samples to be kept at (5 ± 3) °C for up to 24 h prior to
examination.
The volume of the sample to be analysed depends on the type of water. Usual volumes for bathing water and
drinking water are 1 000 ml to 5 000 ml. For polluted surface waters and waste water, smaller volumes are
usually analysed.
If sample dilutions are necessary (e.g. for waste water samples), prepare these dilutions as specified in
ISO 8199.
8.2 Non-selective pre-enrichment
8.2.1 Non-selective pre-enrichment for volumes less than 10 ml
Inoculate 50 ml of BPW (B.1) at room temperature with the sample or dilutions thereof and incubate at
(36 ± 2) °C for (18 ± 2) h.
8.2.2 Non-selective pre-enrichment for volumes greater than 10 ml
Filter a volume of water appropriate for the water being examined.
Immerse the membrane filter in 50 ml of BPW (B.1).
Alternatively, add the sample to the same volume of double strength BPW.
Note that the latter procedure is not suitable for mineral waters with high salt content or sea water.
Incubate the cultures at (36 ± 2) °C for (18 ± 2) h.
8.2.3 Recommendation for turbid or polluted water
For turbid or polluted waters, sterile filter aid (B.10) can be added and the sample filtered through a sterile
absorbent pad acting as a supporting base instead of using the membrane.
In this case, filter an aliquot of filter aid, typically 15 ml, to form an initial layer on the absorbent pad. Mix a
second aliquot, typically 15 ml, with the volume of sample and filter. For turbid or dirty waters, additional
aliquots may be filtered. When filtration is complete, remove the funnel and carefully transfer the absorbent
pad and filter aid to BPW (B.1). If necessary, retain a small volume of BPW to rinse the funnel so that the
final volume of BPW is 100 ml. Incubate for presence or absence, or dispense as an MPN series for a
semi-quantitative count.
8.3 Selective enrichment
Allow the enrichment broth(s) to equilibrate to room temperature if they were stored at a lower temperature.
Transfer 0,1 ml of the culture obtained in 8.2 to a tube containing 10 ml of the RVS broth (B.2). When
MKTTn (B.9) is also used, transfer 1 ml of the culture obtained in 8.2 to a tube containing 10 ml of the MKTTn
broth.
© ISO 2010 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
Incubate the inoculated RVS broth at (41,5 ± 1,0) °C for (24 ± 3) h and, if necessary (see 4.3), for (48 ± 4) h.
Care should be taken that the maximum allowed incubation temperature (42,5 °C) is not exceeded. Incubate
the inoculated MKTTn broth at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h.
NOTE For RVS broth, the magnesium chloride concentration and incubation temperature have been optimized to
yield good recovery without losing selectivity according to Reference [5].
8.4 Plating out
8.4.1 General
Allow the XLD agar plates and the second selective plating-out medium (see ISO 6579:2002, 5.2.4.2) to
equilibrate at room temperature if they were stored at a lower temperature. If necessary, dry the surface of the
plates before use.
8.4.2 Plating from RVS broth
Using the culture obtained in the RVS broth, inoculate, after incubation for (24 ± 3) h and, if necessary
(see 4.3), for (48 ± 4) h, by means of a sterile loop (5.10), the surface of the following enrichment media so
that well-isolated colonies are obtained:
a) XLD agar (B.3);
b) an additional selective medium (7.3.4).
Invert the dishes so that the bottom is uppermost, and place them in the incubator (5.3) set at (36 ± 2) °C for
(24 ± 3) h for the XLD agar. The manufacturer's instructions shall be followed for the second selective
plating-out medium.
8.4.3 Plating from MKTTn broth
After incubation at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h using the culture obtained, repeat the procedure specified in 8.4.2
with the two selective plating-out media.
8.5 Confirmation
8.5.1 General
If shown to be reliable, commercially available identification kits for the biochemical examination of Salmonella
may be used. Use these kits according to the manufacturer's instructions.
8.5.2 Selection of colonies for confirmation
For routine monitoring purposes, take, for confirmation, from each Petri dish of each selective medium (8.4),
at least one discrete colony considered to be typical or presumptive Salmonella. If the first colony is not
confirmed as Salmonella, then take a further four colonies.
On XLD agar, typical Salmonella colonies usually have a black centre and a lightly transparent zone of
reddish colour due to the colour change of the indicator. It is recommended that at least five colonies be
identified for epidemiological studies. If on one dish there are fewer than five typical or suspect colonies, take
all the typical or suspect colonies for confirmation.
NOTE The recognition of Salmonella colonies is to a large extent a matter of experience and their appearance can
vary somewhat, not only from serovar to serovar, but also from batch to batch of the selective medium used. Shigella,
Providencia and H S-negative Salmonella spp.(e.g. Salmonella Paratyphi A) appear as pink with a darker pink centre;
2
lactose-positive Salmonella grown on XLD are yellow with or without blackening; Enterobacteriaceae e.g. Escherichia coli,
Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, and Serratia appear as yellow, opaque colonies.
6 © ISO 2010 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
Streak the selected colonies on to the surface of pre-dried “non-selective” agar plates (e.g. nutrient agar, B.4)
to allow the development of well-isolated colonies.
Incubate the inoculated plates at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h.
If the plating fails to produce distinct colonies, repeat in a manner which ensures that single discrete colonies
are produced. Use single isolated colonies for biochemical and, if appropriate, serological confirmation. If
biochemical kits are used for identification, follow the manufacturer's instructions.
8.5.3 Biochemical confirmation
8.5.3.1 General
By means of an inoculating wire, inoculate the media specified in 8.5.3.2 to 8.5.3.4 with each of the cultures
obtained from the colonies selected in 8.5.2.
8.5.3.2 TSI agar
Streak the TSI agar (B.5) slant surface and stab the butt. Incubate at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h. Interpret the
appearance of the medium as in Table 1.
Table 1 — Interpretation of changes in medium
Appearance Interpretation
Butt
Yellow (acid) Glucose positive (fermentation of glucose)
Red or unchanged (alkaline) Glucose negative (no fermentation of carbohydrates)
Black Formation of hydrogen sulfide
Bubbles or cracks Gas formation from glucose
Slant surface
Yellow Lactose or sucrose positive (lactose or sucrose used)
Red or unchanged (alkaline) Lactose and sucrose negative (neither lactose nor sucrose used)
Typical Salmonella cultures show alkaline (red) slants, gas formation (bubbles) and acid (yellow) butts, with (in
about 90 % of the cases) formation of hydrogen sulfide (blackening of the agar).
When a lactose-positive Salmonella is isolated, the TSI slant is yellow. Thus, preliminary confirmation of
Salmonella cultures shall not be based on the results of the TSI agar test only.
8.5.3.3 Urea agar
Streak the urea agar (B.6) slant surface. Incubate at (36 ± 2) °C for up to 24 h and examine at intervals. lf the
reaction is positive, hydrolysis of urea liberates ammonia, which changes the colour of phenol red to rose-pink
and later to deep cerise. The reaction is often apparent after 2 h to 4 h. Typical Salmonella cultures show a
negative reaction, i.e. no colour production.
8.5.3.4 L-Lysine decarboxylation medium
Inoculate well below the surface of the liquid L-lysine decarboxylation medium (B.7). Incubate at (36 ± 2) °C
for (24 ± 3) h. Typical Salmonella cultures show a purple colour after incubation.
© ISO 2010 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
8.5.3.5 Interpretation of the biochemical tests
Salmonella generally show the reactions given in Table 2.
Table 2 — Biochemical reactions of Salmonella
Salmonella strains showing the reaction
a
Test Subclause Reaction
b
%
TSI glucose (acid formation) 8.5.3.2 100,0
+
c
TSI glucose (gas formation) 8.5.3.2 +
91,9
d
TSI lactose 8.5.3.2 −
99,2
TSI sucrose 8.5.3.2 99,5
−
e
TSI hydrogen sulfide 8.5.3.2 +
91,6
Urea hydrolysis 8.5.3.3 − 99,0
f
L-Lysine decarboxylation 8.5.3.4 +
94,6
a
See Reference [8].
b
These figures indicate only that not all strains of Salmonella show the reactions marked + or −. They may vary between
geographical areas and from water source to water source.
c
Salmonella Typhi is anaerogenic.
d
The Salmonella enterica subsp. arizonae gives positive or negative lactose reactions but is always β-galactosidase positive. The
Salmonella enterica subsp. diarizonae gives a negative lactose reaction, but gives a positive β-galactosidase reaction. In addition, it is
possible that these strains do not produce H S. For the study of these strains, it can be useful to carry out complimentary biochemical
2
tests (References [9][10]).
e
Acid formation is sometimes difficult to recognize due to strong blackening.
f
Salmonella Paratyphi A is negative.
The biochemical reactions in Table 3 are typical of Salmonella spp.
Table 3 — Typical biochemical reactions of Salmonella spp. to tests
Test Subclause Reaction
TSI lactose 8.5.3.2 −
TSI glucose 8.5.3.2 +
TSI sucrose 8.5.3.2 −
TSI hydrogen sulfide 8.5.3.2 +
Urea splitting 8.5.3.3 −
L-Lysine decarboxylase 8.5.3.4 +
Isolates which only vary from the typical parameters listed in Table 3 by one or two reactions can still be
Salmonella and should be further investigated and sent to a recognized reference laboratory for confirmation.
8.5.4 Serological confirmation and serotyping
Isolates which are typical according to the biochemical reactions listed in Table 3 are presumptive Salmonella
spp. and should, if need be, be investigated further by a reference laboratory. The presence of Salmonella O-,
Vi-, and H-antigens is detected by slide agglutination as specified in ISO 6579 with the appropriate sera, from
pure colonies (8.5.2) and after auto-agglutinating strains have been eliminated.
Isolates which give positive serological reactions are confirmed as Salmonella spp.
8 © ISO 2010 – All rights reserved
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 19250:2010(E)
9 Expression of results
In accordance with the results of the biochemical tests (8.5.3) and serological confirmation (8.5.4), indicate
whether presumptive or confirmed Salmonella were detected in the test portion ex
...
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.Qualité de l'eau - Recherche de Salmonella spp.Water quality - Detection of Salmonella spp.07.100.20Mikrobiologija vodeMicrobiology of waterICS:Ta slovenski standard je istoveten z:ISO 19250:2010SIST ISO 19250:2011en,fr01-junij-2011SIST ISO 19250:2011SLOVENSKI
STANDARDSIST ISO 6340:19981DGRPHãþD
SIST ISO 19250:2011
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.Qualité de l'eau - Recherche de Salmonella spp.Water quality - Detection of Salmonella spp.07.100.20Mikrobiologija vodeMicrobiology of waterICS:Ta slovenski standard je istoveten z:ISO 19250:2010SIST ISO 19250:2011en,fr01-junij-2011SIST ISO 19250:2011SLOVENSKI
STANDARDSIST ISO 6340:19981DGRPHãþDSIST ISO 19250:2011
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
Reference numberISO 19250:2010(E)© ISO 2010
INTERNATIONAL STANDARD ISO19250First edition2010-07-15Water quality — Detection of Salmonella spp. Qualité de l'eau — Recherche de Salmonella spp.
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) PDF disclaimer This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat accepts no liability in this area. Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated. Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
©
ISO 2010 All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO's member body in the country of the requester. ISO copyright office Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Tel.
+ 41 22 749 01 11 Fax
+ 41 22 749 09 47 E-mail
copyright@iso.org Web
www.iso.org Published in Switzerland
ii
© ISO 2010 – All rights reserved
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved
iii Contents Page Foreword.iv Introduction.v 1 Scope.1 2 Normative references.1 3 Terms and definitions.2 4 Principle.2 4.1 General.2 4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium.2 4.3 Enrichment in selective liquid media.2 4.4 Plating out and recognition.3 4.5 Confirmation.3 5 Apparatus.3 6 Sampling.4 7 Culture media and reagents.4 8 Procedure.5 8.1 Preparation of the sample.5 8.2 Non-selective pre-enrichment.5 8.3 Selective enrichment.5 8.4 Plating out.6 8.5 Confirmation.6 9 Expression of results.9 10 Test report.9 Annex A (normative)
Diagram of procedure.10 Annex B (normative)
Composition and preparation of culture media and reagents.11 Annex C (informative)
Results of the interlaboratory trial.18 Bibliography.23
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) iv
© ISO 2010 – All rights reserved Foreword ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization. International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2. The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote. Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. ISO 19250 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4, Microbiological methods. This edition cancels and replaces ISO 6340:1995, which has been technically revised.
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved
v Introduction Salmonella species are bacteria which are widely distributed all over the world. They are usually classified as pathogens, although their virulence and pathogenesis vary widely. The natural hosts of Salmonella include humans, agricultural and domestic livestock, and wild animals including birds. Humans and animals can excrete these bacteria while carrying them asymptomatically as well as during disease. It is therefore impossible to eliminate them from the environment. Following the infection of humans, the transmission of Salmonella can cause severe disease. Since water is a recognized vehicle of infection, the presence or absence of Salmonella is monitored in water where there is perceived to be a risk of infection. Salmonella can be present in all types of domestic and agricultural waste water, freshwaters, including ground and drinking waters, as well as sea water. The detection of Salmonella in water usually requires a concentration step. Since Salmonella cells can be present in low numbers and injured in the aqueous environment, their detection in water usually requires a pre-enrichment step.
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
INTERNATIONAL STANDARD ISO 19250:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved
1 Water quality — Detection of Salmonella spp. WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for detecting Salmonella, and especially S. enterica subsp. enterica ser. Typhi (Salmonella ser. Typhi) and S. enterica subsp. enterica ser. Paratyphi (Salmonella ser. Paratyphi), be undertaken only in properly equipped laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care be taken in the disposal of all incubated materials. Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions. IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard be carried out by suitably trained staff. 1 Scope This International Standard specifies a method for the detection of Salmonella spp. (presumptive or confirmed) in water samples. It is possible that, for epidemiological purposes or during outbreak investigations, other media are also required. WARNING — It is possible that the method does not recover all Salmonella ser. Typhi and ser. Paratyphi. NOTE For a semi-quantitative approach, most probable number (MPN) tests can be performed using appropriate sample volumes. For these cases, the volume of the buffered peptone water is adjusted accordingly.
2 Normative references The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies. ISO 6579, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp. ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) 2
© ISO 2010 – All rights reserved 3 Terms and definitions For the purposes of this document, the following terms and definitions apply. 3.1 presumptive Salmonella spp. bacteria which grow in the selective enrichment medium specified, and form typical or atypical colonies on the solid selective media 3.2 confirmed Salmonella spp. bacteria which grow in the selective enrichment medium specified, and form typical and suspicious colonies on the solid selective media, and which display specfic biochemical and serological characteristics NOTE The specific biochemical and serological characteristics are determined by tests specified in this International Standard. 3.3 Salmonella detection determination of the presence or absence of Salmonella (3.4) 3.4 Salmonella spp. Salmonella microorganisms which form typical or atypical colonies on solid selective media and which display specific biochemical and serological characteristics 4 Principle 4.1 General The detection of Salmonella necessitates four successive stages (see also Annex A). Pre-enrichment is often necessary to permit detection of low numbers of Salmonella or injured Salmonella. Some Salmonella and those which are sublethally injured may require additional incubation time (4.3). Furthermore, Salmonella can be present in small numbers and are often accompanied by considerably Iarger numbers of other members of Enterobacteriaceae or of other families. Therefore, selective enrichment is necessary. 4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium Buffered peptone water (B.1) is inoculated at ambient temperature with a known volume of the sample or its dilutions, then incubated at (36 ± 2) °C for (18 ± 2) h. Larger volumes can be concentrated using membrane filtration and the membrane filter is then added to buffered peptone water. NOTE For waste water it has been shown that shorter incubation times or direct inoculation of the sample in selective medium (4.3) produce better results. For a semi-quantitative approach, MPN tests can be performed using appropriate sample volumes. In these cases, adjust the volumes of the buffered peptone water accordingly. 4.3 Enrichment in selective liquid media Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS broth) and Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn) are inoculated with the culture obtained in 4.2. The RVS broth is incubated at (41,5 ± 1) °C for (24 ± 3) h and the MKTTn broth at (37 ± 1) °C for (24 ± 3) h. SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved
3 To detect slow-growing Salmonella spp., incubate the enrichment broth for a further (24 ± 3) h to a total of (48 ± 4) h at (41,5 ± 1,0) °C. NOTE Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi A are usually not important in routine water quality monitoring, but can be relevant in epidemiological investigations. MKTTn broth is used for enrichment with incubation at (36 ± 2) °C for up to (24 ± 3) h and recovers most strains of Salmonella, including some strains of Salmonella Paratyphi, but is not thought to be able to recover strains of Salmonella Paratyphi C. MKTTn broth is not used if Salmonella Typhi is suspected after the use of selenite cystine broth. 4.4 Plating out and recognition From the cultures obtained in 4.3, two selective solid media are inoculated: a) xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar); b) any other solid selective medium complementary to XLD agar and, if applicable, appropriate for the isolation of lactose-positive Salmonella and Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi strains — the laboratory may choose which medium to use.
Incubate the XLD agar at (36 ± 2) °C and examine after (24 ± 3) h to check for the presence of colonies which are considered to be presumptive Salmonella. Incubate the second selective agar according to the manufacturer's recommendations. NOTE For information, brilliant green agar (BGA), bismuth sulfite agar, etc., can be used as the second plating-out medium. 4.5 Confirmation Subculture colonies of presumptive Salmonella, then plate out as described in 4.4 and confirm their identity by means of appropriate biochemical (8.5.3) and serological (8.5.4) tests.
5 Apparatus Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following. 5.1 General. Except for disposable glassware which is delivered sterile, sterilize glassware as specified in ISO 8199. Disposable apparatus is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications. 5.2 Autoclave, capable of being maintained at (121 ± 3) °C and at (115 ± 3) °C. 5.3 Water bath or incubator, capable of being maintained at (36 ± 2) °C. 5.4 Water bath or incubator, capable of being maintained at (41,5 ± 1,0) °C. 5.5 Water baths, capable of operating at (70 ± 1) °C and at 50 °C to 55 °C. 5.6 Membrane filtration apparatus, as specified in ISO 8199. 5.7 Sterile membrane filters, with a nominal pore size of 0,45 µm. The quality of membrane filters may vary from brand to brand or even from batch to batch. It is therefore advisable to check the quality on a regular basis, as specified in ISO 7704. SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) 4
© ISO 2010 – All rights reserved 5.8 pH-meter, with an accuracy of calibration of ± 0,1 pH at 20 °C to 25 °C. 5.9 Sterile forceps. 5.10 Sterile loops, approximate diameter 3 mm (10 µl volume), and inoculation needle or wire. 6 Sampling Sampling is not part of the method specified in this International Standard. Samples should be taken in accordance with ISO 19458. It is important the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or changed during transport or storage. 7 Culture media and reagents NOTE For guidelines on quality assurance and performance testing, see ISO/TS 11133-1[2] and ISO/TS 11133-2[3]. 7.1 Basic materials. For uniformity of results, in the preparation of media, either use a dehydrated complete medium or use constituents of uniform quality and reagents of recognized analytical grade. Other grades of reagents may be used provided they can be shown to produce comparable results. 7.2 Water, ISO 3696[1], grade 3. 7.3 Culture media, prepared in accordance with Annex B. 7.3.1 Buffered peptone water, non-selective pre-enrichment medium buffered peptone water (BPW, B.1). 7.3.2 Rappaport-Vassiliadis broth with soya (RVS broth, B.2), selective enrichment medium. 7.3.3 Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar, B.3). 7.3.4 Second solid selective plating-out medium, whose choice is left to the discretion of the testing laboratory. Follow the manufacturer's instructions precisely regarding its preparation for use.
7.3.5 Nutrient agar (B.4), or other appropriate non-selective agar. 7.3.6 Triple sugar and iron agar (TSI agar, B.5).
As an alternative, iron and two sugar agar may be used. 7.3.7 Urea agar, Christensen (B.6). 7.3.8 L-Lysine decarboxylation medium (B.7). 7.3.9 Selenite cystine broth (B.8). 7.3.10 Muller-Kaufmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn, B.9). 7.3.11 Filter aid (B.10). SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved
5 8 Procedure See Figure A.1. 8.1 Preparation of the sample For the preparation of the sample, filtration and inoculation on isolation media, follow the instructions as specified in ISO 8199 and ISO 6887-1. Start the examination preferably immediately after taking the samples. If the samples are kept at ambient temperatures, start the examination within 12 h after sampling. Under exceptional circumstances, it is allowable for the samples to be kept at (5 ± 3) °C for up to 24 h prior to examination. The volume of the sample to be analysed depends on the type of water. Usual volumes for bathing water and drinking water are 1 000 ml to 5 000 ml. For polluted surface waters and waste water, smaller volumes are usually analysed. If sample dilutions are necessary (e.g. for waste water samples), prepare these dilutions as specified in ISO 8199. 8.2 Non-selective pre-enrichment 8.2.1 Non-selective pre-enrichment for volumes less than 10 ml Inoculate 50 ml of BPW (B.1) at room temperature with the sample or dilutions thereof and incubate at (36 ± 2) °C for (18 ± 2) h. 8.2.2 Non-selective pre-enrichment for volumes greater than 10 ml Filter a volume of water appropriate for the water being examined. Immerse the membrane filter in 50 ml of BPW (B.1). Alternatively, add the sample to the same volume of double strength BPW. Note that the latter procedure is not suitable for mineral waters with high salt content or sea water. Incubate the cultures at (36 ± 2) °C for (18 ± 2) h. 8.2.3 Recommendation for turbid or polluted water For turbid or polluted waters, sterile filter aid (B.10) can be added and the sample filtered through a sterile absorbent pad acting as a supporting base instead of using the membrane. In this case, filter an aliquot of filter aid, typically 15 ml, to form an initial layer on the absorbent pad. Mix a second aliquot, typically 15 ml, with the volume of sample and filter. For turbid or dirty waters, additional aliquots may be filtered. When filtration is complete, remove the funnel and carefully transfer the absorbent pad and filter aid to BPW (B.1). If necessary, retain a small volume of BPW to rinse the funnel so that the final volume of BPW is 100 ml. Incubate for presence or absence, or dispense as an MPN series for a semi-quantitative count. 8.3 Selective enrichment Allow the enrichment broth(s) to equilibrate to room temperature if they were stored at a lower temperature. Transfer 0,1 ml of the culture obtained in 8.2 to a tube containing 10 ml of the RVS broth (B.2). When MKTTn (B.9) is also used, transfer 1 ml of the culture obtained in 8.2 to a tube containing 10 ml of the MKTTn broth. SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) 6
© ISO 2010 – All rights reserved Incubate the inoculated RVS broth at (41,5 ± 1,0) °C for (24 ± 3) h and, if necessary (see 4.3), for (48 ± 4) h. Care should be taken that the maximum allowed incubation temperature (42,5 °C) is not exceeded. Incubate the inoculated MKTTn broth at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h. NOTE For RVS broth, the magnesium chloride concentration and incubation temperature have been optimized to yield good recovery without losing selectivity according to Reference [5].
8.4 Plating out 8.4.1 General Allow the XLD agar plates and the second selective plating-out medium (see ISO 6579:2002, 5.2.4.2) to equilibrate at room temperature if they were stored at a lower temperature. If necessary, dry the surface of the plates before use. 8.4.2 Plating from RVS broth Using the culture obtained in the RVS broth, inoculate, after incubation for (24 ± 3) h and, if necessary (see 4.3), for (48 ± 4) h, by means of a sterile loop (5.10), the surface of the following enrichment media so that well-isolated colonies are obtained: a) XLD agar (B.3); b) an additional selective medium (7.3.4). Invert the dishes so that the bottom is uppermost, and place them in the incubator (5.3) set at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h for the XLD agar. The manufacturer's instructions shall be followed for the second selective plating-out medium. 8.4.3 Plating from MKTTn broth After incubation at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h using the culture obtained, repeat the procedure specified in 8.4.2 with the two selective plating-out media. 8.5 Confirmation 8.5.1 General If shown to be reliable, commercially available identification kits for the biochemical examination of Salmonella may be used. Use these kits according to the manufacturer's instructions. 8.5.2 Selection of colonies for confirmation
For routine monitoring purposes, take, for confirmation, from each Petri dish of each selective medium (8.4), at least one discrete colony considered to be typical or presumptive Salmonella. If the first colony is not confirmed as Salmonella, then take a further four colonies. On XLD agar, typical Salmonella colonies usually have a black centre and a lightly transparent zone of reddish colour due to the colour change of the indicator. It is recommended that at least five colonies be identified for epidemiological studies. If on one dish there are fewer than five typical or suspect colonies, take all the typical or suspect colonies for confirmation. NOTE The recognition of Salmonella colonies is to a large extent a matter of experience and their appearance can vary somewhat, not only from serovar to serovar, but also from batch to batch of the selective medium used. Shigella, Providencia and H2S-negative Salmonella spp.(e.g. Salmonella Paratyphi A) appear as pink with a darker pink centre; lactose-positive Salmonella grown on XLD are yellow with or without blackening; Enterobacteriaceae e.g. Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, and Serratia appear as yellow, opaque colonies. SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) © ISO 2010 – All rights reserved
7 Streak the selected colonies on to the surface of pre-dried “non-selective” agar plates (e.g. nutrient agar, B.4) to allow the development of well-isolated colonies. Incubate the inoculated plates at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h. If the plating fails to produce distinct colonies, repeat in a manner which ensures that single discrete colonies are produced. Use single isolated colonies for biochemical and, if appropriate, serological confirmation. If biochemical kits are used for identification, follow the manufacturer's instructions. 8.5.3 Biochemical confirmation 8.5.3.1 General By means of an inoculating wire, inoculate the media specified in 8.5.3.2 to 8.5.3.4 with each of the cultures obtained from the colonies selected in 8.5.2.
8.5.3.2 TSI agar Streak the TSI agar (B.5) slant surface and stab the butt. Incubate at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h. Interpret the appearance of the medium as in Table 1. Table 1 — Interpretation of changes in medium Appearance Interpretation Butt Yellow (acid) Glucose positive (fermentation of glucose) Red or unchanged (alkaline) Glucose negative (no fermentation of carbohydrates) Black Formation of hydrogen sulfide Bubbles or cracks Gas formation from glucose Slant surface Yellow Lactose or sucrose positive (lactose or sucrose used) Red or unchanged (alkaline) Lactose and sucrose negative (neither lactose nor sucrose used) Typical Salmonella cultures show alkaline (red) slants, gas formation (bubbles) and acid (yellow) butts, with (in about 90 % of the cases) formation of hydrogen sulfide (blackening of the agar). When a lactose-positive Salmonella is isolated, the TSI slant is yellow. Thus, preliminary confirmation of Salmonella cultures shall not be based on the results of the TSI agar test only. 8.5.3.3 Urea agar Streak the urea agar (B.6) slant surface. Incubate at (36 ± 2) °C for up to 24 h and examine at intervals. lf the reaction is positive, hydrolysis of urea liberates ammonia, which changes the colour of phenol red to rose-pink and later to deep cerise. The reaction is often apparent after 2 h to 4 h. Typical Salmonella cultures show a negative reaction, i.e. no colour production. 8.5.3.4 L-Lysine decarboxylation medium Inoculate well below the surface of the liquid L-lysine decarboxylation medium (B.7). Incubate at (36 ± 2) °C for (24 ± 3) h. Typical Salmonella cultures show a purple colour after incubation. SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2011
ISO 19250:2010(E) 8
© ISO 2010 – All rights reserved 8.5.3.5 Interpretation of the biochemical tests Salmonella generally show the reactions given in Table 2.
Table 2 — Biochemical reactions of Salmonella Testa Subclause Reaction Salmonella strains showing the reaction %b TSI glucose (acid formation) 8.5.3.2 + 100,0 TSI glucose (gas formation) 8.5.3.2 + 91,9c TSI lactose 8.5.3.2 − 99,2d TSI sucrose 8.5.3.2 − 99,5 TSI hydrogen sulfide 8.5.3.2 + 91,6e Urea hydrolysis 8.5.3.3 − 99,0 L-Lysine decarboxylation 8.5.3.4 + 94,6f a See Reference [8]. b These figures indicate only that not all strains of Salmonella show the reactions marked + or −. They may vary between geographical areas and from water source to water source. c Salmonella Typhi is anaerogenic. d The Salmonella enterica subsp. arizonae gives positive or negative lactose reactions but is always β-galactosidase positive. The Salmonella enterica subsp. diarizonae gives a negative lactose reaction, but gives a positive β-galactosidase reaction. In addition, it is possible that these strains do not produce H2S. For the study of these strains, it can be useful to carry out complimentary biochemical tests (References [9][10]). e Acid formation is sometimes difficult to recognize due to strong blackening. f Salmonella Paratyphi A is negative.
The biochemical reactions in Table 3 are typical of Salmonella spp. Table 3 — Typical biochemical reactions of Salmonella spp. to tests Test Subclause Reaction TSI lactose 8.5.3.2 − TSI glucose 8.5.3.2 + TSI sucrose 8.5.3.2 − TSI hydrogen sulfide 8.5.3.2 + Urea splitting 8.5.3.3 − L-Lysine decarboxylase 8.5.3.4 + Isolates which only vary from the typical parameters listed in Table 3 by one or two reactions can still be Salmonella and should be further investigated and sent to a recognized reference laboratory for confirmation. 8.5.4 Serological confirmation and serotyping Isolates which are typical according to the biochemical reactions listed in Table 3 are presumptive Salmonella spp. and should, if need be, be investigated further by a reference laboratory. The presence of Salmonella O-, Vi-, and H-antigens is detected by slide agglutination as specified in ISO 6579 with the appropriate sera, from pure colonies (8.5.2) and after auto-agglutinating strains have been eliminated. Isolates which give positive serological reactions are confirmed as Salmonella spp. SIST ISO 19250:2011SIST ISO 19250:2
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 19250
Première édition
2010-07-15
Qualité de l'eau — Recherche
de Salmonella spp.
Water quality — Detection of Salmonella spp.
Numéro de référence
ISO 19250:2010(F)
©
ISO 2010
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2010
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2010 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes et définitions .2
4 Principe.2
4.1 Généralités .2
4.2 Préenrichissement sur milieu non sélectif liquide .2
4.3 Enrichissement sur milieux sélectifs liquides .3
4.4 Isolement et identification .3
4.5 Confirmation .3
5 Appareillage .3
6 Échantillonnage.4
7 Milieux de culture et réactifs .4
8 Mode opératoire.5
8.1 Préparation de l'échantillon .5
8.2 Préenrichissement non sélectif .5
8.3 Enrichissement sélectif .6
8.4 Isolement.6
8.5 Confirmation .6
9 Expression des résultats.9
10 Rapport d'essai.9
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .11
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et réactifs .12
Annexe C (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires.19
Bibliographie.24
© ISO 2010 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 19250 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4,
Méthodes microbiologiques.
Cette édition annule et remplace l'ISO 6340:1995, qui a fait l'objet d'une révision technique.
iv © ISO 2010 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
Introduction
Les Salmonella sont des bactéries qui sont largement répandues à travers le monde. Elles sont, en général,
considérées comme pathogènes bien que leur virulence et leur pouvoir pathogène varient énormément. Les
hôtes naturels des Salmonella sont la population humaine, le bétail, les animaux domestiques, ainsi que les
animaux sauvages, y compris les oiseaux. Êtres humains et animaux peuvent excréter des Salmonella tout en
étant des porteurs asymptomatiques, de même qu'en cas de maladie. Par conséquent, il est impossible de les
éliminer de l'environnement. Par infection des êtres humains, la transmission des Salmonella peut causer de
graves maladies.
Dans la mesure où l'eau est un vecteur d'infection reconnu, la présence ou l'absence de Salmonella est
contrôlée dans l'eau lorsque l'on considère qu'il existe un risque d'infection. Les Salmonella peuvent être
présentes dans les eaux usées agricoles et domestiques, les eaux douces, y compris les eaux destinées à la
consommation humaine et les eaux souterraines, ainsi que dans les eaux de mer.
La recherche de Salmonella dans l'eau requiert habituellement une étape de concentration. Dans la mesure
où les Salmonella peuvent être présentes en faible nombre et avoir subi une altération dans l'environnement
aqueux, leur recherche dans l'eau nécessite habituellement une étape de préenrichissement.
© ISO 2010 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 19250:2010(F)
Qualité de l'eau — Recherche de Salmonella spp.
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel d'effectuer
les essais de recherche de Salmonella, et plus particulièrement de S. enterica subsp. enterica ser.
Typhi (Salmonella ser. Typhi) et S. enterica subsp. enterica ser. Paratyphi (Salmonella ser. Paratyphi),
uniquement dans des laboratoires correctement équipés, sous la direction d'un microbiologiste
compétent, et de faire très attention à l'élimination de toutes les substances incubées.
Il convient que l'utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur d'établir
des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de s'assurer de la conformité à la
réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d'application
La présente Norme Internationale spécifie une méthode pour la recherche de Salmonella spp. (présomptives
ou confirmées) dans des échantillons d'eau. À des fins épidémiologiques ou au cours d'enquêtes sur des
épidémies, il peut être nécessaire d'utiliser d'autres milieux.
AVERTISSEMENT — Il est possible que cette méthode ne retrouve pas toutes les Salmonella ser.
Typhi et ser. Paratyphi.
NOTE Pour une approche semi-quantitative, la technique du nombre le plus probable (NPP) peut être mise en
œuvre en utilisant des volumes appropriés de l'échantillon. Dans ces cas, le volume d'eau peptonée tamponnée est ajusté
en conséquence.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont utiles pour l'application du présent document. Pour les références
datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de
référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6579:2002, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 7704, Qualité de l'eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses
microbiologiques
ISO 8199, Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
© ISO 2010 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Salmonella spp. présomptives
bactéries se développant dans le milieu d'enrichissement sélectif spécifié et formant des colonies typiques ou
atypiques sur les milieux sélectifs solides
3.2
Salmonella spp. confirmées
bactéries se développant dans le milieu d'enrichissement sélectif spécifié et formant des colonies typiques et
suspectes sur les milieux sélectifs solides et qui présentent des caractéristiques biochimiques et sérologiques
spécifiques
NOTE Les caractéristiques biochimiques et sérologiques sont déterminées par des essais spécifiés dans la présente
Norme Internationale.
3.3
recherche de Salmonella
mise en évidence de la présence ou de l'absence de Salmonella (3.4)
3.4
Salmonella spp.
Salmonella
micro-organismes formant des colonies typiques ou atypiques sur des milieux sélectifs solides et présentant
des caractéristiques biochimiques et sérologiques spécifiques
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Salmonella nécessite quatre phases successives (voir également l'Annexe A).
Un préenrichissement est souvent nécessaire pour permettre la recherche de Salmonella en nombre
relativement faible ou de Salmonella ayant subi une altération. Certaines Salmonella et celles ayant subi un
dommage sublétal peuvent nécessiter une période d'incubation supplémentaire (4.3). Par ailleurs, des
Salmonella peuvent être présentes en petit nombre et sont souvent accompagnées d'autres membres de la
famille des Enterobacteriaceae ou d'autres familles, en nombre largement plus important. Un enrichissement
sélectif est donc nécessaire.
4.2 Préenrichissement sur milieu non sélectif liquide
L'eau peptonée tamponnée (B.1) est ensemencée à température ambiante avec un volume connu de
l'échantillon ou de ses dilutions, puis incubée à (36 ± 2) °C pendant (18 ± 2) h. Des volumes plus importants
peuvent être concentrés par filtration sur membrane, après quoi la membrane filtrante est transférée dans
l'eau peptonée tamponnée.
NOTE Pour les eaux usées, il a été démontré que des périodes d'incubation plus courtes ou des ensemencements
directs de l'échantillon dans le milieu sélectif (4.3) donnent de meilleurs résultats.
Pour une approche semi-quantitative, la technique du NPP peut être mise en œuvre en utilisant des volumes
appropriés de l'échantillon. Dans ces cas, ajuster les volumes d'eau peptonée tamponnée en conséquence.
2 © ISO 2010 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
4.3 Enrichissement sur milieux sélectifs liquides
Un milieu Rappaport-Vassiliadis au soja (bouillon RVS) et un bouillon Muller-Kauffmann
tétrathionate-novobiocine (MKTTn) sont ensemencés avec la culture obtenue en 4.2.
Le bouillon RVS est incubé à (41,5 ± 1) °C pendant (24 ± 3) h et le bouillon MKTTn à (37 ± 1) °C pendant
(24 ± 3) h.
Pour détecter les Salmonella spp. à croissance lente, incuber le bouillon d'enrichissement pendant (24 ± 3) h
supplémentaires pour une période d'incubation totale de (48 ± 4) h à (41,5 ± 1,0) °C.
NOTE Les Salmonella Typhi et les Salmonella Paratyphi A ne sont généralement pas importantes pour le contrôle de
routine de la qualité de l'eau, mais peuvent être pertinentes pour des enquêtes épidémiologiques. Le bouillon MKTTn est
utilisé pour enrichissement avec une incubation à (36 ± 2) °C pendant une période maximale de (24 ± 3) h et récupère la
plupart des souches de Salmonella, y compris certaines souches de Salmonella Paratyphi, mais il n'est pas considéré
comme apte à récupérer les souches de Salmonella Paratyphi C. Le bouillon MKTTn n'est pas utilisé lorsque la présence
de Salmonella Typhi est suspectée après l'utilisation d'un bouillon sélénite cystine.
4.4 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.3, deux milieux sélectifs solides sont ensemencés:
a) gélose lysine xylose désoxycholate (gélose XLD);
b) tout autre milieu sélectif solide en complément de la gélose XLD et, s'il y a lieu, approprié à l'isolement de
souches de Salmonella lactose positives, de Salmonella Typhi et de Salmonella Paratyphi — le
laboratoire peut choisir le milieu à utiliser.
Incuber la gélose XLD à (36 ± 2) °C et examiner après (24 ± 3) h afin de détecter la présence de colonies
considérées comme Salmonella présomptives. Incuber le deuxième milieu de gélose sélectif conformément
aux recommandations du fabricant.
NOTE À titre informatif, il est possible d'utiliser de la gélose au vert brillant (BGA), de la gélose au sulfite de bismuth,
etc., comme deuxième milieu d'isolement.
4.5 Confirmation
Repiquer les colonies de Salmonella présomptives, puis isoler comme décrit en 4.4 et confirmer leur identité
en effectuant des essais biochimiques (8.5.3) et sérologiques (8.5.4) appropriés.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218), et en particulier, ce qui suit.
5.1 Généralités. Sauf pour la verrerie à usage unique qui est livrée stérile, stériliser la verrerie comme
spécifié dans l'ISO 8199. L'appareillage à usage unique est une solution acceptable au même titre que la
verrerie réutilisable, s'il répond à des spécifications appropriées.
5.2 Autoclave, pouvant être maintenu à (121 ± 3) °C et à (115 ± 3) °C.
5.3 Bain d'eau ou incubateur, pouvant être maintenu à (36 ± 2) °C.
5.4 Bain d'eau ou incubateur, pouvant être maintenu à (41,5 ± 1,0) °C.
5.5 Bains d'eau, pouvant fonctionner à (70 ± 1) °C et de 50 °C à 55 °C.
5.6 Appareil de filtration sur membrane, comme spécifié dans l'ISO 8199.
© ISO 2010 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
5.7 Membranes filtrantes stériles, avec un diamètre de pore nominal de 0,45 µm.
La qualité des membranes filtrantes peut varier en fonction de la marque et parfois même du lot. Il est donc
recommandé de vérifier régulièrement la qualité de ces membranes, comme spécifié dans l'ISO 7704.
5.8 pH-mètre, avec une exactitude d'étalonnage de ± 0,1 unité pH entre 20 °C et 25 °C.
5.9 Pinces stériles.
5.10 Anses stériles, diamètre d'environ 3 mm (volume de 10 µl) et aiguille ou fil d'ensemencement.
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Il convient
que les échantillons soient prélevés conformément à l'ISO 19458.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport ou de l'entreposage.
7 Milieux de culture et réactifs
NOTE Pour connaître les lignes directrices relatives à l'assurance qualité et aux essais de performance, voir
[2] [3]
l'ISO/TS 11133-1 et l'ISO/TS 11133-2 .
7.1 Substances de base. Dans un souci d'uniformité des résultats, utiliser soit des milieux complets
déshydratés, soit des composants de qualité uniforme et des réactifs de qualité analytique reconnue, pour la
préparation du milieu.
Des réactifs d'autres qualités peuvent être utilisés à condition qu'il ait été démontré qu'il donnent les mêmes
résultats.
[1]
7.2 Eau, ISO 3696 , qualité 3.
7.3 Milieux de culture, préparés conformément à l'Annexe B.
7.3.1 Eau peptonée tamponnée, milieu de préenrichissement non sélectif (EPT, B.1).
7.3.2 Bouillon Rappaport-Vassiliadis au soja (bouillon RVS, B.2), milieu d'enrichissement sélectif.
7.3.3 Gélose lysine xylose désoxycholate (gélose XLD, B.3).
7.3.4 Deuxième milieu d'isolement sélectif solide, dont le choix est laissé à la discrétion du laboratoire
d'essai. Suivre scrupuleusement les instructions du fabricant concernant la préparation pour utilisation.
7.3.5 Gélose nutritive (B.4), ou autre gélose non sélective appropriée.
7.3.6 Gélose ferrique aux trois sucres (gélose TSI, B.5).
De la gélose ferrique aux deux sucres peut être utilisée en variante.
7.3.7 Gélose à l'urée, Christensen (B.6).
7.3.8 Milieu de décarboxylation de la L-Iysine (B.7).
4 © ISO 2010 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
7.3.9 Bouillon sélénite cystine (B.8).
7.3.10 Bouillon Muller-Kauffmann tétrathionate-novobiocine (MKTTn, B.9).
7.3.11 Adjuvant de filtration (B.10).
8 Mode opératoire
Voir la Figure A.1.
8.1 Préparation de l'échantillon
Pour la préparation de l'échantillon, la filtration et l'ensemencement sur les milieux d'isolement, suivre les
instructions comme spécifié dans l'ISO 8199 et l'ISO 6887-1. Il est préférable de commencer l'examen
immédiatement après avoir prélevé les échantillons. Si les échantillons sont conservés à température
ambiante, commencer l'examen dans les 12 h suivant l'échantillonnage. Dans des cas exceptionnels, il est
permis de conserver les échantillons à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale de 24 h avant l'examen.
Le volume de l'échantillon à analyser dépend du type d'eau. Les volumes habituels pour l'eau de baignade et
l'eau potable se situent entre 1 000 ml et 5 000 ml. Pour les eaux de surface polluées et les eaux usées,
l'analyse se fait généralement sur des volumes inférieurs.
Si des dilutions de l'échantillon sont nécessaires (par exemple pour des échantillons d'eaux usées), préparer
ces dilutions comme spécifié dans l'ISO 8199.
8.2 Préenrichissement non sélectif
8.2.1 Préenrichissement non sélectif pour des volumes inférieurs à 10 ml
Ensemencer 50 ml d'EPT (B.1) à température ambiante avec l'échantillon ou ses dilutions et incuber à
(36 ± 2) °C pendant (18 ± 2) h.
8.2.2 Préenrichissement non sélectif pour des volumes supérieurs à 10 ml
Filtrer un volume d'eau approprié pour l'eau examinée.
Immerger la membrane filtrante dans 50 ml d'EPT (B.1).
Il est également possible d'ajouter l'échantillon au même volume d'EPT de concentration double.
Il faut toutefois noter que cette procédure n'est pas adaptée aux eaux minérales à forte teneur en sel, ni aux
eaux de mer.
Incuber les cultures à (36 ± 2) °C pendant (18 ± 2) h.
8.2.3 Recommandation pour les eaux turbides ou polluées
Pour les eaux turbides ou polluées, un adjuvant de filtration stérile (B.10) peut être ajouté et l'échantillon être
filtré à travers un tampon absorbant stérile agissant comme support au lieu d'utiliser la membrane.
© ISO 2010 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
Dans ce cas, filtrer une aliquote de l'adjuvant de filtration, généralement 15 ml, pour former une première
couche sur le tampon absorbant. Mélanger une deuxième aliquote, généralement 15 ml, avec le volume de
l'échantillon et filtrer. Pour les eaux turbides ou sales, des aliquotes supplémentaires peuvent être filtrées.
Une fois la filtration terminée, enlever l'entonnoir et transférer avec précaution le tampon absorbant et
l'adjuvant de filtration dans l'EPT (B.1). Si nécessaire, conserver un petit volume d'EPT pour rincer l'entonnoir
de manière à obtenir un volume final d'EPT de 100 ml. Incuber en vue de détecter une présence ou absence
ou procéder à une répartition selon une série de NPP pour obtenir un résultat semi-quantitatif.
8.3 Enrichissement sélectif
Laisser le (les) bouillon(s) d'enrichissement s'équilibrer à température ambiante s'il(s) étai(en)t conservé(s) à
une température inférieure. Transférer 0,1 ml de la culture obtenue en 8.2 dans un tube contenant 10 ml de
bouillon RVS (B.2). Lorsqu'un bouillon MKTTn (B.9) est également utilisé, transférer 1 ml de la culture
obtenue en 8.2 dans un tube contenant 10 ml de bouillon MKTTn.
Incuber le bouillon RVS ensemencé à (41,5 ± 1,0) °C pendant (24 ± 3) h et, si nécessaire (voir 4.3), pendant
(48 ± 4) h. Il convient de s'assurer que la température d'incubation maximale tolérée (42,5 °C) n'est pas
dépassée. Incuber le bouillon MKTTn ensemencé à (36 ± 2) °C pendant (24 ± 3) h.
NOTE Pour le bouillon RVS, la concentration en chlorure de magnésium et la température d'incubation ont été
optimisées afin d'assurer un bon rendement sans perte de sélectivité conformément à la Référence [5].
8.4 Isolement
8.4.1 Généralités
Laisser les boîtes de gélose XLD et le deuxième milieu d'isolement sélectif (voir l'ISO 6579:2002, 5.2.4.2)
s'équilibrer à température ambiante s'ils étaient conservés à une température inférieure. Si nécessaire, sécher
la surface des boîtes avant utilisation.
8.4.2 Isolement à partir du bouillon RVS
À l'aide de la culture obtenue dans le bouillon RVS, ensemencer la surface des milieux d'enrichissement
suivants après incubation pendant (24 ± 3) h et, si nécessaire (voir 4.3), pendant (48 ± 4) h, à l'aide d'une
anse stérile (5.10), de manière à obtenir des colonies bien isolées:
a) gélose XLD (B.3);
b) un milieu sélectif supplémentaire (7.3.4).
Retourner les boîtes de manière que la partie inférieure se retrouve en position supérieure et les placer dans
l'incubateur (5.3) à une température de (36 ± 2) °C pendant (24 ± 3) h pour la gélose XLD. Les instructions du
fabricant doivent être suivies pour le deuxième milieu d'isolement sélectif.
8.4.3 Isolement à partir du bouillon MKTTn
Après incubation à (36 ± 2) °C pendant (24 ± 3) h à l'aide de la culture obtenue, répéter le mode opératoire
spécifié en 8.4.2 avec les deux milieux d'isolement sélectifs.
8.5 Confirmation
8.5.1 Généralités
S'ils sont identifiés comme étant fiables, des kits d'identification disponibles dans le commerce peuvent être
utilisés pour l'examen biochimique des Salmonella. Utiliser ces kits conformément aux instructions du
fabricant.
6 © ISO 2010 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
8.5.2 Sélection des colonies pour confirmation
En vue d'un contrôle de routine, prélever, pour la confirmation, dans chaque boîte de Petri de chaque milieu
sélectif (8.4) au moins une colonie isolée considérée comme Salmonella typique ou présomptive. Si la
première colonie n'est pas classée comme Salmonella confirmée, prélever quatre autres colonies.
Sur la gélose XLD, les colonies de Salmonella typiques ont généralement un centre noir et une zone
rougeâtre légèrement transparente en raison du changement de couleur de l'indicateur. Il est recommandé
d'identifier au moins cinq colonies en cas d'études épidémiologiques. S'il y a moins de cinq colonies typiques
ou suspectes présentes sur une boîte, prélever pour la confirmation toutes les colonies typiques ou suspectes.
NOTE L'identification des colonies de Salmonella est, dans une large mesure, une question d'expérience; leur aspect
peut varier quelque peu, non seulement entre les différents sérotypes, mais également entre les différents lots de milieux
sélectifs utilisés. Les Shigella, Providencia et les Salmonella spp. H S-négatives (comme les Salmonella Paratyphi A)
2
apparaissent en rose avec un centre rose plus foncé; les Salmonella lactose positives ayant poussé sur la gélose XLD
sont jaunes avec des noircissements possibles; les Enterobacteriaceae comme les Escherichia coli, Enterobacter,
Klebsiella, Citrobacter, Proteus et Serratia apparaissent comme des colonies jaunes et opaques.
Ensemencer en stries les colonies sélectionnées sur la surface des boîtes de gélose «non sélective»
préalablement séchées (par exemple gélose nutritive, B.4) de manière à permettre le développement de
colonies bien isolées.
Incuber les boîtes ensemencées à (36 ± 2) °C pendant (24 ± 3) h.
Si l'isolement ne produit pas de colonies séparées, le répéter de façon à s'assurer que des colonies isolées
pures sont produites. Utiliser des colonies isolées pures pour la confirmation biochimique et, si nécessaire,
pour la confirmation sérologique. Si des kits biochimiques sont utilisés pour l'identification, suivre les
instructions du fabricant.
8.5.3 Confirmation biochimique
8.5.3.1 Généralités
Au moyen d'un fil droit, ensemencer les milieux spécifiés en 8.5.3.2 à 8.5.3.4 avec chacune des cultures
obtenues à partir des colonies sélectionnées en 8.5.2.
8.5.3.2 Gélose TSI
Ensemencer en stries la surface des tranches de gélose TSI (B.5) et piquer le culot. Incuber à (36 ± 2) °C
pendant (24 ± 3) h. Interpréter l'aspect du milieu comme indiqué dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Interprétation des changements observés dans le milieu
Aspect Interprétation
Culot
Jaune (acide) Réaction positive au glucose (fermentation du glucose)
Rouge ou inchangé (alcalin) Réaction négative au glucose (pas de fermentation de glucides)
Noir Formation de sulfure d'hydrogène
Bulles ou fissures Formation de gaz due au glucose
Surface des tranches
Jaune Réaction positive au lactose ou au saccharose (lactose ou saccharose utilisés)
Rouge ou inchangée (alcaline) Réaction négative au lactose et au saccharose (ni lactose ni saccharose utilisé)
© ISO 2010 – Tous droits réservés 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 19250:2010(F)
Les cultures de Salmonella typiques présentent une tranche alcaline (rouge), une formation de gaz (bulles) et
des culots acides (jaunes) avec une formation (dans 90 % des cas environ) de sulfure d'hydrogène
(noircissement de la gélose).
Lorsque des Salmonella lactose positives sont isolées, la tranche TSI est jaune. Ainsi, la confirmation
préliminaire des cultures de Salmonella ne doit pas être uniquement fondée sur les résultats de l'essai réalisé
sur la gélose TSI.
8.5.3.3 Gélose à l'urée
Ensemencer en stries la surface des tranches de gélose à l'urée (B.6). Incuber à (36 ± 2) °C pendant 24 h et
examiner à
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.