ISO 21766:2018

Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS

This document specifies a method for the quantification of four tobacco specific nitrosamines (TSNAs) in tobacco and the following tobacco products: cigarettes, cigars and smokeless tobacco products using reversed phase high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The TSNAs determined with this method are: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine (NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).

Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines spécifiques du tabac dans les produits du tabac — Méthode par CL-SM/SM

Le présent document spécifie une méthode de quantification de quatre nitrosamines spécifiques du tabac (TSNAs) dans le tabac et les produits du tabac suivants: cigarettes, cigares et produits du tabac sans fumée, par chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). Les TSNAs dosés par cette méthode sont: la N-nitrosonornicotine (NNN), la N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 20-Sep-2018
• Withdrawal Date: 20-Sep-2018
• ICS: 65.160 - Tobacco, tobacco products and related equipment
• Technical Committee: ISO/TC 126 - Tobacco and tobacco products
• Drafting Committee: ISO/TC 126 - Tobacco and tobacco products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Start Date: 03-Feb-2021
• Completion Date: 03-Feb-2021

Relations

• Revised: ISO 21766:2021 - Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS
• Effective Date: 18-Apr-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21766
First edition
2018-08
Tobacco and tobacco products —
Determination of tobacco-specific
nitrosamines in tobacco products —
Method using LC-MS/MS
Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines spécifiques du
tabac dans les produits du tabac — Méthode par CL-SM/SM
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Fax: [phone]
Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus . 2
7 Preparation . 3
7.1 Preparation of glassware. 3
7.2 Preparation of solutions . 3
7.2.1 Extraction solution, 100 mM ammonium acetate in water . 3
7.2.2 HPLC Mobile Phase A: Water, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C . 3
7.2.3 HPLC Mobile Phase B: 0,1 % acetic acid in methanol . 3
7.3 Preparation of standards. 3
7.3.1 General. 3
7.3.2 Preparation of internal standard solutions . 4
7.3.3 Preparation of calibration standard solutions . 4
8 Sampling . 5
8.1 General . 5
8.2 Sample preparation . 5
8.3 Sample extraction . 5
9 Sample analysis . 6
9.1 General . 6
9.2 Suggested HPLC parameters . 6
9.3 MS/MS parameters . 6
9.3.1 General. 6
9.3.2 Quantification and qualification transitions . 7
9.4 System suitability . 7
9.5 Calibration . 7
9.6 Calculation . 7
10 Repeatability and reproducibility . 8
11 Test report .11
Annex A (informative) Sample clean-up using solid phase extraction (SPE) .12
Annex B (informative) Examples of typical chromatograms .14
Bibliography .16
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 126, Tobacco and tobacco products.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
The Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco (CORESTA) Smokeless Tobacco Sub-
Group studied various widely-used procedures for the determination of tobacco specific nitrosamines
(TSNAs) in smokeless tobacco products. A study was conducted in 2009 that evaluated several different
methodologies. This study included both liquid chromatography tandem mass spectrometry methods
(LC-MS/MS) and gas chromatography combined with nitrogen chemiluminescence detection methods.
The results generated with a supplied LC-MS/MS method proved to be the most consistent and was
[7]
used as the basis for CORESTA Recommended Method N° 72 . Nine laboratories provided data using
this method. This study included nine commercial smokeless tobacco products covering eight different
product styles. CORESTA Recommended Method N° 72 was updated in 2016 to include repeatability
and reproducibility for the four CORESTA reference products.
CORESTA Recommended Method N° 72 was used as the basis for this document. However, the scope of
this document was broadened to include ground tobacco, cigarette fillers and cigar fillers in addition
to smokeless tobacco products. The respective values for repeatability (r) and reproducibility (R)
for ground tobacco, cigarette fillers and cigar fillers have been determined through an international
collaborative study that was conducted in 2017 and involved 18 laboratories.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21766:2018(E)
Tobacco and tobacco products — Determination of
tobacco-specific nitrosamines in tobacco products —
Method using LC-MS/MS
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all the safety problems associated with
its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and
health practices and determine the applicability of any other restrictions prior to use.
1 Scope
This document specifies a method for the quantification of four tobacco specific nitrosamines (TSNAs)
in tobacco and the following tobacco products: cigarettes, cigars and smokeless tobacco products using
reversed phase high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/
MS). The TSNAs determined with this method are: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine
(NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
tobacco specific nitrosamines
TSNAs
four nitrosamines found predominantly in tobacco: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine
(NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)
[SOURCE: ISO 22303:2008, 3.1]
4 Principle
Deuterium-labelled (d4) internal standards are added to the tobacco sample and subsequently extracted
with an aqueous buffer. The sample extracts are filtered and then analysed by reversed phase high
performance liquid chromatography (HPLC) and quantified by tandem mass spectrometry (MS/MS).
The amounts of TSNAs in the tobacco products are reported as ng/g, as is wet mass.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade during the analysis. Solvents shall be of HPLC-grade
or better.
5.1 Water, de-ionized, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C.
5.2 Acetonitrile, HPLC grade or better.
5.3 Methanol, HPLC grade or better.
5.4 Ammonium acetate, w ≥ 98 % (mass fraction).
5.5 Acetic acid, w ≥ 98 %.
5.6 N-Nitrosoanabasine, (NAB, CAS-No: 1133-64-8), w ≥ 98 %.
5.7 N-Nitrosoanatabine, (NAT, CAS-No: 71267-22-6), w ≥ 98 %.
5.8 4-(N-Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, (NNK, CAS-No: 64091-91-4), w ≥ 98 %.
5.9 N-Nitrosonornicotine, (NNN, CAS-No
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21766
First edition
2018-08
Tobacco and tobacco products —
Determination of tobacco-specific
nitrosamines in tobacco products —
Method using LC-MS/MS
Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines spécifiques du
tabac dans les produits du tabac — Méthode par CL-SM/SM
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Fax: [phone]
Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus . 2
7 Preparation . 3
7.1 Preparation of glassware. 3
7.2 Preparation of solutions . 3
7.2.1 Extraction solution, 100 mM ammonium acetate in water . 3
7.2.2 HPLC Mobile Phase A: Water, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C . 3
7.2.3 HPLC Mobile Phase B: 0,1 % acetic acid in methanol . 3
7.3 Preparation of standards. 3
7.3.1 General. 3
7.3.2 Preparation of internal standard solutions . 4
7.3.3 Preparation of calibration standard solutions . 4
8 Sampling . 5
8.1 General . 5
8.2 Sample preparation . 5
8.3 Sample extraction . 5
9 Sample analysis . 6
9.1 General . 6
9.2 Suggested HPLC parameters . 6
9.3 MS/MS parameters . 6
9.3.1 General. 6
9.3.2 Quantification and qualification transitions . 7
9.4 System suitability . 7
9.5 Calibration . 7
9.6 Calculation . 7
10 Repeatability and reproducibility . 8
11 Test report .11
Annex A (informative) Sample clean-up using solid phase extraction (SPE) .12
Annex B (informative) Examples of typical chromatograms .14
Bibliography .16
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 126, Tobacco and tobacco products.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
The Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco (CORESTA) Smokeless Tobacco Sub-
Group studied various widely-used procedures for the determination of tobacco specific nitrosamines
(TSNAs) in smokeless tobacco products. A study was conducted in 2009 that evaluated several different
methodologies. This study included both liquid chromatography tandem mass spectrometry methods
(LC-MS/MS) and gas chromatography combined with nitrogen chemiluminescence detection methods.
The results generated with a supplied LC-MS/MS method proved to be the most consistent and was
[7]
used as the basis for CORESTA Recommended Method N° 72 . Nine laboratories provided data using
this method. This study included nine commercial smokeless tobacco products covering eight different
product styles. CORESTA Recommended Method N° 72 was updated in 2016 to include repeatability
and reproducibility for the four CORESTA reference products.
CORESTA Recommended Method N° 72 was used as the basis for this document. However, the scope of
this document was broadened to include ground tobacco, cigarette fillers and cigar fillers in addition
to smokeless tobacco products. The respective values for repeatability (r) and reproducibility (R)
for ground tobacco, cigarette fillers and cigar fillers have been determined through an international
collaborative study that was conducted in 2017 and involved 18 laboratories.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21766:2018(E)
Tobacco and tobacco products — Determination of
tobacco-specific nitrosamines in tobacco products —
Method using LC-MS/MS
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all the safety problems associated with
its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and
health practices and determine the applicability of any other restrictions prior to use.
1 Scope
This document specifies a method for the quantification of four tobacco specific nitrosamines (TSNAs)
in tobacco and the following tobacco products: cigarettes, cigars and smokeless tobacco products using
reversed phase high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/
MS). The TSNAs determined with this method are: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine
(NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
tobacco specific nitrosamines
TSNAs
four nitrosamines found predominantly in tobacco: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine
(NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)
[SOURCE: ISO 22303:2008, 3.1]
4 Principle
Deuterium-labelled (d4) internal standards are added to the tobacco sample and subsequently extracted
with an aqueous buffer. The sample extracts are filtered and then analysed by reversed phase high
performance liquid chromatography (HPLC) and quantified by tandem mass spectrometry (MS/MS).
The amounts of TSNAs in the tobacco products are reported as ng/g, as is wet mass.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade during the analysis. Solvents shall be of HPLC-grade
or better.
5.1 Water, de-ionized, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C.
5.2 Acetonitrile, HPLC grade or better.
5.3 Methanol, HPLC grade or better.
5.4 Ammonium acetate, w ≥ 98 % (mass fraction).
5.5 Acetic acid, w ≥ 98 %.
5.6 N-Nitrosoanabasine, (NAB, CAS-No: 1133-64-8), w ≥ 98 %.
5.7 N-Nitrosoanatabine, (NAT, CAS-No: 71267-22-6), w ≥ 98 %.
5.8 4-(N-Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, (NNK, CAS-No: 64091-91-4), w ≥ 98 %.
5.9 N-Nitrosonornicotine, (NNN, CAS-No
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21766
Première édition
2018-08
Tabac et produits du tabac — Dosage
des nitrosamines spécifiques du tabac
dans les produits du tabac — Méthode
par CL-SM/SM
Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific
nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS
Numéro de référence
©
ISO 2018
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2018
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
Fax: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 2
7 Préparation . 3
7.1 Préparation de la verrerie . 3
7.2 Préparation des solutions . 3
7.3 Préparations des étalons . 4
7.3.1 Généralités . 4
7.3.2 Préparation des solutions d’étalons internes . 4
7.3.3 Préparation des solutions d’étalonnage . 4
8 Échantillonnage . 5
8.1 Généralités . 5
8.2 Préparation des échantillons . 5
8.3 Extraction de l’échantillon . 6
9 Analyse des échantillons . 6
9.1 Généralités . 6
9.2 Paramètres CLHP suggérés . 6
9.3 Paramètres SM/SM . 7
9.3.1 Généralités . 7
9.3.2 Transitions de quantification et de qualification . 7
9.4 Adéquation du système . 8
9.5 Étalonnage . 8
9.6 Calcul . 8
10 Répétabilité et reproductibilité . 9
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Nettoyage de l'échantillon par extraction en phase solide (SPE) .13
Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes types .15
Bibliographie .17
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 126, Tabac et produits du tabac.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés

Introduction
Le sous-groupe «Tabac sans fumée» du CORESTA (Centre de Coopération pour les Recherches
Scientifiques Relatives au Tabac) a étudié divers modes opératoires largement employés pour le dosage
des nitrosamines spécifiques du tabac (TSNAs) dans les produits du tabac sans fumée. Une étude
évaluant plusieurs méthodologies différentes a été menée en 2009. Elle incluait à la fois des méthodes
par chromatographie liquide avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM) et des
méthodes par chromatographie en phase gazeuse couplée à la détection d'azote par chimiluminescence.
Les résultats produits avec la méthode CL-SM/SM se sont révélés être les plus cohérents et ils ont été
[7]
utilisés comme base pour la méthode recommandée CORESTA N° 72 . Neuf laboratoires ont fourni
des données obtenues avec cette méthode. Cette étude incluait neuf produits du tabac sans fumée du
commerce, couvrant huit types de produits différents. La méthode recommandée CORESTA N° 72 a été
actualisée en 2016 pour inclure la répétabilité et la reproductibilité des quatre produits de référence du
CORESTA.
La méthode recommandée CORESTA N° 72 a servi de base pour l’élaboration du présent document.
Cependant, le domaine d’application du présent document a été élargi pour inclure le tabac broyé, les
éléments de remplissage de la colonne tabac des cigarettes et les éléments de remplissage des cigares en
plus des produits du tabac sans fumée. Les valeurs respectives de répétabilité (r) et de reproductibilité
(R) pour le tabac broyé, les éléments de remplissage de la colonne tabac des cigarettes et les éléments
de remplissage des cigares ont été déterminées via une étude collaborative internationale menée en
2017 et impliquant 18 laboratoires.
NORME INTERNATIONALE ISO 21766:2018(F)
Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines
spécifiques du tabac dans les produits du tabac — Méthode
par CL-SM/SM
AVERTISSEMENT — L’utilisation du présent document peut impliquer des réactifs, manipulations
ou matériels dangereux. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les problèmes de
sécurité qui sont liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du présent document d’établir
des pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées et déterminer l’applicabilité de toute autre
restrictions avant son utilisation.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de quantification de quatre nitrosamines spécifiques
du tabac (TSNAs) dans le tabac et les produits du tabac suivants: cigarettes, cigares et produits du
tabac sans fumée, par chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec détection
par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). Les TSNAs dosés par cette méthode sont:
la N-nitrosonornicotine (NNN), la N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la
4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de navigation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
nitrosamines spécifiques du tabac
TSNAs
les quatre nitrosamines prédominantes dans le tabac: la N-nitrosonornicotine (NNN), la
N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-
butanone (NNK)
[SOURCE: ISO 22303:2008, 3.1]
4 Principe
Des étalons internes marqués au deutérium (d4) sont ajoutés à l'échantillon de tabac, puis extraits avec
un tampon aqueux. Les extraits d’échantillons sont filtrés, puis analysés par chromatographie liquide
haute performance (CLHP) en phase inverse et quantifiés par spectrométrie de masse en tandem (SM/
SM). Les quantités de TSNAs dans les produits du tabac sont reportées en ng/g, en l’état, sur la base de
la masse humide.
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21766
Première édition
2018-08
Tabac et produits du tabac — Dosage
des nitrosamines spécifiques du tabac
dans les produits du tabac — Méthode
par CL-SM/SM
Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific
nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS
Numéro de référence
©
ISO 2018
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2018
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 2
7 Préparation . 3
7.1 Préparation de la verrerie . 3
7.2 Préparation des solutions . 3
7.3 Préparations des étalons . 4
7.3.1 Généralités . 4
7.3.2 Préparation des solutions d’étalons internes . 4
7.3.3 Préparation des solutions d’étalonnage . 4
8 Échantillonnage . 5
8.1 Généralités . 5
8.2 Préparation des échantillons . 5
8.3 Extraction de l’échantillon . 6
9 Analyse des échantillons . 6
9.1 Généralités . 6
9.2 Paramètres CLHP suggérés . 6
9.3 Paramètres SM/SM . 7
9.3.1 Généralités . 7
9.3.2 Transitions de quantification et de qualification . 7
9.4 Adéquation du système . 8
9.5 Étalonnage . 8
9.6 Calcul . 8
10 Répétabilité et reproductibilité . 9
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Nettoyage de l'échantillon par extraction en phase solide (SPE) .13
Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes types .15
Bibliographie .17
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 126, Tabac et produits du tabac.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés

Introduction
Le sous-groupe «Tabac sans fumée» du CORESTA (Centre de Coopération pour les Recherches
Scientifiques Relatives au Tabac) a étudié divers modes opératoires largement employés pour le dosage
des nitrosamines spécifiques du tabac (TSNAs) dans les produits du tabac sans fumée. Une étude
évaluant plusieurs méthodologies différentes a été menée en 2009. Elle incluait à la fois des méthodes
par chromatographie liquide avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM) et des
méthodes par chromatographie en phase gazeuse couplée à la détection d'azote par chimiluminescence.
Les résultats produits avec la méthode CL-SM/SM se sont révélés être les plus cohérents et ils ont été
[7]
utilisés comme base pour la méthode recommandée CORESTA N° 72 . Neuf laboratoires ont fourni
des données obtenues avec cette méthode. Cette étude incluait neuf produits du tabac sans fumée du
commerce, couvrant huit types de produits différents. La méthode recommandée CORESTA N° 72 a été
actualisée en 2016 pour inclure la répétabilité et la reproductibilité des quatre produits de référence du
CORESTA.
La méthode recommandée CORESTA N° 72 a servi de base pour l’élaboration du présent document.
Cependant, le domaine d’application du présent document a été élargi pour inclure le tabac broyé, les
éléments de remplissage de la colonne tabac des cigarettes et les éléments de remplissage des cigares en
plus des produits du tabac sans fumée. Les valeurs respectives de répétabilité (r) et de reproductibilité
(R) pour le tabac broyé, les éléments de remplissage de la colonne tabac des cigarettes et les éléments
de remplissage des cigares ont été déterminées via une étude collaborative internationale menée en
2017 et impliquant 18 laboratoires.
NORME INTERNATIONALE ISO 21766:2018(F)
Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines
spécifiques du tabac dans les produits du tabac — Méthode
par CL-SM/SM
AVERTISSEMENT — L’utilisation du présent document peut impliquer des réactifs, manipulations
ou matériels dangereux. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les problèmes de
sécurité qui sont liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du présent document d’établir
des pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées et déterminer l’applicabilité de toute autre
restrictions avant son utilisation.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de quantification de quatre nitrosamines spécifiques
du tabac (TSNAs) dans le tabac et les produits du tabac suivants: cigarettes, cigares et produits du
tabac sans fumée, par chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec détection
par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). Les TSNAs dosés par cette méthode sont:
la N-nitrosonornicotine (NNN), la N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la
4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de navigation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
nitrosamines spécifiques du tabac
TSNAs
les quatre nitrosamines prédominantes dans le tabac: la N-nitrosonornicotine (NNN), la
N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-
butanone (NNK)
[SOURCE: ISO 22303:2008, 3.1]
4 Principe
Des étalons internes marqués au deutérium (d4) sont ajoutés à l'échantillon de tabac, puis extraits avec
un tampon aqueux. Les extraits d’échantillons sont filtrés, puis analysés par chromatographie liquide
haute performance (CLHP) en phase inverse et quantifiés par spectrométrie de masse en tandem (SM/
SM). Les quantités de TSNAs dans les produits du tabac sont reportées en ng/g, en l’état, sur la base de
la masse humide.
...