ISO 21766:2018

Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS

This document specifies a method for the quantification of four tobacco specific nitrosamines (TSNAs) in tobacco and the following tobacco products: cigarettes, cigars and smokeless tobacco products using reversed phase high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The TSNAs determined with this method are: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine (NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).

Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines spécifiques du tabac dans les produits du tabac — Méthode par CL-SM/SM

Le présent document spécifie une méthode de quantification de quatre nitrosamines spécifiques du tabac (TSNAs) dans le tabac et les produits du tabac suivants: cigarettes, cigares et produits du tabac sans fumée, par chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). Les TSNAs dosés par cette méthode sont: la N-nitrosonornicotine (NNN), la N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 20-Sep-2018
• Withdrawal Date: 20-Sep-2018
• ICS: 65.160 - Tobacco, tobacco products and related equipment
• Technical Committee: ISO/TC 126 - Tobacco and tobacco products
• Drafting Committee: ISO/TC 126 - Tobacco and tobacco products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 03-Feb-2021

Relations

• Revised: ISO 21766:2021 - Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS
• Effective Date: 18-Apr-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21766
First edition
2018-08
Tobacco and tobacco products —
Determination of tobacco-specific
nitrosamines in tobacco products —
Method using LC-MS/MS
Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines spécifiques du
tabac dans les produits du tabac — Méthode par CL-SM/SM
Reference number
ISO 21766:2018(E)
©
ISO 2018

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ISO 21766:2018(E)

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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Fax: [phone]
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus . 2
7 Preparation . 3
7.1 Preparation of glassware. 3
7.2 Preparation of solutions . 3
7.2.1 Extraction solution, 100 mM ammonium acetate in water . 3
7.2.2 HPLC Mobile Phase A: Water, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C . 3
7.2.3 HPLC Mobile Phase B: 0,1 % acetic acid in methanol . 3
7.3 Preparation of standards. 3
7.3.1 General. 3
7.3.2 Preparation of internal standard solutions . 4
7.3.3 Preparation of calibration standard solutions . 4
8 Sampling . 5
8.1 General . 5
8.2 Sample preparation . 5
8.3 Sample extraction . 5
9 Sample analysis . 6
9.1 General . 6
9.2 Suggested HPLC parameters . 6
9.3 MS/MS parameters . 6
9.3.1 General. 6
9.3.2 Quantification and qualification transitions . 7
9.4 System suitability . 7
9.5 Calibration . 7
9.6 Calculation . 7
10 Repeatability and reproducibility . 8
11 Test report .11
Annex A (informative) Sample clean-up using solid phase extraction (SPE) .12
Annex B (informative) Examples of typical chromatograms .14
Bibliography .16
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ISO 21766:2018(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 126, Tobacco and tobacco products.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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Introduction
The Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco (CORESTA) Smokeless Tobacco Sub-
Group studied various widely-used procedures for the determination of tobacco specific nitrosamines
(TSNAs) in smokeless tobacco products. A study was conducted in 2009 that evaluated several different
methodologies. This study included both liquid chromatography tandem mass spectrometry methods
(LC-MS/MS) and gas chromatography combined with nitrogen chemiluminescence detection methods.
The results generated with a supplied LC-MS/MS method proved to be the most consistent and was
[7]
used as the basis for CORESTA Recommended Method N° 72 . Nine laboratories provided data using
this method. This study included nine commercial smokeless tobacco products covering eight different
product styles. CORESTA Recommended Method N° 72 was updated in 2016 to include repeatability
and reproducibility for the four CORESTA reference products.
CORESTA Recommended Method N° 72 was used as the basis for this document. However, the scope of
this document was broadened to include ground tobacco, cigarette fillers and cigar fillers in addition
to smokeless tobacco products. The respective values for repeatability (r) and reproducibility (R)
for ground tobacco, cigarette fillers and cigar fillers have been determined through an international
collaborative study that was conducted in 2017 and involved 18 laboratories.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21766:2018(E)
Tobacco and tobacco products — Determination of
tobacco-specific nitrosamines in tobacco products —
Method using LC-MS/MS
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all the safety problems associated with
its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and
health practices and determine the applicability of any other restrictions prior to use.
1 Scope
This document specifies a method for the quantification of four tobacco specific nitrosamines (TSNAs)
in tobacco and the following tobacco products: cigarettes, cigars and smokeless tobacco products using
reversed phase high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/
MS). The TSNAs determined with this method are: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine
(NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
tobacco specific nitrosamines
TSNAs
four nitrosamines found predominantly in tobacco: N-nitrosonornicotine (NNN), N-nitrosoanatabine
(NAT), N-nitrosoanabasine (NAB) and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)
[SOURCE: ISO 22303:2008, 3.1]
4 Principle
Deuterium-labelled (d4) internal standards are added to the tobacco sample and subsequently extracted
with an aqueous buffer. The sample extracts are filtered and then analysed by reversed phase high
performance liquid chromatography (HPLC) and quantified by tandem mass spectrometry (MS/MS).
The amounts of TSNAs in the tobacco products are reported as ng/g, as is wet mass.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade during the analysis. Solvents shall be of HPLC-grade
or better.
5.1 Water, de-ionized, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C.
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5.2 Acetonitrile, HPLC grade or better.
5.3 Methanol, HPLC grade or better.
5.4 Ammonium acetate, w ≥ 98 % (mass fraction).
5.5 Acetic acid, w ≥ 98 %.
5.6 N-Nitrosoanabasine, (NAB, CAS-No: 1133-64-8), w ≥ 98 %.
5.7 N-Nitrosoanatabine, (NAT, CAS-No: 71267-22-6), w ≥ 98 %.
5.8 4-(N-Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, (NNK, CAS-No: 64091-91-4), w ≥ 98 %.
5.9 N-Nitrosonornicotine, (NNN, CAS-No: 80508-23-2), w ≥ 98 %.
5.10 N-Nitrosoanabasine – Deuterated, (NAB-d4, CAS-No: 1020719-68-9), w ≥ 98 %, isotopic purity
w ≥ 99 %.
5.11 N-Nitrosoanatabine – Deuterated, (NAT-d4, CAS-No: 1020719-69-0), w ≥ 98 %, isotopic purity
w ≥ 99 %.
5.12 4-(N-Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone-Deuterated, (NNK-d4, CAS-No: 76661-
24-7), w ≥ 98 %, isotopic purity w ≥ 99 %.
5.13 N-Nitrosonornicotine – Deuterated, (NNN-d4, CAS-No: 66148-19-4), w ≥ 98 %, isotopic purity
w ≥ 99 %.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and supplies, and in particular the following items. All glassware shall be
cleaned before use to avoid any contamination.
6.1 High performance liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS/MS) with
electrospray ion source (ESI), consisting of the following.
6.1.1 Binary pump.
6.1.2 Autosampler.
6.1.3 Column oven.
6.1.4 Data collection system.
1)
6.2 HPLC column: reversed-phase C18 , 2,5 μm particle size, 2,1 mm × 50 mm, or equivalent.
6.3 Orbital shaker, wrist action shaker, or similar.
1) Waters XTerra® MS C18, 2,5 μm, 2,1 × 50 mm has been shown to be a suitable column. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equivalent columns may be used if they can be shown to lead to the same results, i.e. that the analytes and internal
standards are sufficiently resolved from interferences.
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6.4 Autosampler vials.
6.5 Disposable syringes, of appropriate size for filtering samples.
6.6 Syringe filter, of diameter 25 mm and pore size 0,45 μm, made of polytetrafluoroethylene (PTFE)
or equivalent.
NOTE Various filter materials were evaluated during the collaborative study and PTFE had the highest
recovery from those verified.
Other filter materials may also be suitable, however, they should be evaluated before routine use.
6.7 Extraction containers, glass, of capacity 50 ml to 100 ml.
6.8 Amber volumetric flasks, class A, in a range of sizes.
6.9 Glass volumetric pipettes, class A, and/or positive-displacement pipettes, in a range of sizes.
6.10 Analytical balance, capable of measuring to at least four decimal places (gram).
7 Preparation
7.1 Preparation of glassware
Glassware shall be cleaned and dried in such a manner to ensure that contamination does not occur.
It is important that all possible sources of contamination which may interfere with the analytical
process are removed from the work area.
Standard solutions and sample extracts shall be protected from light.
7.2 Preparation of solutions
7.2.1 Extraction solution, 100 mM ammonium acetate in water
Weigh 15,4 g ± 0,05 g of ammonium acetate. Quantitatively transfer into a 2 000 ml volumetric flask and
dilute to the mark with de-ionized water.
7.2.2 HPLC Mobile Phase A: Water, resistivity ≥ 18,2 MΩ·cm at 25 °C
7.2.3 HPLC Mobile Phase B: 0,1 % acetic acid in methanol
Add 1 ml of acetic acid into a 1 000 ml volumetric flask and dilute to the mark with methanol.
Stability studies should be performed by the laboratory to determine the shelf life of these solutions.
7.3 Preparation of standards
7.3.1 General
All standard solutions shall be prepared in amber, or light protected glassware and stored at about
−20 °C, except the calibration standards which shall be stored in a refrigerator. Produce a series of
calibration standards to cover the range of expected results to be found in the test samples, as in 7.3.3.4.
Determine the shelf-life of the standard and internal standard solutions.
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7.3.2 Preparation of internal standard solutions
7.3.2.1 Stock solution
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 10 mg each of NNN-d4, NAT-d4, NAB-d4 and NNK-d4.
Quantitatively transfer into individual 10 ml volumetric flasks and dilute each flask to the mark with
acetonitrile and mix well. The concentration in each solution is approximately 1 000 μg/ml.
7.3.2.2 Combined secondary internal standard solution
Transfer 4,00 ml of each of the four internal standard stock solutions into a 100 ml volumetric flask and
dilute to volume with acetonitrile. Mix well. The concentration is approximately 40 µg/ml of NNN-d4,
NNK-d4, NAT-d4 and NAB-d4.
7.3.2.3 Internal standard spiking solution
Transfer 5,00 ml of mixed internal standard solution into a 100 ml volumetric flask and dilute to volume
with acetonitrile. Mix well. The concentration is approximately 2 000 ng/ml of NNN-d4, NNK-d4, NAT-d4
and NAB-d4.
7.3.3 Preparation of calibration standard solutions
7.3.3.1 Stock solution
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 10 mg each of NNN, NAT, NAB and NNK. Quantitatively
transfer into individual 10 ml volumetric flasks and dilute each flask to the mark with acetonitrile and
mix well. The concentration in each solution is approximately 1 000 μg/ml.
7.3.3.2 Mixed TSNA standard solution (I)
Transfer 4,00 ml of each of the three TSNA stock solutions NNN, NNK, NAT and 1,00 ml of the TSNA
stock solution NAB into a 100 ml volumetric flask and dilute to volume with acetonitrile. Mix well. The
concentration will be approximately 40 µg/ml of NNN, NNK, NAT and 10 µg/ml of NAB.
7.3.3.3 Mixed TSNA standard solution (II)
Transfer 2,50 ml of the mixed TSNA standard solution (I) into a 250 ml volumetric flask and dilute to
volume with acetonitrile/de-ionized water (30 %/70 %). Mix well. The concentration of NNN, NNK and
NAT will be approximately 400 ng/ml, and the concentration of NAB will be approximately 100 ng/ml.
7.3.3.4 TSNA calibration standards
Prepare seven working standard solutions that cover the concentration range of interest. Table 1
provides an example of calibration standard preparation.
The TSNA calibration standards are prepared in seven separate 100 ml volumetric flasks, each
containing 10 ml of 100 mM ammonium acetate solution. Transfer 1,00 ml of the internal standard
spiking solution (2 000 ng/ml) to each of the seven volumetric flasks. Next, add the appropriate volume
of the mixed TSNA standard solution (II), given in Table 1. Then add the volume of acetonitrile, given in
Table 1. Finally, dilute each of the seven flasks to volume with 100 mM ammonium acetate and mix well.
Calculate the exact concentrations for each standard and record.
NOTE Stock solutions of the individual TSNAs and deuterated internal standards in acetonitrile can be
purchased at the required levels.
4 © ISO 2018 – All rights reserved

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NORME ISO
INTERNATIONALE 21766
Première édition
2018-08
Tabac et produits du tabac — Dosage
des nitrosamines spécifiques du tabac
dans les produits du tabac — Méthode
par CL-SM/SM
Tobacco and tobacco products — Determination of tobacco-specific
nitrosamines in tobacco products — Method using LC-MS/MS
Numéro de référence
ISO 21766:2018(F)
©
ISO 2018

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ISO 21766:2018(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2018
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
Fax: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés

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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 2
7 Préparation . 3
7.1 Préparation de la verrerie . 3
7.2 Préparation des solutions . 3
7.3 Préparations des étalons . 4
7.3.1 Généralités . 4
7.3.2 Préparation des solutions d’étalons internes . 4
7.3.3 Préparation des solutions d’étalonnage . 4
8 Échantillonnage . 5
8.1 Généralités . 5
8.2 Préparation des échantillons . 5
8.3 Extraction de l’échantillon . 6
9 Analyse des échantillons . 6
9.1 Généralités . 6
9.2 Paramètres CLHP suggérés . 6
9.3 Paramètres SM/SM . 7
9.3.1 Généralités . 7
9.3.2 Transitions de quantification et de qualification . 7
9.4 Adéquation du système . 8
9.5 Étalonnage . 8
9.6 Calcul . 8
10 Répétabilité et reproductibilité . 9
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Nettoyage de l'échantillon par extraction en phase solide (SPE) .13
Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes types .15
Bibliographie .17
© ISO 2018 – Tous droits réservés iii

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ISO 21766:2018(F)

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 126, Tabac et produits du tabac.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés

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ISO 21766:2018(F)

Introduction
Le sous-groupe «Tabac sans fumée» du CORESTA (Centre de Coopération pour les Recherches
Scientifiques Relatives au Tabac) a étudié divers modes opératoires largement employés pour le dosage
des nitrosamines spécifiques du tabac (TSNAs) dans les produits du tabac sans fumée. Une étude
évaluant plusieurs méthodologies différentes a été menée en 2009. Elle incluait à la fois des méthodes
par chromatographie liquide avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM) et des
méthodes par chromatographie en phase gazeuse couplée à la détection d'azote par chimiluminescence.
Les résultats produits avec la méthode CL-SM/SM se sont révélés être les plus cohérents et ils ont été
[7]
utilisés comme base pour la méthode recommandée CORESTA N° 72 . Neuf laboratoires ont fourni
des données obtenues avec cette méthode. Cette étude incluait neuf produits du tabac sans fumée du
commerce, couvrant huit types de produits différents. La méthode recommandée CORESTA N° 72 a été
actualisée en 2016 pour inclure la répétabilité et la reproductibilité des quatre produits de référence du
CORESTA.
La méthode recommandée CORESTA N° 72 a servi de base pour l’élaboration du présent document.
Cependant, le domaine d’application du présent document a été élargi pour inclure le tabac broyé, les
éléments de remplissage de la colonne tabac des cigarettes et les éléments de remplissage des cigares en
plus des produits du tabac sans fumée. Les valeurs respectives de répétabilité (r) et de reproductibilité
(R) pour le tabac broyé, les éléments de remplissage de la colonne tabac des cigarettes et les éléments
de remplissage des cigares ont été déterminées via une étude collaborative internationale menée en
2017 et impliquant 18 laboratoires.
© ISO 2018 – Tous droits réservés v

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NORME INTERNATIONALE ISO 21766:2018(F)
Tabac et produits du tabac — Dosage des nitrosamines
spécifiques du tabac dans les produits du tabac — Méthode
par CL-SM/SM
AVERTISSEMENT — L’utilisation du présent document peut impliquer des réactifs, manipulations
ou matériels dangereux. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les problèmes de
sécurité qui sont liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du présent document d’établir
des pratiques d’hygiène et de sécurité appropriées et déterminer l’applicabilité de toute autre
restrictions avant son utilisation.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de quantification de quatre nitrosamines spécifiques
du tabac (TSNAs) dans le tabac et les produits du tabac suivants: cigarettes, cigares et produits du
tabac sans fumée, par chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec détection
par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). Les TSNAs dosés par cette méthode sont:
la N-nitrosonornicotine (NNN), la N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la
4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de navigation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
nitrosamines spécifiques du tabac
TSNAs
les quatre nitrosamines prédominantes dans le tabac: la N-nitrosonornicotine (NNN), la
N-nitrosoanatabine (NAT), la N-nitrosoanabasine (NAB) et la 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-
butanone (NNK)
[SOURCE: ISO 22303:2008, 3.1]
4 Principe
Des étalons internes marqués au deutérium (d4) sont ajoutés à l'échantillon de tabac, puis extraits avec
un tampon aqueux. Les extraits d’échantillons sont filtrés, puis analysés par chromatographie liquide
haute performance (CLHP) en phase inverse et quantifiés par spectrométrie de masse en tandem (SM/
SM). Les quantités de TSNAs dans les produits du tabac sont reportées en ng/g, en l’état, sur la base de
la masse humide.
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ISO 21766:2018(F)

5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue pendant l’analyse. Les solvants doivent
être de qualité pour CLHP ou supérieure.
5.1 Eau, déionisée, résistivité ≥ 18,2 MΩ·cm à 25 °C.
5.2 Acétonitrile, de qualité pour CLHP ou supérieure.
5.3 Méthanol, de qualité pour CLHP ou supérieure.
5.4 Acétate d'ammonium, w ≥ 98 % (fraction massique).
5.5 Acide acétique, w ≥ 98 %.
5.6 N-Nitrosoanabasine, (NAB, n° CAS: 1133-64-8), w ≥ 98 %.
5.7 N-Nitrosoanatabine, (NAT, n° CAS: 71267-22-6), w ≥ 98 %.
5.8 4-(N-méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, (NNK, n° CAS: 64091-91-4), w ≥ 98 %.
5.9 N-Nitrosonornicotine, (NNN, n° CAS: 80508-23-2), w ≥ 98 %.
5.10 N-Nitrosoanabasine – deutérée, (NAB-d4, n° CAS: 1020719-68-9), w ≥ 98 %, d’une pureté
isotopique w ≥ 99 %.
5.11 N-Nitrosoanatabine – deutérée, (NAT-d4, n° CAS: 1020719-69-0), w ≥ 98 %, d’une pureté
isotopique w ≥ 99 %.
5.12 4-(N-méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone – deutérée, (NNK-d4, n° CAS: 76661-24-
7), w ≥ 98 %, d’une pureté isotopique w ≥ 99 %.
5.13 N-Nitrosonornicotine – deutérée, (NNN-d4, n° CAS: 66148-19-4), w ≥ 98 %, d’une pureté
isotopique w ≥ 99 %.
6 Appareillage
Appareillage et consommables courants de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. Toute la verrerie
doit être nettoyée avant utilisation pour éviter toute contamination.
6.1 Chromatographe liquide haute performance couplé à un spectromètre de masse en tandem
(CL-SM/SM) avec source d’ionisation par électrospray (ESI), composé des éléments suivants.
6.1.1 pompe binaire.
6.1.2 passeur d’échantillons.
6.1.3 four à colonne.
6.1.4 système d’acquisition de données.
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1)
6.2 Colonne CLHP: C18 en phase inverse, granulométrie 2,5 μm, 2,1 mm × 50 mm, ou équivalent.
6.3 Agitateur orbital, agitateur oscillant ou équipement similaire.
6.4 Flacons pour passeur d'échantillons.
6.5 Seringues à usage unique, de taille appropriée pour filtrer les échantillons.
6.6 Filtre à seringue, de 25 mm de diamètre et de 0,45 μm de porosité, en polytétrafluoroéthylène
(PTFE) ou équivalent.
NOTE Divers matériaux filtrants ont été évalués lors de l'étude collaborative et le PTFE présentait le plus
fort taux de recouvrement parmi ceux vérifiés.
D'autres matériaux filtrants peuvent également convenir; toutefois, il convient qu'ils soient évalués
avant d'être utilisés en routine.
6.7 Récipients d'extraction, en verre, d'une contenance de 50 ml à 100 ml.
6.8 Fioles jaugées ambrées, de classe A, disponibles en plusieurs tailles.
6.9 Pipettes jaugées en verre, de classe A, et/ou pipettes à déplacement positif, disponibles en
plusieurs tailles.
6.10 Balance analytique, capable de peser avec une précision d'au moins quatre décimales (en
grammes).
7 Préparation
7.1 Préparation de la verrerie
La verrerie doit être nettoyée et séchée de manière à s'assurer qu'aucune contamination ne se produise.
Il est important que toutes les sources possibles de contamination pouvant interférer avec le processus
analytique soient éliminées de la zone de travail.
Les solutions étalons et les extraits d'échantillons doivent être protégés de la lumière.
7.2 Préparation des solutions
7.2.1 Solution d’extraction, solution d’acétate d’ammonium à 100 mM dans l’eau.
Peser 15,4 g ± 0,05 g d’acétate d’ammonium. Transférer quantitativement dans une fiole jaugée de
2 000 ml et diluer jusqu’au trait de jauge avec de l’eau déionisée.
7.2.2 Phase mobile A de CLHP: eau, résistivité ≥ 18,2 MΩ·cm à 25 °C.
1) La colonne Waters XTerra® MS C18, 2,5 μm, 2,1 × 50 mm a été jugée adaptée. Ces informations sont données à
titre pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifient nullement l’approbation de ce produit par l’ISO.
Des colonnes équivalentes peuvent être utilisées s’il peut être démontré qu’elles conduisent aux mêmes résultats,
c’est-à-dire que les analytes et les étalons internes sont suffisamment séparés des interférences.
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7.2.3 Phase mobile B de CLHP: acide acétique à 0,1 % dans le méthanol.
Ajouter 1 ml d’acide acétique dans une fiole jaugée de 1 000 ml et diluer jusqu’au trait de jauge avec du
méthanol.
Il convient que le laboratoire réalise des études de stabilité pour déterminer la durée de conservation
de ces solutions.
7.3 Préparations des étalons
7.3.1 Généralités
Toutes les solutions étalons doivent être préparées dans de la verrerie ambrée ou opaque et conservées
à environ −20 °C, sauf les solutions d'étalonnage qui doivent être conservées au réfrigérateur. Produire
une série de solutions d’étalonnage pour couvrir la plage de résultats attendue avec les échantillons
d’essai, comme indiqué en 7.3.3.4. Déterminer la durée de conservation des solutions étalons et d’étalons
internes.
7.3.2 Préparation des solutions d’étalons internes
7.3.2.1 Solution mère
Peser respectivement, à 0,1 mg près, environ 10 mg de NNN-d4, de NAT-d4, de NAB-d4 et de NNK-d4.
Transférer quantitativement dans des fioles jaugées de 10 ml et diluer le contenu de chaque fiole jusqu’au
trait de jauge avec de l’acétonitrile, puis bien homogénéiser. La concentration de chaque solution est
d’environ 1 000 μg/ml.
7.3.2.2 Solution secondaire mixte d’étalons internes
Transférer 4,00 ml de chacune des quatre solutions mères d’étalons internes dans une fiole jaugée de
100 ml et diluer au volume avec de l’acétonitrile. Homogénéiser le tout. La concentration est d'environ
40 µg/ml de NNN-d4, de NNK-d4, de NAT-d4 et de NAB-d4.
7.3.2.3 Solution de dopage contenant les étalons internes
Transférer 5,00 ml de la solution composée du mélange d’étalons internes dans une fiole jaugée de
100 ml et diluer au volume avec de l’acétonitrile. Homogénéiser le tout. La concentration est d'environ
2 000 ng/ml de NNN-d4, de NNK-d4, de NAT-d4 et de NAB-d4.
7.3.3 Préparation des solutions d’étalonnage
7.3.3.1 Solution mère
Peser respectivement, à 0,1 mg près, environ 10 mg de NNN, de NAT, de NAB et de NNK. Transférer
quantitativement dans des fioles jaugées de 10 ml et diluer le contenu de chaque fiole jusqu’au trait de
jauge avec de l’acétonitrile, puis bien homogénéiser. La concentration de chaque solution est d’environ
1 000 μg/ml.
7.3.3.2 Solution étalon (I) composée d’un mélange de TSNAs
Transférer 4,00 l de chacune des trois solutions mères de NNN, de NNK et de NAT, et 1,00 ml de la
solution mère de NAB dans une fiole jaugée de 100 ml et diluer au volume avec de l’acétonitrile.
Homogénéiser le tout. La concentration sera d'environ 40 µg/ml de NNN, de NNK et de NAT et d'environ
10 µg/ml de NAB.
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7.3.3.3 Solution étalon (II) composée d’un mélange de TSNAs
Transférer 2,50 ml de la solution étalon (I) composée d'un mélange de TSNAs dans une fiole jaugée de
250 ml et diluer au volume avec de l'acétonitrile/de l'eau déionisée (30 %/70 %). Homogénéiser le tout.
La concentration de NNN, de NNK et de NAT sera d'environ 400 ng/ml, et la concentration de NAB sera
d'environ 100 ng/ml.
7.3.3.4 Solutions d’étalonnage de TSNA
Préparer sept solutions étalons de travail qui couvrent la plage de concentration concernée. Le Tableau 1
montre un exemple de préparation de la solution d’étalonnage.
Les solutions d’étalonnage de TSNA sont préparées dans sept fioles jaugées de 100 ml, contenant
chacune 10 ml de la solution d’acétate d’ammonium à 100 mM. Transférer 1,00 ml de la solution de
dopage contenant les étalons internes (2 000 ng/ml) dans chacune des sept fioles jaugées. Ensuite,
ajouter le volume approprié de solution étalon (II) composée d'un mélange de TSNAs, indiqué dans le
Tableau 1 ci-dessous. Puis ajouter le volume d’acétonitrile indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous. Enfin,
diluer chacune des sept fioles au volume avec la solution d'acétate d'ammonium à 100 mM, puis bien
homogénéiser. Calculer les concentrations d’extraits pour chaque étalon et les enregistrer.
NOTE Les solutions mères des TSNAs individuelles et les étalons internes deutérés dans l'acétonitrile
peuvent être achetés aux concentrations requises.
Tableau 1 — Préparation des solutions étalons de travail en vue de l’étalonnage
Solution Volume de Volume de Volume Concen- Concen- Concen- Concen-
d’étalon- solution solution de d’acétoni- tration tration tration tration
nage étalon (II) dopage contenant trile de NNN de NNK de NAT de NAB
composée les étalons
d’un mélange internes à
de TSNAs 2 000 ng/ml
(ml) (ml) (ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml)
Étalon 1 0,125 1,00 22 0,5 0,5 0,5 0,125
Étalon 2 0,250 1,00 22 1,0 1,0 1,0 0,250
Étalon 3 0,50 1,00 22 2,0 2,0 2,0 0,50
Étalon 4 1,00 1,00 22 4,0 4,0 4,0 1,00
Étalon 5 2,00 1,00 22 8,0 8,0 8,0 2,00
Étalon 6 5,00 1,00 21 20 20 20 5,00
Étalon 7 25,0 1,00 15 100 100 100 25,0
La plage de linéarité doit être déterminée pour l’instrument spécifique utilisé. Il convient que le
laboratoire réalise des études de stabilité pour déterminer la durée de conservation des solutions
étalons et d’étalons internes.
8 Échantillonnage
8.1 Généralités
L’échantillonnage est réalisé de manière que l’échantillon d’essai du laboratoire soit représentatif de la
population à soumettre à l’essai.
8.2 Préparation des échantillons
Une prise d'essai doit être préparée et analysée pour chaque échantillon d'essai.
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Le tabac et les produits du tabac doivent être broyés, sauf si les échantillons sont homogènes et ont une
granulométrie < 4 mm. Il est important que le mode opératoire de broyage ne génère pas de chaleur
excessive ou ne cause pas de dégradation de l’échantillon. Pour plus d'informations, voir la Référence [4].
Il convient que les produits du tabac fournis en sachets soient analysés avec leur sachet et ils doivent
être découpés en deux directement dans le flacon d'extraction.
Au moment de l'analyse, il convient de laisser les échantillons s'équilibrer à la température ambiante
pendant généralement 2 h avant de les peser. Toutefois, les échantillons sortis du congélateur peuvent
nécessiter plus de temps pour s'équilibrer.
Il convient que les échantillons soient homogénéisés avant la pesée afin de garantir leur homogénéité.
8.3 Extraction de l’échantillon
a) Sur une balance analytique, peser environ 1,000 g (noter le poids exact de l'extrait au millième de
gramme près) d'échantillon dans le récipient d'extraction de 50 ml à 100 ml.
b) Ajouter 0,300 ml de la solution de dopage contenant les étalons internes à 2 000 ng/ml (en utilisant
une pipette à déplacement positif calibrée ou équivalent).
c) Ajouter 30 ml de la solution d'acétate d'ammonium à 100 mM et boucher le récipient d'extraction.
d) Agiter l’échantillon/les échantillons pendant 40 min ± 5 min à une vitesse qui garantira une
extraction suffisante.
e) Filtrer chaque échantillon au moyen d’un filtre à seringue en PTFE de 25 mm et de 0,45 µm
directement dans les flacons ambrés pour passeur d’échantillons et boucher chaque flacon.
Les échantillons peuvent être extraits dans un tube à centrifuger et être centrifugés après agitation.
f) L'extrait est prêt pour l'injection dans le système CL-SM/SM.
NOTE Il a été démontré que le nettoyage de l'échantillon par extraction en phase solide (SPE) avant
l'injection dans le système CL-SM/SM réduit la contamination de la source d'ions et les besoins de maintenance
de l'instrument en routine. Voir l'Annexe A pour une proposition de mode opératoire de nettoyage d'échantillon
par SPE.
9 Analyse des échantillons
9.1 Généralités
Le taux d’humidité peut être déterminé sur l’échantillon d’essai de laboratoire pour présenter le résultat
final sur la base du poids sec.
Configurer et utiliser le système CL-SM/SM conformément aux instructions du fabricant. Laisser le
système s’équilibrer avant utilisation.
9.2 Paramètres CLHP suggérés
Les conditions suivantes sont recommandées pour le système CLHP.
Un ajustement des conditions chromatographiques peut être requis en fonction de la configuration de
l'instrument et des colonnes choisies pour la séparation:
— température de la colonne: 60 °C;
— volume d’injection: 10 µl;
— débit: 0,22 ml/min;
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— phase mobile A: eau;
— phase mobile B: acide acétique à 0,1 % dans le méthanol.
Tableau 2 — Gradient CLHP
Heure Débit Phase mobile A Phase mobile B Type de
gradient
(min) (ml/min) (%) (%)
0 0,22 100 0 Initial
3,0 0,22 10 90 Linéaire
4,0 0,22 10 90 Linéaire
5,0 0,22 0 100 Linéaire
6,0 0,22 100 0 Linéaire
10,0 0,22 100 0 Linéaire
9.3 Paramètres SM/SM
9.3.1 Généralités
Le spectromètre de masse en tandem doit fonctionner en mode positif d'ionisation par électrospray
(ESI) avec surveillance de réactions multiples (SRM).
Les paramètres SM/SM adaptés peuvent varier en fonction de la marque et du modèle de l'instrument
utilisé, mais les paramètres suivants peuvent servir de lignes directrices:
— gaz 1 (gaz nébuliseur): N , 50 psi;
2
— gaz 2 (gaz de séchage/évaporation): N , 60 psi;
2
— température de nébulisation d’ions turbo: 700 °C;
— température d'interface: activée;
— rideau de gaz (CUR): N , 40 psi;
2
— gaz de collision (CAD): N , 3 psi;
2
— tension de nébulisation d’ions (IS): 4 500 V.
Injecter chaque échantillon dans la colonne CL-SM/SM et analyser dans les conditions
chromatographiques énumérées ci-dessus.
9.3.2 Transitions de quantification et de qualification
La quantification est réalisée en utilisant les données de surveillance de réactions multiples (SRM) des
transitions des ions précurseurs et les ions produits recommandés dans le Tableau 3.
Tableau 3 — Transitions de quantification et de qualification des TSNAs
Nom Transition de Transition de Étalon interne
quantification qualification de référence
(m/z) (m/z)
NNK 208 > 122 208 > 79 NNK-d4
NNK-d4 212 > 126 Non applicable Non applicable
NNN 178 > 148 178 > 105 NNN-d4
a
Les transitions sont uniquement données à titre informatif et les valeurs optimisées
réelles peuvent varier d'un instrument à l'autre.
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Tableau 3 (suite)
Nom Transition de Transition de Étalon interne
quantification qualification de référence
(m/z) (m/z)
NNN-d4 182 > 152 Non applicable Non applicable
NAT 190 > 160 190 > 79 NAT-d4
NAT-d4 194 > 164 Non applicable Non applicable
NAB 192 > 162 192 > 133 NAB-d4
NAB-d4 196 > 166 Non applicable Non applicable
a
Les transitions sont uniquement données à titre informatif et les valeurs optimisées
réelles peuvent varier d'un instrument à l'autre.
La performance du système doit être suffisante pour obtenir des chromatogramme
...