ISO 20079:2005
(Main)Water quality — Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) — Duckweed growth inhibition test
Water quality — Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) — Duckweed growth inhibition test
ISO 20079:2005 specifies a method for the determination of the growth-inhibiting response of duckweed (Lemna minor) to substances and mixtures contained in water, treated municipal wastewater and industrial effluents.
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet toxique des constituants de l'eau et des eaux résiduaires vis-à-vis des lentilles d'eau (Lemna minor) — Essai d'inhibition de la croissance des lentilles d'eau
L'ISO 20079:2005 spécifie une méthode permettant la détermination de l'inhibition de la croissance des lentilles d'eau (Lemna minor) provoquée par des substances et des préparations contenues dans les eaux, les eaux résiduaires urbaines après traitement et les effluents industriels.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20079
First edition
2005-11-01
Water quality — Determination of the
toxic effect of water constituents and
waste water on duckweed (Lemna
minor) — Duckweed growth inhibition
test
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet toxique des constituants de
l'eau et des eaux résiduaires vis-à-vis des lentilles d'eau (Lemna
minor) — Essai d'inhibition de la croissance des lentilles d'eau
Reference number
ISO 20079:2005(E)
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ISO 2005
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ISO 20079:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 3
5 Interferences . 4
6 Apparatus . 4
7 Reagents. 4
8 Test organisms . 7
9 Stock cultures and pre-cultures. 7
10 Procedure . 8
11 Validity criteria . 10
12 Expression of results . 10
13 Estimation of EC(r) values for frond number and the second observation parameter . 12
x
14 Documentation of results . 12
15 Precision. 12
16 Test report . 13
Annex A (informative) Preparation of the nutrient media . 14
Annex B (informative) Measurement of the lowest ineffective dilution (LID) of a waste water —
A simplified evaluation for testing of waste water. 19
Annex C (informative) Suppliers of Lemna species . 22
Bibliography . 23
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ISO 20079:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 20079 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
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ISO 20079:2005(E)
Introduction
The duckweed species Lemna minor is used as model organism for higher water plants. Duckweeds are
monocotyledonous, free-floating angiosperms and belong to the Arales within the subclass of Aridae.
Duckweeds are fast growing higher plants, spreading from the tropic to the arctic zone. As primary producers
they are a food source for waterfowl, fish and small animals and serve as physical support for a variety of
small invertebrates.
Duckweed can be damaged by water constituents and effluents (see Annex B). The subsequent inhibition of
growth is calculated from the observation parameters (frond number, frond area, chlorophyll, dry weight) by a
number of defined calculation methods.
EC values are determined to allow for an assessment of toxic effects of water constituents (e.g. chemicals,
plant protection products). The evaluation for at least two observation parameters is based on the average
specific growth-rates.
The test is designed for measurement of response of substances dissolved in water. This includes the
definition of a fixed dilution step, or a concentration of the test sample at which a parameter of observation
(endpoint) is inhibited relative to a control for a defined percentage.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20079:2005(E)
Water quality — Determination of the toxic effect of water
constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) —
Duckweed growth inhibition test
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the growth-inhibiting response of
duckweed (Lemna minor) to substances and mixtures contained in water, treated municipal wastewater and
industrial effluents.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 10260, Water quality — Measurement of biochemical parameters — Spectrometric determination of the
chlorophyll-a concentration
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
axenic cultures
monocultures of organisms from a single species, free from fungi, algae and other macrophyte species
3.2
calculation parameters
parameters for the estimation of toxicity derived from any parameters of observation by different methods of
calculation
EXAMPLE Growth-rates derived from frond number, frond area, chlorophyll and dry weight are calculation
parameters in this International Standard.
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ISO 20079:2005(E)
3.3
chlorosis
loss of pigment (yellowing of frond tissue)
3.4
colony
aggregate of mother and daughter fronds, attached to each other, sometimes referred to as a plant
3.5
control batch
control medium, including organisms used for testing
3.6
control medium
combination of dilution water and/or nutrient medium used in the test
3.7
dilution water
water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions
3.8
doubling time
quotient of natural logarithm of 2 (ln 2) divided by average specific growth-rate
3.9
effective concentration
concentration of the test sample (EC ) at which an effect of x % is measured, if compared to the control
x
NOTE To unambiguously denote an EC value deriving from growth-rate, it is proposed to use the symbol “EC(r)”,
followed by the observation parameter used, e.g. EC(r) (frond number).
3.10
frond
individual leaf-like structure on a duckweed colony; the smallest unit (i.e. individual), capable of reproducing
3.11
frond area
total area of all fronds visible from vertically above
3.12
frond number
all fronds protruding from a mother frond which are directly visible from above without magnification
3.13
growth
increase in biomass over time as the result of proliferation of new tissues
NOTE In this test it refers to any parameter of observation.
3.14
growth-rate
calculation parameter defined as quotient of the difference of the natural logarithms of a parameter of
observation and the respective time period
NOTE If the time period comprises the total duration of the test, the term is referred to as average specific
growth-rate. If the period between two measurements within the test period is used, the term is named segmented
growth-rate (see 12.1.2).
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ISO 20079:2005(E)
3.15
inoculum
number of fronds (colonies) added to the test batch at the beginning of the test
3.16
necrosis
localised dead frond tissue (i.e. brown or white)
3.17
nutrient medium
solution of nutrients and micronutrients in water which are essential for the growth of duckweed
3.18
observation parameters
observed or measured biomass parameters like frond number, frond area, chlorophyll, dry weight, which are
measured or counted once or repeatedly by observation or measurement
NOTE These parameters are relevant for the assessment of growth and vitality of the test organisms (e.g. frond
number, frond area or chlorophyll content, dry weight).
3.19
pre-culture
culture of duckweed used for acclimatisation of test plants to the test conditions and for the growing of the
plants to be used in the inoculum
3.20
root
that part of the Lemna plant that assumes a root-like structure
3.21
stock culture
culture of a single species of duckweed to conserve the original defined Lemna species in the laboratory and
to provide inoculum for the pre-culture
NOTE It is necessary to use defined and verified strains, because of possible insecurities in species taxonomy. An
address list of suppliers is given in Annex C.
3.22
test batch
test medium including organisms used for testing
3.23
test medium
combination of test sample, dilution water and/or nutrient medium used in the test
3.24
test sample
discrete portion of a sample (taken from i.e. receiving water, waste water, dissolved chemical substances or
mixtures, products and compounds) pretreated according to the needs of this test (e.g. dissolution, filtering,
neutralisation)
4 Principle
Plants of the species Lemna minor are allowed to grow as monocultures in different concentrations of the test
sample over a period of seven days. The objective of the test is to quantify substance-related effects on
vegetative growth over this period based on assessments of frond number, and also on assessments on
biomass (total frond area, dry weight or chlorophyll). To quantify substance-related effects, the growth-rate in
the test solutions is compared with that of the controls and the concentration resulting in a specified x %
inhibition of growth-rate is determined and expressed as the EC(r) .
x
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ISO 20079:2005(E)
5 Interferences
Non-soluble, poorly soluble, volatile, bio- or photodegradable substances or substances reacting with the
dilution water or the nutrient medium or changing their state during the test, may falsify or reduce the
reproducibility of the results (see ISO 5667-16). Special consideration is necessary in the case of substances
accumulated at the water surface as this may increase the effects on duckweed.
6 Apparatus
The test design determines the requirements for the apparatus.
6.1 Cylindrical vessels, (glass beakers, crystallising dishes, Petri dishes).
Minimum volume of 150 ml (for 2/3 of total volume, i.e. 100 ml of test solution).
6.2 Uniform glass coverings.
Covers may be provided to minimize evaporation and accidental contamination.
6.3 Facilities with constant temperature and illumination, temperature controlled room or water bath,
incubator or environmental chamber.
6.4 Spectrometer to monitor chlorophyll, 665 nm and 750 nm.
6.5 Lumino-meter, to be used to measure light intensity.
6.6 pH-meter.
6.7 Tweezers.
6.8 Glassware, for the preparation of different concentration series and nutrient medium (volumetric flasks,
graduated cylinders, pipettes, Petri dishes).
6.9 Image analysis system, to measure frond number and frond area.
6.10 Autoclave.
6.11 Filtration device, for sterile filtration.
7 Reagents
Use only reagents of recognised analytical grade.
7.1 Dilution water, distilled or deionised water or water of equivalent purity, conductivity u 10 µS/cm.
7.2 Hydrochloric acid, for example c(HCl) = 0,1 mol/l.
7.3 Sodium hydroxide solution, for example c(NaOH) = 0,1 mol/l.
7.4 Glucose, C H O .
6 12 6
7.5 Agar medium.
See Annex A.
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7.6 Nutrient media, modified STEINBERG medium (see Table 1).
Generally the modified STEINBERG medium shall be used for all applications within the scope of the guideline,
i.e. water constituents and wastewaters. In some cases, use of the media described in Annex A may also be
suitable as long as all validity criteria are fulfilled.
Table 1 — pH-stabilised STEINBERG medium (modified by Altenburger)
Substance Nutrient medium
Macroelements Molecular mass mg/l mmol/l
KNO 101,12 350,00 3,46
3
Ca(NO )⋅4HO 236,15 295,00 1,25
3 2 2
KH PO 136,09 90,00 0,66
2 4
K HPO 174,18 12,60 0,072
2 4
MgSO⋅7HO 246,37 100,00 0,41
4 2
Microelements Molecular mass µg/l µmol/l
H BO 61,83 120,00 1,94
3 3
ZnSO⋅7HO 287,43 180,00 0,63
4 2
Na MoO⋅2HO 241,92 44,00 0,18
2 4 2
MnCl ·4HO 197,84 180,00 0,91
2 2
FeCl⋅6HO 270,21 760,00 2,81
3 2
EDTA Disodium-dihydrate 372,24 1 500,00 4,03
7.6.1 Concentrations and stock solutions (see Tables 2 and 3).
Prepare the nutrient medium from single solutions. The required concentrations of pre-culture and test
medium are obtained by dilution if 10-fold concentrated medium is prepared.
Table 2 — Stock solutions (macroelements)
Macroelements (50-fold concentrated) g/l
Stock solution 1:
KNO 17,50
3
KH PO 4,5
2 4
K HPO 0,63
2 4
Stock solution 2:
MgSO⋅7HO 5,00
4 2
Stock solution 3:
Ca(NO )⋅4HO 14,75
3 2 2
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ISO 20079:2005(E)
Table 3 — Stock solutions (microelements)
Microelements (1 000-fold concentrated) mg/l
Stock solution 4:
H BO 120,0
3 3
Stock solution 5:
ZnSO⋅7HO 180,0
4 2
Stock solution 6:
Na MoO⋅2HO 44,0
2 4 2
Stock solution 7:
MnCl⋅4HO 180,0
2 2
Stock solution 8:
FeCl⋅6HO 760,00
3 2
EDTA disodium-dihydrate 1 500,00
Stock solutions 2 and 3 and 4 to 7 may be pooled (taking into account the required concentrations).
For longer shelf life, treat stock solutions in an autoclave at 121 °C for 20 min or alternatively carry out a
sterile filtration (0,2 µm). For stock solution 8, sterile filtration (0,2 µm) is strongly recommended.
7.6.2 Preparation of the final concentration of modified STEINBERG medium
Add 20 ml each of stock solutions 1, 2 and 3 (see Table 2) to about 900 ml water (7.1).
Then add 1,0 ml each of stock solutions 4, 5, 6, 7 and 8 (see Table 3) to avoid precipitation.
The pH should be 5,5 ± 0,2 [adjust by addition of a minimised volume of NaOH solution (7.3) or HCl (7.2)].
Adjust with water (7.1) to 1 000 ml.
If stock solutions are sterilized and appropriate water is used, no further sterilisation is necessary. If
sterilisation is done with the final medium, stock solution 8 should be added after autoclaving (at 121 °C for
20 min).
7.6.3 Preparation of 10-fold-concentrated modified STEINBERG medium
Add 20 ml each of stock solutions 1, 2 and 3 (see Table 2) to about 30 ml water (7.1).
Then add 1,0 ml each of stock solutions 4, 5, 6, 7 and 8 (see Table 3) to avoid precipitation. Adjust with water
(7.1) to 100 ml.
If stock solutions are sterilized and appropriate water is used, no further sterilisation is necessary. If
sterilisation is done with the final medium, stock solution 8 should be added after autoclaving (at 121 °C for
20 min).
The pH of the medium (final concentration) should be 5,5 ± 0,2.
For the assessment of mining effluents, metal substances added to water or other samples which may contain
pre-dominantly metals, it may be appropriate to use a modified APHA test medium. Using modified APHA (i.e.
without EDTA, see Annex A) would make it necessary to change medium from modified STEINBERG medium to
[12]
modified APHA between pre-culture and an acclimatization phase before the test . This change does not
conform with 9.2, but this is to be accepted in this case. All details on handling and use of APHA are included
in Annex A.
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ISO 20079:2005(E)
For the assessment of water constituents (chemicals), the OECD medium (modified SIS) could also be used
(see Annex A). The concentration of the respective nutrient medium shall be kept constant in all treatments
and controls.
7.7 Reference substances
7.7.1 3,5-dichlorophenol
3,5-dichlorophenol analytical grade > 99 % purity.
7.7.2 Potassium chloride, KCl.
8 Test organisms
For use in this International Standard, Lemna minor (with a documentation of origin) is the recommended
species. Plants obtained from a wild population need a confirmation of their taxonomy.
9 Stock cultures and pre-cultures
9.1 Stock cultures
Stock cultures are kept axenically. Addition of glucose (1 %) enables the recognition of microbial infections.
For solid medium, about 1 % of agar may be added (approved media are listed in Annex A). Stock cultures
may be maintained at low light conditions and ambient temperature for several months without re-inoculation if
evaporation is minimized by covering the Erlenmeyer flask with a plug or cap and aluminium foil (see also
Annex A).
9.2 Pre-cultures
Initiate cultures used for toxicity tests at 7 d to 10 d prior to the test, using test medium and test conditions.
NOTE 1 A longer adaptation-time may be required in the case of change of the nutrient medium between stock culture
and pre-culture.
NOTE 2 Where the modified APHA-medium is to be used as testing medium, specific treatment will be necessary (see
Annex A).
Pre-cultured duckweed to be used in toxicity tests should meet the following health criteria:
⎯ exponential growth;
⎯ the number of fronds in the pre-culture should have a seven-fold increase by the end of 7 d (i.e.
r W 0,275 per d or doubling time u 2,5 d);
⎯ the culture should consist of young, rapidly growing colonies with bright green colour without visible
lesions, chlorosis or necrosis;
⎯ a large number of single fronds or small colonies is an indication of environmental stress and these plants
should not be used in testing;
⎯ the depth of the medium should be at least 3 cm.
To minimise lag-phases caused by interactions between colonies, it should be assured that the covering is
less than 50 % of the total available surface (no crowding). All colonies used should originate from the same
pre-culture.
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ISO 20079:2005(E)
10 Procedure
10.1 General
The general recommendations as specified in ISO 5667-16 are to be taken into account. Adjust the pH value
of the test sample to ± 0,2 of the pH value of the nutrient medium in the control by adding hydrochloric acid
(7.2) or sodium hydroxide solution (7.3). Dilution should be kept at a minimum. No later adjustment should be
made.
NOTE Duckweed generally has no growth problems between pH 5 and pH 9. Therefore adjustment of pH is usually
not necessary as long as the pH of the sample is between 5 and 8, depending on buffer capacity.
Neutralisation is not allowed if the effect of pH is to be reflected in the test results or if physical modification or chemical
reaction is observed due to pH adjustment.
10.2 Preparation of concentration series for EC(r) value assessment
x
If the EC(r) is to be estimated, a sufficient number of concentrations is used to define the EC(r) at an
x x
appropriate confidence level. An appropriate test design consists of a geometric series of at least five
concentrations. At least one measured inhibition value for the intended EC(r) should be below and one above
x
the EC(r) to be estimated, and three or more values should be other than 0 % or 100 % inhibition. Otherwise,
x
confidence limits might be too large.
10.3 Test
10.3.1 Test for EC(r)
x
For EC(r) assessment (see also ISO 5667-16), use at least 3 replicates at each concentration level for the
x
treatments and 6 replicates for the controls.
10.3.2 Test for EC(r)
<20
The number of replicates strongly depends on the size of the expected coefficient of variation and the
tolerated deviations. The coefficient of variation should be calculated from tests with a sufficiently large
number of controls (see also ISO 5667-16).
10.3.3 Limit test
A dilution series is unnecessary when it is only desired to ascertain, whether a given concentration or dilution
level exhibits an effect (limit test). Use at least 6 replicates for the limit concentration and the controls.
10.3.4 Use of solvents or dispersants
If solvents or dispersants cannot be avoided (at a maximum concentration of 0,1 ml/l or 100 mg/l, respectively),
use an additional control with 6 replicates including the solvent or dispersant at the same concentration as in
all replicate vessels. Solvents or dispersants shall exhibit no toxic effects at the concentration chosen.
10.3.5 Test with reference substances
Carry out a test using 3,5-dichlorophenol and/or potassium chloride solution (7.7.1, 7.7.2).
EC(r) (frond number) should be in a range between 2,2 mg/l and 3,8 mg/l for 3,5-dichlorophenol and
50
between 5,5 g/l and 10,0 g/l for potassium chloride.
Reference substances may be tested for checking the test procedure and sensitivity. It is advisable to test the
reference substances regularly and to use control charts for measuring within laboratory precision and
[13]
monitoring culture health. Guidance on preparation of control charts is available .
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ISO 20079:2005(E)
NOTE 1 The range for 3,5-dichlorophenol (tested with modified STEINBERG medium) is based on data of the
international interlaboratory test for this International Standard. The range for potassium chloride (tested with modified
STEINBERG medium and APHA medium) is based on Canadian and German data according to 95 % confidence limits of
EC(r) (frond number).
50
NOTE 2 In recent research studies, nickel sulfate (NiSO ) has been proved to be an additional reference substance.
4
10.4 Number of fronds at the start of the test
Each test vessel should contain a total of 10 to 16 fronds (2 or 3 fronds per colony) satisfying the pre-culture
conditions. The number of fronds and colonies should be the same in each test vessel. Generally the total size
of all colonies together has significant influence on the coefficient of variation at the end of the test for all
observation parameters. For this reason, keep the total size of all colonies as homogeneous as possible.
To provide a random inoculation, it is recommended to place one of the pre-selected colonies in each test
vessel and to continue this process until each test vessel contains the same required number of fronds. A
minimum volume of 100 ml is recommended. The diameter of the vessel should be chosen in such a way that
overlapping of the fronds (more than about 50 % covering) at the end of the test is avoided.
10.5 Temperature
The temperature in the test vessels should be 24 °C ± 2 °C. Maintain this temperature throughout the test
allowing a deviation of not more than ± 1 °C in all vessels. Measure at least at the four observation times;
however, continuous temperature control is recommended. If temperature records are based on
measurements other than in the test vessels, the relationship should be established.
10.6 Light
Continuous warm or cool white fluorescent lighting should be used. Measure photosynthetically active
–2 –1 –2 –1
radiation (PAR) with a spherical quantum sensor. Light intensity should be 85 µE⋅m ⋅s to 135 µE⋅m ⋅s
(400 nm to 700 nm) at the water level in the test vessels.
Measure the light intensity once per test in at least five characteristic points of the test area in a realistic test
environment. It shall not vary by more than ± 15 % of the selected light intensity. Exclude light from the side
and bottom by test design, i.e. black side covers and a black bottom. The measurement of light with a
spherical head quantifies all light that would reach the plants if the test solution is clear.
The use of a random design with changes at the observation times is recommended, but does not
compensate high deviations of light intensity and temperature between different places of the test area.
Before a toxicity test is conducted with new test facilities, it is desirable to conduct a non-toxicant test, in which
all test vessels contain control medium. The coefficient of variation of growth-rate should be less than 10 %.
10.7 Test duration
The test duration is 7 d.
10.8 Measurements and observations
Measure the basic parameter frond number. In addition, a second observation parameter (frond area, dry
weight or chlorophyll) shall be measured.
Record qualitative observations of any visual signs of phytotoxicity for each test vessel at the end of the test
as follows:
a) abnormally sized fronds;
b) root length and destruction;
c) local or size specific chlorosis or necrosis;
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ISO 20079:2005(E)
d) loss of buoyancy, break-up of colonies;
e) changes of the test medium, bacterial contamination and any other relevant changes;
f) pH value of the medium at the end of the test.
For observations, place the test vessels on a white background. Illuminate from the side or the bottom of the
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20079
Première édition
2005-11-01
Qualité de l'eau — Détermination de
l'effet toxique des constituants de l'eau et
des eaux résiduaires vis-à-vis des
lentilles d'eau (Lemna minor) — Essai
d'inhibition de la croissance des lentilles
d'eau
Water quality — Determination of the toxic effect of water constituents
and waste water on duckweed (Lemna minor) — Duckweed growth
inhibition test
Numéro de référence
ISO 20079:2005(F)
©
ISO 2005
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ISO 20079:2005(F)
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 4
5 Interférences . 4
6 Appareillage . 4
7 Réactifs . 5
8 Organismes d'essai . 7
9 Cultures mères et précultures. 7
10 Mode opératoire . 8
11 Critères de validité. 11
12 Expression des résultats . 11
13 Estimation des valeurs de CE(r) pour le nombre de frondes et pour le second paramètre
x
observé . 13
14 Report des résultats . 13
15 Précision. 13
16 Rapport d'essai . 14
Annex A (informative) Préparation de milieux nutritifs. 15
Annex B (informative) Mesurage de la dilution minimale sans effet (DMSE) des eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour l'analyse des eaux résiduaires . 20
Annex C (informative) Fournisseurs de l'espèce Lemna . 23
Bibliographie . 24
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 20079 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
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ISO 20079:2005(F)
Introduction
La lentille d'eau Lemna minor est utilisée comme organisme modèle représentatif des plantes aquatiques
supérieures. Les lentilles d'eau sont des angiospermes monocotylédones flottantes, autonomes et
appartiennent aux Arales dans la sous-classe Aridae. Ce sont des plantes supérieures à croissance rapide
dont la répartition s'étend des tropiques à la zone arctique. En tant que producteurs primaires, elles
représentent une source de nourriture pour le gibier d'eau, les poissons et les petits animaux et servent de
support physique à divers petits invertébrés.
Les lentilles d'eau peuvent être altérées par certains constituants présents dans les eaux et les effluents (voir
Annexe B). L'inhibition de la croissance résultante est calculée à partir des paramètres observés (nombre de
frondes, surface des frondes, chlorophylle et poids sec) par différentes méthodes définies de calcul.
Des valeurs de concentrations effectives (CE) sont déterminées pour permettre une évaluation des effets
toxiques des constituants présents dans les eaux (par exemple produits chimiques, produits
phytopharmaceutiques). L'évaluation pour au moins deux des paramètres observés se base sur les taux de
croissance moyens spécifiques.
L'essai est conçu pour mesurer la réponse à des substances dissoutes dans les eaux. Ceci comprend la
définition du niveau de dilution ou de la concentration de l'échantillon soumis à essai à laquelle un paramètre
observé (critère d'effet) est inhibé par rapport à un témoin à un pourcentage défini.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20079:2005(F)
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet toxique des
constituants de l'eau et des eaux résiduaires vis-à-vis des
lentilles d'eau (Lemna minor) — Essai d'inhibition de la
croissance des lentilles d'eau
AVERTISSEMENT — Il convient que les personnes utilisant la présente Norme internationale soient
familiarisées avec les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale ne
prétend pas couvrir tous les problèmes de sécurité potentiels liés à son utilisation. Il est de la
responsabilité de l'utilisateur de mettre en place des pratiques d'hygiène et de sécurité appropriées et
de s'assurer de la conformité avec toutes les dispositions réglementaires nationales.
IMPORTANT — Il est essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par du personnel formé.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode permettant la détermination de l'inhibition de la
croissance des lentilles d'eau (Lemna minor) provoquée par des substances et des préparations contenues
dans les eaux, les eaux résiduaires urbaines après traitement et les effluents industriels.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 10260, Qualité de l'eau — Mesurage des paramètres biochimiques — Dosage spectrométrique de la
chlorophylle a
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
cultures axéniques
cultures monospécifiques d'organismes, sans champignons, algues ou autres espèces de macrophytes
3.2
paramètres de calcul
paramètres, dérivés des différents critères observés, permettant d'évaluer la toxicité par différentes méthodes
de calcul
EXEMPLE En l'occurrence, les taux de croissance dérivés du nombre de frondes, de la surface des frondes, de la
chlorophylle et du poids sec représentent des paramètres de calcul dans la présente Norme internationale.
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ISO 20079:2005(F)
3.3
chlorose
dépigmentation (jaunissement des tissus des frondes)
3.4
colonie
ensemble de frondes mères et filles, reliées entre elles, parfois désigné comme une plante
3.5
lot témoin
milieu témoin, incluant les organismes utilisés pour l'essai
3.6
milieu témoin
combinaison de l'eau de dilution et/ou du milieu nutritif utilisée pour l'essai
3.7
eau de dilution
eau ajoutée à l'échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
3.8
temps de doublement
quotient du logarithme népérien de 2 (ln 2) divisé par le taux de croissance moyen spécifique
3.9
concentration efficace
concentration de l'échantillon soumis à essai (CE ) à laquelle un effet de x % est mesuré par rapport au
x
témoin
NOTE Afin d'indiquer sans ambiguïté une valeur de CE dérivée du taux de croissance, il est proposé d'utiliser le
symbole «CE(r)», suivi du paramètre observé utilisé, par exemple CE(r) (nombre de frondes).
3.10
fronde
structure individuelle sous forme de feuille dans une colonie de lentilles d'eau; la plus petite unité (individuelle)
capable de se reproduire
3.11
surface des frondes
surface totale de toutes les frondes directement visibles du dessus (à la verticale du récipient)
3.12
nombre de frondes
toutes les frondes issues d'une fronde mère, directement visibles du dessus, sans grossissement
3.13
croissance
augmentation de la biomasse au cours du temps résultant de la production de nouveaux tissus
NOTE Dans cet essai, elle fait référence à l'un des paramètres observés.
3.14
taux de croissance
paramètre de calcul défini comme le quotient de la différence des logarithmes népériens d'un des paramètres
observés et de la période de temps respective
NOTE Si la période correspond à la durée totale de l'essai, le terme est désigné sous le nom de taux de croissance
moyen spécifique. Si elle correspond à la période entre deux mesurages au cours de l'essai, le terme est désigné sous le
nom de taux de croissance séquentiel (voir 12.1.2).
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3.15
inoculum
nombre de frondes (colonies) ajoutées au lot d'essai au début de l'essai
3.16
nécrose
mort localisée des tissus des frondes (c'est-à-dire apparition d'une coloration marron ou blanche)
3.17
milieu nutritif
solution aqueuse contenant les nutriments et les micronutriments essentiels pour la croissance des lentilles
d'eau
3.18
paramètres observés
paramètres observés ou mesurés permettant de quantifier la biomasse, tels que le nombre de frondes, la
surface des frondes, la chlorophylle, le poids sec, mesurés ou dénombrés une ou plusieurs fois
NOTE Ces paramètres (tels que le nombre de frondes, la surface des frondes ou la teneur en chlorophylle et le poids
sec) sont pertinents pour l'évaluation de la croissance et de la vitalité des organismes d'essai.
3.19
préculture
culture de lentilles d'eau utilisée pour l'acclimatation des plantes aux conditions d'essai et pour la croissance
des plants qui seront utilisés dans l'inoculum
3.20
racine
partie de la plante Lemna qui présente une structure radiculaire
3.21
culture mère
culture monospécifique de lentille d'eau, dans le but de conserver en laboratoire l'espèce définie Lemna
d'origine et de fournir l'inoculum pour la préculture
NOTE Il est indispensable d'utiliser des souches définies et contrôlées, en raison des incertitudes liées à la
taxonomie des espèces. La liste des adresses des fournisseurs est donnée à l'Annexe C.
3.22
lot d'essai
milieu d'essai incluant les organismes utilisés pour l'essai
3.23
milieu d'essai
combinaison de l'échantillon soumis à essai, de l'eau de dilution et/ou du milieu nutritif, utilisée pour l'essai
3.24
échantillon pour essai
portion discrète d'un échantillon (par exemple, eau prélevée à partir du milieu récepteur, eaux usées,
substances chimiques dissoutes ou préparations, produits et composés) ayant subi un prétraitement en
fonction des besoins de cet essai (dissolution, filtrage, neutralisation, par exemple)
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4 Principe
Les plantes de l'espèce Lemna minor sont cultivées en culture monospécifique à différentes concentrations
de la substance soumise à essai pendant une période de sept jours. L'objectif de l'essai est de quantifier les
effets des substances sur la croissance végétative pendant cette période par l'évaluation du nombre de
frondes et de la biomasse (surface totale des frondes, poids sec ou chlorophylle). Afin de quantifier les effets
des substances, le taux de croissance des solutions d'essai est comparé à celui des témoins et la
concentration provoquant une inhibition de x % du taux de croissance est déterminée et exprimée en tant que
CE(r) .
x
5 Interférences
Les substances non solubles, faiblement solubles ou volatiles, les substances bio- ou photodégradables, les
substances réagissant avec l'eau de dilution ou avec le milieu nutritif ou dont l'état évolue au cours de l'essai
peuvent fausser ou réduire la reproductibilité des résultats (voir l'ISO 5667-16). Il est nécessaire de prêter une
attention particulière en cas d'accumulation de substances à la surface de l'eau, étant donné que ce
phénomène peut augmenter les effets sur les lentilles d'eau.
6 Appareillage
Le dispositif expérimental détermine les besoins en matériel de laboratoire.
6.1 Récipients cylindriques, (béchers en verre, cristallisoirs, boîtes de Petri).
Volume minimal de 150 ml (pour 2/3 du volume total, c'est-à-dire 100 ml de solution d'essai).
6.2 Couvercles en verre uniformes.
Il est possible de prévoir des couvercles pour minimiser l'évaporation et la contamination accidentelle.
6.3 Installations à température et éclairage constants, chambre ou bain-marie à température contrôlée,
incubateur ou chambre climatique.
6.4 Spectromètre pour surveiller la chlorophylle, 665 nm et 750 nm.
6.5 Luminomètre, à utiliser pour mesurer l'intensité lumineuse.
6.6 pH-mètre.
6.7 Pinces.
6.8 Verrerie, pour la préparation des différentes gammes de concentrations et du milieu nutritif (flacons
volumétriques, cylindres gradués, pipettes, boîtes de Petri).
6.9 Analyseur d'images, pour mesurer le nombre et la surface des frondes.
6.10 Autoclave.
6.11 Appareil de filtration, pour la filtration stérile.
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7 Réactifs
N'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.
7.1 Eau de dilution, eau distillée ou déionisée ou eau de pureté équivalente avec une conductivité
u 10 µS/cm.
7.2 Acide chlorhydrique, par exemple c(HCl) = 0,1 mol/l.
7.3 Solution d'hydroxyde de sodium, par exemple c(NaOH) = 0,1 mol/l.
7.4 Glucose, C H O .
6 12 6
7.5 Milieu gélosé (agar-agar).
Voir Annexe A.
7.6 Milieu nutritif, milieu STEINBERG modifié (voir Tableau 1).
En règle générale, le milieu STEINBERG modifié doit être utilisé pour toute les applications du domaine
d'application des lignes directrices, c'est-à-dire les constituants des eaux et des eaux résiduaires. Dans
certains cas, l'utilisation des milieux décrits à l'Annexe A peut être adaptée, pour autant que les critères de
validité sont remplis.
Tableau 1 — Milieu STEINBERG à pH stabilisé (modifié selon Altenburger)
Substance Milieu nutritif
Macroéléments Masse molaire mg/l mmol/l
KNO 101,12 350,00 3,46
3
Ca(NO ) ,4HO 236,15 295,00 1,25
3 2 2
KH PO 136,09 90,00 0,66
2 4
K HPO 174,18 12,60 0,072
2 4
MgSO ,7HO 246,37 100,00 0,41
4 2
Microéléments Masse molaire µg/l µmol/l
H BO 61,83 120,00 1,94
3 3
ZnSO ,7HO 287,43 180,00 0,63
4 2
Na MoO ,2HO 241,92 44,00 0,18
2 4 2
MnCl ,4HO 197,84 180,00 0,91
2 2
FeCl ,6HO 270,21 760,00 2,81
3 2
EDTA disodique dihydraté 372,24 1 500,00 4,03
7.6.1 Concentrations et solutions mères (voir Tableaux 2 et 3).
Préparer le milieu nutritif à partir de solutions individuelles. Les concentrations requises pour la préculture et
le milieu d'essai sont ensuite obtenues par dilution en cas de préparation d'un milieu dix fois concentré.
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Tableau 2 — Solutions mères (macroéléments)
Macroéléments (solutions 50 fois concentrées) g/l
Solution mère 1:
KNO 17,50
3
KH PO 4,5
2 4
K HPO 0,63
2 4
Solution mère 2:
MgSO ,7HO 5,00
4 2
Solution mère 3:
Ca(NO ) ,4HO 14,75
3 2 2
Tableau 3 — Solutions mères (microéléments)
Microéléments (solutions 1 000 fois
mg/l
concentrées)
Solution mère 4:
H BO 120,0
3 3
Solution mère 5:
ZnSO ,7HO 180,0
4 2
Solution mère 6:
Na MoO ,2HO 44,0
2 4 2
Solution mère 7:
MnCl ,4HO 180,0
2 2
Solution mère 8:
FeCl ,6HO 760,00
3 2
EDTA disodique dihydraté 1 500,00
Il est possible de regrouper les solutions mères 2 et 3 et 4 à 7 (en prenant en considération les concentrations
requises).
Afin de prolonger la durée de conservation, autoclaver les solutions mères à 121 °C pendant 20 min ou bien
effectuer une filtration stérile (0,2 µm). Il est fortement conseillé d'effectuer une filtration stérile (0,2 µm) pour
la solution mère 8.
7.6.2 Préparation de la concentration finale du milieu STEINBERG modifié
Ajouter 20 ml de chaque solution mère 1, 2 et 3 (voir Tableau 2) à environ 900 ml d'eau (7.1).
Ajouter 1,0 ml de chaque solution mère 4, 5, 6, 7 et 8 (voir Tableau 3) pour éviter la précipitation.
Il convient que le pH soit de 5,5 ± 2 [ajuster par ajout d'un volume le plus réduit possible d'une solution de
NaOH (7.3) ou de HCl (7.2)].
Compléter avec de l'eau (7.1) jusqu'à 1 000 ml.
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Si les solutions mères sont stérilisées et que l'eau recommandée est utilisée, il n'est pas nécessaire
d'effectuer une nouvelle stérilisation. Si la stérilisation intervient sur le milieu final, il convient d'ajouter la
solution mère 8 après passage à l'autoclave (à 121 °C pendant 20 min).
7.6.3 Préparation du milieu STEINBERG modifié 10 fois concentré
Ajouter 20 ml de chaque solution mère 1, 2 et 3 (voir Tableau 2) à environ 30 ml d'eau (7.1).
Ajouter 1,0 ml de chaque solution mère 4, 5, 6, 7 et 8 (voir Tableau 3) pour éviter une précipitation. Compléter
avec de l'eau (7.1) jusqu'à 100 ml.
Si les solutions mères sont stérilisées et que l'eau recommandée est utilisée, il n'est pas nécessaire
d'effectuer une nouvelle stérilisation. Si la stérilisation intervient sur le milieu final, il convient d'ajouter la
solution mère 8 après passage à l'autoclave (à 121 °C pendant 20 min).
Il convient que le pH du milieu (concentration finale) soit de 5,5 ± 0,2.
Dans certains cas, il peut être judicieux d'utiliser un milieu d'essai APHA modifié, en particulier lorsque sont
concernés des effluents miniers ou d'autres échantillons susceptibles de contenir des métaux. L'utilisation du
milieu APHA modifié (c'est-à-dire sans EDTA, voir Annexe A) implique un changement de milieu (de
[12]
STEINBERG modifié à APHA modifié) entre la préculture et une phase d'acclimatation avant l'essai . Ceci
pose problème par rapport à 9.2 mais cela est admis dans ce cas. Toutes les informations sur la préparation
et l'utilisation du milieu APHA sont données dans l'Annexe A.
En ce qui concerne l'évaluation des constituants contenus dans les eaux (produits chimiques), il est aussi
possible d'utiliser le milieu OCDE (SIS modifié) (voir Annexe A). La concentration du milieu nutritif respectif
doit être maintenue constante pour tous les traitements et témoins lors de tous les essais.
7.7 Substances de référence
7.7.1 3,5-Dichlorophénol
3,5-dichlorophénol pour analyses (pureté > 99 %).
7.7.2 Chlorure de potassium, KCl.
8 Organismes d'essai
L'espèce recommandée pour cette Norme Internationale est Lemna minor (avec origine documentée). Il est
nécessaire de confirmer la taxonomie des plantes obtenues à partir d'une population sauvage.
9 Cultures mères et précultures
9.1 Cultures mères
Les cultures mères sont maintenues en conditions axéniques. L'ajout de glucose (1 %) permet l'identification
de contaminations microbiennes. Pour obtenir un milieu sous forme solide, il est possible d'ajouter environ
1 % de milieu gélosé (les milieux agréés sont indiqués dans l'Annexe A). Il est possible de conserver les
cultures mères pendant plusieurs mois dans des conditions de faible intensité lumineuse et à température
ambiante sans réensemencement si l'évaporation est minimisée en recouvrant le bouchon de l'Erlenmeyer
avec du papier aluminium (voir aussi Annexe A).
9.2 Précultures
Débuter les cultures utilisées pour les essais de toxicité 7 j à 10 j avant l'essai, en utilisant le milieu d'essai et
en respectant les conditions d'essai.
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NOTE 1 Une période d'adaptation plus longue peut être nécessaire lorsque le milieu nutritif doit être modifié entre la
culture mère et la préculture.
NOTE 2 Si le milieu APHA modifié est utilisé, un traitement spécifique sera nécessaire (voir Annexe A).
Il convient que les lentilles d'eau utilisées pour les essais de toxicité satisfassent aux critères suivants
traduisant une bonne santé de la préculture:
⎯ croissance exponentielle;
ème
⎯ pendant la préculture, il convient que le nombre de frondes ait septuplé à la fin du 7 jour (c'est-à-dire
r W 0,275 par jour ou temps de doublement u 2,5 jours);
⎯ il convient que la culture se compose de colonies jeunes, à croissance rapide, de couleur vert vif, ne
présentant aucune lésions, chloroses ou nécroses;
⎯ un nombre élevé de frondes individuelles ou de petites colonies est un signe de stress environnemental;
⎯ il convient que la profondeur du milieu soit de 3 cm au minimum.
Afin de minimiser les phases de latence engendrées par les interactions entre les colonies, il convient de
s'assurer que le recouvrement de la surface totale disponible soit inférieur à 50 % (absence de
chevauchement). Il convient que toutes les colonies proviennent de la même préculture.
10 Mode opératoire
10.1 Généralités
Les recommandations générales à prendre en considération sont celles de l'ISO 5667-16. Ajuster la valeur du
pH de l'échantillon pour essai à ± 0,2 de la valeur du pH du milieu nutritif du témoin en ajoutant de l'acide
chlorhydrique (7.2) ou une solution d'hydroxyde de sodium (7.3). Il convient que la dilution soit minimale et
qu'aucun ajustement ne soit effectué par la suite.
NOTE En règle générale, les lentilles d'eau ne présentent aucun problème de croissance lorsque le pH est compris
entre 5 et 9. Un ajustement du pH n'est, par conséquent, pas nécessaire tant que le pH de l'échantillon reste compris
entre 5 et 8, en fonction du pouvoir tampon.
La neutralisation n'est pas toujours autorisée si l'effet du pH doit être pris en compte dans les résultats d'essai ou si une
modification physique ou une réaction chimique est observée en raison de l'ajustement du pH.
10.2 Préparation de la gamme de concentrations pour l'évaluation de la valeur de CE(r)
x
Si la CE(r) doit être évaluée, un nombre suffisant de concentrations est utilisé pour définir cette CE(r) avec
x x
un niveau de confiance approprié. Un dispositif expérimental adéquat consiste en une série géométrique d'au
moins cinq concentrations. Il convient qu'au moins une valeur d'inhibition mesurée soit inférieure à la CE(r) à
x
estimer et une autre supérieure à cette dernière et, que pour trois valeurs ou plus, les pourcentages
d'inhibition soient différents de 0 % ou de 100 %. Dans le cas contraire, il est possible que les limites de
confiance soient trop importantes.
10.3 Essai
10.3.1 Essai pour la détermination d'une CE(r)
x
Pour l'évaluation de la CE(r) (voir aussi ISO 5667-16), préparer 3 réplicats au moins pour chaque
x
concentration et 6 réplicats pour les témoins.
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ISO 20079:2005(F)
10.3.2 Essai pour la détermination d'une CE(r)
<20
Le nombre de réplicats dépend en grande partie de l'importance du coefficient de variation attendu et des
écarts tolérés. Il est possible de calculer le coefficient de variation à partir d'essais réalisés sur un grand
nombre de témoins (voir aussi ISO 5667-16).
10.3.3 Essai limite
Une série de dilutions n'est pas nécessaire quand il s'agit seulement de vérifier si une concentration donnée
ou un niveau de dilution présente un effet (essai limite). Utiliser au moins 6 réplicats pour la concentration
limite et le témoin.
10.3.4 Utilisation de solvants ou de dispersants
S'il n'est pas possible d'éviter l'utilisation de solvants ou de dispersants (à une concentration maximale de
0,1 ml/l ou 100 mg/l respectivement), préparer un témoin supplémentaire avec 6 réplicats comprenant le
solvant ou le dispersant à la même concentration que celle de tous les récipients. Les solvants ou les
dispersants ne doivent provoquer aucun effet toxique à la concentration choisie.
10.3.5 Essai avec des substances de référence
Effectuer un essai avec le 3,5-dichlorophénol et/ou une solution de chlorure de potassium (7.7.1, 7.7.2).
Il convient que la CE(r) (nombre de frondes) se trouve dans une gamme comprise entre 2,2 mg/l et 3,8 mg/l
50
pour le 3,5-dichlorophénol et entre 5,5 g/l et 10,0 g/l pour le chlorure de potassium.
Il est possible d'effectuer un essai avec la substance de référence pour vérifier le mode opératoire et la
sensitivité. Il est recommandé de contrôler les substances de référence périodiquement et d'utiliser des cartes
de contrôle pour mesurer en laboratoire la précision et surveiller l'état de la culture. Pour la préparation des
[13]
cartes de contrôle .
NOTE 1 La gamme pour le 3,5-dichlorophénol (essai réalisé avec le milieu STEINBERG modifié) est basée sur les
données obtenues lors des essais interlaboratoires réalisés pour la présente Norme Internationale. La gamme pour le
chlorure de potassium (essai réalisé avec le milieu STEI
...
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