ISO 11348-3:2007
(Main)Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria
ISO 11348 describes three methods for determining the inhibition of the luminescence emitted by the marine bacterium Vibrio fischeri (NRRL B‑11177). ISO 11348-3:2007 specifies a method using freeze‑dried bacteria. This method is applicable to: waste water; aqueous extracts and leachates; fresh water (surface and ground water); sea and brackish water; eluates of sediment (freshwater, brackish and sea water); pore water; single substances, diluted in water.
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries luminescentes) — Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
L'ISO 11348 décrit trois méthodes de détermination de l'inhibition de la luminescence émise par la bactérie marine Vibrio fischeri (NRRL B-11177). L'ISO 11348-3:2007 spécifie une méthode utilisant des bactéries lyophilisées. Cette méthode est applicable aux eaux usées, aux extraits aqueux et aux lixiviats, aux eaux douces (eaux de surface ou souterraines), à l'eau de mer ou aux eaux saumâtres, aux éluats de sédiments (eau douce, eau saumâtre et eau de mer), aux eaux interstitielles et aux substances individuelles diluées dans l'eau.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 11348-3
Второе издание
2007-12-01
Качество воды. Определение
ингибиторного воздействия проб воды
на испускание света бактериями Vibrio
fischeri (тест на люминесцентные
бактерии).
Часть 3.
Метод с применением бактерий
лиофильной сушки
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples
on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) —
Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номерr
ISO 11348-3:2007(R)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe — торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2007
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Сущность метода.2
4 Мешающие элементы .2
5 Реактивы и материалы.2
6 Аппаратура.3
7 Отбор проб и предварительная подготовка проб .4
8 Проведение анализа .5
9 Оценка.7
10 Обработка результатов.9
11 Критерии достоверности .11
12 Прецизионность.11
13 Протокол испытания.11
Приложение A (информативное) Метод коррекции цвета .13
Приложение B (информативное) Уровень разведения D. Приготовление серии разведений .16
Приложение С (информативное) Показатели прецизионности.19
Приложение D (информативное) Анализ проб соленой воды с люминесцентными
бактериями лиофильной сушки .20
Библиография.23
© ISO 2007 — Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член ISO, заинтересованный
в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в
этом комитете. Международные организации, правительственные и неправительственные, имеющие
связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO непосредственно сотрудничает с
Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам электротехнической
стандартизации.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего документа могут быть объектом патентных
прав. ISO не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных
прав.
ISO 11348-3 был разработан Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 5,
Биологические методы.
Настоящее второе издание отменяет и заменяет первое издание (ISO 11348-1:1998), которое прошло
технический пересмотр.
ISO 11348 включает следующие части под общим заголовком Качество воды. Определение
ингибиторного воздействия проб воды на световое излучение бактерий Vibrio fischeri (Тест на
люминесцентные бактерии):
Часть 1. Метод с применением свежеприготовленных бактерий
Часть 2. Метод с применением высушенных бактерий
Часть 3. Метод с применением бактерий лиофильной сушки
iv © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
Введение
Измерения, установленные в ISO 11348 можно осуществить, используя свежеприготовленные
бактерии, а также бактериальные препараты после обычной или сублимационной сушки.
Стандартизованные методы, разработанные и осуществленные DIN Normenausschuss Wasserwesen и
ISO/TC 147/SC 5/WG 1 показали, что в определенных случаях такие разные способы подготовки
бактерий могут давать отличающиеся результаты, особенно в присутствии тяжелых металлов.
Изменчивая чувствительность вызвана различиями в составе используемых для получения бактерий
обычной и лиофильной сушки сред. Эти защитные среды влияют на биологическую доступность
ядовитых веществ и/или излучение света люминесцентными бактериями. Это означает, что
происхождение и тип препарата необходимо принимать в расчет при интерпретации результатов. Это
иногда трудно сделать, поскольку бактерии обычной и лиофильной сушки могут быть получены от
разных поставщиков. Это, в свою очередь, может означать, что состав подробно неизвестен и поэтому
не может быть истолкован пользователем.
По этой причине в дополнение к измерениям токсичности высушенных бактерий (ISO 11348-2) и
свежеприготовленных бактерий (ISO 11348-1), описывается процедура, использующая бактерий
лиофильной сушки, в данной части ISO 11348, выполнение которой может толковаться пользователем
очень подробно.
Лаборатории, ответственные за результаты, имеют возможность выбора наиболее подходящего
метода на основе оценки специалистов и информации об испытуемой пробе воды.
© ISO 2007 — Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 11348-3:2007(R)
Качество воды. Определение ингибиторного воздействия
проб воды на испускание света бактериями Vibrio fischeri
(тест на люминесцентные бактерии).
Часть 3.
Метод с применением бактерий лиофильной сушки
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ— Пользователи настоящей части ISO 11348 должны быть знакомы с
обычной лабораторной практикой. Настоящий международный стандарт не ставит цели решить
все проблемы, связанные с безопасностью, если таковые возникают в процессе его
использования. Пользователь сам несет ответственность за установление соответствующих
правил безопасности и охраны здоровья, а также за обеспечения соответствия всем
регламентным требованиям.
ВНИМАНИЕ— Чрезвычайно важно, чтобы все испытания, проводимые в соответствии с
настоящей частью ISO 11348, выполнялись персоналом с соответствующей подготовкой.
1 Область применения
ISO 11348 описывает три метода для определения подавления люминесценции, производимой
морскими бактериями Vibrio fischeri (NRRL B-11177). В данной части ISO 11348 устанавливается метод
с использованием бактерий лиофильной сушки.
Этот метод применим к:
сточной воде;
водным экстрактам и продуктам выщелачивания;
свежей воде (поверхностным и грунтовым водам);
морской и солоноватой воде;
элюатам отстоя (свежей, солоноватой и морской воды);
внутрипоровой воде;
отдельным веществам, растворенным в воде.
2 Нормативные ссылки
Нижеследующие документы являются обязательными для применения данного документа. Для
датированных ссылок действительно только указанное издание. В случае недатированных ссылок
используется последняя редакция документа, на который дается ссылка (включая все изменения).
ISO 5667-16, Качество воды. Отбор проб. Часть 16: Руководство по биотестированию образцов
© ISO 2007 — Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
ISO 5814, Качество воды. Определение содержания растворенного кислорода. Электрохимический
метод с применением зонда
3 Сущность метода
Подавление излучения света культурами Vibrio fischeri определяют посредством анализа серии. Оно
заключается в соединении установленных объемов испытуемой пробы или разбавленной пробы с
суспензией люминесцентных бактерий в пробирке.
Критерием испытания является люминесценция, измеренная по прошествии установленного времени
контакта, от 15 мин до 30 мин, иногда по выбору 5 мин, принимая во внимание поправочный
коэффициент (f ), который является мерой изменения интенсивности контрольных проб в течение
kt
времени экспонирования. Эффект подавления, вызванного пробой воды, можно определить как LID
(см. Приложение B) или как EC и/или значений EC с помощью серии разведений. (EC =
20 50
эффективная концентрация).
4 Мешающие элементы
Нерастворимые, плохо растворимые или летучие вещества, или вещества, вступающие в реакцию с
водой для разбавления или с суспензией, или изменяющие свое состояние во время периода
испытания, могут повлиять на результаты или ухудшить воспроизводимость результатов испытания.
Убыль люминесценции, вызванная поглощением света или рассеянием света, может произойти в
случае сильно окрашенных или мутных вод. Такие помехи можно скомпенсировать путем обработки на
мутность (7.2) или, например, путем использования двухкамерной трубки коррекции поглощения (см.
Приложение A).
[6]
Поскольку кислород требуется для биолюминесценции , пробы с высоким потреблением кислорода
(и/или низкой концентрацией кислорода) могут вызывать дефицит кислорода и поэтому являются
ингибиторными.
Легко биологически разлагающиеся питательные вещества в пробе могут привести к независимому от
[1]
примесей понижению биолюминесценции .
Пробы, значения pH которых выпадает за диапазон от pH = 6,0 до pH = 8,5, влияют на люминесценцию
[6], [7]
бактерий . Регулирование рН пробы требуется, если токсичный эффект pH не желателен.
Поскольку испытуемые микроорганизмы Vibrio fischeri являются морскими бактериями, испытание проб
солоноватой воды с помощью стандартного метода часто приводит к стимуляции биолюминесценции,
что может замаскировать ингиюирующие эффекты (см. Приложение D).
Концентрация соли в исходной пробе, превышающая 30 г/л NaCl, или содержание других веществ,
дающих аналогичную осмолярность, может привести, наряду с добавлением соли, требуемым
испытанием, к гиперосмотическим эффектам. Результирующая концентрация соли в испытуемых
пробах не должна превышать осмолярность раствора концентрацией 35 г/л NaCl, чтобы избежать
таких эффектов.
5 Реактивы и материалы
Используют химические реактивы признанной аналитической чистоты. Воду используют
дистиллированную или равноценной чистоты.
2 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
5.1 Испытуемые бактерии.
Используют штамм люминесцентных бактерий, принадлежащих виду Vibrio fischeri NRRL B-11177.
Бактериальный штамм можно приобрести в виде имеющихся в продаже бактерий лиофильной сушки,
которые можно хранить в морозильной камере при температуре от −18 °C до −20 °C. Бактерии
начинают светиться непосредственно после восстановления влагосодержания и готовы к применению
в анализе.
5.2 Раствор хлорида натрия, в качестве разбавителя.
Растворяют 20 г хлорида натрия (NaCl) в воде и доводят до 1 л водой.
5.3 Раствор гидроксида натрия, например, c(NaOH) = 1 моль/л.
5.4 Соляная кислота, например, c(HCl) = 1 моль/л.
Для регулировки pH может потребоваться использовать кислоты или основания низкой или высокой
концентрации.
5.5 Раствор для получения бактерий лиофильной сушки.
20 г Хлорид натрия (NaCl)
2,035 г Гексагидрат хлорида магния (MgCl ·6 H O)
2 2
0,30 г Хлорид калия (KCl)
Растворяют в воде и доводят водой до объема 1 л. Этот раствор можно хранить порциями в
морозильной камере при температуре от −18 °C до −20 °C.
5.6 Контрольные вещества.
Готовят следующие исходные растворы контрольных веществ с раствором хлорида натрия (5.2) в
качестве растворителя по отдельности, без регулировки pH:
19,34 мг/л Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO ·7 H O)
4 2
6,8 мг/л 3,5- дихлорофенол (C H OCl ) (чистота ≥ 99 %)
6 4 2
105,8 мг/л Дихромат калия (K Cr O )
2 2 7
Эти концентрации примерно вдвое превышают ожидаемые значения EC для соответствующих
50
контрольных веществ в данной части ISO 11348. Требуемые объемы зависят от установочных
параметров испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ Можно использовать имеющиеся в продаже химические препараты с определенной
концентрацией ZnSO и K Cr O (титрисол) для приготовления исходных растворов контрольных веществ.
4 2 2 7
6 Аппаратура
6.1 Морозильная камера, для хранения консервированных бактерий.
6.2 Термостат или холодильник, для хранения исходной суспензии (8.2) и, необязательно,
“раствора для бактерий лиофильной сушки” (5.5) (вариант B) при температуре 4 °C ± 3 °C.
6.3 Термоблок с термостатическим контролем, для поддержания испытуемых проб при
температуре 15 °C ± 1 °C. В процессе одного эксперимента температура не должна отклоняться более
чем на ± 0,3 °C.
© ISO 2007 — Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
6.4 Люминометр, измерительная ячейка, поддерживаемая при температуре 15 °C ± 1 °C,
оснащенная подходящими пробирками.
6.5 Пробирки, изготовленные из химически стойкого материала, подходящие к выбранному
люминометру вместимостью, которая помогает снимать показания по максимально возможно площади
поверхности и вмещается в термоблок (6.3).
6.6 pH-метр.
6.7 Хронометр.
6.8 Поршневые пипетки или пластиковые шприцы, 100 мкл, 500 мкл и 1 000 мкл.
6.9 Поршневые пипетки, переменного объема, от 10 мл до 200 мл и от 200 мкл до 5 000 мкл.
6.10 Кондуктометр.
6.11 Зонд для определения кислорода, в соответствии с ISO 5814.
7 Отбор проб и предварительная подготовка проб
7.1 Отбор проб
Пробы собирают в химически инертные чистые контейнеры в соответствии с ISO 5667-16. Контейнеры
наполняют полностью и герметично закрывают. Пробы испытывают, по возможности, быстро после
отбора. Там где необходимо, хранят пробы при температуре от 2 °C до 5 °C в темном месте в
контейнерах не более 48 ч. До 2 месяцев можно хранить при температуре u−18 °C. Не допускается
использовать специальные химические вещества-консерванты. Выполняют необходимую регулировку
pH и добавляют соль непосредственно перед испытанием.
7.2 Подготовка пробы
Измеряют концентрацию кислорода во всех пробах. Для испытания требуется концентрация кислорода
> 3 мг/л. Если концентрация кислорода в неразбавленной пробе меньше 3 мг/л, используют
адекватные методы для насыщения пробы кислородом, например, аэрацию или перемешивание.
Измеряют pH всех проб. если значение pH попадает в диапазон от 6,0 до 8,5, в регулировании рН
обычно нет необходимости. Регулировка значения pH, однако, может изменять природу пробы. С
другой стороны, pH пробы и pH испытуемой партии могут отличаться в результате буферной емкости
испытательной среды. Может потребоваться осуществлять испытания на пробах с отрегулированным
рН и на пробах с неотрегулированным рН.
Если необходимо, регулируют pH пробы путем добавления либо соляной кислоты (5.4), либо раствор
гидроксида натрия (5.3). В зависимости от цели испытания pH можно довести до 7,0 ± 0,2 или выше до
(8,5 ± 0,2) с нижним пределом (6,0 ± 0,2). Выбирают концентрацию соляной кислоты или раствора
гидроксида натрия , так чтобы ограничить добавляемый объем до не более 5 % от общего объема.
Добавляют 20 г раствора хлорида натрия на литр пробы воды или к нейтрализованной пробе воды.
Для проб с высокой концентрацией солей измеряют соленость и добавляют такое количество соли,
которое необходимо для регулирования осмолярности до 20 г/л NaCl.
Если проба содержит от 20 г/л до 50 г/л эквивалента NaCl, соли добавлять не требуется.
Результирующая концентрация соли в испытуемых пробах не должна превышать осмолярности 35 г/л
раствора хлорида натрия.
Дополнительную информацию в отношении проб соленой воды см. Приложение D.
4 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
Очень мутные пробы необходимо выдержать в течение 1 ч, чтобы дать отстояться, или
центрифугировать, например, в течение 10 мин при 5 000g, или фильтровать. Используют для
испытания надосадочную жидкость или фильтрат.
8 Проведение анализа
8.1 Начальные приготовления
Готовят контрольные пробы согласно 5.6. Анализируют каждую серию бактерий со всеми тремя
контрольными веществами. Анализируют не менее одного из трех контрольных веществ параллельно
с каждой пробиркой исходной суспензии, оттаянной для анализа.
Пробы готовят в соответствии с 7.2.
Готовят первый набор пробирок (6.5), серии разведения пробы, контрольную пробу (5.6) и требуемые
контроли (5.2).
Обычная подготовка серии разведения описана в Приложении B. В зависимости от цели анализа и
статистических требований в отношении результатов испытания, могут использоваться другие
пропорции разведений с концентрациями, распределенными в геометрическом ряду или
логарифмическом ряду. Благодаря смешению равных объемов пробы/разбавленной пробы и
испытуемой суспензии самая высокая концентрация пробы в анализе составляет, как правило, 50 %
собственно пробы. Для испытания практически неразбавленных проб воды (80 % пробы), требуется
дополнительная контрольная серия (см. B.2 и Таблицу 1).
Поддерживают пробирки, содержащие раствор хлорида натрия (5.2) для контроля, контрольные пробы
(5.6), сами пробы (7.2) и пробы серии разведения (Таблица B.1) при температуре 15 °C ± 1 °C.
Выбирают условия испытания, которые гарантируют максимальное отклонение температуры в
термоблоке в процессе одного эксперимента не более ± 0,3 °C.
8.2 Подготовка исходной суспензии
Извлекают ампулу с бактериями лиофильной сушки (содержимого ампулы хватает на 100 измерений)
из морозильной камеры непосредственно перед восстановлением влагосодержания в воде. Для этого
охлаждают 1 мл дистиллированной воды в стеклянной пробирке до температуры 4 °C ± 3 °C.
Переливают этот объем охлажденной воды целиком за один раз в ампулу с бактериями лиофильной
сушки, сводя таким образом к минимуму повреждение клеток в процессе регидратации.
Важно добавлять воду быстро, чтобы дать бактериям прийти в контакт с водой сразу, избегая
образования комков и потери активности. Поэтому не рекомендуется использование пипетки. Точность
объема воды не является критической.
8
Суспензия люминесцентных бактерий с восстановленным влагосодержанием (концентрация 10 клеток
на миллилитр) служит исходной суспензией; хранят ее при температуре 4 °C ± 3 °C. Такую исходную
суспензию можно использовать для анализа пока удовлетворяются критерии достоверности,
описанные в Разделе 11. Регидративные бактерии повторной заморозки можно использовать только
для предварительных испытаний.
8.3 Приготовление суспензий для испытания
8.3.1 Начальный этап
Выдержав не менее 10 мин, готовят испытуемые суспензии из исходной суспензии во втором наборе
пробирок (6.5), поддерживаемых при температуре 15 °C ± 1 °C по одному из двух вариантов.
© ISO 2007 — Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
8.3.2 Вариант A
Готовят испытуемые суспензии непосредственно в пробирках.
Добавляют аликвотные количества 10 мкл исходной суспензии к 500 мкл раствора (5.5),
содержащегося в пробирках, поддерживаемых при температуре 15 °C ± 1 °C, через те же временные
интервалы (от 5 с до 20 с), как для последующих измерений интенсивности излучения. Встряхивают
смеси вручную.
8.3.3 Вариант B
Готовят испытуемые суспензии в конической колбе (а не в пробирках) вместимостью, например,
250 мл.
Добавляют 1 объем исходной суспензии к 50 объемам раствора (5.5), поддерживаемого при
температуре 4 °C ± 3 °C и тщательно перемешивают полученную суспензию.
С помощью пипетки переливают по 500 мкл испытуемой суспензии в пробирки, поддерживаемые при
температуре 15 °C ± 1 °C в инкубаторе (термостате), через такие же интервалы времени (от 5 с до
20 с), как используются для последующих измерений интенсивности.
ПРИМЕЧАНИЕ Ампулы с меньшим объемом бактерий лиофильной сушки (например, когда содержимого
ампулы хватаетт на 20 или на10 измерений) также имеются в продаже. Лиофилизованные бактерии в этих
ампулах восстанавливают непосредственно перед добавлением адекватного объема “среды для бактерий
лиофильной сушки” (5.5). Полученная суспензия для испытания обрабатывается по варианту B (8.3.3) путем
розлива по 500 мкл этого раствора в пробирки, поддерживаемые при температуре 15 °C ± 1 °C, в термостате.
8.4 Проведение анализа
Выполняют два параллельных измерения на уровень разведения при температуре испытания
15 °C ± 1 °C.
Регулируют люминометр на удобные близкие к максимуму установочные параметры.
После кондиционирования в течение не менее 15 мин определяют и регистрируют интенсивность
люминесценции, I , испытуемых суспензий с помощью люминометра.
0
Поскольку время контакта для всех испытуемых проб должно быть одинаковым, используют хронометр
(6.7) для измерения интенсивности люминесценции через равные промежутки времени,
последовательно. Удобным считается интервал от 5 с до 20 с.
Измеряют все испытуемые суспензии, поскольку можно ожидать отличающуюся люминесценцию в
результате возможной неоднородности испытуемой суспензии.
Немедленно после измерения начальной люминесценции испытуемой суспензии доводят эту
суспензию до полного объема 1 мл пробами (7.2), разбавленными пробами (Приложение B),
контрольными веществами (5.6) или раствором хлорида натрия (5.2), по обстоятельствам. Это
выполняют путем пипетирования по 500 мкл каждой пробы, разбавленной пробы, контрольных проб
или раствора хлорида натрия, приготовленных в первом наборе пробирок, к испытуемым суспензиям
каждой пробирки в соответствующем втором наборе пробирок. Перемешивают вручную, включают
хронометр и помещают пробирки снова в термоблок при температуре 15 °C ± 1 °C
Повторяют то же самое для всех остальных пробирок, оставляя такие же промежутки времени между
последовательными добавлениями.
Определяют и регистрируют интенсивность люминесценции во всех испытательных пробирках второго
набора, включая контроли, после (необязательно) 5 мин (I ) и снова спустя 15 мин и 30 мин (I , I ), по
5 15 30
мере необходимости, через интервалы от 5 с до 20 с.
6 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
Записывают параметры прибора.
9 Оценка
9.1 Ингибиторное воздействие на люминесцентные бактерии
Рассчитывают поправочный коэффициент (значение f ) по измеренной интенсивности люминесценции
kt
с помощью Уравнения (1). Этот коэффициент служит для внесения поправки в исходное значение I
0
всех испытуемых проб до того, как их можно будет использовать в качестве контрольных значений для
определения зависимой от воды люминесценции.
f = I / I (t = 5 мин, 15 мин, 30 мин) (1)
kt kt 0
где
f поправочный коэффициент для времени контакта 5 мин, 15 мин или 30 мин;
kt
I интенсивность люминесценции в контрольной пробе после времени контакта 5 мин, 15 мин
kt
или 30 мин, в относительных единицах люминесценции;
I интенсивность люминесценции контрольной испытуемой суспензии, непосредственно перед
0
добавлением разбавителя (5.2), в относительных единицах люминесценции.
Рассчитывают средний поправочный коэффициент f и отклонения отдельных значений от среднего
kt
в процентах (одна значащая цифра) по Уравнению (2):
ff±×/f 100 (2)
()
kktti
kt
где
f любое из двух отдельных значений поправочного коэффициента f является средним
kti
kt
значением.
Рассчитывают I по Уравнению (3):
ct
I=×If (3)
ct 0 kt
где
f среднее от f ;
kt kt
I интенсивность люминесценции суспензии испытуемой пробы непосредственно перед
0
добавлением пробы (7.2) или разбавленной пробы (Приложение B), в относительных
единицах люминесценции;
I скорректированное значение I для пробирок с пробой непосредственно перед добавлением
ct 0
испытуемой пробы.
Рассчитывают ингибиторное действие испытуемой пробы по Уравнению (4):
H = [(I − I )/I ] × 100 (4)
t ct t ct
где
H ингибиторное воздействие испытуемой пробы после времени контакта 5 мин, 15 мин или
t
30 мин, в процентах;
© ISO 2007 — Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
I см. Уравнение (3);
ct
I интенсивность люминесценции испытуемой пробы после времени контакта 5 мин, 15 мин или
t
30 мин, в относительных единицах люминесценции.
Рассчитывают среднее значение ингибиторного воздействия H для каждого уровня разведения, в
t
процентах.
Рассчитывают арифметическую разность параллельных определений H по их соответствующему
ti
среднему H , в процентных точках (одна значащая цифра):
t
HH(%)- (%)
tti
где
H любое из двух отдельных значений ингибиторного воздействия испытуемой пробы и H
t
ti
является среднее значение
Для оценки взаимосвязи концентрация-воздействие вычисляют значение гамма для каждого уровня
разведения по Уравнению (5):
Γ=−H / 100 H (5)
tt()
t
где
Γ гамма-значение испытуемой пробы после времени контакта 5 мин, 15 мин или 30 мин;
t
H среднее от H , см. Уравнение (4).
t
t
9.2 Определение значений EC
Рассчитывают взаимосвязь концентрация-воздействие для каждого времени экспонирования,
[8]
используя стандартный анализ линейной или нелинейной регрессии .
Для оценки взаимосвязи концентрация-воздействие с помощью анализа линейной регрессии, для
каждого уровня разведения вычисляют значение гамма (отношение убыли света к количеству света,
оставшегося на момент времени t) по Уравнению (5):
Γ=−H / 100 H
tt()
t
где
Γ гамма-значение испытуемой пробы после времени контакта 5 мин, 15 мин или 30 мин;
t
H среднее от H , см. Уравнение (4).
t
t
ПРИМЕЧАНИЕ Если определенная испытуемая концентрация дает 0 % или 100 % подавления
биолюминесценции, то гамма-значение рассчитать невозможно. Поэтому обычно только значения H от 10 % до
t
90 % используют в расчетах взаимосвязи концентрация-воздействие.
Взаимосвязь концентрация-воздействие при заданном времени экспонирования часто можно описать
следующим линейным уравнением:
lg c = b lg Γ + lg a (6)
t t
где
8 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 11348-3:2007(R)
c порция пробы воды в испытуемой пробе, в процентах;
t
Γ см. уравнение (5);
t
b значение наклона описанной линии;
lg a значение отсекаемого отрезка описанной линии.
С помощью стандартной статистики регрессии наименьших квадратов рассчитывают EC
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11348-3
Second edition
2007-12-01
Water quality — Determination
of the inhibitory effect of water samples
on the light emission of Vibrio fischeri
(Luminescent bacteria test) —
Part 3:
Method using freeze-dried bacteria
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons
d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries
luminescentes) —
Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
Reference number
ISO 11348-3:2007(E)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2007
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 2
4 Interferences . 2
5 Reagents and materials . 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling and sample pretreatment. 4
8 Procedure . 4
9 Evaluation. 6
10 Expression of results . 8
11 Criteria of validity. 10
12 Precision. 10
13 Test report . 10
Annex A (informative) Colour-correction method. 11
Annex B (informative) Dilution level D — Preparation of the dilution series . 14
Annex C (informative) Precision data. 17
Annex D (informative) Testing salt water samples with the luminescent bacteria test with
freeze-dried bacteria. 18
Bibliography . 21
© ISO 2007 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11348-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11348-3:1998), which has been technically
revised.
ISO 11348 consists of the following parts, under the general title Water quality — Determination of the
inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test):
⎯ Part 1: Method using freshly prepared bacteria
⎯ Part 2: Method using liquid-dried bacteria
⎯ Part 3: Method using freeze-dried bacteria
iv © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
Introduction
The measurements specified in ISO 11348 can be carried out using freshly prepared bacteria, as well as
freeze-dried or liquid-dried bacterial preparations.
Standardized work carried out by DIN Normenausschuss Wasserwesen and ISO/TC 147/SC 5/WG 1 has
shown that, in special cases, these different techniques may give different results, especially in the presence
of heavy metals.
Such varying sensitivity is caused by differences in media composition used in the preparation of freeze-dried
or liquid-dried bacteria. These protective media influence the bioavailability of toxicants and/or the light
emission of luminescent bacteria. This means that the origin and type of preparation need to be taken into
account when interpreting the results. This may be difficult sometimes, as freeze-dried and liquid-dried
bacteria may be obtained from different suppliers. This, in turn, can mean that the composition is not known in
detail and therefore cannot be interpreted by the user.
For this reason, in addition to toxicity measurements with liquid-dried bacteria (ISO 11348-2) and freshly
prepared bacteria (ISO 11348-1), a procedure with freeze-dried bacteria is described in this part of ISO 11348,
the performance of which can be interpreted by the user in every detail.
The laboratories responsible for the results have the opportunity to select the most suitable technique based
on expert judgement and information about the water sample to be tested.
© ISO 2007 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11348-3:2007(E)
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water
samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent
bacteria test) —
Part 3:
Method using freeze-dried bacteria
WARNING — Persons using this part of ISO 11348 should be familiar with normal laboratory practice.
This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It
is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure
compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of
ISO 11348 be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
ISO 11348 describes three methods for determining the inhibition of the luminescence emitted by the marine
bacterium Vibrio fischeri (NRRL B-11177). This part of ISO 11348 specifies a method using freeze-dried
bacteria.
This method is applicable to:
⎯ waste water;
⎯ aqueous extracts and leachates;
⎯ fresh water (surface and ground water);
⎯ sea and brackish water;
⎯ eluates of sediment (freshwater, brackish and sea water);
⎯ pore water;
⎯ single substances, diluted in water.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
© ISO 2007 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
3 Principle
The inhibition of light emission by cultures of Vibrio fischeri is determined by means of a batch test. This is
accomplished by combining specified volumes of the test sample or the diluted sample with the luminescent
bacteria suspension in a test tube.
The test criterion is the luminescence, measured after a contact time of 15 min or 30 min and optionally 5 min,
taking into account a correction factor (f ), which is a measure of intensity changes of control samples during
kt
the exposure time. The inhibitory effect of the water sample can be determined as LID (see Annex B) or as
EC - and/or EC -values by means of a dilution series. (EC is the effective concentration.)
20 50
4 Interferences
Insoluble, slightly soluble or volatile substances or substances which react with the dilution water or the
suspension, or alter their state during the test period, may affect the result or impair the reproducibility of the
test results.
Losses of luminescence caused by light absorption or light scattering may occur in the case of strongly
coloured or turbid waters. This interference can be compensated by a sample treatment for turbidity (7.2) or,
for example, by using a double-chambered absorption correction test tube (see Annex A).
[6]
Since oxygen is required for the bioluminescence , samples with a high oxygen demand (and/or a low
oxygen concentration) may cause a deficiency of oxygen and be inhibitory.
Readily biodegradable nutrients in the sample may cause a pollutant-independent reduction in
[1]
bioluminescence .
[6], [7]
Samples with a pH outside the range of pH = 6,0 and pH = 8,5 affect the luminescence of the bacteria .
An adjustment of the sample is required when the toxic effect of pH is not wanted.
As the test organism Vibrio fischeri is a marine bacterium, testing salt-water samples with the standard
procedure often leads to stimulation effects of bioluminescence, which may mask inhibition effects (see
Annex D).
Salt concentrations in the initial sample exceeding 30 g/l NaCl, or contents of other compounds giving equal
osmolarity may lead, together with the salt spiking required by the test, to hyperosmotic effects. The resulting
salt concentration in the test samples should not exceed the osmolarity of a 35 g/l NaCl solution in order to
avoid these effects.
5 Reagents and materials
Use chemicals of recognized analytical grade quality. Use distilled water or water of equivalent purity.
5.1 Test bacteria.
Use a strain of luminescence bacteria belonging to the species Vibrio fischeri NRRL B-11177. The bacterial
suspensions used for toxicity measurements are prepared from commercially available freeze-dried reagents
which can be stored in a freezer at −18 °C to −20 °C. The bacteria start glowing immediately after
reconstitution and are ready to be used for the test.
5.2 Sodium chloride solution, as diluent.
Dissolve 20 g of sodium chloride (NaCl) in water and make up to 1 l with water.
5.3 Sodium hydroxide solution, e.g. c(NaOH) = 1 mol/l.
2 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
5.4 Hydrochloric acid, e.g. c(HCl) = 1 mol/l.
For the adjustment of the pH, it may be necessary to use acids or bases of lower or higher concentration.
5.5 Solution for freeze-dried bacteria.
20 g Sodium chloride (NaCl)
2,035 g Magnesium chloride hexahydrate (MgCl ·6 H O)
2 2
0,30 g Potassium chloride (KCl)
Dissolve in water and make up to 1 l with water. The solution may be stored in portions in a freezer at −18 °C
to −20 °C.
5.6 Reference substances.
Prepare the following reference-substance stock solutions with sodium chloride solution (5.2) as diluent
separately, without adjustment of the pH:
19,34 mg/l Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO ·7 H O)
4 2
6,8 mg/l 3,5-Dichlorophenol (C H OCl ) (purity > 99 %)
6 4 2
105,8 mg/l Potassium dichromate (K Cr O )
2 2 7
These concentrations are approximately twice the expected EC -values for the respective reference
50
substances in this part of ISO 11348. The volumes required depend on the test set-up.
NOTE It is possible to use commercially available chemical preparations with defined concentrations of ZnSO and
4
K Cr O (titrisol) for the preparation of the stock solutions of the reference substances.
2 2 7
6 Apparatus
6.1 Freezer, for the storage of preserved bacteria.
6.2 Incubator or refrigerator, to maintain the stock suspension (8.2) and, optionally, the “solution for
freeze-dried bacteria” (5.5) (variant B) at a temperature of 4 °C ± 3 °C.
6.3 Thermostatically controlled thermo-block, to maintain the test samples at a temperature of
15 °C ± 1 °C. Within one test, the temperature deviation should be at most ± 0,3 °C.
6.4 Luminometer, measuring cell maintained at 15 °C ± 1 °C, equipped with suitable test tubes.
6.5 Test tubes, made of a chemically inert material, appropriate for the selected luminometer and having a
capacity which facilitates the taking of a reading over the largest possible surface area and able to fit into the
thermo-block (6.3).
6.6 pH-meter.
6.7 Chronometer.
6.8 Piston pipettes or plastic syringes, 10 µl, 500 µl and 1 000 µl.
6.9 Piston pipettes, with variable volume, 10 ml to 200 ml and 200 µl to 5 000 µl.
6.10 Conductometer.
6.11 Oxygen probe, in accordance with ISO 5814.
© ISO 2007 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
7 Sampling and sample pretreatment
7.1 Sampling
Collect samples in chemically inert, clean containers as specified in ISO 5667-16. Fill the containers
completely and seal them. Test the samples as soon as possible after collection. Where necessary, store
samples at 2 °C to 5 °C in the dark in the containers for not longer than 48 h. For periods up to two months,
store at u −18 °C. Do not use chemicals to preserve the samples. Perform the necessary pH-adjustment and
salt addition immediately before testing.
7.2 Sample preparation
Measure the oxygen concentration in all samples. An oxygen concentration > 3 mg/l is required for the test. If
the oxygen concentration of the undiluted sample is less than 3 mg/l, use adequate methods to oxygenate the
sample, e.g. aeration or stirring.
Measure the pH of all samples. If the pH is between 6,0 and 8,5, an adjustment is usually not necessary.
Adjustment of the pH-value, however, may alter the nature of the sample. On the other hand, the pH of the
sample and the pH of the test batch may differ because of the buffer capacity of the test medium. It may be
necessary to carry out tests on both the pH-adjusted and the non-pH-adjusted samples.
If necessary, adjust the pH of the sample by adding either hydrochloric acid (5.4) or sodium hydroxide solution
(5.3). Depending on the purpose of the test, the pH may be adjusted to 7,0 ± 0,2 or to the upper (8,5 ± 0,2)
and lower limits (6,0 ± 0,2). Choose the concentration of the hydrochloric acid or the sodium hydroxide
solution to restrict the volume added to not more than 5 % of total volume.
Add 20 g of sodium chloride per litre to the water sample or to the neutralized water sample.
For samples with high salt concentrations, measure the salinity and add the amount of salt which is necessary
to adjust the osmolarity to 20 g/l NaCl.
If the sample contains between 20 g/l and 50 g/l NaCl-equivalents, add no salt. The resulting salt
concentration in the test samples shall not exceed the osmolarity of a 35 g/l sodium chloride solution.
For salt water samples, Annex D gives further information.
Strongly turbid samples should be allowed to settle for 1 h or centrifuged, for example for 10 min at 5 000g, or
should be filtered. Use the supernatant or filtrate for the test.
8 Procedure
8.1 Initial preparations
Prepare the reference samples according to 5.6. Test each batch of bacteria after delivery with all three
reference substances. Test at least one of the three reference substances in parallel to each stock suspension
vial reconstituted.
Prepare the samples according to 7.2.
Prepare, in a first set of test tubes (6.5), the sample dilution series, the reference sample (5.6) and the
controls (5.2) required.
4 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
A common procedure for the preparation of the dilution series is described in Annex B. Depending on the
purpose of the test and the statistical requirements concerning the test results, other dilution designs with
concentrations in a geometric or a logarithmic series may be appropriate as well. Due to mixing of equal
volumes of sample/diluted sample and test suspension, the highest sample concentration in the test is 50 %
sample as a rule. For the testing of nearly undiluted water samples (80 % sample), an extra control batch is
needed (see B.2 and Table 1).
Maintain the test tubes containing the sodium chloride solution (5.2) for controls, the reference samples (5.6),
the samples (7.2) and the samples of the dilution series (Table B.1) at 15 °C ± 1 °C.
Chose test conditions which safeguard that the maximum temperature deviation in the thermo-block within
one test is at most ± 0,3 °C.
8.2 Preparation of stock suspension
Remove the vial of the freeze-dried culture (contents sufficient for up to 100 measurements) from the freezer
immediately before reconstitution in water. For the reconstitution, cool 1 ml of distilled water in a glass test
tube to 4 °C ± 3 °C.
Pour this volume of cooled water all at once into the lyophilized bacteria in the vial, thereby minimizing cell
damage during the rehydration process.
It is important that water be added quickly, to allow the bacteria to come into contact with the water at once,
thus avoiding clumping and loss of activity. Therefore, do not use a pipette. The exact volume of water is not
critical.
8
The reconstituted luminescent bacteria suspension (cell concentration about 10 cells per millilitre) serves as
a stock suspension; store it at 4 °C ± 3 °C. The stock suspension may be used for testing purposes, as long
as the validity criteria stated in Clause 11 are met. Refrozen, rehydrated bacteria may be used for preliminary
tests only.
8.3 Preparation of test suspensions
8.3.1 Initial step
After a waiting time of at least 10 min, prepare the test suspensions from the stock suspension into a second
corresponding set of test tubes (6.5), maintained at 15 °C ± 1 °C by one of the two variants.
8.3.2 Variant A
Prepare the test suspensions directly in the test tubes.
Add 10 µl aliquots of the stock suspension to 500 µl of the solution (5.5), contained in test tubes maintained at
15 °C ± 1 °C, at the same time intervals (5 s to 20 s) as for later intensity measurements. Shake the mixtures
by hand.
8.3.3 Variant B
Prepare the test suspensions outside the test tubes in a conical flask (volume e.g. 250 ml).
Add 1 volume of the stock suspension to 50 volumes of the solution (5.5) maintained at 4 °C ± 3 °C and mix
the resultant suspension thoroughly.
Pipette 500 µl of test suspension into the test tubes, maintained at 15 °C ± 1 °C in the incubator, at the same
time intervals (5 s to 20 s) as used for later intensity measurements.
© ISO 2007 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
NOTE Vials with smaller volumes of freeze-dried bacteria (e.g. content sufficient for 20 or 10 measurements per vial)
are also commercially available. The lyophilized bacteria in these vials are reconstituted directly by adding an adequate
volume of “medium for freeze-dried bacteria” (5.5). The resulting test suspension is handled as in variant B (8.3.3) by
pipetting 500 µl of this solution into the test tubes, maintained at 15 °C ± 1 °C, in the incubator.
8.4 Test procedure
Carry out two parallel determinations per dilution level at a test temperature of 15 °C ± 1 °C.
Adjust the luminometer instrument to a convenient near-maximum setting.
After a conditioning time of at least 15 min, determine and record the luminescence intensity, I , of the test
0
suspensions by means of a luminometer.
As the contact time for all test samples shall be equal, use a chronometer (6.7) for the measurement of the
luminescence intensities at equal time intervals, seriatim. An interval of 5 s to 20 s has been found convenient.
Measure all samples, as differing luminescence may be expected due to possible inhomogeneities of the test
suspension.
Immediately after the luminescence measurement of a test suspension, make up this suspension to a total
volume of 1 ml with samples (7.2), diluted samples (Annex B), reference sample (5.6) or sodium chloride
solution (5.2), as appropriate, by pipetting 500 µl of each of the samples, diluted samples, reference sample or
sodium chloride solution, prepared in the first set of test tubes, to the test suspensions in each of the
corresponding tubes in the second set of test tubes. Mix by hand, start the chronometer and put the test tubes
back into the thermo-block at 15 °C ± 1 °C.
Repeat the above procedure for all other test tubes, leaving the same time interval between successive
additions.
Determine and record the luminescence intensity in all test tubes of the second set of test tubes, including
controls, after, optionally, 5 min (I ) and again after 15 min and 30 min (I , I ), as required, at intervals of 5 s
5 15 30
to 20 s.
Record the instrument adjustment.
9 Evaluation
9.1 Inhibitory effect on luminescent bacteria
Calculate the correction factor (f -value) from the measured luminescence intensity using Equation (1). This
kt
factor serves to correct the initial values I of all test samples before they can be used as reference values for
0
the determination of the water-dependent decrease in luminescence.
f = I / I (t = 5 min, 15 min, 30 min) (1)
kt kt 0
where
f is the correction factor for the contact time of 5 min, 15 min or 30 min;
kt
I is the luminescence intensity in the control sample after the contact time of 5 min, 15 min or 30 min,
kt
in relative luminescence units;
I is the luminescence intensity of the control test suspension, immediately before the addition of the
0
diluent (5.2), in relative luminescence units.
6 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
Calculate the mean correction factor f and the deviation of the individuals from the means in percent (one
kt
significant digit) using Equation (2):
⎡⎤
ff±×/f 100 (2)
()
⎢⎥kktti kt
⎣⎦
where
f is either of the two individual values of the correction factor and f is the mean value.
kt
kti
Calculate I using Equation (3):
ct
I=×If (3)
ct 0 kt
where
f is the mean of f ;
kt
kt
I is the luminescence intensity of the test sample suspension, immediately before the addition of the
0
sample (7.2) or the diluted sample (Annex B), in relative luminescence units;
I is the corrected value of I for test sample tubes immediately before the addition of the test sample.
ct 0
Calculate the inhibitory effect of a test sample using Equation (4):
⎡⎤
HI=−I /I×100 (4)
()
tt⎢⎥ct ct
⎣⎦
where
H is the inhibitory effect of a test sample after the contact time of 5 min, 15 min or 30 min, in percent;
t
I see Equation (3);
ct
I is the luminescence intensity of the test sample after the contact time of 5 min, 15 min or 30 min, in
t
relative luminescence units.
Calculate the mean of the inhibitory effect H for each dilution level, in percent.
t
Calculate the arithmetic difference of the parallel determinations of H from their respective mean H , in
ti t
percent points (one significant digit):
HH(%)− (%)
tti
where
H is either of the two individual values of the inhibitory effects of a test sample and H is the mean
ti t
value.
For evaluation of concentration-effect relationships, evaluate the gamma value for each dilution level using
Equation (5):
⎡⎤
Γ=−HH/ 100 (5)
()
tt t
⎢⎥
⎣⎦
where
Γ is the gamma value of the test sample after the contact time of 5 min, 15 min or 30 min;
t
H is the mean of H [see Equation (4)].
t t
© ISO 2007 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
9.2 Determination of EC-values
Calculate the concentration-effect relationship for each exposure time using suitable standard linear or non-
[8]
linear regression analysis .
For evaluation of concentration-effect relationships using a linear regression technique, evaluate, for each
dilution level, the gamma value (ratio of light lost to the amount of light remaining at time t) using Equation (5):
⎡⎤
Γ=−HH/ 100
()
tt t
⎢⎥
⎣⎦
where
Γ is the gamma value of the test sample after the contact time of 5 min, 15 min or 30 min;
t
H is the mean of H , see Equation (4).
t
t
NOTE When a certain test concentration gives 0 % or 100 % inhibition of bioluminescence, the gamma value cannot
be calculated. Therefore, usually only H -values between 10 % and 90 % are used in the calculation of the concentration-
t
effect relationship.
The concentration-effect relationship at a given exposure time often can be described by the following linear
equation:
lg c = b lg Γ + lg a (6)
t t
where
c is the portion of the water sample within the test sample, in percent;
t
Γ see Equation (5);
t
b is the value of the slope of the described line;
lg a is the value of the intercept of the described line.
By means of standard least-squares regression statistics, calculate the EC - and EC -values with
20 50
corresponding confidence limits, in which:
c EC at Γ = 0,25;
=
t 20,t t
c EC at
= Γ = 1,00.
t 50,t
t
For non-linear regression analysis, various models are available within standard graphic or statistical software
packages. They are typically based on functions of the normal distribution (i.e. Probit analysis), the logistic
distribution (i.e. Logit analysis), or the Weibull distribution (i.e. Weibull analysis). Calculated inhibitory effects
(H ) can be used directly to estimate parameters of the nonlinear concentration-effect relationship, from which
t
[8]
EC-values for any level might subsequently be derived .
If the range of value pairs cannot be curve-fitted, the EC-values can be estimated graphically using a double
logarithmic coordinate system.
10 Expression of results
Report the results in accordance with the example in Table 1.
8 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 11348-3:2007(E)
Table 1 — Example of test evaluation – Sample: effluent from a sewage treatment plant
Control experiments
Control batch number Dilution level D Measured values I / I f Validity test
k30 0 k30
Deviation from
I I
0 k30
the mean f
k30
b
in %
a
1 1 93 76 0,8172 0,8152 ± 0,3
2 91 74 0,8132
a
3 W 2 92 79 0,8587 0,8504 ± 1,0
4 95 80 0,8421
Test experiments
Test batch Dilution level D Measured values I H H Validity test Γ
c30 30 30 30
number
Deviation
from the
mean, in
c
% points
I % %
Ι
0 30
1 1 9
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11348-3
Deuxième édition
2007-12-01
Qualité de l'eau — Détermination
de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau
sur la luminescence de Vibrio fischeri
(Essai de bactéries luminescentes) —
Partie 3:
Méthode utilisant des bactéries
lyophilisées
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples
on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) —
Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Numéro de référence
ISO 11348-3:2007(F)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2007
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d’application. 1
2 Références normatives . 1
3 Principe. 2
4 Interférences . 2
5 Réactifs et matériaux. 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage et prétraitement des échantillons . 4
8 Mode opératoire . 5
9 Évaluation. 7
10 Expression des résultats . 9
11 Critères de validité. 11
12 Fidélité . 11
13 Rapport d’essai . 11
Annexe A (informative) Méthode de correction de la couleur . 12
Annexe B (informative) Niveau de dilution D — Préparation des séries de dilutions. 15
Annexe C (informative) Données de fidélité . 18
Annexe D (informative) Essai de bactéries luminescentes sur des échantillons d’eau salée
utilisant des bactéries lyophilisées . 19
Bibliographie . 23
© ISO 2007 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11348-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11348-3:1998), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
L'ISO 11348 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau —
Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de
bactéries luminescentes):
⎯ Partie 1: Méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées
⎯ Partie 2: Méthode utilisant des bactéries déshydratées
⎯ Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
iv © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
Introduction
Les mesurages spécifiés dans l’ISO 11348 peuvent être réalisés au moyen de bactéries fraîchement
préparées, de même qu’avec des préparations bactériennes lyophilisées ou déshydratées.
Les travaux de normalisation menés par le DIN Normenausschuss Wasserwesen et l’ISO/TC 147/SC 5/WG 1
ont montré que, dans certains cas particuliers, ces différentes techniques pouvaient donner des résultats
différents, notamment en présence de métaux lourds.
Une telle variété dans la sensibilité résulte des différences de composition des milieux utilisés pour la
préparation de bactéries lyophilisées ou déshydratées. Ces milieux protecteurs influent sur la biodisponibilité
des produits toxiques et/ou sur l’émission de lumière des bactéries luminescentes. Cela signifie que l’origine
et le type de préparation doivent être pris en considération lors de l’interprétation des résultats. Cette prise en
compte peut s’avérer parfois difficile, du fait que les bactéries lyophilisées et déshydratées peuvent être
obtenues auprès de fournisseurs différents. Il peut donc en résulter une méconnaissance des détails de la
composition, qui, par conséquent, ne peut pas être interprétée par l’utilisateur.
Pour cette raison, la présente partie de l’ISO 11348 comprend, en complément des mesurages de toxicité à
l’aide de bactéries déshydratées (ISO 11348-2) et de bactéries fraîchement préparées (ISO 11348-1), la
description d’un mode opératoire utilisant des bactéries lyophilisées dont les performances peuvent être
interprétées par l’utilisateur dans les moindres détails.
Les laboratoires responsables des résultats ont l’opportunité de sélectionner la technique la mieux adaptée,
en se fondant sur des jugements d’experts et des informations relatives aux échantillons d’eau soumis à essai.
© ISO 2007 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 11348-3:2007(F)
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur
d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri
(Essai de bactéries luminescentes) —
Partie 3:
Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente partie de l’ISO 11348 connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l’utilisateur de mettre en place des pratiques d’hygiène et de sécurité adéquates et de s’assurer de la
conformité avec toutes les dispositions réglementaires nationales.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente partie de l’ISO 11348 le
soient par du personnel qualifié.
1 Domaine d’application
L’ISO 11348 décrit trois méthodes de détermination de l’inhibition de la luminescence émise par la bactérie
marine Vibrio fischeri (NRRL B-11177). La présente partie de l’ISO 11348 spécifie une méthode utilisant des
bactéries lyophilisées.
Cette méthode est applicable:
⎯ aux eaux usées;
⎯ aux extraits aqueux et aux lixiviats;
⎯ aux eaux douces (eaux de surface ou souterraines);
⎯ à l’eau de mer ou aux eaux saumâtres;
⎯ aux éluats de sédiments (eau douce, eau saumâtre et eau de mer);
⎯ aux eaux interstitielles;
⎯ aux substances individuelles diluées dans l’eau.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 5814, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
© ISO 2007 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
3 Principe
L’inhibition de la luminescence produite par des cultures de Vibrio fischeri est déterminée au moyen d’un
essai par lots. Celui-ci est mis en œuvre par mélange de volumes spécifiés de l’échantillon soumis à essai, ou
de l’échantillon dilué, et de bactéries luminescentes mises en suspension dans une cuvette.
Le critère suivi est la luminescence, mesurée après un temps de contact de 15 min ou de 30 min, et
éventuellement de 5 min, prenant en compte un facteur de correction (f ) qui représente une mesure des
kt
changements d’intensité des témoins pendant le temps d’exposition. L’effet inhibiteur de l’échantillon d’eau
peut être déterminé sous forme des valeurs de DMSE (voir Annexe B) ou des valeurs de CE et/ou de CE ,
20 50
au moyen d’une série de dilutions (CE est la concentration effective).
4 Interférences
Des substances insolubles, faiblement solubles ou volatiles, ou des substances qui réagissent avec l’eau de
dilution ou avec la suspension, ou qui s’altèrent au cours de la période d’essai, sont susceptibles d’influer sur
les résultats ou de nuire à la reproductibilité des résultats d’essai.
Les pertes de luminescence, provoquées par l’absorption ou la diffusion de lumière, peuvent se produire en
présence d’eaux fortement colorées ou turbides. Cette interférence peut être compensée en soumettant
l’échantillon à un traitement contre la turbidité (7.2) ou, par exemple, en utilisant une cuvette de correction de
l’absorption à double compartiment (voir Annexe A).
[6]
La bioluminescence nécessitant de l’oxygène, les échantillons à forte demande en oxygène
(et/ou possédant une faible concentration en oxygène) peuvent provoquer un déficit en oxygène et être
inhibiteurs.
La présence de substances nutritives à biodégradabilité rapide dans l’échantillon peut provoquer une
[1]
réduction de la bioluminescence indépendante de la pollution .
Les échantillons dont le pH se trouve en dehors de la plage de pH = 6,0 à pH = 8,5 affectent la luminescence
[6], [7]
des bactéries . Un ajustement de l’échantillon est nécessaire si l’effet toxique du pH est indésirable.
Étant donné que l’organisme d’essai Vibrio fischeri est une bactérie marine, les essais sur des échantillons
d’eau salée suivant le mode opératoire normalisé ont souvent pour résultat une stimulation de la
bioluminescence, susceptible de masquer des effets inhibiteurs (voir Annexe D).
Les concentrations en sel de l’échantillon initial supérieures à 30 g/l de NaCl, ou les teneurs en composés
autres produisant une osmolarité équivalente, peuvent conduire, en association avec l’adjonction de sel requis
pour l’essai, à des effets hyperosmotiques. Pour éviter ces effets, il convient que la concentration en sel
résultante dans les échantillons soumis à essai n’excède pas l’osmolarité d’une solution de chlorure de
sodium à 35 g/l.
5 Réactifs et matériaux
Utiliser des substances chimiques de qualité analytique reconnue. Utiliser de l’eau distillée ou présentant une
pureté équivalente.
5.1 Bactéries pour essai.
Utiliser une souche de bactéries luminescentes appartenant à l’espèce Vibrio fischeri NRRL B-11177. Les
suspensions de bactéries utilisées pour les mesurages de la toxicité sont préparées à partir de réactifs
lyophilisés disponibles dans le commerce, pouvant être conservés au congélateur entre −18 °C et −20 °C. Les
bactéries commencent à émettre de la lumière immédiatement après leur réhydratation et sont prêtes à être
utilisées pour l’essai.
2 © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
5.2 Solution de chlorure de sodium, utilisée comme diluant.
Dissoudre 20 g de chlorure de sodium (NaCl) dans de l’eau et compléter à 1 l avec de l’eau.
5.3 Solution aqueuse d’hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l, par exemple.
5.4 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l, par exemple.
Il peut être nécessaire, pour l’ajustement du pH, d’utiliser des acides ou des bases de concentrations
supérieures ou inférieures.
5.5 Solution destinée aux bactéries lyophilisées.
20 g Chlorure de sodium (NaCl)
2,035 g Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6H O)
2 2
0,30 g Chlorure de potassium (KCl)
Dissoudre dans de l’eau et compléter à 1 l avec de l’eau. Cette solution peut être conservée sous forme
d’aliquotes de −18 °C à −20 °C dans un congélateur.
5.6 Substances de référence.
Préparer les solutions mères des substances de référence suivantes en utilisant la solution de chlorure de
sodium (5.2) séparément comme diluant, sans ajustement du pH:
19,34 mg/l Sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO ,7H O)
4 2
6,8 mg/l 3,5-Dichlorophénol (C H OCl ) (pureté > 99 %)
6 4 2
105,8 mg/l Dichromate de potassium (K Cr O )
2 2 7
Ces concentrations représentent environ le double des valeurs de CE attendues pour les substances de
50
référence respectives dans la présente partie de l'ISO 11348. Les volumes nécessaires dépendent de la
configuration des essais.
NOTE Il est possible d’utiliser des préparations chimiques du commerce ayant des concentrations définies en ZnSO
4
et K Cr O (titrisol) pour préparer les solutions mères des substances de référence.
2 2 7
6 Appareillage
6.1 Congélateur, destiné à la conservation des bactéries préservées.
6.2 Incubateur ou réfrigérateur, destiné à maintenir la suspension mère (8.2) et, éventuellement, la
«solution destinée aux bactéries lyophilisées» (5.5) (variante B) à une température de (4 ± 3) °C.
6.3 Bloc thermique thermostaté, destiné à maintenir les échantillons soumis à l’essai à une température
de (15 ± 1) °C. Au sein d’un essai, il convient que l’écart de température soit au plus de ± 0,3 °C.
6.4 Luminomètre, dont la cellule de mesure est maintenue à (15 ± 1) °C, équipé de cuvettes appropriées.
6.5 Cuvettes, fabriquées à partir d’un matériau chimiquement inerte, adaptées au luminomètre choisi,
ayant une capacité suffisante pour favoriser la lecture sur la plus grande surface possible et de taille adaptée
pour pouvoir être placées dans le bloc thermique (6.3).
6.6 pH-mètre.
6.7 Chronomètre.
© ISO 2007 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
6.8 Pipettes à piston ou seringues en plastique, de 10 µl, de 500 µl et de 1 000 µl.
6.9 Pipettes à piston, de volume variable, de 10 ml à 200 ml et de 200 µl à 5 000 µl.
6.10 Conductimètre.
6.11 Électrode à oxygène, selon l’ISO 5814.
7 Échantillonnage et prétraitement des échantillons
7.1 Échantillonnage
Recueillir les échantillons dans des récipients chimiquement inertes et propres, comme cela est spécifié dans
l’ISO 5667-16. Remplir complètement les récipients et les fermer hermétiquement. Soumettre les échantillons
à essai dès que possible après avoir effectué le prélèvement. Si nécessaire, conserver les échantillons à une
température comprise entre 2 °C et 5 °C, dans l’obscurité et dans les récipients, pendant une durée inférieure
à 48 h. En cas de période s’étendant jusqu’à deux mois, les conserver à une température u −18 °C. Ne pas
employer de substances chimiques pour la conservation des échantillons. Réaliser l’ajustement nécessaire du
pH, ainsi que l’ajout de sel, immédiatement avant l’essai.
7.2 Préparation des échantillons
Mesurer la concentration en oxygène de tous les échantillons. L’essai exige une concentration en oxygène
> 3 mg/l. Si la concentration en oxygène de l’échantillon non dilué est inférieure à 3 mg/l, oxygéner
l’échantillon de manière adaptée, par exemple par aération ou agitation.
Mesurer le pH de tous les échantillons. Si le pH se situe entre 6,0 et 8,5, aucun ajustement n’est
généralement nécessaire. L’ajustement du pH est toutefois susceptible d’altérer la nature de l’échantillon. En
revanche, le pH de l’échantillon et le pH du lot soumis à essai peuvent être différents en raison du pouvoir
tampon du milieu d’essai. Parfois, il peut s’avérer nécessaire d’effectuer les essais tant sur des échantillons
dont le pH est ajusté que sur ceux dont le pH n’est pas ajusté.
Si nécessaire, ajuster le pH de l’échantillon en ajoutant soit de l’acide chlorhydrique (5.4), soit la solution
d’hydroxyde de sodium (5.3). Selon l’objectif de l’essai, il est possible d’ajuster le pH à 7,0 ± 0,2 ou aux limites
supérieure (8,5 ± 0,2) ou inférieure (6,0 ± 0,2). Choisir la concentration d’acide chlorhydrique ou de solution
d’hydroxyde de sodium qui permet de réduire le volume ajouté afin que celui-ci n’excède pas 5 % du volume
total.
Ajouter 20 g de chlorure de sodium par litre dans l’échantillon d’eau ou dans l’échantillon d’eau neutralisé.
Pour les échantillons ayant des concentrations en sel élevées, mesurer la salinité et ajouter la quantité de sel
nécessaire pour ajuster l’osmolarité à 20 g/l NaCl.
Si l’échantillon contient entre 20 g/l et 50 g/l d’équivalents NaCl, ne pas ajouter de sel. La concentration en sel
résultante dans les échantillons soumis à essai ne doit pas excéder l’osmolarité d’une solution de chlorure de
sodium à 35 g/l.
L’Annexe D donne de plus amples informations concernant les échantillons d’eau salée.
Il convient de laisser décanter pendant 1 h les échantillons présentant une forte turbidité, ou bien de les
centrifuger, par exemple pendant 10 min à 5 000g, ou encore de les filtrer. Pour l’essai, utiliser le surnageant
ou le filtrat.
4 © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
8 Mode opératoire
8.1 Préparations initiales
Préparer les échantillons de référence conformément à 5.6. Après livraison, tester chaque lot de bactéries
avec chacune des trois substances de référence. Tester au moins l’une des trois substances de référence en
parallèle à chaque cuvette de suspension mère reconstituée.
Préparer les échantillons conformément à 7.2.
Dans une première série de cuvettes (6.5), préparer la série de dilutions de l’échantillon, l’échantillon de
référence (5.6) et les témoins (5.2) requis.
Un mode opératoire courant pour la préparation de la série de dilution est décrit à l’Annexe B. Selon l’objectif
de l’essai et les exigences statistiques applicables aux résultats d’essai, d’autres modes de dilution avec des
concentrations réparties selon une série géométrique ou logarithmique peuvent également convenir. En
raison du mélange de volumes égaux d’échantillon ou d’échantillon dilué et de suspension d’essai, la
concentration en échantillon la plus élevée au cours de l’essai est, en règle générale, de 50 % d’échantillon.
L’analyse d’échantillons d’eau faiblement dilués (80 % d’échantillon) nécessite un lot témoin supplémentaire
(voir B.2 et le Tableau 1).
Maintenir les cuvettes contenant la solution de chlorure de sodium (5.2) utilisées pour les témoins, les
échantillons de référence (5.6), les échantillons (7.2) ainsi que les échantillons de la série de dilution
(Tableau B.1) à (15 ± 1) °C.
Choisir des conditions d’essai dans lesquelles l’écart maximal de température dans le bloc thermique
thermostaté au cours d’un même essai soit au plus de ± 0,3 °C.
8.2 Préparation de la suspension mère
Retirer, immédiatement avant reconstitution dans l’eau, le flacon contenant la culture lyophilisée (quantité
suffisante pour permettre jusqu’à 100 mesurages) du congélateur. Pour la reconstitution, faire refroidir 1 ml
d’eau distillée dans une cuvette en verre à (4 ± 3) °C.
Verser en une fois ce volume d’eau refroidie dans le flacon contenant les bactéries lyophilisées, en réduisant
ainsi au maximum la détérioration des cellules durant le processus de réhydratation.
Il est primordial d’ajouter l’eau très rapidement afin de permettre aux bactéries d’entrer instantanément au
contact de l’eau, et ainsi éviter qu’elles ne s’agglomèrent ou ne perdent de leur activité. Par conséquent, ne
pas utiliser de pipette. Le volume exact d’eau n’est pas déterminant.
8
La suspension de bactéries luminescentes reconstituée (ayant une concentration en cellules de 10 cellules
par millilitre environ) sert de suspension mère; la conserver à (4 ± 3) °C. La suspension mère peut être utilisée
pour les besoins de l’essai aussi longtemps que les critères de validité définis dans l’Article 11 sont respectés.
Les bactéries réhydratées recongelées ne peuvent être utilisées que pour des essais préliminaires.
8.3 Préparation des suspensions d’essai
8.3.1 Étape initiale
Après un temps d’attente d’au moins 10 min, préparer, à partir de la suspension mère et en suivant l’une des
deux variantes, les suspensions d’essai, dans une seconde série correspondante de cuvettes (6.5)
maintenues à (15 ± 1) °C.
8.3.2 Variante A
Préparer les suspensions d’essai directement dans les cuvettes.
© ISO 2007 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
Ajouter des portions aliquotes de 10 µl de suspension mère à 500 µl de la solution (5.5) contenus dans des
cuvettes maintenues à (15 ± 1) °C, selon des intervalles de temps (de 5 s à 20 s) équivalents à ceux
employés ultérieurement pour les mesurages de l’intensité. Agiter manuellement les mélanges.
8.3.3 Variante B
Préparer les suspensions d’essai à l’extérieur des cuvettes, dans une fiole conique (de 250 ml, par exemple).
Ajouter un volume de suspension mère à 50 volumes de la solution (5.5) maintenue à (4 ± 3) °C et mélanger
soigneusement la suspension obtenue.
Introduire, à l’aide d’une pipette, 500 µl de suspension d’essai dans les cuvettes maintenues à (15 ± 1) °C à
l’intérieur de l’incubateur, selon des intervalles de temps (de 5 s à 20 s) équivalents à ceux employés
ultérieurement pour les mesurages de l’intensité.
NOTE Des flacons contenant de plus petits volumes de bactéries lyophilisées (quantités permettant, par exemple,
d’effectuer 20 ou 10 mesurages par flacon) sont également disponibles dans le commerce. Les bactéries lyophilisées
contenues dans ces flacons sont reconstituées directement en ajoutant un volume approprié de «solution destinée aux
bactéries lyophilisées» (5.5). La suspension d’essai obtenue est alors traitée comme dans la variante B (8.3.3) en
transférant à la pipette 500 µl de cette solution dans les cuvettes, maintenues à (15 ± 1) °C dans l’incubateur.
8.4 Mode opératoire d’essai
Réaliser les déterminations en double par niveau de dilution, à une température d’essai de (15 ± 1) °C.
Ajuster le luminomètre à un niveau approprié, proche du maximum.
Après un temps de conditionnement d’au moins 15 min, déterminer et reporter l’intensité de la luminescence.
I , des suspensions d’essai, au moyen d’un luminomètre.
0
La durée de contact devant être égale pour tous les échantillons, utiliser un chronomètre (6.7) lors du
mesurage en série des intensités de luminescence à des intervalles de temps égaux. Un intervalle de 5 s à
20 s a été jugé convenable.
Mesurer tous les échantillons, car des luminescences différentes peuvent être dues au manque
d’homogénéité de la suspension d’essai.
Immédiatement après le mesurage de la luminescence d’une suspension d’essai, compléter cette suspension
à un volume total de 1 ml avec des échantillons (7.2), des échantillons dilués (voir Annexe B), un échantillon
de référence (5.6) ou une solution de chlorure de sodium (5.2), suivant le cas, en introduisant à la
pipette 500 µl de chacun des échantillons, échantillons dilués, échantillon de référence ou solution de chlorure
de sodium, préparés dans la première série de cuvettes, aux suspensions d’essai contenues dans chaque
cuvette correspondant de la seconde série de cuvettes. Mélanger manuellement, déclencher le chronomètre
et replacer les cuvettes dans le bloc thermique, à (15 ± 1) °C.
Répéter le mode opératoire ci-dessus pour toutes les autres cuvettes, en laissant s’écouler le même intervalle
de temps entre ajouts successifs.
Déterminer et reporter l’intensité de la luminescence relevée dans l’ensemble des cuvettes de la seconde
série, y compris les témoins, après (facultatif) 5 min (I ), puis de nouveau après 15 min et 30 min (I , I ),
5 15 30
selon ce qui est nécessaire, à des intervalles de 5 s à 20 s.
Consigner les réglages de l’instrument.
6 © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11348-3:2007(F)
9 Évaluation
9.1 Effet inhibiteur sur les bactéries luminescentes
Calculer à l’aide de l’Équation (1) le facteur de correction (valeur de f ) à partir de l’intensité de luminescence
kt
mesurée. Ce facteur a pour but de corriger les valeurs initiales I de tous les échantillons soumis à essai
0
avant que celles-ci ne soient utilisées comme valeurs de référence pour déterminer la diminution de la
luminescence provoquée par l’eau.
f = I /I (t = 5 min, 15 min, 30 min) (1)
kt kt 0
où
f est le facteur de correction pour un temps de contact de 5 min, de 15 min ou de 30 min;
kt
I est l’intensité de luminescence du témoin après un temps de contact de 5 min, de 15 min ou de
kt
30 min, en unités de luminescence relative;
I est l’intensité de luminescence de la suspension témoin, immédiatement avant l’ajout du diluant
0
(5.2), en unités de luminescence relative.
Calculer, à l’aide de l’Équation (2), le facteur de correction moyen f et l’écart, en pourcentage (un chiffre
kt
significatif), des valeurs individuelles de ce facteur par rapport à la moyenne:
⎡⎤
ff±×/f 100 (2)
()
kktti kt
⎢⎥
⎣⎦
où
f est l’une des deux valeurs individuelles du facteur de correction et f est la valeur moyenne.
kti
kt
Calculer I à l’aide de l’Équation (3):
ct
I=×If (3)
ct 0 kt
où
f est la moyenne des f ;
kt
kt
I est l’intensité de luminescence de la suspension témoin, immédiatement avant l’ajout de
0
l’échantillon (7.2) ou de l’échantillon dilué (voir Annexe B), en unités de luminescence relative;
I est la valeur corrigée de I pour les cuvettes d’échantillons soumis à essai, immédiatement avant
ct 0
l’ajout de l’échantillon soumis à essai.
Calculer l’effet inhibiteur d’un échantillon soumis à essai à l’aide de l’Équation (4):
⎡⎤
HI=−I /I×100 (4)
()
tt⎢⎥ct ct
⎣⎦
où
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.