ISO 13904:2005
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
ISO 13904:2005 describes the determination of the total and free tryptophan in feeding stuffs (e.g. complete and complementary feeds, supplementary feeds, raw materials, ingredients, premixtures and concentrates. It does not distinguish between D- and L-forms.
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
L'ISO 13904:2005 décrit le dosage du tryptophane total et libre des aliments pour animaux. Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13904
First edition
2005-05-01
Animal feeding stuffs — Determination
of tryptophan content
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en tryptophane
Reference number
ISO 13904:2005(E)
©
ISO 2005
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13904:2005(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2005
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2005 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13904:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Principle . 1
3 Reagents and materials. 1
4 Apparatus. 2
5 Procedure. 3
5.1 Preparation of samples . 3
5.2 Determination of free tryptophan (extract). 3
5.3 Determination of total tryptophan (hydrolysate) . 3
5.4 HPLC determination. 4
6 Calculation of results. 4
7 Precision . 5
7.1 Interlaboratory test . 5
7.2 Repeatability. 5
7.3 Reproducibility . 5
8 Test report. 5
Annex A (informative) Results of an interlaboratory test. 6
Annex B (informative) Observations on the method. 8
Bibliography . 9
© ISO 2005 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13904:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13904 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
iv © ISO 2005 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13904:2005(E)
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
1 Scope
This International Standard describes determination of the total and free tryptophan content in feeding stuffs
(e.g. complete and complementary feeds, supplementary feeds, raw materials, ingredients, premixtures and
concentrates). It does not distinguish between D- and L-forms.
2 Principle
For the determination of the total tryptophan, the sample is hydrolysed under alkaline conditions with
saturated barium hydroxide solution and heated to 110 °C for 20 h. After hydrolysis, an internal standard is
added.
For the determination of free tryptophan, the sample is extracted under mild acidic conditions in the presence
of an internal standard.
The tryptophan and the internal standard in the hydrolysate or in the extract are determined by reversed
phase C HPLC with fluorescence detection.
18
3 Reagents and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
3.1 Double-distilled water, or water of equivalent purity (conductivity < 10 µS/cm).
3.2 Standard substance: tryptophan (purity/content W 99 %) dried under vacuum over phosphorus
pentoxide.
3.3 Internal standard substance: αα-methyltryptophan (purity/content W 99 %), dried under vacuum over
αα
phosphorus pentoxide.
3.4 Barium hydroxide octahydrate.
Care should be taken not to expose the Ba(OH)⋅8H O excessively to air in order to avoid formation of BaCO ,
2 2 3
which could disturb the determination (see observation in B.3).
3.5 Sodium hydroxide.
3.6 Orthophosphoric acid, w = 85 %.
3.7 Concentrated hydrochloric acid, ρ = 1,19 g/ml.
20
3.8 Methanol, HPLC grade.
3.9 Light petroleum, boiling range 40 °C to 60 °C.
3.10 Sodium hydroxide solution, c = 1 mol/l.
Dissolve 40,0 g of NaOH (3.5) in water (3.1) and make up to 1 l with water (3.1).
© ISO 2005 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 13904:2005(E)
3.11 Hydrochloric acid, c = 6 mol/l.
Take 492 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.12 Hydrochloric acid, c = 1 mol/l.
Take 82 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.13 Hydrochloric acid, c = 0,1 mol/l.
Take 8,2 ml of HCl (3.7) and make up to 1 l with water (3.1).
3.14 Orthophosphoric acid, c = 0,5 mol/l.
Take 34 ml of orthophosphoric acid (3.6) and make up to 1 l with water (3.1).
3.15 Concentrated tryptophan solution (3.2), c = 0,000 5000 g/ml.
In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,25 g of tryptophan (3.2) (weighed to the nearest 0,1 mg) in
hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at –18 °C for a maximum
of four weeks.
3.16 Concentrated internal standard solution, c = 0,000 54 g/ml.
In a 500 ml volumetric flask, dissolve 0,27 g of α-methyltryptophan (3.3) (weighed to the nearest 0,1 mg) in
hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13). Store at –18 °C for a maximum
of four weeks.
3.17 Calibration standard solution of tryptophan and internal standard.
Take 2,00 ml of the concentrated tryptophan solution (3.15) and 2,00 ml of concentrated internal standard
solution (α-methyltryptophan) (3.16). Dilute with water (3.1) and methanol (3.8) to approximately the same
volume and to approximately the same concentration of methanol (10 % to 30 %) as the finished hydrolysate.
This solution shall be prepared freshly before use.
Protect from direct sunlight during preparation.
3.18 Ethanolamine > 98 %.
3.19 1,1,1-Trichloro-2-methyl-2-propanol solution.
Add 1 g of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol to 100 ml of methanol (3.8).
3.20 Mobile phase for HPLC.
Dissolve 3,00 g of acetic acid in 900 ml of water (3.1) and add 50,0 ml of 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol
solution (3.19). Adjust the pH to 5,00 using ethanolamine (3.18). Make up to 1 000 ml with water (3.1).
4 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
4.1 HPLC equipment with a spectrofluorimetric detector.
4.2 Liquid chromatographic column, 125 mm × 4 mm, with C , 3 µm packing, or equivalent.
18
4.3 pH-meter.
2 © ISO 2005 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 13904:2005(E)
4.4 Polypropylene flask, of capacity 125 ml, with wide neck and screw cap.
4.5 Membrane filter, 0,45 µm.
4.6 Autoclave, capable of being maintained at (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].
A pressure-tight covered dish that may be put into a drying oven adjustable to (110 ± 2) °C may be used.
4.7 Mechanical shaker or magnetic stirrer.
4.8 Vortex mixer.
5 Procedure
5.1 Preparation of samples
Grind the sample to pass through a 0,5 mm sieve. Samples high in moisture shall be either air-dried at a
temperature not exceeding 50 °C or freeze-dried prior to grinding. Samples with high fat content shall be
extracted with light petroleum (3.9) prior to grinding.
5.2 Determination of free tryptophan (extract)
Weigh, to the nearest 1 mg, an appropriate amount (1 g to 5 g) of the prepared sample (5.1) into a conical
flask. Add 100,0 ml of hydrochloric acid, (3.13) and 5,00 ml of concentrated internal standard solution (3.16).
Shake or mix for 60 min using a mechanical shaker or a magnetic stirrer (4.7). Allow the sediment to settle
and pipette 10,0 ml of the supernatant solution into a beaker. Add 5 ml of orthophosphoric acid (3.14). Adjust
the pH to 3,0 using sodium hydroxide (3.10). Add sufficient methanol (3.8) to give a concentration of b
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 13904
Première édition
2005-05-01
Aliments des animaux — Dosage du
tryptophane
Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content
Numéro de référence
ISO 13904:2005(F)
©
ISO 2005
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13904:2005(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2005
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2008
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13904:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Principe. 1
3 Réactifs et matériaux. 1
4 Appareillage . 2
5 Mode opératoire . 3
5.1 Préparation des échantillons. 3
5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait). 3
5.3 Dosage du tryptophane total (hydrolysat) . 3
5.4 Dosage par CLHP. 4
6 Expression des résultats . 4
7 Fidélité . 5
7.1 Essai interlaboratoires . 5
7.2 Répétabilité. 5
7.3 Reproductibilité. 5
8 Rapport d'essai . 5
Annexe A (informative) Résultats d'un essai interlaboratoires. 6
Annexe B (informative) Observations sur la méthode . 8
Bibliographie . 9
© ISO 2005 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13904:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13904 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,
Aliments des animaux.
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 13904:2005(F)
Aliments des animaux — Dosage du tryptophane
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit le dosage du tryptophane total et libre des aliments pour animaux
(par exemple aliments complets et complémentaires, compléments alimentaires, matières premières,
ingrédients, prémélanges et concentrés). Elle ne fait pas la distinction entre les formes D et L.
2 Principe
Pour le dosage du tryptophane total, l'échantillon est hydrolysé en milieu basique avec une solution
d'hydroxyde de baryum et il est chauffé à 110 °C pendant 20 h. Après l'hydrolyse, un étalon interne est ajouté.
Pour le dosage du tryptophane libre, l'échantillon est extrait en milieu acide en présence d'un étalon interne.
Le tryptophane et l'étalon interne dans l'hydrolysat ou l'extrait sont déterminés par CLHP avec une séparation
en phase inverse sur colonne C et détection fluorimétrique.
18
3 Réactifs et matériaux
Sauf spécification contraire, n'utiliser que des réactifs de qualité analytique reconnue.
3.1 Eau bidistillée, ou de pureté équivalente (conductivité < 10 µS/cm).
3.2 Substance étalon: tryptophane (pureté/teneur W 99 %) séché sous vide sur du pentoxyde de
phosphore.
3.3 Substance étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté/teneur W 99 %) séché sous vide sur du
pentoxyde de phosphore.
3.4 Hydroxyde de baryum octahydraté.
Prendre soin de ne pas exposer excessivement le Ba(OH) , 8H O à l'air afin d'éviter la formation de BaCO ,
2 2 3
qui peut perturber le dosage (voir B.3).
3.5 Hydroxyde de sodium.
3.6 Acide orthophosphorique, w = 85 %.
3.7 Acide chlorhydrique concentré, ρ = 1,19 g/ml.
20
3.8 Méthanol, qualité CLHP.
3.9 Éther de pétrole, plage d'ébullition entre 40 °C et 60 °C.
3.10 Solution d'hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l.
Dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l'eau (3.1) et compléter 1 l avec de l'eau (3.1).
© ISO 2005 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 13904:2005(F)
3.11 Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l.
Prélever 492 ml d'HCl (3.7) et compléter à 1 l avec de l'eau (3.1).
3.12 Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l.
Prélever 82 ml d'HCl (3.7) et compléter à 1 l avec de l'eau (3.1).
3.13 Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l.
Prélever 8,2 ml d'HCl (3.7) et compléter à 1 l avec de l'eau (3.1).
3.14 Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l.
Prélever 34 ml d'acide orthophosphorique (3.6) et compléter à 1 l avec de l'eau (3.1).
3.15 Solution mère de tryptophane (3.2), c = 0,000 5000 g/ml.
Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,25 g de tryptophane (3.2) (pesé à 0,1 mg près) dans de l'acide
chlorhydrique (3.13) et porter au trait avec de l'acide chlorhydrique (3.13). Conserver à −18 °C pendant quatre
semaines maximum.
3.16 Solution mère d'étalon interne, c = 0,000 54 g/ml.
Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,27 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) (pesé à 0,1 mg près) dans
de l'acide chlorhydrique (3.13) et porter au trait avec de l'acide chlorhydrique (3.13). Conserver à −18 °C
pendant quatre semaines maximum.
3.17 Solution étalon de tryptophane de calibration et étalon interne.
Prélever 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère d'étalon interne
(α-méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l'eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même
volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10 % à 30 %) que l'hydrolysat final.
Cette solution doit être préparée avant chaque utilisation.
Elle doit être protégée de l'exposition directe au soleil au cours de la préparation.
3.18 Éthanolamine > 98 %.
3.19 Solution de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol.
Ajouter 1 g de 1,1,1-trichloro-2-méthyl-2-propanol à 100 ml de méthanol (3.8).
3.20 Phase mobile pour CLHP.
Dissoudre 3,00 g d'acide acétique dans 900 ml d'eau (3.1) puis ajouter 50,0 ml de solution de 1,1,1-trichloro-
2-méthyl-2-propanol (3.19). Ajuster le pH à 5,00 à l'aide de l'éthanolamine (3.18). Compléter à 1 000 ml avec
de l'eau (3.1).
4 Appareillage
Matériel de laboratoire courant et, en particulier, ce qui suit.
4.1 Équipement pour CLHP avec détecteur spectrofluorimétrique.
4.2 Colonne de chromatographie en phase liquide, 125 mm × 4 mm, avec C , particules de 3 µm, ou
18
équivalent.
2 © ISO 2005 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 13904:2005(F)
4.3 pH-mètre.
4.4 Flacon en polypropylène, d'une capacité de 125 ml, à large col et bouchon à vis.
4.5 Membrane filtrante, 0,45 µm.
4.6 Autoclave, pouvant être maintenu à 110 °C ± 2 °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar].
Un boîtier fermé étanche à la pression placé dans une étuve de séchage réglable à (110 ± 2) °C peut être
utilisé.
4.7 Agitateur mécanique ou magnétique.
4.8 Mélangeur vortex.
5 Mode opératoire
5.1 Préparation des échantillons
Broyer l'échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Avant broyage, les échantillons à fort taux
d'humidité doivent être soit séchés à l'air à une température maximale de 50 °C ou par lyophilisation. Les
échantillons à forte teneur en matières grasses doivent subir une extraction par de l'éther de pétrole (3.9)
avant broyage.
5.2 Dosage du tryptophane libre (extrait)
Peser, à 1 mg près, une quantité appropriée (de 1 g à 5 g) de l'échantillon préparé (5.1) dans un erlenmeyer.
Ajouter 100,0 ml d'acide chlorhydrique (3.13) et 5,00 ml de la solution mère d'étalon interne (3.16). Agiter ou
mélanger pendant 60 min avec un agitateur mécanique ou magnétique (4.7). Laisser décanter et prélever à la
pipette 10,0 ml de surnageant dans un bécher. Ajouter 5 ml d'acide orthophosphorique (3.14). Ajuster le pH à
3,0 avec l'hydroxyde de sodium (3.10). Ajouter assez de méthanol (3.8) pour obtenir une concentration
comprise entre 10 % et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans une fiol
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.