Rapeseed and rapeseed meals — Determination of glucosinolates content — Method using high-performance liquid chromatography

This document specifies a method for the determination of the individual glucosinolates content in rapeseeds and rapeseed meals using high-performance liquid chromatography with gradient elution. This method was tested on rapeseeds and rapeseed meals (Brassica rapa, Brassica napus and Brassica juncea) but is applicable to other plant materials, on the condition that the occurring glucosinolates previously identified are described in this document. On the contrary, the quantitative analysis of the concerned glucosinolate(s) is not carried out. NOTE This method does not determine glucosinolates that are substituted on the glucose molecule, but these compounds are of little importance in commercial rapeseed and rapeseed meal. Annex A presents the results of the interlaboratory trials for the gradient elution HPLC method. Annex B presents how to check the titre of the prepared internal standard solution. Annex C presents how to prepare and test the purified sulfatase solution and how to check the desulphation step on the ion exchange column. Annex D presents the HPLC and column performance criteria qualification. The analysis of glucosinolates content in rapeseed can also be done using an isocratic elution mode. This requires some modifications of the method (internal, standard, HPLC column and HPLC buffers), as described in Annex E.

Graines et tourteaux de colza — Dosage des glucosinolates — Méthode par chromatographie liquide à haute performance

Le présent document spécifie une méthode de dosage des glucosinolates individuels dans les graines et tourteaux de colza par chromatographie en phase liquide à haute performance avec élution par gradient. Cette méthode a été soumise à essai sur les graines et tourteaux de colza (Brassica rapa, Brassica napus et Brassica juncea), mais elle est applicable à d'autres matériaux végétaux, à condition que les glucosinolates identifiés précédemment soient décrits dans le présent document. Sinon, l'analyse quantitative du ou des glucosinolates concernés n'est pas effectuée. NOTE Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces composés sont peu importants dans les graines et tourteaux de colza commercialisés. L'Annexe A présente les résultats des essais interlaboratoires pour la méthode de CLHP avec élution par gradient. L'Annexe B présente comment vérifier le titre de la solution préparée d'étalon interne. L'Annexe C présente comment préparer et analyser la solution purifiée de sulfatase et contrôler l'étape de désulfatation sur la colonne échangeuse d'ions. L'Annexe D présente la qualification du système de CLHP et des critères de performance de la colonne. Les glucosinolates des graines de colza peuvent également être dosés en utilisant un mode d'élution isocratique. Cela nécessite un certain nombre de modifications de la méthode (étalon interne, colonne de CLHP et solutions tampons pour CLHP), comme décrit dans l'Annexe E.

General Information

Status
Published
Publication Date
23-May-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
24-May-2019
Completion Date
24-May-2019
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ISO 9167:2019 - Rapeseed and rapeseed meals -- Determination of glucosinolates content -- Method using high-performance liquid chromatography
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ISO 9167:2019 - Graines et tourteaux de colza -- Dosage des glucosinolates -- Méthode par chromatographie liquide a haute performance
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9167
First edition
2019-05
Rapeseed and rapeseed meals —
Determination of glucosinolates
content — Method using high-
performance liquid chromatography
Graines et tourteaux de colza — Dosage des glucosinolates —
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
Reference number
ISO 9167:2019(E)
ISO 2019
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ISO 9167:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

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Fax: +41 22 749 09 47
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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ISO 9167:2019(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 5

8 Preparation of the test sample ............................................................................................................................................................... 6

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Test portion ................................................................................................................................................................................................ 6

9.2 Extraction of glucosinolates ........................................................................................................................................................ 6

9.3 Blank test ..................................................................................................................................................................................................... 7

9.4 Preparation of ion-exchange columns ................................................................................................................................ 7

9.5 Purification and desulfatation ................................................................................................................................................... 7

9.6 Chromatography with gradient elution ............................................................................................................................. 7

9.6.1 General...................................................................................................................................................................................... 7

9.6.2 Adjustment of the apparatus ................................................................................................................................. 8

10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 9

10.1 Calculation of the content of each glucosinolate ....................................................................................................... 9

10.2 Relative proportionality factors ............................................................................................................................................... 9

10.3 Calculation of the total glucosinolate content ...........................................................................................................10

11 Precision ....................................................................................................................................................................................................................10

11.1 Interlaboratory test..........................................................................................................................................................................10

11.2 Repeatability ..........................................................................................................................................................................................10

11.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................10

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................11

Annex A (informative) Results of interlaboratory trials — Gradient elution HPLC method ...................12

Annex B (normative) Checking of the titre of the prepared internal standard solution.............................14

Annex C (normative) Preparation and test of purified sulfatase solution and checking of the

desulphation step on ion-exchange columns .......................................................................................................................15

Annex D (informative) HPLC system and column performance criteria qualification ..................................20

Annex E (informative) Elution in the isocratic mode .......................................................................................................................22

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................28

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 9167:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 2,

Oleaginous seeds and fruits and oilseed meals.

This first edition cancels and replaces ISO 9167-1:1992, which has been technically revised. It also

incorporates the amendment ISO 9167-1:1992/Amd.1:2013. The main changes are as follows:

— rapeseed meals have been added to the scope with the addition of a new collaborative trial;

[6]
— in 9.2, methanol 70 % has been replaced by ethanol 50 % for lower toxicity ;
— in 9.2, only one extraction is carried out instead of two;

— in 10.2 and E.5.1, the term “relative proportionality factor” has been used instead of “response

factor”;
— the isocratic mode has been added in Annex E.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 9167:2019(E)
Introduction

The glucosinolates in rapeseed can be analysed by chromatographic, enzymatic or spectroscopic

methods. This document describes a chromatographic method with two conditions (gradient and

isocratic) of elution for qualitative and quantitative analysis of individual glucosinolates in rapeseed

and rapeseed meals. The method with gradient elution is considered as the reference method whereas

the method with isocratic elution is considered as a simplified method and is presented in Annex E as

information.

This document specifies a method using high-performance liquid chromatography (HPLC) with

gradient elution as reference method. For the isocratic mode, the choice of the internal standard, the

chromatographic conditions and the separation results are different from the reference method. These

aspects are discussed in Annex E.
© ISO 2019 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 9167:2019(E)
Rapeseed and rapeseed meals — Determination of
glucosinolates content — Method using high-performance
liquid chromatography
1 Scope

This document specifies a method for the determination of the individual glucosinolates content in

rapeseeds and rapeseed meals using high-performance liquid chromatography with gradient elution.

This method was tested on rapeseeds and rapeseed meals (Brassica rapa, Brassica napus and Brassica

juncea) but is applicable to other plant materials, on the condition that the occurring glucosinolates

previously identified are described in this document. On the contrary, the quantitative analysis of the

concerned glucosinolate(s) is not carried out.

NOTE This method does not determine glucosinolates that are substituted on the glucose molecule, but

these compounds are of little importance in commercial rapeseed and rapeseed meal.

Annex A presents the results of the interlaboratory trials for the gradient elution HPLC method.

Annex B presents how to check the titre of the prepared internal standard solution. Annex C presents

how to prepare and test the purified sulfatase solution and how to check the desulphation step on the

ion exchange column. Annex D presents the HPLC and column performance criteria qualification.

The analysis of glucosinolates content in rapeseed can also be done using an isocratic elution mode.

This requires some modifications of the method (internal, standard, HPLC column and HPLC buffers),

as described in Annex E.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 664, Oilseeds — Reduction of laboratory sample to test sample
ISO 665, Oilseeds — Determination of moisture and volatile matter content

ISO 771, Oilseed residues — Determination of moisture and volatile matter content

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5502, Oilseed residues — Preparation of test samples
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 9167:2019(E)
4 Principle

Extraction of glucosinolates by a water-ethanol mixture, then purification and enzymatic desulfatation

on ion-exchange columns. Determination using reverse phase liquid chromatography with gradient

elution (reference method) or isocratic elution (rapid method) and detection by ultraviolet

absorptiometry.
5 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and water conforming to

grade 2 of ISO 3696.
5.1 Ethanol, volume fraction = 50 %.

5.2 Sodium acetate, c = 0,02 mol/l at pH 4,0, prepared by mixing sodium acetate, c = 0,02 mol/l and

acetic acid, c = 0,02 mol/l as to obtain a solution having a pH = 4,0.

5.3 Sulfatase, Helix pomatia, type H1 purified and diluted as described in Annex C.

5.4 Imidazole formiate, c = 6 mol/l.

Dissolve 204 g of imidazole in 113 ml of formic acid in a 500 ml beaker. Transfer the mixture in a 500 ml

cylinder and make up to 500 ml with water.
5.5 Internal standard.

Use either sinigrin (potassium allyglucosinolate monohydrate, M = 415,5 g/mol) (5.6) or glucotropaeolin

(potassium benzylglucosinolate, M = 447,5 g/mol or tetramethylammonium benzylglucosinolate,

M = 482,6 g/mol) (5.7). The glucotropaeolin may be used in a hydrated form, then the molar mass and

the purity shall be known and taken into consideration for the preparation of the solution.

The choice of the internal standard will be conditioned by its perfect chromatographic separation from

the other glucosinolates of the sample. The natural absence in the sample of the internal standard or of

glucosinolates unseparated from the latter may be checked with a blank test (see 9.3).

With gradient elution on octyl or octadecyl stationary phases, sinigrin or glucotropaeolin can be used.

However, glucotropaeolin is sometimes difficult to separate from other natural minor glucosinolates.

With isocratic elution on cyano propyl stationary phase (see Annex E), sinigrin cannot be used for

rapeseed analysis because of the non-separation from the other glucosinolates. Glucotropaeolin shall

be used instead.

In the most frequent cases (i.e. when rapeseeds have an assumed glucosinolates content between

10 μmol/g and 50 μmol/g inclusive) the internal standard is used in solution form at 20 mmol/l. For

rapeseeds where the assumed glucosinolates content is less than 10 μmol/g or greater than 50 μmol/g,

the concentrations of the internal standard solutions used per sample are given in Table 1.

Check the titre of the prepared internal standard solution as described in Annex B.

2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 9167:2019(E)

Table 1 — Concentration of the internal standard solution to use according to the assumed

glucosinolates content of the sample

Glucosinolates content of the sample Concentrations of the internal standard solutions

μmol/g mmol/l
< 10 5
> 10 and < 50 20
> 50 40
5.6 Sinigrin solution.

The sinigrin solution with the required concentration (see Table 1) is prepared according to Table 2.

Weigh the sinigrin to the nearest 0,5 mg and dissolve it in water in a 100 ml volumetric flask. Make up

to the mark with water. The solution thus prepared may be stored in a refrigerator at approximately

4 °C up to a week or in a freezer at −18 °C for a longer period.

Table 2 — Weight of sinigrin in 100 ml water for preparation of 5 mmol/l, 20 mmol/l and

40 mmol/l solutions
Molecular weight Sinigrin weight
Sinigrin form g
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium monohydrate 415,5 0,207 7 0,831 0 1,662 0
5.7 Glucotropaeolin solution.

The glucotropaeolin solution with the required concentration (see Table 1) is prepared according to

Table 3. Weigh the glucotropaeolin to the nearest 0,5 mg and dissolve it in water in a 100 ml volumetric

flask. Make up to the mark with water. The solution thus prepared may be stored in a refrigerator at

approximately 4 °C up to a week or in a freezer at –18 °C for a longer period.

Table 3 — Weight of glucotropaeolin in 100 ml water for preparation of 5 mmol/l, 20 mmol/l

and 40 mmol/l solutions
Glucotropaeolin weight
Molecular weight
Glucotropaeolin form
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium 447,5 0,223 7 0,895 0 1,790 1
Tetramethylammonium 482,6 0,241 3 0,965 2 1,930 3

5.8 Eluent A: water, purified by passing it through an activated charcoal cartridge or water of

equivalent purity.

NOTE The use of insufficiently purified water can lead to ghost peaks during the analysis due to impurities

eluted when the proportion of acetonitrile in the eluent increases.

5.9 Eluent B: acetonitrile, HPLC gradient grade, solution in purified water, volumic fraction = 20 %.

The concentration may be modified in relation to the column used.

5.10 Rinsing solvent: acetonitrile, HPLC grade, solution in water, volumic fraction = 70 %.

© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 9167:2019(E)
5.11 Ion-exchange resin: DEAE Sephadex A25 suspension, prepared as follows.

Mix 10 g of DEAE Sephadex A25 resin (or an equivalent resin) in excess 2 mol/l acetic acid solution. Leave

to settle. Add 2 mol/l acetic acid until the total volume is equal to twice the volume of the sediment.

6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.

6.1 HPLC apparatus with gradient or isocratic elution, column temperature adjustment at 30 °C and

detection by ultraviolet absorptiometry at wavelength of 229 nm and, if possible, at wavelength of 275 nm.

An efficient column temperature regulation at 30 °C can be impossible when the ambient temperature

is above 25 °C. An oven with a cooling-heating device is recommended in this case.

6.2 HPLC columns for gradient elution.

HPLC column containing an octyl (C8) or octadecyl (C18) stationary phase, fixed to silica column

packing, of particle size less than or equal to 5 μm.

The performance of the column should be checked regularly, preferably using a reference sample of

rapeseed. In particular, the column shall not degrade desulfo-4-hydroxyglucobrassicin, an important

but relatively unstable desulfoglucosinolate. Figure 1 shows an example of glucosinolates separations

using the HPLC gradient mode. New columns shall be subjected to preliminary conditioning in

accordance with the manufacturer’s instructions so that reproducible results can be obtained.

6.3 pH-meter.
6.4 Microgrinder, for example, a coffee mill.

6.5 Centrifuge, suitable for use with the tubes (6.6), capable of obtaining a centrifugal acceleration

of 5 000g.
6.6 Polypropylene tubes, of 6 ml capacity.

6.7 Water-bath or other heating apparatus, capable of maintaining a temperature of 75 °C ± 3 °C.

6.8 Pasteur pipettes fitted with glass wood, 150 mm long, and a suitable stand, or any other

appropriate apparatus.

1) DEAE Sephadex A25 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for

the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 9167:2019(E)
Key
1 desulfoglucoiberin 9 desulfogluconapin
2 desulfoprogoitrin 10 desulfo-4-hydroxyglucobrassicin
3 desulfoepiprogoitrin 11 desulfoglucobrassicanapin
4 desulfosinigrin 12 desulfoglucotropaeolin
5 desulfoglucoraphanin 13 desulfoglucobrassicin
6 desulfogluconapoleiferin 14 desulfogluconasturtiin
7 desulfoglucoalyssin 15 desulfo-4-methoxyglucobrassicin
8 desulfosinalbin 16 desulfoneoglucobrassicin
Figure 1 — Example of a typical chromatogram of rape seeds with gradient elution
7 Sampling

It is important that the laboratory receive a sample that is truly representative and that has not been

damaged or changed during transport or storage.
© ISO 2019 – All rights reserved 5
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ISO 9167:2019(E)

Sampling is not part of the method specified in this document. A recommended sampling method is

[4] [1]
given in ISO 21294 for oilseeds and ISO 5500 for oilseed meals.

If large non-oleaginous foreign bodies have been separated before the reduction of the laboratory

sample, allowance shall be made for this in the calculation.
8 Preparation of the test sample

Reduce the laboratory sample in accordance with ISO 664 for oilseeds and ISO 5502 for oilseed meals.

If the seeds have a moisture and volatile matter content in excess of w = 10 %, dry them beforehand

using a current of air at 45 °C ± 5 °C.

The impurities level is generally 2 % (mass fraction). If sinigrin is found in the sample (with the blank),

analyse the impurities separately, as the sinigrin may stem from seeds of adventitious cruciferae, which

are impurities in rapeseed.

If the seeds have been treated, wash them with dichloromethane and dry them in a current of air at

ambient temperature.
Reduce the sample to two sub-samples of 20 g each.

Determine the moisture and volatile matter content of a sub-sample in accordance with ISO 665 for

oilseeds and ISO 771 for oilseed meals or an adequate procedure.

Grind the seeds of other sub-sample in the microgrinder (6.4) for 20 s. Mix, then grind for a further 5 s.

Weigh the prepared sample (see 9.1) immediately to avoid modification of the moisture and volatile

matter content.
9 Procedure
9.1 Test portion

Label two tubes (6.6) as A and B and transfer 200 mg for oilseeds and 100 mg for oilseed meals, weighed

to the nearest 0,5 mg, of the prepared test sample (see Clause 8) to each tube. Use tube A for the test

sample and use the tube B as blank sample, if necessary.
9.2 Extraction of glucosinolates

Place the tubes in the water-bath or other heating apparatus (6.7), set at 75 °C and leave for 1 min. Add

3 ml of boiling ethanol solution (5.1) and then immediately add, to tube A, 200 μl to the nearest 3 μl of

internal standard solution prepared according to the HPLC elution mode and the assumed glucosinolate

content of the sample (5.5).

The temperature of the ethanol solution shall be as close as possible to the boiling point to ensure a

rapid denaturation of the enzyme myrosinase which generally occurs in the test portion.

NOTE Non-denatured myrosinase can break down the glucosinolates in a few minutes.

Continue heating at 75 °C for a further 10 min, shaking the tubes at regular intervals. Adjust the volume

in each tube A and B to approximately 4 ml with water, mix and then centrifuge at an acceleration of

5 000g for 3 min.

Transfer the supernatant liquid from each tube to two other tubes (6.6) labelled A′ and B′. Adjust the

volume in each tube A′ and B′ to approximately 5 ml with water and mix.

These extracts may be kept for two weeks if stored in the dark in a freezer at −18 °C.

[6].

NOTE With ethanol 50 % as solvent, a one-step extraction was found efficient enough

6 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 9167:2019(E)
9.3 Blank test

If required (5.5), carry out a blank test using the same procedure (see 9.2) on a test portion taken

from the same test sample, but omitting the internal standard solution (sinigrin or glucotropaeolin)

and replacing it by 200 µl of water, in order to detect and quantify any sinigrin or glucotropaeolin (or

coeluting compound) present in the test portion.
9.4 Preparation of ion-exchange columns

Cut the required number of Pasteur pipettes fitted with glass wood (6.8), i.e. one pipette per combined

extract, so as to leave a volume of 1,2 ml above the neck. Place the pipettes vertically on a stand.

Transfer 0,5 ml of a well-mixed suspension of ion-exchange resin (5.11) to each pipette and allow to settle.

Rinse the pipettes with 2 ml of the imidazole formiate (5.4) and then twice with 1 ml portions of water.

9.5 Purification and desulfatation
9.5.1 Carry out the operations given in 9.5.2 to 9.5.5 for each extract.

9.5.2 Transfer 1 ml or 0,5 ml of the extract (see 9.2) depending on the assumed glucosinolate content

of the sample (see Table 4) to a prepared column (see 9.4) without disturbing the resin surface and allow

to drain. Add two 1 ml portions of the 0,02 M, pH 4,0 sodium acetate buffer (5.2), allowing the buffer to

drain after each addition.

Table 4 — Volume of extract transferred to the ion-exchange column according to the expected

glucosinolate content of the sample
Glucosinolate content of the sample Volume of extract
µmol/g ml
< 50 1,0
> 50 0,5

9.5.3 Add to the column 75 μl of diluted purified sulfatase solution (see C.4.4). Leave to act

approximately 15 h at ambient temperature.

9.5.4 Place a tube (6.6) under the column to collect the eluate. Elute the desulfoglucosinolates obtained

with two 1 ml portions of water, allowing the water to drain after each addition.

NOTE The complete elution of the desulfoglucosinolates from the ion exchange column can be checked by

using an additional portion of water (1 ml) for elution. The chromatography of this additional portion will not

reveal any desulfoglucosinolate in significant amount.

9.5.5 Mix the eluate well. If not used immediately for chromatography, the eluate may be stored in the

dark in a freezer at −18 °C for up to one week.
9.6 Chromatography with gradient elution
9.6.1 General

The reference method uses a gradient elution with octyl or octadecyl stationary phase column (6.2) and

eluents (5.8, 5.9 and 5.10).
© ISO 2019 – All rights reserved 7
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ISO 9167:2019(E)
9.6.2 Adjustment of the apparatus
9.6.2.1 General

Adjust the column temperature to 30 °C and the detector wavelength to 229 nm. Programme the HPLC

apparatus (6.1) so as to rinse the column by passing of eluent B at a flow rate of approximately 1 ml/

min. When the baseline is stable, assume the initial conditions of the elution gradient (eluent A) and

allow the system to establish equilibrium during 5 min.

If the baseline remains unstable after passing the eluent B during 20 min, use the rinsing eluent

(acetonitrile 70 %) to clean the column, then use again eluent B during 5 min and assume the initial

conditions (eluent A).

When the system is balanced with eluant A, the sample shall be injected without delay. If not, traces of

organic compounds occurring in water can be concentrated onto the column and be released during the

gradient elution. Coelution with desulfoglucosinolates may then occur.
9.6.2.2 Analysis

Inject into the chromatograph not more than 50 μl of the desulfoglucosinolate solution obtained in 9.5.5

and vary the concentration in acetonitrile of the mobile phase according to a linear gradient (from 0 %

to 25 % within approximately 20 min).
Use an elution gradient appropriate to the column employed.

The following elution gradients are given as examples and may be modified to give optimum separations

according to the columns used (see Annex D).

EXAMPLE 1 RP18 column, 5 μm (150 mm × 4,6 mm): Pass 100 % of eluent A (5.8) for 1 min. Apply a linear

elution gradient over 20 min until 0 % of eluent A and 100 % of eluent B are obtained. Apply a linear elution

gradient over 5 min until 100 % of eluent A and 0 % of eluent B are obtained. Pass 100 % of eluent A for 5 min to

establish equilibrium.

EXAMPLE 2 RP8 column, 5 μm (125 mm × 4 mm): Pass 100 % of eluent A for 2 min 30 s. Apply a linear elution

gradient over 18 min until 0 %
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9167
Première édition
2019-05
Graines et tourteaux de colza —
Dosage des glucosinolates — Méthode
par chromatographie liquide à haute
performance
Rapeseed and rapeseed meals — Determination of glucosinolates
content — Method using high-performance liquid chromatography
Numéro de référence
ISO 9167:2019(F)
ISO 2019
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ISO 9167:2019(F)
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 9167:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 4

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 5

8 Préparation de l’échantillon pour essai ....................................................................................................................................... 6

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Prise d’essai ............................................................................................................................................................................................... 6

9.2 Extraction des glucosinolates ..................................................................................................................................................... 6

9.3 Essai à blanc .............................................................................................................................................................................................. 7

9.4 Préparation des colonnes échangeuses d’ions ............................................................................................................ 7

9.5 Purification et désulfatation ........................................................................................................................................................ 7

9.6 Chromatographie avec élution par gradient .................................................................................................................. 8

9.6.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 8

9.6.2 Réglage de l’appareil ........................................................................................................................................... .......... 8

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 9

10.1 Calcul de la teneur de chaque glucosinolate .................................................................................................................. 9

10.2 Facteurs de proportionnalité relatifs ................................................................................................................................10

10.3 Calcul de la teneur totale en glucosinolate ..................................................................................................................10

11 Fidélité .........................................................................................................................................................................................................................10

11.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................10

11.2 Répétabilité .............................................................................................................................................................................................11

11.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................11

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................11

Annexe A (informative) Résultats des essais interlaboratoires — Méthode de CLHP avec

élution par gradient .......................................................................................................................................................................................12

Annexe B (normative) Vérification du titre de la solution préparée d’étalon interne ..................................14

Annexe C (normative) Préparation et analyse d’une solution purifiée de sulfatase et

contrôle de l’étape de désulfatation sur colonnes échangeuses d’ions ...................................................15

Annexe D (informative) Qualification du système de CLHP et des critères de performance

de la colonne ..........................................................................................................................................................................................................20

Annexe E (informative) Élution en mode isocratique ......................................................................................................................22

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................29

© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
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ISO 9167:2019(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 2, Graines et fruits oléagineux et farines de graines oléagineuses.

Cette première édition annule et remplace l’ISO 9167-1:1992, qui a fait l’objet d’une révision technique.

Elle incorpore également l’amendement ISO 9167-1:1992/Amd.1:2013. Les principales modifications

sont les suivantes:

— les tourteaux de colza ont été ajoutés au domaine d’application, avec l’ajout d’un nouvel essai

interlaboratoires;
[6]

— en 9.2, le méthanol à 70 % a été remplacé par l’éthanol à 50 % pour une toxicité moindre ;

— en 9.2, une seule extraction est réalisée au lieu de deux;

— en 10.2 et E.5.1, le terme «facteur de proportionnalité relatif» a été utilisé au lieu de «facteur de

réponse»;
— le mode isocratique a été ajouté dans l’Annexe E.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 9167:2019(F)
Introduction

Les glucosinolates dans les graines de colza peuvent être analysés au moyen de méthodes

chromatographiques, enzymatiques ou spectroscopiques. Le présent document décrit une méthode

chromatographique avec deux conditions (par gradient et isocratique) d’élution pour l’analyse

qualitative et quantitative des glucosinolates individuels dans les graines et tourteaux de colza. La

méthode avec élution par gradient est considérée comme la méthode de référence, tandis que la

méthode avec élution isocratique est considérée comme une méthode simplifiée et est présentée dans

l’Annexe E pour information.

Le présent document spécifié une méthode par chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

avec élution par gradient comme méthode de référence. Pour le mode isocratique, le choix de l’étalon

interne, les conditions chromatographiques et les résultats de séparation sont différents de la méthode

de référence. Ces aspects sont discutés dans l’Annexe E.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 9167:2019(F)
Graines et tourteaux de colza — Dosage des glucosinolates
— Méthode par chromatographie liquide à haute
performance
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de dosage des glucosinolates individuels dans les graines

et tourteaux de colza par chromatographie en phase liquide à haute performance avec élution par

gradient.

Cette méthode a été soumise à essai sur les graines et tourteaux de colza (Brassica rapa, Brassica

napus et Brassica juncea), mais elle est applicable à d’autres matériaux végétaux, à condition que les

glucosinolates identifiés précédemment soient décrits dans le présent document. Sinon, l’analyse

quantitative du ou des glucosinolates concernés n’est pas effectuée.

NOTE Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces

composés sont peu importants dans les graines et tourteaux de colza commercialisés.

L’Annexe A présente les résultats des essais interlaboratoires pour la méthode de CLHP avec élution

par gradient. L’Annexe B présente comment vérifier le titre de la solution préparée d’étalon interne.

L’Annexe C présente comment préparer et analyser la solution purifiée de sulfatase et contrôler l’étape

de désulfatation sur la colonne échangeuse d’ions. L’Annexe D présente la qualification du système de

CLHP et des critères de performance de la colonne.

Les glucosinolates des graines de colza peuvent également être dosés en utilisant un mode d’élution

isocratique. Cela nécessite un certain nombre de modifications de la méthode (étalon interne, colonne

de CLHP et solutions tampons pour CLHP), comme décrit dans l’Annexe E.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 664, Graines oléagineuses — Réduction de l'échantillon pour laboratoire en échantillon pour essai

ISO 665, Graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles

ISO 771, Tourteaux de graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai

ISO 5502, Tourteaux de graines oléagineuses — Préparation des échantillons pour essai

3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
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ISO 9167:2019(F)
4 Principe

Extraction des glucosinolates par un mélange eau-éthanol, puis purification et désulfatation

enzymatique sur colonnes échangeuses d’ions. Détermination par chromatographie liquide en phase

inverse avec élution par gradient (méthode de référence) ou élution isocratique (méthode rapide) et

détection par absorptiométrie dans l’ultraviolet.
5 Réactifs

Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau

de grade 2, conformément à l’ISO 3696.
5.1 Éthanol, fraction volumique = 50 %.

5.2 Acétate de sodium, c = 0,02 mol/l à pH 4,0, préparé en mélangeant de l’acétate de sodium,

c = 0,02 mol/l et de l’acide acétique, c = 0,02 mol/l pour obtenir une solution de pH = 4,0.

5.3 Sulfatase, Helix pomatia, type H1 purifiée et diluée comme décrit dans l’Annexe C.

5.4 Formiate d’imidazole, c = 6 mol/l.

Dissoudre 204 g d’imidazole dans 113 ml d’acide formique dans un bécher de 500 ml. Transférer le

mélange dans une éprouvette de 500 ml et compléter à 500 ml avec de l’eau.
5.5 Étalon interne

Utiliser soit la sinigrine (allylglucosinolate, sel de potassium monohydrate, M = 415,5 g/mol) (5.6) soit

la glucotropaéoline (benzylglucosinolate, sel de potassium, M = 447,5 g/mol ou benzylglucosinate, sel

de tétraméthylammonium, M = 482,6 g/mol) (5.7). La glucotropaéoline peut être utilisée sous forme

hydratée, auquel cas la masse molaire et la pureté doivent être connues et prises en compte pour la

préparation de la solution.

Le choix de l’étalon interne sera conditionné par sa séparation chromatographique parfaite des

autres glucosinolates de l’échantillon. L’absence naturelle dans l’échantillon de l’étalon interne ou de

glucosinolates non séparés de ce dernier peut être vérifiée par un essai à blanc (voir 9.3).

Avec l’élution par gradient sur phases stationnaires octyle ou octadéyle, la sinigrine ou la

glucotropaéoline peuvent être utilisées. Toutefois, la glucotropaéoline est parfois difficile à séparer des

autres glucosinolates mineurs naturels.

Avec l’élution isocratique sur phase stationnaire cyanopropyle (voir Annexe E), la sinigrine ne peut

pas être utilisée pour l’analyse des graines de colza en raison de l’absence de séparation des autres

glucosinolates. Elle doit être remplacée par la glucotropaéoline.

Dans les cas les plus fréquents (c’est-à-dire lorsque l’on suppose que les graines de colza ont une teneur

en glucosinolates comprise entre 10 et 50 µmol/g inclus), l’étalon interne est utilisé sous forme de

solution à 20 mmol/l. Pour les graines de colza dont la teneur supposée en glucosinolates est inférieure

à 10 µmol/g ou supérieure à 50 µmol/g, les concentrations des solutions d’étalon interne utilisées par

échantillon sont fournies dans le Tableau 1.

Vérifier le titre de la solution préparée d’étalon interne comme décrit dans l’Annexe B.

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ISO 9167:2019(F)

Tableau 1 — Concentration de la solution d’étalon interne à utiliser selon la teneur supposée en

glucosinolates de l’échantillon

Teneur en glucosinolates de l’échantillon Concentrations des solutions d’étalon interne

μmol/g mmol/l
< 10 5
> 10 et < 50 20
> 50 40
5.6 Solution de sinigrine

La solution de sinigrine de concentration requise (voir Tableau 1) est préparée selon le Tableau 2.

Peser la sinigrine à 0,5 mg près et la dissoudre dans l’eau dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter

au volume avec de l’eau. La solution ainsi préparée peut être conservée au réfrigérateur à environ 4 °C

pendant une semaine ou au congélateur à −18 °C pendant une période plus longue.

Tableau 2 — Poids de sinigrine dans 100 ml d’eau pour la préparation de solutions à 5 mmol/l,

20 mmol/l et 40 mmol/l
Masse moléculaire Masse de sinigrine
Forme de sinigrine g
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium monohydrate 415,5 0,207 7 0,831 0 1,662 0
5.7 Solution de glucotropaéoline

La solution de glucotropaéoline de concentration requise (voir Tableau 1) est préparée selon le Tableau 3.

Peser la glucotropaéoline à 0,5 mg près et la dissoudre dans l’eau dans une fiole jaugée de 100 ml.

Compléter au volume avec de l’eau. La solution ainsi préparée peut être conservée au réfrigérateur à

environ 4 °C pendant une semaine ou au congélateur à −18 °C pendant une période plus longue.

Tableau 3 — Masse de glucotropaéoline dans 100 ml d’eau pour la préparation de solutions à

5 mmol/l, 20 mmol/l et 40 mmol/l
Masse de glucotropaéoline
Masse moléculaire
Forme de glucotropaéoline
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium 447,5 0,223 7 0,895 0 1,790 1
Tétraméthylammonium 482,6 0,241 3 0,965 2 1,930 3

5.8 Éluant A: eau, purifiée par passage sur cartouche de charbon actif ou eau de pureté équivalente.

NOTE L’utilisation d’une eau insuffisamment purifiée peut conduire à des pics fantômes durant l’analyse,

dus aux impuretés éluées lorsque la proportion d’acétonitrile dans l’éluant augmente.

5.9 Éluant B: acétonitrile, qualité gradient de CLHP, solution dans l’eau purifiée, Fraction

volumique = 20 %. La concentration peut être modifiée en fonction de la colonne utilisée.

5.10 Solvant de rinçage: acétonitrile, qualité CLHP, solution dans l’eau, Fraction volumique = 70 %.

© ISO 2019 – Tous droits réservés 3
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ISO 9167:2019(F)

5.11 Résine échangeuse d’ions: Suspension de DEAE Sephadex A25 , préparée comme suit.

Mélanger 10 g de résine DEAE Sephadex A25 (ou d’une résine équivalente) dans un excès d’acide

acétique à 2 mol/l. Laisser décanter. Ajouter de l’acide acétique à 2 mol/l jusqu’à ce que le volume total

soit égal à deux fois le volume du gel décanté.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment:

6.1 Système de CLHP avec élution par gradient ou isocratique, réglage de la température de la colonne

à 30 °C et détection par absorptiométrie dans l’ultraviolet à la longueur d’onde de 229 nm et, si possible,

à la longueur d’onde de 275 nm.

La régulation de la température de la colonne à 30 °C peut être impossible lorsque la température

ambiante est supérieure à 25 °C. Un four avec système de refroidissement-chauffage est alors

recommandé.
6.2 Colonnes de CLHP pour élution par gradient.

Colonne de CLHP contenant une phase stationnaire octyle (C8) ou octadécyle (C18), fixée à un

remplissage de colonne de silice de taille de particules inférieure ou égale à 5 µm.

Il convient de contrôler régulièrement les performances de la colonne à l’aide, de préférence, d’un

échantillon de référence de graines de colza. En particulier, la colonne ne doit pas dégrader la désulfo-

4-hydroxyglucobrassicine, un désulfoglucosinolate important, mais relativement instable. La Figure 1

montre un exemple de séparation des glucosinolates en utilisant le mode de CLHP avec gradient. Les

nouvelles colonnes doivent faire l’objet d’une mise en condition préliminaire, selon les instructions du

fabricant, avant de pouvoir obtenir des résultats reproductibles.
6.3 pH-mètre
6.4 Microbroyeur, par exemple moulin à café.

6.5 Centrifugeuse, convenant pour l’utilisation avec les tubes (6.6), permettant d’obtenir une

accélération centrifuge de 5 000g.
6.6 Tubes en polypropylène, de 6 ml de capacité.

6.7 Bain d’eau ou bloc de chauffage, capable de maintenir une température de (75 ± 3) °C.

6.8 Pipettes Pasteur remplies de laine de verre, 150 mm de long, et support approprié, ou tout

autre dispositif adéquat.

1) DEAE Sepharose A25 est un exemple de produit adapté et disponible dans le commerce. Cette information

est donnée aux utilisateurs du présent document pour des raisons de commodité et ne constitue en aucun cas une

recommandation de ce produit par l’ISO.
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ISO 9167:2019(F)
Légende
1 désulfoglucoibérine 9 désulfogluconapine
2 désulfoprogoitrine 10 désulfo-4-hydroxyglucobrassicine
3 désulfoépiprogoitrine 11 désulfoglucobrassicanapine
4 désulfosinigrine 12 désulfoglucotropaéoline
5 désulfoglucoraphanine 13 désulfoglucobrassicine
6 désulfogluconapoléiférine 14 désulfogluconasturtiine
7 désulfoglucoalyssine 15 désulfo-4-méthoxyglucobrassicine
8 désulfosinalbine 16 désulfonéoglucobrassicine

Figure 1 — Exemple de chromatogramme-type de graines de colza avec élution par gradient

7 Échantillonnage

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou

modifié lors du transport ou l’entreposage.
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ISO 9167:2019(F)

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode

[4]

d’échantillonnage recommandée est fournie dans l’ISO 21294 pour les graines oléagineuses et dans

[1]
l’ISO 5500 pour les tourteaux de graines oléagineuses.

Si, avant la réduction de l’échantillon pour laboratoire, on a séparé les gros corps étrangers non

oléagineux, il doit en être tenu compte dans le calcul.
8 Préparation de l’échantillon pour essai

Réduire l’échantillon pour laboratoire selon l’ISO 664 pour les graines oléagineuses et l’ISO 5502 pour

les tourteaux de graines oléagineuses.

Si les graines ont une teneur en eau et en matières volatiles supérieure à w = 10 %, les sécher au

préalable à l’aide d’un courant d’air à environ (45 ± 5) °C.

Le taux d’impuretés est en général de 2 % (fraction massique). Si l’on trouve de la sinigrine dans

l’échantillon (avec le blanc), effectuer une analyse séparée pour les impuretés, car la sinigrine peut

provenir de graines de crucifères présentes accidentellement, qui constituent des impuretés dans le colza.

Si les graines ont été traitées, les laver au dichlorométhane et les sécher dans un courant d’air à

température ambiante.
Réduire l’échantillon à deux sous-échantillons de 20 g chacun.

Déterminer la teneur en eau et en matière volatiles d’un sous-échantillon conformément à l’ISO 665

pour les graines oléagineuses et à l’ISO 771 pour les tourteaux de graines oléagineuses ou un mode

opératoire approprié.

Broyer les graines de l’autre sous-échantillon dans le microbroyeur (6.4) pendant 20 s. Mélanger, puis

broyer pendant encore 5 s. Peser l’échantillon préparé (voir 9.1) afin d’éviter la modification de sa

teneur en eau et en matières volatiles.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai

Étiqueter deux tubes (6.6) A et B et introduire dans chaque tube 200 mg pour les graines oléagineuses

et 100 mg pour les tourteaux de graines oléagineuses, pesés à 0,5 mg près, de l’échantillon pour essai

préparé (voir Article 8). Utiliser le tube A pour l’échantillon pour essai et le tube B comme blanc, si

nécessaire.
9.2 Extraction des glucosinolates

Plonger les tubes dans le bain d’eau ou le bloc de chauffage (6.7), réglé à 75 °C et les y laisser 1 min.

Ajouter ensuite 3 ml d’une solution bouillante d’éthanol (5.1) et immédiatement après, ajouter dans le

tube A 200 μl à 3 μl près de solution d’étalon interne préparée en fonction du mode d’élution de CLHP et

de la teneur supposée en glucosinolate de l’échantillon (5.5).

La température de la solution d’éthanol doit être aussi proche que possible du point d’ébullition afin de

garantir une dénaturation rapide de l’enzyme myrosinase généralement présente dans la prise d’essai.

NOTE La myrosinase non dénaturée peut dégrader les glucosinolates en quelques minutes.

Poursuivre le chauffage à 75 °C pendant 10 min, en agitant régulièrement. Ajuster le volume dans

chaque tube A et B à environ 4 ml avec de l’eau, mélanger puis centrifuger à 5 000g pendant 3 min.

Transférer le liquide surnageant de chaque tube dans deux autres tubes (6.6) étiquetés A′ et B′. Ajuster

le volume dans chaque tube A′ et B′ à environ 5 ml avec de l’eau et mélanger.
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ISO 9167:2019(F)

Ces extraits peuvent être conservés deux semaines à l’abri de la lumière, au congélateur à −18 °C.

NOTE Avec l’éthanol à 50 % comme solvant, une extraction en une étape s’est avérée suffisamment

[6]
efficace .
9.3 Essai à blanc

Si besoin est (5.5), effectuer un essai à blanc en suivant le même mode opératoire (voir 9.2), sur une

prise d’essai provenant du même échantillon pour essai, mais en omettant la solution d’étalon interne

(sinigrine ou glucotropaéoline) et en la remplaçant par 200 µl d’eau, afin de détecter et de quantifier

une éventuelle présence de sinigrine ou de glucotropaéoline (ou composé élué conjointement) dans la

prise d’essai.
9.4 Préparation des colonnes échangeuses d’ions

Couper le nombre de pipettes Pasteur approprié remplies de laine de verre (6.8), soit une pipette

par extrait combiné, de manière à laisser un volume de 1,2 ml au-dessus de l’étranglement. Placer les

pipettes verticalement sur un support.

Déposer 0,5 ml de la suspension, préalablement bien mélangée, de résine échangeuse d’ions (5.11) dans

chaque pipette et laisser décanter.

Rincer les pipettes avec 2 ml de formiate d’imidazole (5.4) puis deux fois avec 1 ml d’eau.

9.5 Purification et désulfatation
9.5.1 Réaliser les opérations indiquées en 9.5.2 à 9.5.5 pour chaque extrait.

9.5.2 Déposer 1 ml ou 0,5 ml de l’extrait (voir 9.2), selon la teneur supposée en glucosinolate de

l’échantillon (voir Tableau 4) sur une colonne préparée (voir 9.4) sans modifier la surface de la résine et

laisser s’écouler. Ajouter deux fois 1 ml de tampon d’acétate de sodium 0,02 M à pH 4,0 (5.2) en laissant

s’écouler après chaque addition.

Tableau 4 — Volume d’extrait transféré sur la colonne échangeuse d’ions en fonction de la

teneur attendue en glucosinolate de l’échantillon
Teneur en glucosinolate de l’échantillon Volume d’extrait
µmol/g ml
< 50 1,0
> 50 0,5

9.5.3 Ajouter dans la colonne 75 µl de la solution de sulfatase purifiée diluée (voir C.4.4). Laisser agir

pendant environ 15 h à température ambiante.

9.5.4 Placer un tube (6.6) sous la colonne pour recueillir l’éluat. Éluer les désulfoglucosinolate

...

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