ISO 9167:2019
(Main)Rapeseed and rapeseed meals — Determination of glucosinolates content — Method using high-performance liquid chromatography
Rapeseed and rapeseed meals — Determination of glucosinolates content — Method using high-performance liquid chromatography
This document specifies a method for the determination of the individual glucosinolates content in rapeseeds and rapeseed meals using high-performance liquid chromatography with gradient elution. This method was tested on rapeseeds and rapeseed meals (Brassica rapa, Brassica napus and Brassica juncea) but is applicable to other plant materials, on the condition that the occurring glucosinolates previously identified are described in this document. On the contrary, the quantitative analysis of the concerned glucosinolate(s) is not carried out. NOTE This method does not determine glucosinolates that are substituted on the glucose molecule, but these compounds are of little importance in commercial rapeseed and rapeseed meal. Annex A presents the results of the interlaboratory trials for the gradient elution HPLC method. Annex B presents how to check the titre of the prepared internal standard solution. Annex C presents how to prepare and test the purified sulfatase solution and how to check the desulphation step on the ion exchange column. Annex D presents the HPLC and column performance criteria qualification. The analysis of glucosinolates content in rapeseed can also be done using an isocratic elution mode. This requires some modifications of the method (internal, standard, HPLC column and HPLC buffers), as described in Annex E.
Graines et tourteaux de colza — Dosage des glucosinolates — Méthode par chromatographie liquide à haute performance
Le présent document spécifie une méthode de dosage des glucosinolates individuels dans les graines et tourteaux de colza par chromatographie en phase liquide à haute performance avec élution par gradient. Cette méthode a été soumise à essai sur les graines et tourteaux de colza (Brassica rapa, Brassica napus et Brassica juncea), mais elle est applicable à d'autres matériaux végétaux, à condition que les glucosinolates identifiés précédemment soient décrits dans le présent document. Sinon, l'analyse quantitative du ou des glucosinolates concernés n'est pas effectuée. NOTE Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces composés sont peu importants dans les graines et tourteaux de colza commercialisés. L'Annexe A présente les résultats des essais interlaboratoires pour la méthode de CLHP avec élution par gradient. L'Annexe B présente comment vérifier le titre de la solution préparée d'étalon interne. L'Annexe C présente comment préparer et analyser la solution purifiée de sulfatase et contrôler l'étape de désulfatation sur la colonne échangeuse d'ions. L'Annexe D présente la qualification du système de CLHP et des critères de performance de la colonne. Les glucosinolates des graines de colza peuvent également être dosés en utilisant un mode d'élution isocratique. Cela nécessite un certain nombre de modifications de la méthode (étalon interne, colonne de CLHP et solutions tampons pour CLHP), comme décrit dans l'Annexe E.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9167
First edition
2019-05
Rapeseed and rapeseed meals —
Determination of glucosinolates
content — Method using high-
performance liquid chromatography
Graines et tourteaux de colza — Dosage des glucosinolates —
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
Reference number
©
ISO 2019
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ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling . 5
8 Preparation of the test sample . 6
9 Procedure. 6
9.1 Test portion . 6
9.2 Extraction of glucosinolates . 6
9.3 Blank test . 7
9.4 Preparation of ion-exchange columns . 7
9.5 Purification and desulfatation . 7
9.6 Chromatography with gradient elution . 7
9.6.1 General. 7
9.6.2 Adjustment of the apparatus . 8
10 Expression of results . 9
10.1 Calculation of the content of each glucosinolate . 9
10.2 Relative proportionality factors . 9
10.3 Calculation of the total glucosinolate content .10
11 Precision .10
11.1 Interlaboratory test.10
11.2 Repeatability .10
11.3 Reproducibility .10
12 Test report .11
Annex A (informative) Results of interlaboratory trials — Gradient elution HPLC method .12
Annex B (normative) Checking of the titre of the prepared internal standard solution.14
Annex C (normative) Preparation and test of purified sulfatase solution and checking of the
desulphation step on ion-exchange columns .15
Annex D (informative) HPLC system and column performance criteria qualification .20
Annex E (informative) Elution in the isocratic mode .22
Bibliography .28
Foreword
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bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
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Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 2,
Oleaginous seeds and fruits and oilseed meals.
This first edition cancels and replaces ISO 9167-1:1992, which has been technically revised. It also
incorporates the amendment ISO 9167-1:1992/Amd.1:2013. The main changes are as follows:
— rapeseed meals have been added to the scope with the addition of a new collaborative trial;
[6]
— in 9.2, methanol 70 % has been replaced by ethanol 50 % for lower toxicity ;
— in 9.2, only one extraction is carried out instead of two;
— in 10.2 and E.5.1, the term “relative proportionality factor” has been used instead of “response
factor”;
— the isocratic mode has been added in Annex E.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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Introduction
The glucosinolates in rapeseed can be analysed by chromatographic, enzymatic or spectroscopic
methods. This document describes a chromatographic method with two conditions (gradient and
isocratic) of elution for qualitative and quantitative analysis of individual glucosinolates in rapeseed
and rapeseed meals. The method with gradient elution is considered as the reference method whereas
the method with isocratic elution is considered as a simplified method and is presented in Annex E as
information.
This document specifies a method using high-performance liquid chromatography (HPLC) with
gradient elution as reference method. For the isocratic mode, the choice of the internal standard, the
chromatographic conditions and the separation results are different from the reference method. These
aspects are discussed in Annex E.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 9167:2019(E)
Rapeseed and rapeseed meals — Determination of
glucosinolates content — Method using high-performance
liquid chromatography
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the individual glucosinolates content in
rapeseeds and rapeseed meals using high-performance liquid chromatography with gradient elution.
This method was tested on rapeseeds and rapeseed meals (Brassica rapa, Brassica napus and Brassica
juncea) but is applicable to other plant materials, on the condition that the occurring glucosinolates
previously identified are described in this document. On the contrary, the quantitative analysis of the
concerned glucosinolate(s) is not carried out.
NOTE This method does not determine glucosinolates that are substituted on the glucose molecule, but
these compounds are of little importance in commercial rapeseed and rapeseed meal.
Annex A presents the results of the interlaboratory trials for the gradient elution HPLC method.
Annex B presents how to check the titre of the prepared internal standard solution. Annex C presents
how to prepare and test the purified sulfatase solution and how to check the desulphation step on the
ion exchange column. Annex D presents the HPLC and column performance criteria qualification.
The analysis of glucosinolates content in rapeseed can also be done using an isocratic elution mode.
This requires some modifications of the method (internal, standard, HPLC column and HPLC buffers),
as described in Annex E.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 664, Oilseeds — Reduction of laboratory sample to test sample
ISO 665, Oilseeds — Determination of moisture and volatile matter content
ISO 771, Oilseed residues — Determination of moisture and volatile matter content
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5502, Oilseed residues — Preparation of test samples
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
4 Principle
Extraction of glucosinolates by a water-ethanol mixture, then purification and enzymatic desulfatation
on ion-exchange columns. Determination using reverse phase liquid chromatography with gradient
elution (reference method) or isocratic elution (rapid method) and detection by ultraviolet
absorptiometry.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and water conforming to
grade 2 of ISO 3696.
5.1 Ethanol, volume fraction = 50 %.
5.2 Sodium acetate, c = 0,02 mol/l at pH 4,0, prepared by mixing sodium acetate, c = 0,02 mol/l and
acetic acid, c = 0,02 mol/l as to obtain a solution having a pH = 4,0.
5.3 Sulfatase, Helix pomatia, type H1 purified and diluted as described in Annex C.
5.4 Imidazole formiate, c = 6 mol/l.
Dissolve 204 g of imidazole in 113 ml of formic acid in a 500 ml beaker. Transfer the mixture in a 500 ml
cylinder and make up to 500 ml with water.
5.5 Internal standard.
Use either sinigrin (potassium allyglucosinolate monohydrate, M = 415,5 g/mol) (5.6) or glucotropaeolin
(potassium benzylglucosinolate, M = 447,5 g/mol or tetramethylammonium benzylglucosinolate,
M = 482,6 g/mol) (5.7). The glucotropaeolin may be used in a hydrated form, then the molar mass and
the purity shall be known and taken into consideration for the preparation of the solution.
The choice of the internal standard will be conditioned by its perfect chromatographic separation from
the other glucosinolates of the sample. The natural absence in the sample of the internal standard or of
glucosinolates unseparated from the latter may be checked with a blank test (see 9.3).
With gradient elution on octyl or octadecyl stationary phases, sinigrin or glucotropaeolin can be used.
However, glucotropaeolin is sometimes difficult to separate from other natural minor glucosinolates.
With isocratic elution on cyano propyl stationary phase (see Annex E), sinigrin cannot be used for
rapeseed analysis because of the non-separation from the other glucosinolates. Glucotropaeolin shall
be used instead.
In the most frequent cases (i.e. when rapeseeds have an assumed glucosinolates content between
10 μmol/g and 50 μmol/g inclusive) the internal standard is used in solution form at 20 mmol/l. For
rapeseeds where the assumed glucosinolates content is less than 10 μmol/g or greater than 50 μmol/g,
the concentrations of the internal standard solutions used per sample are given in Table 1.
Check the titre of the prepared internal standard solution as described in Annex B.
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Table 1 — Concentration of the internal standard solution to use according to the assumed
glucosinolates content of the sample
Glucosinolates content of the sample Concentrations of the internal standard solutions
μmol/g mmol/l
< 10 5
> 10 and < 50 20
> 50 40
5.6 Sinigrin solution.
The sinigrin solution with the required concentration (see Table 1) is prepared according to Table 2.
Weigh the sinigrin to the nearest 0,5 mg and dissolve it in water in a 100 ml volumetric flask. Make up
to the mark with water. The solution thus prepared may be stored in a refrigerator at approximately
4 °C up to a week or in a freezer at −18 °C for a longer period.
Table 2 — Weight of sinigrin in 100 ml water for preparation of 5 mmol/l, 20 mmol/l and
40 mmol/l solutions
Molecular weight Sinigrin weight
Sinigrin form g
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium monohydrate 415,5 0,207 7 0,831 0 1,662 0
5.7 Glucotropaeolin solution.
The glucotropaeolin solution with the required concentration (see Table 1) is prepared according to
Table 3. Weigh the glucotropaeolin to the nearest 0,5 mg and dissolve it in water in a 100 ml volumetric
flask. Make up to the mark with water. The solution thus prepared may be stored in a refrigerator at
approximately 4 °C up to a week or in a freezer at –18 °C for a longer period.
Table 3 — Weight of glucotropaeolin in 100 ml water for preparation of 5 mmol/l, 20 mmol/l
and 40 mmol/l solutions
Glucotropaeolin weight
Molecular weight
Glucotropaeolin form
g
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium 447,5 0,223 7 0,895 0 1,790 1
Tetramethylammonium 482,6 0,241 3 0,965 2 1,930 3
5.8 Eluent A: water, purified by passing it through an activated charcoal cartridge or water of
equivalent purity.
NOTE The use of insufficiently purified water can lead to ghost peaks during the analysis due to impurities
eluted when the proportion of acetonitrile in the eluent increases.
5.9 Eluent B: acetonitrile, HPLC gradient grade, solution in purified water, volumic fraction = 20 %.
The concentration may be modified in relation to the column used.
5.10 Rinsing solvent: acetonitrile, HPLC grade, solution in water, volumic fraction = 70 %.
1)
5.11 Ion-exchange resin: DEAE Sephadex A25 suspension, prepared as follows.
Mix 10 g of DEAE Sephadex A25 resin (or an equivalent resin) in excess 2 mol/l acetic acid solution. Leave
to settle. Add 2 mol/l acetic acid until the total volume is equal to twice the volume of the sediment.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 HPLC apparatus with gradient or isocratic elution, column temperature adjustment at 30 °C and
detection by ultraviolet absorptiometry at wavelength of 229 nm and, if possible, at wavelength of 275 nm.
An efficient column temperature regulation at 30 °C can be impossible when the ambient temperature
is above 25 °C. An oven with a cooling-heating device is recommended in this case.
6.2 HPLC columns for gradient elution.
HPLC column containing an octyl (C8) or octadecyl (C18) stationary phase, fixed to silica column
packing, of particle size less than or equal to 5 μm.
The performance of the column should be checked regularly, preferably using a reference sample of
rapeseed. In particular, the column shall not degrade desulfo-4-hydroxyglucobrassicin, an important
but relatively unstable desulfoglucosinolate. Figure 1 shows an example of glucosinolates separations
using the HPLC gradient mode. New columns shall be subjected to preliminary conditioning in
accordance with the manufacturer’s instructions so that reproducible results can be obtained.
6.3 pH-meter.
6.4 Microgrinder, for example, a coffee mill.
6.5 Centrifuge, suitable for use with the tubes (6.6), capable of obtaining a centrifugal acceleration
of 5 000g.
6.6 Polypropylene tubes, of 6 ml capacity.
6.7 Water-bath or other heating apparatus, capable of maintaining a temperature of 75 °C ± 3 °C.
6.8 Pasteur pipettes fitted with glass wood, 150 mm long, and a suitable stand, or any other
appropriate apparatus.
1) DEAE Sephadex A25 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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Key
1 desulfoglucoiberin 9 desulfogluconapin
2 desulfoprogoitrin 10 desulfo-4-hydroxyglucobrassicin
3 desulfoepiprogoitrin 11 desulfoglucobrassicanapin
4 desulfosinigrin 12 desulfoglucotropaeolin
5 desulfoglucoraphanin 13 desulfoglucobrassicin
6 desulfogluconapoleiferin 14 desulfogluconasturtiin
7 desulfoglucoalyssin 15 desulfo-4-methoxyglucobrassicin
8 desulfosinalbin 16 desulfoneoglucobrassicin
Figure 1 — Example of a typical chromatogram of rape seeds with gradient elution
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample that is truly representative and that has not been
damaged or changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this document. A recommended sampling method is
[4] [1]
given in ISO 21294 for oilseeds and ISO 5500 for oilseed meals.
If large non-oleaginous foreign bodies have been separated before the reduction of the laboratory
sample, allowance shall be made for this in the calculation.
8 Preparation of the test sample
Reduce the laboratory sample in accordance with ISO 664 for oilseeds and ISO 5502 for oilseed meals.
If the seeds have a moisture and volatile matter content in excess of w = 10 %, dry them beforehand
using a current of air at 45 °C ± 5 °C.
The impurities level is generally 2 % (mass fraction). If sinigrin is found in the sample (with the blank),
analyse the impurities separately, as the sinigrin may stem from seeds of adventitious cruciferae, which
are impurities in rapeseed.
If the seeds have been treated, wash them with dichloromethane and dry them in a current of air at
ambient temperature.
Reduce the sample to two sub-samples of 20 g each.
Determine the moisture and volatile matter content of a sub-sample in accordance with ISO 665 for
oilseeds and ISO 771 for oilseed meals or an adequate procedure.
Grind the seeds of other sub-sample in the microgrinder (6.4) for 20 s. Mix, then grind for a further 5 s.
Weigh the prepared sample (see 9.1) immediately to avoid modification of the moisture and volatile
matter content.
9 Procedure
9.1 Test portion
Label two tubes (6.6) as A and B and transfer 200 mg for oilseeds and 100 mg for oilseed meals, weighed
to the nearest 0,5 mg, of the prepared test sample (see Clause 8) to each tube. Use tube A for the test
sample and use the tube B as blank sample, if necessary.
9.2 Extraction of glucosinolates
Place the tubes in the water-bath or other heating apparatus (6.7), set at 75 °C and leave for 1 min. Add
3 ml of boiling ethanol solution (5.1) and then immediately add, to tube A, 200 μl to the nearest 3 μl of
internal standard solution prepared according to the HPLC elution mode and the assumed glucosinolate
content of the sample (5.5).
The temperature of the ethanol solution shall be as close as possible to the boiling point to ensure a
rapid denaturation of the enzyme myrosinase which generally occurs in the test portion.
NOTE Non-denatured myrosinase can break down the glucosinolates in a few minutes.
Continue heating at 75 °C for a further 10 min, shaking the tubes at regular intervals. Adjust the volume
in each tube A and B to approximately 4 ml with water, mix and then centrifuge at an acceleration of
5 000g for 3 min.
Transfer the supernatant liquid from each tube to two other tubes (6.6) labelled A′ and B′. Adjust the
volume in each tube A′ and B′ to approximately 5 ml with water and mix.
These extracts may be kept for two weeks if stored in the dark in a freezer at −18 °C.
[6].
NOTE With ethanol 50 % as solvent, a one-step extraction was found efficient enough
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9.3 Blank test
If required (5.5), carry out a blank test using the same procedure (see 9.2) on a test portion taken
from the same test sample, but omitting the internal standard solution (sinigrin or glucotropaeolin)
and replacing it by 200 µl of water, in order to detect and quantify any sinigrin or glucotropaeolin (or
coeluting compound) present in the test portion.
9.4 Preparation of ion-exchange columns
Cut the required number of Pasteur pipettes fitted with glass wood (6.8), i.e. one pipette per combined
extract, so as to leave a volume of 1,2 ml above the neck. Place the pipettes vertically on a stand.
Transfer 0,5 ml of a well-mixed suspension of ion-exchange resin (5.11) to each pipette and allow to settle.
Rinse the pipettes with 2 ml of the imidazole formiate (5.4) and then twice with 1 ml portions of water.
9.5 Purification and desulfatation
9.5.1 Carry out the operations given in 9.5.2 to 9.5.5 for each extract.
9.5.2 Transfer 1 ml or 0,5 ml of the extract (see 9.2) depending on the assumed glucosinolate content
of the sample (see Table 4) to a prepared column (see 9.4) without disturbing the resin surface and allow
to drain. Add two 1 ml portions of the 0,02 M, pH 4,0 sodium acetate buffer (5.2), allowing the buffer to
drain after each addition.
Table 4 — Volume of extract transferred to the ion-exchange column according to the expected
glucosinolate content of the sample
Glucosinolate content of the sample Volume of extract
µmol/g ml
< 50 1,0
> 50 0,5
9.5.3 Add to the column 75 μl of diluted purified sulfatase solution (see C.4.4). Leave to act
approximately 15 h at ambient temperature.
9.5.4 Place a tube (6.6) under the column to collect the eluate. Elute the desulfoglucosinolates obtained
with two 1 ml portions of water, allowing the water to drain after each addition.
NOTE The complete elution of the desulfoglucosinolates from the ion exchange column can be checked by
using an additional portion of water (1 ml) for elution. The chromatography of this additional portion will not
reveal any desulfoglucosinolate in significant amount.
9.5.5 Mix the eluate well. If not used immediately for chromatography, the eluate may be stored in the
dark in a freezer at −18 °C for up to one week.
9.6 Chromatography with gradient elution
9.6.1 General
The reference method uses a gradient elution with octyl or octadecyl stationary phase column (6.2) and
eluents (5.8, 5.9 and 5.10).
9.6.2 Adjustment of the apparatus
9.6.2.1 General
Adjust the column temperature to 30 °C and the detector wavelength to 229 nm. Programme the HPLC
apparatus (6.1) so as to rinse the column by passing of eluent B at a flow rate of approximately 1 ml/
min. When the baseline is stable, assume the initial conditions of the elution gradient (eluent A) and
allow the system to establish equilibrium during 5 min.
If the baseline remains unstable after passing the eluent B during 20 min, use the rinsing eluent
(acetonitrile 70 %) to clean the column, then use again eluent B during 5 min and assume the initial
conditions (eluent A).
When the system is balanced with eluant A, the sample shall be injected without delay. If not, traces of
organic compounds occurring in water can be concentrated onto the column and be released during the
gradient elution. Coelution with desulfoglucosinolates may then occur.
9.6.2.2 Analysis
Inject into the chromatograph not more than 50 μl of the desulfoglucosinolate solution obtained in 9.5.5
and vary the concentration in acetonitrile of the mobile phase according to a linear gradient (from 0 %
to 25 % within approximately 20 min).
Use an elution gradient appropriate to the column employed.
The following elution gradients are given as examples and may be modified to give optimum separations
according to the columns used (see Annex D).
EXAMPLE 1 RP18 column, 5 μm (150 mm × 4,6 mm): Pass 100 % of eluent A (5.8) for 1 min. Apply a linear
elution gradient over 20 min until 0 % of eluent A and 100 % of eluent B are obtained. Apply a linear elution
gradient over 5 min until 100 % of eluent A and 0 % of eluent B are obtained. Pass 100 % of eluent A for 5 min to
establish equilibrium.
EXAMPLE 2 RP8 column, 5 μm (125 mm × 4 mm): Pass 100 % of eluent A for 2 min 30 s. Apply a linear elution
gradient over 18 min until 0 % of eluent A and 100 % of eluent B are obtained. Pass 100 % of eluent B for 5 min.
Apply a linear elution gradient over 2 min until 100 % of eluent A and 0 % of eluent B are obtained. Pass 100 % of
eluent A for 5 min to establish equilibrium.
9.6.2.3 Examination of chromatograms
9.6.2.3.1 Identification of the peaks
Using this chromatographic method, the desulfated derivatives of the rape glucosinolates can be
separated fairly easily and the order of elution is generally as shown in Figure 1. However, a few
problems, which can be solved after slight modification of the elution gradient or after change of the
column type, can exist for the separation of the following desulfoglucosinolates:
— desulfoepiprogoitrin and desulfoglucosinigrin;
— desulfogluconapoleiferin and desulfoglucoalyssin;
— desulfoglucobrassicanapin and desulfoglucotropaeolin;
— desulfogluconasturtiin and desulfo-4-methoxyglucobrassicin.
The identification of the peaks may be carried out by comparison with a chromatogram stemming from
a standard sample (6.2) or by UV detection at a specific wavelength (275 nm for indolic glucosinolates).
8 © ISO 2019 – All rights reserved
9.6.2.3.2 Quantification
Only take into account the peaks which correspond to desulfoglucosinolates and where the area exceeds
1 % of the total surface of the areas of these peaks.
Make certain that the integration measurement device operates in a suitable manner for badly
separated peaks and for high intensity peaks. If necessary, reinject the desulfoglucosinolate solution
(see 9.5.5) after diluting with water.
NOTE In spite of the choice of two internal standards, the chromatogram of the blank analysis (tube B,
see 9.2) can show a peak with the same retention time than the internal standard used in the tube A (see 9.2).
Nevertheless, the calculation of the glucosinolates content can be possible by elimination of the influence of the
coeluting peak on the internal standard peak area. If the coeluting peak area is less than the half of the internal
standard area, the former can be subtracted from the latter with a correction made in comparison with the areas
of another major peak present in both chromatograms. The test report specifies this calculation mode.
10 Expression of results
10.1 Calculation of the content of each glucosinolate
The content C of each glucosinolate, expressed in micromoles per gram of dry matter of the product is
g
equal to Formula (1):
A K
g n g 100
C =× ×× (1)
g
A m Kw()100−
s s
where
A is the numeric value of the peak area, in integrator units, corresponding to the
g
desulfoglucosinolate;
A is the numeric value of the peak area, in integrator units, corresponding to the
s
desulfoglucosinolate used as internal standard;
K is the numeric value of the relative proportionality factor of the desulfoglucosinolate;
g
K is the numeric value of the relative proportionality factor of the desulfoglucosinolate used as
s
internal standard;
m is the numeric value of the mass, in grams, of the test portion;
n is the numeric value of the quantity, in micromoles, of internal standard added to the tube in 9.2;
w is the numeric value of the moisture and volatile matter content, expressed in percentage by
mass, of the test sample.
If it is desired to express the result relative to a specific moisture and volatile matter content, w (e.g.
s
w = 9 %), multiply the result C obtained for dry matter (as above) by Formula (2):
s g
100− w
s
(2)
10.2 Relative proportionality factors
The relative proportionality factors (Ki) given in Table 5 shall be adopted.
NOTE These relative proportionality factors have been determined experimentally and have been fixed by
consensus between the various laboratories who took part in the test; they may need to be revised in due course.
Table 5 — Relative proportionality factors (Ki) to adopt
Desulfo-glucosinolate Ki
1 Desulfoglucoiberin 1,07
2 Desulfoprogoitrin 1,09
3 Desulfoepiprogoitrin 1,09
4 Desulfosinigrin 1,00
5 Desulfoglucoraphanin 1,07
6 Desulfogluconapoleiferin 1,00
7 Desulfoglucoalyssin 1,07
8 Desulfosinalbin 0,50
9 Desulfogluconapin 1,11
10 Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin 0,28
11 Desulfoglucobrassicanapin 1,15
12 Desulfoglucotropaeolin 0,95
13 Desulfoglucobrassicin 0,29
14 Desulfogluconasturtiin 0,95
15 Desulfo-4-methoxyglucobrassicin 0,25
16 Desulfoneoglucobrassicin 0,20
17 Other desulfoglucosinolates 1,00
10.3 Calculation of the total glucosinolate content
The total glucosinolate content, expressed in micromoles per gram of dry matter of the product, is equal
to the sum of the content of each glucosinolate (the corresponding peak area of which is greater than
1 % of the sum total of the peak areas).
11 Precision
11.1 Interlaboratory test
Details of an interlaboratory test on the precision of the method are summarized in Annex A. The values
derived from this interlaboratory test may not be applicable to concentration ranges and matrices other
than those given.
11.2 Repeatability
The absolute difference between two independent single test results, obtained using the same method
on identical test materials in the same laboratory by the same operator using the same equipment
within a short interval of time, should not be greater than 2 µmol/g for glucosinolates contents lower
than 20 µmol/g and 4 µmol/g for glucosinolates contents ranging from 20 µmol/g to 35 µmol/g.
11.3 Reproducibility
The absolute difference between two single test results, obtained using the same method on identical
test materials in different equipment, should not be greater than 4 µmol/g for glucosinolate contents
lower than 20 µmol/g and 8 µmol/g for glucosinolate contents ranging from 20 µmol/g to 35 µmol/g.
10 © ISO 2019 – All rights reserved
12 Test report
The test report shall specify the following:
— all information necessary for the complete identification of the sample;
— the sampling method used, if known;
— the test method used, with reference to this document, i.e. ISO 9167;
— all operating details not specified in this document, or regarded as optional, together with details of
any incidents which may have influenced the test result(s);
— the test result(s) obtained;
— if the repeatability has been checked, the final quoted result obtained.
Annex A
(informative)
Results of interlaboratory trials — Gradient elution HPLC method
An interlaboratory test, carried out at the international level in 1988, in which 11 laboratories
participated, each of which carried out two determinations on each sample A, B, C and D, gave the
[2]
statistical results (evaluated in accordance with ISO 5725:1986 ) shown in Table A.1. The gradient
elution method was used.
Table A.1 — Statistical results of the 1988 interlaboratory test — Gradient elution
Rapeseed Rapeseed Rapeseed Rapeseed
Sample
A B C D
Number of laboratories retained after 11 11 11 11
eliminating outliers
a
Mean glucosinolate content 20,6 14,1 4,9 25,6
a
Standard deviation of repeatability, s 1,7 0,6 0,3 0,8
r
Coefficient of variation of repeatability 8,5 4,4 6,7 3,3
(%)
a
Repeatability limit, r (2,83 × s ) 4,8 1,7 0,8 2,2
r
Standard deviation of reproducibility, 3,4 2,5 1,5 2,4
a
s
R
Coefficient of variation of reproduci- 17 18 31 9,4
bility (%)
a
Reproducibility limit, R (2,83 × s ) 9,5 7,0 4,2 6,7
R
a
Expressed in µmol/g dry matter.
An interlaboratory test, carried out at the international level in 2014, in which 18 laboratories
participated, each of which carried out two determinations on each sample A to F, gave the statistical
[2]
results (evaluated in accordance with ISO 5725:1986 ) shown in Table A.2. The gradient elution
method was used.
Table A.2 — Statistical results of the 2014 interlaboratory test
Sample A B C D E F
Sample type Brassica Brassica Brassica Brassica Brassica Brassica
napus meal napus seed juncea juncea napus (can- napus (can-
meal seed ola) seed ola) meal
Number of participating laborato- 18 18 15 18 18 18
ries
Number of laboratories retained 16 18 13 17 18 16
after eliminating outliers
a
Mean glucosinolates content 7,83 14,58 156,97 15,07 10,14 1,70
Standard deviation of repeatabil- 0,15 0,18 1,99 0,36 0,52 0,10
a
ity, s
r
Coefficient of variation of repeata- 1,9 1,2 1,3 2,4 5,2 6,1
bility (%)
a
Repeatability limit, r (2,83 × s ) 0,43 0,51 5,57 1,02 1,47 0,29
r
a
Expressed in µmol/g dry matter.
12 © ISO 2019 – All rights reserved
Table A.2 (continued)
Sample A B C D E F
Standard deviation of reproducibil- 1,33 1,34 30,14 1,91 1,27 0,36
a
ity, s
R
Coefficient of variation of repro- 17,0 9,2 19,2 12,7 12,5 21,0
ducibility (%)
a
Reproducibility limit, R (2,83 × s ) 3,72 3,75 84,4 5,34 3,56 1,00
R
a
Expressed in µmol/g dry matter.
Annex B
(normative)
Checking of the titre of the prepared internal standard solution
B.1 Determination of purity
Make certain that the solution does not contain glucosinolates other than the internal standard by
analysing the solution according to 9.5 to Clause 11.
B.2 Determination of the titre
B.2.1 Principle
The titre is determined either by an independent method for measuring the glucosinolates (glucose
released) or by calibration with the present method and a reference material.
B.2.2 Glucose release method
Determine the titre of the solution by measuring the stoechiometric quantity of glucose released after
complete hydrolysis with the myrosinase (thioglucoside glucohydrolase EC 3.2.3.1). The hydrolysis
[5]
will be carried out on ion exchange columns and the yield of the hydrolysis will be checked by using
different durations as for checking activity of sulfatase (see C.4.5).
B.2.3 Calibration by a reference material
Use with a theoretical titre, the internal standard solution where the real titre have to be determined,
to analyse a sample of rape having a certified glucosinolate content. Use the same method of elution
(gradient or isocratic) than for the expected use of the internal standard solution and carry out several
replicates to evaluate the precision of the calibration. The real titre of the internal standard solution is
calculated as shown by Formula (B.1):
IS =×IS cc/ (B.1)
rthc th
where
IS is the numeric value of the real titre of the internal standard;
r
IS is the numeric value of the theoretical titre of the internal standard;
th
c is the numeric value of the certified glucosinolates content of the reference material;
c
c is the numeric value of the glucosinolates content of the reference material determined
th
with IS .
th
B.3 Relative proportionality factors
Verify that the relative proportionality factor of glucotropaeolin, in comparison with sinigrin,
corresponds to those indicated in 10.2 with a tolerance of 10 %.
14 © ISO 2019 – All rights reserved
Annex C
(normative)
Preparation and test of purified sulfatase solution and checking of
the desulphation step on ion-exchange columns
C.1 General
The sulfatase solution can be purified by two methods based on different principles. Method A is more
efficient but less simple than method B. The purified sulfatase activity is measured in order to prepare
“ready to use” solutions. The activity of the sulfatase solution is checked in analysis conditions (on the
ion exchange columns).
C.2 Principle
C.2.1 Purification
Method A: The sulfatase is purified by ion exchange and ultrafiltration.
Method B: The sulfatase is purified by fractionated precipitation.
C.2.2 Activity measurement
The activity is calculated form the initial speed of the desulfatation of sinigrin. The decrease of the
absorbance of the sinigrin solution at 229 nm is measured with a spectrometer.
C.2.3 Activity checking on ion exchange columns
The desulfatation activity is checked by carrying out a kinetic study of the reaction on glucosinolates
linked on the ion exchange column.
C.3 Reagents and apparatus
C.3.1 Sulfatase, Helix pomatia, type H1 (EC 3.1.6.1).
2)
C.3.2 DEAE Sepharose 6B-CL suspension, available commercially, ready for use, or an equivalent
product.
C.3.3 Ion exchange columns for method A purification.
Cut five Pasteur pipettes (6.8) 7 cm above the neck and place a glass wool plug in the neck. Install the
pipettes vertically on a stand and add to each a sufficient quantity of ion exchange resin (C.3.2) such
that, once the water has drained off, a 0,5 ml volume of resin is obtained.
Pour 1 ml of the imidazole formiate solution (5.4) into each pipette, then rinse them twice with 1 ml
of water.
C.3.4 Sodium acetate, 0,2 mol/l solution.
2) DEAE Sepharose is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
C.3.5 Sinigrin solution, 0,15 mmol/l buffered to pH 5,8 for measurement of activity.
Prepare the following three solutions in succession:
a) transfer 1 ml of glacial acetic acid to a 500 ml one-mark volumetric flask and make up to the mark
with water;
b) transfer 1 ml of ethylene diamine to a 500 ml one-mark volumetric flask and make up to the mark
with water;
c) mix 73 ml of solution a) with 40 ml of solution b) and adjust to pH 5,8 using solution a) or b) as
appropriate.
Pour 3 ml of the 5 mmol/l sinigrin solution (5.6) into a 100 ml one-mark volumetric flask and make up
to the mark with solution c).
C.3.6 Ultra-filtration unit (immersion filter or membrane filter) of which the maximum nominal
3)
molar weight is 10 Kg/mol .
C.3.7 Centrifuge tube of 10 ml capacity.
C.3.8 Double-beam spectrometer, capable of operating in the ultraviolet region of the spectrum, and
at a controlled temperature of 30 °C, equipped with quartz cells of path length 1 cm and if possible with a
recording system.
C.4 Procedures
C.4.1 Method A purification
Weigh, to the nearest 1 mg, 25 mg of sulfatase Helix pomatia type H1 (C.3.1), dissolve it in 2,5 ml of
water and transfer 0,5 ml of this solution into each of the columns prepared in C.3.3. Wash each column
with 1,5 ml of water and discard the effluent. Next, add 1,5 ml of the sodium acetate solution (C.3.4)
then collect and combine the eluates from the five columns in a test tube.
Concentrate the eluates using an ultra-filtration unit (C.3.6) until approximately 100 μl of liquid remains
(
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 9167
Première édition
2019-05
Graines et tourteaux de colza —
Dosage des glucosinolates — Méthode
par chromatographie liquide à haute
performance
Rapeseed and rapeseed meals — Determination of glucosinolates
content — Method using high-performance liquid chromatography
Numéro de référence
©
ISO 2019
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
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Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 6
9 Mode opératoire. 6
9.1 Prise d’essai . 6
9.2 Extraction des glucosinolates . 6
9.3 Essai à blanc . 7
9.4 Préparation des colonnes échangeuses d’ions . 7
9.5 Purification et désulfatation . 7
9.6 Chromatographie avec élution par gradient . 8
9.6.1 Généralités . 8
9.6.2 Réglage de l’appareil . . 8
10 Expression des résultats. 9
10.1 Calcul de la teneur de chaque glucosinolate . 9
10.2 Facteurs de proportionnalité relatifs .10
10.3 Calcul de la teneur totale en glucosinolate .10
11 Fidélité .10
11.1 Essai interlaboratoires .10
11.2 Répétabilité .11
11.3 Reproductibilité .11
12 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Résultats des essais interlaboratoires — Méthode de CLHP avec
élution par gradient .12
Annexe B (normative) Vérification du titre de la solution préparée d’étalon interne .14
Annexe C (normative) Préparation et analyse d’une solution purifiée de sulfatase et
contrôle de l’étape de désulfatation sur colonnes échangeuses d’ions .15
Annexe D (informative) Qualification du système de CLHP et des critères de performance
de la colonne .20
Annexe E (informative) Élution en mode isocratique .22
Bibliographie .29
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 2, Graines et fruits oléagineux et farines de graines oléagineuses.
Cette première édition annule et remplace l’ISO 9167-1:1992, qui a fait l’objet d’une révision technique.
Elle incorpore également l’amendement ISO 9167-1:1992/Amd.1:2013. Les principales modifications
sont les suivantes:
— les tourteaux de colza ont été ajoutés au domaine d’application, avec l’ajout d’un nouvel essai
interlaboratoires;
[6]
— en 9.2, le méthanol à 70 % a été remplacé par l’éthanol à 50 % pour une toxicité moindre ;
— en 9.2, une seule extraction est réalisée au lieu de deux;
— en 10.2 et E.5.1, le terme «facteur de proportionnalité relatif» a été utilisé au lieu de «facteur de
réponse»;
— le mode isocratique a été ajouté dans l’Annexe E.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Introduction
Les glucosinolates dans les graines de colza peuvent être analysés au moyen de méthodes
chromatographiques, enzymatiques ou spectroscopiques. Le présent document décrit une méthode
chromatographique avec deux conditions (par gradient et isocratique) d’élution pour l’analyse
qualitative et quantitative des glucosinolates individuels dans les graines et tourteaux de colza. La
méthode avec élution par gradient est considérée comme la méthode de référence, tandis que la
méthode avec élution isocratique est considérée comme une méthode simplifiée et est présentée dans
l’Annexe E pour information.
Le présent document spécifié une méthode par chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
avec élution par gradient comme méthode de référence. Pour le mode isocratique, le choix de l’étalon
interne, les conditions chromatographiques et les résultats de séparation sont différents de la méthode
de référence. Ces aspects sont discutés dans l’Annexe E.
NORME INTERNATIONALE ISO 9167:2019(F)
Graines et tourteaux de colza — Dosage des glucosinolates
— Méthode par chromatographie liquide à haute
performance
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de dosage des glucosinolates individuels dans les graines
et tourteaux de colza par chromatographie en phase liquide à haute performance avec élution par
gradient.
Cette méthode a été soumise à essai sur les graines et tourteaux de colza (Brassica rapa, Brassica
napus et Brassica juncea), mais elle est applicable à d’autres matériaux végétaux, à condition que les
glucosinolates identifiés précédemment soient décrits dans le présent document. Sinon, l’analyse
quantitative du ou des glucosinolates concernés n’est pas effectuée.
NOTE Cette méthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces
composés sont peu importants dans les graines et tourteaux de colza commercialisés.
L’Annexe A présente les résultats des essais interlaboratoires pour la méthode de CLHP avec élution
par gradient. L’Annexe B présente comment vérifier le titre de la solution préparée d’étalon interne.
L’Annexe C présente comment préparer et analyser la solution purifiée de sulfatase et contrôler l’étape
de désulfatation sur la colonne échangeuse d’ions. L’Annexe D présente la qualification du système de
CLHP et des critères de performance de la colonne.
Les glucosinolates des graines de colza peuvent également être dosés en utilisant un mode d’élution
isocratique. Cela nécessite un certain nombre de modifications de la méthode (étalon interne, colonne
de CLHP et solutions tampons pour CLHP), comme décrit dans l’Annexe E.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 664, Graines oléagineuses — Réduction de l'échantillon pour laboratoire en échantillon pour essai
ISO 665, Graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles
ISO 771, Tourteaux de graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 5502, Tourteaux de graines oléagineuses — Préparation des échantillons pour essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
4 Principe
Extraction des glucosinolates par un mélange eau-éthanol, puis purification et désulfatation
enzymatique sur colonnes échangeuses d’ions. Détermination par chromatographie liquide en phase
inverse avec élution par gradient (méthode de référence) ou élution isocratique (méthode rapide) et
détection par absorptiométrie dans l’ultraviolet.
5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
de grade 2, conformément à l’ISO 3696.
5.1 Éthanol, fraction volumique = 50 %.
5.2 Acétate de sodium, c = 0,02 mol/l à pH 4,0, préparé en mélangeant de l’acétate de sodium,
c = 0,02 mol/l et de l’acide acétique, c = 0,02 mol/l pour obtenir une solution de pH = 4,0.
5.3 Sulfatase, Helix pomatia, type H1 purifiée et diluée comme décrit dans l’Annexe C.
5.4 Formiate d’imidazole, c = 6 mol/l.
Dissoudre 204 g d’imidazole dans 113 ml d’acide formique dans un bécher de 500 ml. Transférer le
mélange dans une éprouvette de 500 ml et compléter à 500 ml avec de l’eau.
5.5 Étalon interne
Utiliser soit la sinigrine (allylglucosinolate, sel de potassium monohydrate, M = 415,5 g/mol) (5.6) soit
la glucotropaéoline (benzylglucosinolate, sel de potassium, M = 447,5 g/mol ou benzylglucosinate, sel
de tétraméthylammonium, M = 482,6 g/mol) (5.7). La glucotropaéoline peut être utilisée sous forme
hydratée, auquel cas la masse molaire et la pureté doivent être connues et prises en compte pour la
préparation de la solution.
Le choix de l’étalon interne sera conditionné par sa séparation chromatographique parfaite des
autres glucosinolates de l’échantillon. L’absence naturelle dans l’échantillon de l’étalon interne ou de
glucosinolates non séparés de ce dernier peut être vérifiée par un essai à blanc (voir 9.3).
Avec l’élution par gradient sur phases stationnaires octyle ou octadéyle, la sinigrine ou la
glucotropaéoline peuvent être utilisées. Toutefois, la glucotropaéoline est parfois difficile à séparer des
autres glucosinolates mineurs naturels.
Avec l’élution isocratique sur phase stationnaire cyanopropyle (voir Annexe E), la sinigrine ne peut
pas être utilisée pour l’analyse des graines de colza en raison de l’absence de séparation des autres
glucosinolates. Elle doit être remplacée par la glucotropaéoline.
Dans les cas les plus fréquents (c’est-à-dire lorsque l’on suppose que les graines de colza ont une teneur
en glucosinolates comprise entre 10 et 50 µmol/g inclus), l’étalon interne est utilisé sous forme de
solution à 20 mmol/l. Pour les graines de colza dont la teneur supposée en glucosinolates est inférieure
à 10 µmol/g ou supérieure à 50 µmol/g, les concentrations des solutions d’étalon interne utilisées par
échantillon sont fournies dans le Tableau 1.
Vérifier le titre de la solution préparée d’étalon interne comme décrit dans l’Annexe B.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
Tableau 1 — Concentration de la solution d’étalon interne à utiliser selon la teneur supposée en
glucosinolates de l’échantillon
Teneur en glucosinolates de l’échantillon Concentrations des solutions d’étalon interne
μmol/g mmol/l
< 10 5
> 10 et < 50 20
> 50 40
5.6 Solution de sinigrine
La solution de sinigrine de concentration requise (voir Tableau 1) est préparée selon le Tableau 2.
Peser la sinigrine à 0,5 mg près et la dissoudre dans l’eau dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter
au volume avec de l’eau. La solution ainsi préparée peut être conservée au réfrigérateur à environ 4 °C
pendant une semaine ou au congélateur à −18 °C pendant une période plus longue.
Tableau 2 — Poids de sinigrine dans 100 ml d’eau pour la préparation de solutions à 5 mmol/l,
20 mmol/l et 40 mmol/l
Masse moléculaire Masse de sinigrine
Forme de sinigrine g
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium monohydrate 415,5 0,207 7 0,831 0 1,662 0
5.7 Solution de glucotropaéoline
La solution de glucotropaéoline de concentration requise (voir Tableau 1) est préparée selon le Tableau 3.
Peser la glucotropaéoline à 0,5 mg près et la dissoudre dans l’eau dans une fiole jaugée de 100 ml.
Compléter au volume avec de l’eau. La solution ainsi préparée peut être conservée au réfrigérateur à
environ 4 °C pendant une semaine ou au congélateur à −18 °C pendant une période plus longue.
Tableau 3 — Masse de glucotropaéoline dans 100 ml d’eau pour la préparation de solutions à
5 mmol/l, 20 mmol/l et 40 mmol/l
Masse de glucotropaéoline
Masse moléculaire
Forme de glucotropaéoline
g
g/mol
5 mmol/l 20 mmol/l 40 mmol/l
Potassium 447,5 0,223 7 0,895 0 1,790 1
Tétraméthylammonium 482,6 0,241 3 0,965 2 1,930 3
5.8 Éluant A: eau, purifiée par passage sur cartouche de charbon actif ou eau de pureté équivalente.
NOTE L’utilisation d’une eau insuffisamment purifiée peut conduire à des pics fantômes durant l’analyse,
dus aux impuretés éluées lorsque la proportion d’acétonitrile dans l’éluant augmente.
5.9 Éluant B: acétonitrile, qualité gradient de CLHP, solution dans l’eau purifiée, Fraction
volumique = 20 %. La concentration peut être modifiée en fonction de la colonne utilisée.
5.10 Solvant de rinçage: acétonitrile, qualité CLHP, solution dans l’eau, Fraction volumique = 70 %.
1)
5.11 Résine échangeuse d’ions: Suspension de DEAE Sephadex A25 , préparée comme suit.
Mélanger 10 g de résine DEAE Sephadex A25 (ou d’une résine équivalente) dans un excès d’acide
acétique à 2 mol/l. Laisser décanter. Ajouter de l’acide acétique à 2 mol/l jusqu’à ce que le volume total
soit égal à deux fois le volume du gel décanté.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
6.1 Système de CLHP avec élution par gradient ou isocratique, réglage de la température de la colonne
à 30 °C et détection par absorptiométrie dans l’ultraviolet à la longueur d’onde de 229 nm et, si possible,
à la longueur d’onde de 275 nm.
La régulation de la température de la colonne à 30 °C peut être impossible lorsque la température
ambiante est supérieure à 25 °C. Un four avec système de refroidissement-chauffage est alors
recommandé.
6.2 Colonnes de CLHP pour élution par gradient.
Colonne de CLHP contenant une phase stationnaire octyle (C8) ou octadécyle (C18), fixée à un
remplissage de colonne de silice de taille de particules inférieure ou égale à 5 µm.
Il convient de contrôler régulièrement les performances de la colonne à l’aide, de préférence, d’un
échantillon de référence de graines de colza. En particulier, la colonne ne doit pas dégrader la désulfo-
4-hydroxyglucobrassicine, un désulfoglucosinolate important, mais relativement instable. La Figure 1
montre un exemple de séparation des glucosinolates en utilisant le mode de CLHP avec gradient. Les
nouvelles colonnes doivent faire l’objet d’une mise en condition préliminaire, selon les instructions du
fabricant, avant de pouvoir obtenir des résultats reproductibles.
6.3 pH-mètre
6.4 Microbroyeur, par exemple moulin à café.
6.5 Centrifugeuse, convenant pour l’utilisation avec les tubes (6.6), permettant d’obtenir une
accélération centrifuge de 5 000g.
6.6 Tubes en polypropylène, de 6 ml de capacité.
6.7 Bain d’eau ou bloc de chauffage, capable de maintenir une température de (75 ± 3) °C.
6.8 Pipettes Pasteur remplies de laine de verre, 150 mm de long, et support approprié, ou tout
autre dispositif adéquat.
1) DEAE Sepharose A25 est un exemple de produit adapté et disponible dans le commerce. Cette information
est donnée aux utilisateurs du présent document pour des raisons de commodité et ne constitue en aucun cas une
recommandation de ce produit par l’ISO.
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Légende
1 désulfoglucoibérine 9 désulfogluconapine
2 désulfoprogoitrine 10 désulfo-4-hydroxyglucobrassicine
3 désulfoépiprogoitrine 11 désulfoglucobrassicanapine
4 désulfosinigrine 12 désulfoglucotropaéoline
5 désulfoglucoraphanine 13 désulfoglucobrassicine
6 désulfogluconapoléiférine 14 désulfogluconasturtiine
7 désulfoglucoalyssine 15 désulfo-4-méthoxyglucobrassicine
8 désulfosinalbine 16 désulfonéoglucobrassicine
Figure 1 — Exemple de chromatogramme-type de graines de colza avec élution par gradient
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport ou l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode
[4]
d’échantillonnage recommandée est fournie dans l’ISO 21294 pour les graines oléagineuses et dans
[1]
l’ISO 5500 pour les tourteaux de graines oléagineuses.
Si, avant la réduction de l’échantillon pour laboratoire, on a séparé les gros corps étrangers non
oléagineux, il doit en être tenu compte dans le calcul.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Réduire l’échantillon pour laboratoire selon l’ISO 664 pour les graines oléagineuses et l’ISO 5502 pour
les tourteaux de graines oléagineuses.
Si les graines ont une teneur en eau et en matières volatiles supérieure à w = 10 %, les sécher au
préalable à l’aide d’un courant d’air à environ (45 ± 5) °C.
Le taux d’impuretés est en général de 2 % (fraction massique). Si l’on trouve de la sinigrine dans
l’échantillon (avec le blanc), effectuer une analyse séparée pour les impuretés, car la sinigrine peut
provenir de graines de crucifères présentes accidentellement, qui constituent des impuretés dans le colza.
Si les graines ont été traitées, les laver au dichlorométhane et les sécher dans un courant d’air à
température ambiante.
Réduire l’échantillon à deux sous-échantillons de 20 g chacun.
Déterminer la teneur en eau et en matière volatiles d’un sous-échantillon conformément à l’ISO 665
pour les graines oléagineuses et à l’ISO 771 pour les tourteaux de graines oléagineuses ou un mode
opératoire approprié.
Broyer les graines de l’autre sous-échantillon dans le microbroyeur (6.4) pendant 20 s. Mélanger, puis
broyer pendant encore 5 s. Peser l’échantillon préparé (voir 9.1) afin d’éviter la modification de sa
teneur en eau et en matières volatiles.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai
Étiqueter deux tubes (6.6) A et B et introduire dans chaque tube 200 mg pour les graines oléagineuses
et 100 mg pour les tourteaux de graines oléagineuses, pesés à 0,5 mg près, de l’échantillon pour essai
préparé (voir Article 8). Utiliser le tube A pour l’échantillon pour essai et le tube B comme blanc, si
nécessaire.
9.2 Extraction des glucosinolates
Plonger les tubes dans le bain d’eau ou le bloc de chauffage (6.7), réglé à 75 °C et les y laisser 1 min.
Ajouter ensuite 3 ml d’une solution bouillante d’éthanol (5.1) et immédiatement après, ajouter dans le
tube A 200 μl à 3 μl près de solution d’étalon interne préparée en fonction du mode d’élution de CLHP et
de la teneur supposée en glucosinolate de l’échantillon (5.5).
La température de la solution d’éthanol doit être aussi proche que possible du point d’ébullition afin de
garantir une dénaturation rapide de l’enzyme myrosinase généralement présente dans la prise d’essai.
NOTE La myrosinase non dénaturée peut dégrader les glucosinolates en quelques minutes.
Poursuivre le chauffage à 75 °C pendant 10 min, en agitant régulièrement. Ajuster le volume dans
chaque tube A et B à environ 4 ml avec de l’eau, mélanger puis centrifuger à 5 000g pendant 3 min.
Transférer le liquide surnageant de chaque tube dans deux autres tubes (6.6) étiquetés A′ et B′. Ajuster
le volume dans chaque tube A′ et B′ à environ 5 ml avec de l’eau et mélanger.
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Ces extraits peuvent être conservés deux semaines à l’abri de la lumière, au congélateur à −18 °C.
NOTE Avec l’éthanol à 50 % comme solvant, une extraction en une étape s’est avérée suffisamment
[6]
efficace .
9.3 Essai à blanc
Si besoin est (5.5), effectuer un essai à blanc en suivant le même mode opératoire (voir 9.2), sur une
prise d’essai provenant du même échantillon pour essai, mais en omettant la solution d’étalon interne
(sinigrine ou glucotropaéoline) et en la remplaçant par 200 µl d’eau, afin de détecter et de quantifier
une éventuelle présence de sinigrine ou de glucotropaéoline (ou composé élué conjointement) dans la
prise d’essai.
9.4 Préparation des colonnes échangeuses d’ions
Couper le nombre de pipettes Pasteur approprié remplies de laine de verre (6.8), soit une pipette
par extrait combiné, de manière à laisser un volume de 1,2 ml au-dessus de l’étranglement. Placer les
pipettes verticalement sur un support.
Déposer 0,5 ml de la suspension, préalablement bien mélangée, de résine échangeuse d’ions (5.11) dans
chaque pipette et laisser décanter.
Rincer les pipettes avec 2 ml de formiate d’imidazole (5.4) puis deux fois avec 1 ml d’eau.
9.5 Purification et désulfatation
9.5.1 Réaliser les opérations indiquées en 9.5.2 à 9.5.5 pour chaque extrait.
9.5.2 Déposer 1 ml ou 0,5 ml de l’extrait (voir 9.2), selon la teneur supposée en glucosinolate de
l’échantillon (voir Tableau 4) sur une colonne préparée (voir 9.4) sans modifier la surface de la résine et
laisser s’écouler. Ajouter deux fois 1 ml de tampon d’acétate de sodium 0,02 M à pH 4,0 (5.2) en laissant
s’écouler après chaque addition.
Tableau 4 — Volume d’extrait transféré sur la colonne échangeuse d’ions en fonction de la
teneur attendue en glucosinolate de l’échantillon
Teneur en glucosinolate de l’échantillon Volume d’extrait
µmol/g ml
< 50 1,0
> 50 0,5
9.5.3 Ajouter dans la colonne 75 µl de la solution de sulfatase purifiée diluée (voir C.4.4). Laisser agir
pendant environ 15 h à température ambiante.
9.5.4 Placer un tube (6.6) sous la colonne pour recueillir l’éluat. Éluer les désulfoglucosinolates
obtenus avec deux fois 1 ml d’eau, en laissant l’eau s’écouler après chaque addition.
NOTE L’élution complète des désulfoglucosinolates de la colonne échangeuse d’ions peut être vérifiée
en utilisant une portion supplémentaire (1 ml) d’eau pour l’élution. La chromatographie de cette portion
supplémentaire ne révélera pas de désulfoglucosinolate en quantité significative.
9.5.5 Bien mélanger l’éluat. S’il n’est pas utilisé immédiatement pour la chromatographie, il peut être
conservé à l’abri de la lumière, au congélateur à −18 °C, pendant une semaine.
9.6 Chromatographie avec élution par gradient
9.6.1 Généralités
La méthode de référence utilise une élution par gradient avec une colonne à phase stationnaire octyle
ou octadécyle (6.2) et des éluants (5.8, 5.9 et 5.10).
9.6.2 Réglage de l’appareil
9.6.2.1 Généralités
Régler la température de la colonne à 30 °C et la longueur d’onde du détecteur à 229 nm. Programmer
le système de CLHP (6.1) afin de rincer la colonne en faisant passer l’éluant B à un débit d’environ
1 ml / min. Lorsque la ligne de base est stable, appliquer les conditions initiales du gradient d’élution
(éluant A) et laisser le système s’équilibrer pendant 5 min.
Si la ligne de base reste instable après le passage de l’éluant B pendant 20 min, utiliser l’éluant de
rinçage (acétonitrile à 70 %) pour nettoyer la colonne, puis utiliser de nouveau l’éluant B pendant 5 min
et appliquer les conditions initiales (éluant A).
Lorsque le système est équilibré avec l’éluant A, l’échantillon doit être injecté immédiatement. Sinon,
des traces de composés organiques présents dans l’eau peuvent se concentrer sur la colonne et être
libérées durant l’élution par gradient. Une coélution avec les désulfoglucosinolates est alors possible.
9.6.2.2 Analyse
Injecter dans le chromatographe au maximum 50 μl de la solution de désulfoglucosinolate obtenue en
9.5.5 et faire varier la concentration d’acétonitrile de la phase mobile selon un gradient linéaire (de 0 %
à 25 % en 20 min environ).
Utiliser un gradient d’élution adapté à la colonne utilisée.
Les gradients d’élution suivants sont indiqués comme exemples et peuvent être modifiés afin d’obtenir
des séparations optimales en fonction des colonnes utilisées (voir Annexe D).
EXEMPLE 1 Colonne RP18, 5 μm (150 mm × 4,6 mm): Passer 100 % de l’éluant A (5.8) pendant 1 min.
Appliquer un gradient d’élution linéaire pendant 20 min jusqu’à ce que 0 % de l’éluant A et 100 % de l’éluant B
soient obtenus. Appliquer un gradient d’élution linéaire pendant 5 min jusqu’à ce que 100 % de l’éluant A et 0 %
de I’éluant B soient obtenus. Passer 100 % de l’éluant A pendant 5 min pour établir l’équilibre.
EXEMPLE 2 Colonne RP8, 5 μm (125 mm × 4 mm): Passer 100 % de l’éluant A pendant 2 min 30 s. Appliquer un
gradient d’élution linéaire pendant 18 min jusqu’à ce que 0 % de l’éluant A et 100 % de l’éluant B soient obtenus.
Passer 100 % de l’éluant B pendant 5 min. Appliquer un gradient d’élution linéaire pendant 2 min jusqu’à ce que
100 % de l’éluant A et 0 % de l’éluant B soient obtenus. Passer 100 % de l’éluant A pendant 5 min pour établir
l’équilibre.
9.6.2.3 Examen des chromatogrammes
9.6.2.3.1 Identification des pics
En utilisant cette méthode chromatographique, les dérivés désulfatés des glucosinolates de colza
peuvent être séparés assez aisément et l’ordre d’élution est généralement celui indiqué sur la Figure 1.
Toutefois, quelques difficultés, qui peuvent être résolues après légère modification du gradient d’élution
ou après changement de type de colonne, peuvent exister pour la séparation des désulfoglucosinolates
suivants:
— désulfoépiprogoitrine et désulfoglucosinigrine;
— désulfogluconapoléiférine et désulfoglucoalyssine;
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— désulfoglucobrassicanapine et désulfoglucotropaéoline;
— désulfogluconasturtiine et désulfo-4-méthoxyglucobrassicine.
Les pics peuvent être identifiés par comparaison avec un chromatogramme obtenu avec un échantillon
étalon (6.2) ou par détection UV à une longueur d’onde spécifique (275 nm pour les glucosinolates
indoliques).
9.6.2.3.2 Quantification
Prendre en compte uniquement les pics correspondant aux désulfoglucosinolates et dont l’aire est
supérieure à 1 % de la somme totale des aires des pics.
S’assurer que le dispositif de mesurage d’intégration fonctionne correctement pour les pics mal séparés
et les pics de haute intensité. Si nécessaire, réinjecter la solution de désulfoglucosinolate (voir 9.5.5)
après dilution dans l’eau.
NOTE Malgré le choix de deux étalons internes, le chromatogramme d’analyse du blanc (tube B, voir 9.2) peut
montrer un pic ayant le même temps de rétention que l’étalon interne utilisé dans le tube A (voir 9.2). Néanmoins,
le calcul de la teneur en glucosinolates peut être possible en éliminant l’influence du pic coélué sur l’aire de pic de
l’étalon interne. Si l’aire du pic coélué est inférieure à la moitié de l’aire du pic d’étalon interne, la première peut
être soustraite de la dernière avec une correction établie par comparaison avec les aires d’un autre pic majeur
présent sur les deux chromatogrammes. Le rapport d’essai spécifie ce mode de calcul.
10 Expression des résultats
10.1 Calcul de la teneur de chaque glucosinolate
La teneur C de chaque glucosinolate, exprimée en micromoles par gramme de matière sèche du produit,
g
est égale à la Formule (1):
A K
n 100
g g
C =× ×× (1)
g
A m Kw()100−
s s
où
A est la valeur numérique de l’aire du pic, en unités d’intégrateur, correspondant au
g
désulfoglucosinolate;
A est la valeur numérique de l’aire du pic, en unités d’intégrateur, correspondant au
s
désulfoglucosinolate utilisé comme étalon interne;
K est la valeur numérique du facteur de proportionnalité relatif du désulfoglucosinolate;
g
K est la valeur numérique du facteur de proportionnalité relatif du désulfoglucosinolate utilisé
s
comme étalon interne;
m est la valeur numérique de la masse, en grammes, de la prise d’essai;
n est la valeur numérique de la quantité, en micromoles, de l’étalon interne ajouté dans le tube en 9.2;
w est la teneur numérique de la teneur en eau et en matières volatiles, exprimée en pourcentage
en masse, de l’échantillon pour essai.
Si l’on désire exprimer le résultat par rapport à une teneur en eau et en matières volatiles spécifique,
w , (par exemple, w = 9 %), multiplier le résultat C obtenu sur matière sèche (comme ci-dessus) par la
s s g
Formule (2):
100− w
s
(2)
10.2 Facteurs de proportionnalité relatifs
Les facteurs de proportionnalité relatifs (Ki) fournis dans le Tableau 5 doivent être adoptés.
NOTE Ces facteurs de proportionnalité relatifs ont été déterminés expérimentalement et ont été fixés par
consensus des différents laboratoires ayant participé aux essais; ils sont susceptibles d’être révisés en temps voulu.
Tableau 5 — Facteurs de proportionnalité relatifs (Ki) à adopter
Désulfo-glucosinolate Ki
1 Désulfoglucoibérine 1,07
2 Désulfoprogoitrine 1,09
3 Désulfoépiprogoitrine 1,09
4 Désulfosinigrine 1,00
5 Désulfoglucoraphanine 1,07
6 Désulfogluconapoléiférine 1,00
7 Désulfoglucoalyssine 1,07
8 Désulfosinalbine 0,50
9 Désulfogluconapine 1,11
10 Désulfo-4-hydroxyglucobrassicine 0,28
11 Désulfoglucobrassicanapine 1,15
12 Désulfoglucotropaéoline 0,95
13 Désulfoglucobrassicine 0,29
14 Désulfogluconasturtiine 0,95
15 Désulfo-4-méthoxyglucobrassicine 0,25
16 Désulfonéoglucobrassicine 0,20
17 Autres désulfoglucosinolates 1,00
10.3 Calcul de la teneur totale en glucosinolate
La teneur totale en glucosinolate, exprimée en micromoles par gramme de matière sèche du produit, est
égale à la somme des teneurs de chaque glucosinolate (dont l’aire du pic correspondant est supérieure à
1 % de la somme totale des aires des pics).
11 Fidélité
11.1 Essai interlaboratoires
Les détails d’un essai interlaboratoires relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans l’Annexe A.
Les valeurs dérivées de cet essai peuvent ne pas s’appliquer aux plages de concentrations et matrices
autres que celles données.
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11.2 Répétabilité
Il convient que la différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à
l’aide de la même méthode sur des matériaux identiques soumis à l’essai dans le même laboratoire et
par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne soit pas
supérieure à 2 µmol/g pour les teneurs en glucosinolates inférieures à 20 µmol/g et à 4 µmol/g pour les
teneurs en glucosinolates comprises entre 20 µmol/g et 35 µmol/g.
11.3 Reproductibilité
Il convient que la différence absolue entre deux résultats d’essai individuels indépendants, obtenus à
l’aide de la même méthode sur des matériaux identiques soumis à l’essai en utilisant des appareillages
différents ne soit pas supérieure à 4 µmol/g pour les teneurs en glucosinolates inférieures à 20 µmol/g
et à 8 µmol/g pour les teneurs en glucosinolates comprises entre 20 µmol/g et 35 µmol/g.
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit spécifier ce qui suit:
— tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;
— la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue;
— la méthode d’essai utilisée, avec une référence au présent document, c’est-à-dire l’ISO 9167;
— tous les détails opératoires non prévus dans le présent document, ou considérés comme facultatifs,
ainsi que les détails sur tout incident éventuel susceptible d’avoir agi sur le(s) résultat(s) d’essai;
— le(s) résultat(s) d’essai obtenu(s);
— si la répétabilité a été contrôlée, le résultat final obtenu.
Annexe A
(informative)
Résultats des essais interlaboratoires — Méthode de CLHP avec
élution par gradient
Un essai interlaboratoires, organisé en 1988 sur le plan international avec la participation de
11 laboratoires, chacun d’eux ayant effectué deux déterminations sur chaque échantillon, A, B, C et D, a
[2]
donné les résultats statistiques (déterminés selon l’ISO 5725:1986 ) indiqués dans le Tableau A.1. La
méthode d’élution par gradient a été utilisée.
Tableau A.1 — Résultats statistiques de l’essai interlaboratoires de 1988 — Élution par gradient
Graines de Graines de Graines de Graines de
colza colza colza colza
Échantillon
A B C D
Nombre de laboratoires retenus après élimina- 11 11 11 11
tion des valeurs aberrantes
a
Teneur moyenne en glucosinolate 20,6 14,1 4,9 25,6
a
Écart-type de répétabilité, s 1,7 0,6 0,3 0,8
r
Coefficient de variation de répétabilité (%) 8,5 4,4 6,7 3,3
a
Limite de répétabilité, r (2,83 × s ) 4,8 1,7 0,8 2,2
r
a
Écart-type de reproductibilité, s 3,4 2,5 1,5 2,4
R
Coefficient de variation de reproductibilité (%) 17 18 31 9,4
a
Limite de reproductibilité, R (2,83 × s ) 9,5 7,0 4,2 6,7
R
a
Exprimé en µmol/g de matière sèche.
Un essai interlaboratoires, organisé en 2014 sur le plan international avec la participation de
18 laboratoires, chacun d’eux ayant effectué deux déterminations sur chaque échantillon A à F, a donné
[2]
les résultats statistiques (déterminés selon l’ISO 5725:1986 ) indiqués dans le Tableau A.2. La méthode
d’élution par gradient a été utilisée.
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Tableau A.2 — Résultats statistiques de l’essai interlaboratoires de 2014
Échantillon A B C D E F
Type d’échantillon Tour- Graine Tour- Graine de Graine de Tourteau
teau de de teau de Brassica Bras- de Bras-
Brassica Brassica Brassica juncea sica napus sica napus
napus napus juncea (canola) (canola)
Nombre de laboratoires participants 18 18 15 18 18 18
Nombre de laboratoires retenus après 16 18 13 17 18 16
élimination des valeurs aberrantes
a
Teneur moyenne en glucosinolates 7,83 14,58 156,97 15,07 10,14 1,70
a
Écart-type de répétabilité, s 0,15 0,18 1,99 0,36 0,52 0,10
r
Coefficient de variation de répétabilité (%) 1,9 1,2 1,3 2,4 5,2 6,1
a
Limite de répétabilité, r (2,83 × s ) 0,43 0,51 5,57 1,02 1,47 0,29
r
a
Écart-type de reproductibilité, s 1,33 1,34 30,14 1,91 1,27 0,36
R
Coefficient de variation de reproductibi- 17,0 9,2 19,2 12,7 12,5 21,0
lité (%)
a
Limite de reproductibilité, R (2,83 × s ) 3,72 3,75 84,4 5,34 3,56 1,00
R
a
Exprimé en µmol/g de matière sèche.
Annexe B
(normative)
Vérification du titre de la solution préparée d’étalon interne
B.1 Détermination de la pureté
S’assurer que la solution ne contient pas de glucosinolates autres que l’étalon interne en analysant la
solution conformément à 9.5 à l’Article 11.
B.2 Détermination du titre
B.2.1 Principe
Le titre est déterminé par une méthode indépendante de mesurage des glucosinolates (libération de
glucose) ou par étalonnage avec la présente méthode et un matériau de référence.
B.2.2 Méthode par libération du glucose
Déterminer le titre de la solution en mesurant la quantité stœchiométrique de glucose libéré après
hydrolyse complète avec la myrosinase (thioglucoside glucohydrolase EC 3.2.3.1). L’hydrolyse sera
[5]
réalisée sur colonnes échangeuses d’ions et le rendement de l’hydrolyse sera contrôlé en utilisant
différentes durées comme cela est fait pour contrôler l’activité de la sulfatase (voir C.4.5).
B.2.3 Étalonnage avec un matériau de référence
Utiliser avec un titre théorique la solution d’étalon interne dont le titre réel doit être déterminé, pour
analyser un échantillon de colza ayant une teneur certifiée en glucosinolate. Utiliser la même méthode
d’élution (par gradient ou isocratique) que pour l’utilisation attendue de la solution d’étalon interne et
réaliser plusieurs réplicats pour évaluer la fidélité de l’étalonnage. Le titre réel de la solution d’étalon
interne est calculé comme indiqué par la Formule (B.1):
IS =×IS cc/ (B.1)
rthc th
où
IS est la valeur numérique du titre réel de l’étalon interne;
r
IS est la valeur numérique du titre théorique de l’étalon interne;
th
c est la valeur numérique de la teneur certifiée en glucosinolates du matériau de référence;
c
c est la valeur numérique de la teneur en glucosinolates du matériau de référence déterminée
th
avec l’IS .
th
B.3 Facteurs de proportionnalité relatifs
Vérifier que le facteur de proportionnalité relatif de la glucotropaéoline, comparativement à la sinigrine,
correspond à celui indiqué en 10.2 avec une tolérance de 10 %.
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