ISO 29841:2009
(Main)Vegetable fats and oils — Determination of the degradation products of chlorophylls a and a' (pheophytins a, a' and pyropheophytins)
Vegetable fats and oils — Determination of the degradation products of chlorophylls a and a' (pheophytins a, a' and pyropheophytins)
ISO 29841:2009 specifies a procedure for the determination of the degradation products pheophytin a, a' and pyropheophytin a of chlorophylls. The method is applicable to vegetable fats and oils only.
Corps gras d'origine végétale — Détermination des produits de décomposition des chlorophylles a et a' (phéophytines a, a' et pyrophéophytines)
L'ISO 29841:2009 spécifie un mode opératoire permettant la détermination des produits de décomposition des chlorophylles, à savoir les phéophytines a et a′ et la pyrophéophytine a. La méthode s'applique uniquement aux corps gras d'origine végétale.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 29841
First edition
2009-03-15
Vegetable fats and oils — Determination
of the degradation products of
chlorophylls a and a′ (pheophytins a, a′
and pyropheophytins)
Corps gras d'origine végétale — Détermination des produits de
décomposition des chlorophylles a et a′ (phéophytines a, a′ et
pyrophéophytines)
Reference number
©
ISO 2009
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 29841 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 29841:2009(E)
Vegetable fats and oils — Determination of the degradation
products of chlorophylls a and a′ (pheophytins a, a′ and
pyropheophytins)
1 Scope
This International Standard specifies a procedure for the determination of the degradation products
pheophytin a, a' and pyropheophytin a of chlorophylls. The method is applicable to vegetable fats and oils only.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
pyropheophytin a (content in chlorophyll degradation products)
mass of pyropheophytin a divided by the sum of the masses of pheophytin a, a' and pyropheophytin a
4 Principle
Separation of the pigments (chlorophylls, pheophytins a and a', pyropheophytin a) using a miniaturized
column chromatography on a silica gel column from the major part of the lipids (triglycerides). The eluate is
analysed by RP18-HPLC, and the separated components are monitored at 410 nm using a photometric
detector.
The analysis of some seed oils (e.g. rapeseed oil) requires a higher sensitivity which can be achieved using
fluorescence detection with an excitation wavelength of 430 nm and an emission wavelength of 670 nm.
A direct HPLC determination with fluorescence detection is also possible and described in Annex C.
5 Reagents
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of hazardous
substances. Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Chlorophyll a.
NOTE Due to the lack of pheophytin and pyropheophytin reference materials, chlorophyll a is used to produce these
degradation products. Pheophytins are obtained from a chlorophyll a solution by acidification; pyropheophytins by
additional heat (> 100 °C) (Reference [4]).
5.2 Acetone.
5.3 Methanol.
5.4 Diethyl ether.
5.5 Petroleum ether, boiling point range 40 °C to 60 °C.
5.6 n-Heptane or, if not available, n-hexane.
CAUTION — Owing to its toxicity, avoid using n-hexane if n-heptane is available.
5.7 Petroleum ether and diethyl ether solvent mixture, volume fractions: ϕ = 90 ml/100 ml;
PetE
ϕ = 10 ml/100 ml.
Et O
6 Apparatus
Usual laboratory equipment, and in particular the following.
6.1 HPLC setup.
6.1.1 HPLC system, consisting of a pump, a sample-injecting device (20 µl loop) or auto sampler, either a
photometric detector for measurements at 410 nm or a fluorescence detector (excitation wavelength,
λ = 430 nm and emission wavelength, λ = 670 nm), and an integration system.
ex em
6.1.2 HPLC column, 250 mm length, 4,0 mm or 4,6 mm internal diameter, filled with reverse-phase type
RP18 particles, size 5 µm.
The following conditions have been found to be suitable:
1)
Stationary phase: Partisil ODS 3, 5 µm, 250 mm × 4,6 mm ;
Mobile phase: Water, methanol, and acetone (6.1.3);
Flow rate: 1,0 ml/min.
6.1.3 Mobile phase, water, methanol, and acetone mixture, volume fractions: ϕ = 4 ml/100 ml;
H O
ϕ = 36 ml/100 ml; ϕ = 60 ml/100 ml. All solvents shall be HPLC grade.
MeOH Me C=O
6.2 Taper-shaped flask, of capacity 10 ml or 25 ml.
6.3 Beakers, of different capacities.
6.4 Rotary evaporator, with water bath.
6.5 Auto sampler vials, of suitable capacity.
1) Example, available commercially, of a C18 reverse phase with a 10,5 % mass fraction carbon load, end-capped for
deactivation of silanols to minimize the need for ion suppression or ion pairing agents. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2009 – All rights reserved
2)
6.6 Silica cartridge, 1 000 mg/6 ml, 55 µm, 700 nm or diol cartridge, 3 ml .
NOTE Home-made silica mini-columns can also be used for the separation.
7 Sample
7.1 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 5555 .
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
7.2 Preparation of the test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.
IMPORTANT — Test samples shall be stored cold and protected from light in glass vessels. After
clean-up, the test solutions shall be analysed immediately to prevent degradation and oxidation.
Avoid contact of test samples with plastics.
8 Procedure
8.1 Weigh about 300 mg of the test sample (7.2) into a small beaker (6.3), dissolve it in 1 ml of n-heptane
or n-hexane (5.6) and pour the solution on to the silica cartridge (silica gel column) (6.6). Rinse the beaker
twice with 1 ml portions of petroleum ether (5.5), pouring these washings on to the
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 29841
Première édition
2009-03-15
Corps gras d'origine végétale —
Détermination des produits de
décomposition des chlorophylles a et a'
(phéophytines a, a' et pyrophéophytines)
Vegetable fats and oils — Determination of the degradation products of
chlorophylls a and a' (pheophytins a, a' and pyropheophytins)
Numéro de référence
©
ISO 2009
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 29841 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.
NORME INTERNATIONALE ISO 29841:2009(F)
Corps gras d'origine végétale — Détermination des produits de
décomposition des chlorophylles a et a' (phéophytines a, a' et
pyrophéophytines)
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie un mode opératoire permettant la détermination des produits de
décomposition des chlorophylles, à savoir les phéophytines a et a′ et la pyrophéophytine a. La méthode
s'applique uniquement aux corps gras d'origine végétale.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
pyrophéophytine a (teneur dans les produits de dégradation de la chlorophylle)
masse de pyrophéophytine a divisée par la somme des masses de phéophytines a et a′ et de
pyrophéophytine a
4 Principe
Séparation des pigments (chlorophylles, phéophytines a et a′, pyrophéophytine a), par chromatographie
miniaturisée sur colonne de gel de silice, des constituants majoritaires des lipides (triglycérides). L'éluat est
analysé par CLHP sur colonne RP 18 et les composants séparés sont détectés à 410 nm à l'aide d'un
détecteur photométrique.
L'analyse de certaines huiles issues de graines oléagineuses (par exemple l'huile de colza) nécessite une
sensibilité plus élevée qui peut être obtenue par détection par fluorescence avec une longueur d'onde
d'excitation de 430 nm et une longueur d'onde d'émission de 670 nm.
Une détermination directe par CLHP avec détection par fluorescence est également possible et décrite à
l'Annexe C.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — L'attention est attirée sur les réglementations spécifiant la manipulation des
substances dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et de la
sécurité personnelle doivent être suivies.
Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue.
5.1 Chlorophylle a.
NOTE Du fait de l'absence d'étalons de phéophytine et de pyrophéophytine, de la chlorophylle a est utilisée pour
obtenir ces produits de décomposition. Les phéophytines sont obtenues à partir d'une solution de chlorophylle a par
acidification, les pyrophéophytines en procédant à un chauffage supplémentaire (> 100 °C) (Référence [4]).
5.2 Acétone.
5.3 Méthanol.
5.4 Éther diéthylique.
5.5 Éther de pétrole, domaine d'ébullition compris entre 40 °C et 60 °C.
5.6 n-heptane ou en cas d'indisponibilité n-hexane.
ATTENTION — Du fait de sa toxicité, éviter l'utilisation du n-hexane si le n-heptane est disponible.
5.7 Mélange d'éther de pétrole et d'éther diéthylique, de fractions volumiques ϕ = 90 ml/100 ml et
PetE
ϕ = 10 ml/100 ml.
Et O
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Installation de CLHP.
6.1.1 Système de CLHP, constitué d'une pompe, d'un dispositif d'injection d'échantillon (boucle de 20 µl)
ou d'un auto-échantillonneur, d'un détecteur photométrique pour les mesurages à 410 nm ou d'un détecteur
de fluorescence (longueur d'onde d'excitation λ = 430 nm et longueur d'onde d'émission λ = 670 nm) et
ex em
d'un système d'intégration.
6.1.2 Colonne de CLHP, de 250 mm de longueur, 4,0 mm ou 4,6 mm de diamètre intérieur, remplie de
particules RP 18 en phase inverse, d'une taille de 5 µm.
Les conditions suivantes ont été jugées appropriées:
1)
Phase stationnaire: Partisil ODS 3, 5 µm, 250 mm × 4,6 mm ;
Phase mobile: Eau, méthanol et acétone (6.1.3);
Débit: 1,0 ml/min.
1) Exemple, disponible dans le commerce, de phase inverse C 18 avec une charge de carbone de 10,5 % en fraction
massique, avec masquage des hydroxydes résiduels pour désactivation des silanols afin de limiter le plus possible la
nécessité d’agents de suppression ou d’appariement d’ions. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de
la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés
6.1.3 Phase mobile, mélange eau, méthanol et acétone: fractions volumiques ϕ = 4 ml/100 ml;
H O
ϕ = 36 ml/100 ml; ϕ = 60 ml/100 ml. Tous les solvants doivent être de qualité CLHP.
MeOH Me C=O
6.2 Fiole conique, d'une capacité de 10 ml ou 25 ml.
6.3 Béchers, de différentes capacités.
6.4 Évaporateur rotatif, comportant un bain-marie.
6.5 Flacons pour auto-échantillonneur, d'une capacité appropriée.
2)
6.6 Cartouche de silice, 1 000 mg/6 ml, 55 µm, 700 nm ou cartouche de diol, 3 ml .
NOTE Des mini-colonnes de silice préparées au laboratoire peuvent également être utilisées pour la séparation.
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555 .
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif et non endommagé ni modifié
lors du transport ou du stockage.
7.2 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 661.
IMPORTANT — Les échantillons pour essai doivent être conservés froids et à l'abri de la lumière dans
des récipients en verre. Après purification, les solutions d'essai doivent être immédiatement
analysées afin d'éviter toute dégradation et oxydation. Éviter le contact des échantillons pour essai
avec le plastique.
8 Mode opératoire
8.1 Peser environ 300 mg de l'échantillon pour essai (7.2) dans un pet
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.