ISO 16472:2006
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of amylase-treated neutral detergent fibre content (aNDF)
Animal feeding stuffs — Determination of amylase-treated neutral detergent fibre content (aNDF)
ISO 16472:2006 specifies methods for the determination of amylase-treated neutral detergent insoluble fibrous residue content in all types of animal feed. It includes a gravimetric routine method and a reference method.
Aliments des animaux — Détermination du contenu en fibre par traitement à l'amylase et au détergent neutre (aNDF)
L'ISO 16472:2006 décrit une méthode de détermination du contenu en fibres résiduelles, insolubles, traitées à l'amylase et au détergent neutre, dans tous les types d'aliments pour animaux. Elle inclut une méthode par gravimétrie courante et une méthode de référence.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16472
First edition
2006-04-15
Animal feeding stuffs — Determination of
amylase-treated neutral detergent fibre
content (aNDF)
Aliments des animaux — Détermination du contenu en fibre détergente
neutre traitée à l'amylase
Reference number
ISO 16472:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO 16472:2006(E)
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ISO 16472:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 1
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 2
7 Sampling. 3
8 Preparation of test sample. 3
9 Procedure . 4
9.1 Procedure for traditional method as described in Reference [1] . 4
9.2 Determination using Fibertec-type apparatus . 5
9.3 Modifications for specific types of samples . 7
9.4 Quality assurance. 8
10 Calculation and expression of results. 8
10.1 Calculation. 8
10.2 Expression of results . 9
11 Precision. 9
11.1 Interlaboratory test . 9
11.2 Repeatability. 9
11.3 Reproducibility. 10
12 Test report . 10
Annex A (informative) Results of interlaboratory test. 11
Annex B (informative) Standardization of heat-stable alpha-amylase working solution. 14
Bibliography . 16
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ISO 16472:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16472 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16472:2006(E)
Animal feeding stuffs — Determination of amylase-treated
neutral detergent fibre content (aNDF)
WARNING — The use of this International Standard may involve the use of hazardous materials,
operations and equipment. This International Standard does not purport to address all the safety risks
associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to establish
appropriate safety and health practices and determine the applicability of local regulatory limitations
prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies methods for the determination of amylase-treated neutral detergent
insoluble fibrous residue content in all types of animal feed.
It includes a gravimetric routine method and a reference method.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Preparation of test samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
amylase-treated neutral detergent fibre content
aNDF content
mass fraction of insoluble fibre residues determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The aNDF content is expressed as a percentage by mass.
4 Principle
Neutral detergent (ND) solution and heat-stable alpha-amylase are used to dissolve the easily digestible
proteins, lipids, sugars, starches and pectins in feeds, leaving an insoluble fibrous residue that is primarily cell
wall components of plant materials (cellulose, hemicellulose and lignin) and indigestible nitrogenous matter in
animal products.
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5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
5.1 Sodium sulfite, anhydrous (Na SO ).
2 3
5.2 Dried hominy corn (corn grits, raw), ground to pass through a 1 mm screen in a cutter mill.
5.3 Iodine solution, containing 2 g of potassium iodide and 1 g of iodine in 100 ml of water.
Store the solution in an amber or opaque bottle.
5.4 Heat-stable alpha-amylase, as a solution or a water extract of lyophilised enzyme powder (approx. 1 g
of powder extracted in 100 ml of water).
EXAMPLE Termamyl 120 l from Novo Enzymes or equivalent.
Standardize the heat-stable alpha-amylase solution or enzyme powder extract so that two additions of 2 ml
will remove starch from 0,5 g of raw corn starch (5.2). For a detailed procedure on standardizing heat-stable
alpha-amylase solution, see Annex B.
5.5 Neutral-detergent (ND) solution
Pour between 400 ml and 500 ml of water into a 1 l flask. Add 4,0 g of sodium hydroxide (NaOH) 14,6 g of
EDTA, 4,56 g of sodium hydrogen phosphate (Na HPO ), and 6,81 g of sodium borate decahydrate
2 4
⋅
(Na B O 10 H O) and mix until dissolved (heat if necessary). The NaOH and EDTA may be replaced with
2 4 7 2
18,6 g of disodium EDTA.
Under a safety hood, add 30 g of sodium lauryl sulfate and, after dissolution, add 10 ml of triethylene glycol
(anti-foaming aid). Add water to about 950 ml and mix. Adjust the pH to between 6,95 and 7,05 with
concentrated hydrochloric acid (HCl) or sodium hydroxide (NaOH) and dilute to 1 000 ml with water. If the pH
is off the range by more than 0,5, discard the solution.
Store the ND solution at room temperature. If precipitation occurs, warm the solution to 25 °C and mix before
use. Record the date the ND solution was prepared, the pH measurements and any adjustments in a reagent
log book.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,1 mg, with a readability of 0,1 mg.
6.2 Cyclone mill with 2 mm screen, or cutter mill with 1 mm screen, capable of grinding samples to obtain
a geometric mean particle size of 220 µm to 260 µm
6.3 Refluxing apparatus, with individual heating units and cold water condensers that fit 600 ml flasks.
Any conventional apparatus suitable for crude fibre determinations is acceptable. Calibrate the heating unit
settings so that 50 ml of water boils within 4 min to 5 min when using cold water condensers. A Fibertec type
apparatus may be used and should boil 50 ml of water within 10 min.
6.4 Fritted-disc Gooch crucibles, coarse porosity (pore size 40 µm to 60 µm) crucibles, high-form, 40 ml
to 50 ml capacity, or P2 (pore size 40 µm to 100 µm), 26 ml to 28 ml capacity.
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ISO 16472:2006(E)
Clean new crucibles and ash at 500 °C for 1 h. Clean crucibles after each use by ashing at 500 °C for 3 h,
removing ash, inverting in a detergent solution and sonicating for 7 min to 10 min. Rinse crucibles in hot water,
and soak in water at room temperature for at least 30 min. Fit the top of each crucible with a rubber stopper
fitted with a port that is connected to a trap and vacuum line. Back-flush each crucible with water, by
repeatedly plunging and removing the bottom of the crucible into water to create a vigorous rinsing action.
Occasionally check the filtration rate as follows. Fill each crucible with 50 ml of distilled water (25 ml for
Fibertec P2 crucibles) and record the time required to drain completely without vacuum (should be
180 s ± 60 s for Gooch or 75 s ± 30 s for P2). If the drain time is < 100 s (or < 30 s for P2), discard the crucible.
If it is < 120 s (or < 45 s for P2), check for cracks in the fritted disc. If the filtration takes > 240 s (or > 105 s for
P2), clean the crucible with acid or alkaline cleaning solution (see Reference [1]). If cleaning does not improve
the filtration rate, discard the crucible.
Instead of P2 crucibles, stainless-steel metal crucibles with a 90 µm aperture stainless-steel metal sieve may
also be used.
6.5 Vacuum filter manifold (e.g. Fibertec type), that allows adequate soaking of fibrous residues.
The manifold should provide a vacuum-tight seal with the crucible to reduce foam formation in vacuum lines.
Use thick-walled vacuum tubing to connect the manifold to a trap (4 l to 18 l) and vacuum source. A vacuum
reservoir (18 l) between the trap and vacuum source is recommended to ensure adequate vacuum capacity to
remove the foam.
6.6 Boiling water supply
Use a continuous boiling water generator as described in Reference [1] or a suitable alternative. The
apparatus shall be capable of supplying boiling water (> 95 °C) in a quantity sufficient for all samples being
washed at one time, through a nozzle producing a fine stream (flow rate of 35 ml to 40 ml per 10 s; a 2,5 ml
disposable plastic pipette tip makes an acceptable nozzle). A fine nozzle minimizes the water needed to
transfer particles to the crucible, but provides the water pressure needed to remove residues attached to the
side of the flask. It is critical that water is boiling when added to the crucibles, especially for samples
containing starches, pectic substances, mucilages or glyco-proteins. For Fibertec type apparatus, use a
syringe with a cone-spray nozzle to rinse the condensers and a 60 ml disposable syringe with 12 gauge
needle that is 10 cm in length to dislodge any residues adhering to the condensers.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
is given in ISO 6497.
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test samples in accordance with ISO 6498.
For sample storage and ease of grinding, samples should be air-dry (about 90 % dry matter)
Dry wet samples at < 60 °C to prevent creation of artefact fibre. The amount of residue after extraction is
affected by the particle size of the sample. Grind representative samples to obtain a geometric mean particle
size of 220 µm to 260 µm (see 6.2).
Grinding segregates the sample, with highest fibre content material passing out of the grinder last. Do not
discard material in the grinder, combine it with material in the grinder receptacle. Mix the ground sample by
placing it on a square sheet of paper (approximately 40 cm × 40 cm) creased along both diagonals. Lift two
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opposite corners of the sheet to slide the sample in towards the central crease. Spread the sheet out flat again,
turn it through 90° and lift the other two corners. Repeat 11 times. Transfer the sample to a suitable container.
NOTE Wet samples can be analysed for aNDF; however this is not a routine approach because it is difficult to grind
the samples to the equivalent particle size as above.
9 Procedure
9.1 Procedure for traditional method as described in Reference [1]
9.1.1 Test portion
Dry the empty crucibles at 105 °C ± 1 °C for 4 h then weigh them. Record the empty crucible mass for
samples (m ) or blanks (m ) to the nearest 0,000 1 g.
c b
Mix the material thoroughly and weigh 1 g ± 0,001 g of air-dry feed, or the equivalent amount of wet test
sample (m ), into a crucible or refluxing flask, depending on preliminary defatting.
s
Inhomogeneous samples that need grinding shall be dried (see Clause 8). Only wet samples that can easily
be homogenized may be weighed in directly.
If results are to be reported on a dry matter basis, weigh a second sample at the same time for determination
of the dry matter.
Include an in-house reference sample and two blanks for the first 20 to 30 samples in a run, and add one
reference and one blank for each additional 20 to 30 samples.
9.1.2 Preliminary defatting
Samples containing > 5 % fat should be pre-extracted. Those with > 10 % fat shall be pre-extracted to remove
the fat.
To pre-extract with acetone, put a test portion into a crucible and weigh it. Place it on the filter manifold and
extract four times with 40 ml to 50 ml of acetone (allow material to soak at least 5 min and stir three times
during each soaking). Apply vacuum to remove traces of acetone, air-dry for 10 min to 15 min to ensure that
all traces of acetone are removed and transfer to a reflux flask. Use the same crucible to collect the fibre
residue for the test sample after ND extraction.
If a filtering aid is used, it shall be dried and weighed with the crucible, then transferred to another container
before the test sample is weighed into the crucible and extracted with acetone. Replace the filtering aid in the
crucible before filtration of fibre residues after ND extraction.
9.1.3 Digestion
Add 0,5 g ± 0,1 g of sodium sulfite (5.1) using a graduated scoop and 50 ml ± 5 ml of ND solution (5.5) to
each refluxing flask and swirl (this is critical for starchy feeds that stick to the bottom during refluxing). Do not
add the ND and sodium sulfite to samples more than 60 min before refluxing.
Heat to boiling within 4 min to 5 min, add 2 ml of standardized amylase solution (5.4), resuspend any particles
stuck to the bottom or sides, and swirl.
Reflux for 60 min at a rate that creates vigorous particle movement, but not excessive foaming that would
carry particles up the side of the flask. Samples may foam vigorously for 1 min to 2 min (do not reduce the
temperature of the heating unit). Rinse the sides of the flask with a minimum amount of ND solution, using a
bottle with a fine nozzle, 5 min to 10 min after adding the amylase, and rinse as needed to resuspend particles
on the side of the flask (twice max.).
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ISO 16472:2006(E)
9.1.4 Filtration
Remove the extracted sample from the heating unit and allow particles to settle for 30 s to 60 s. Before
transfer, observe the mixture to determine if lipid globules are present on the surface or if the solution is milky,
which indicates a high-fat material that should be rerun after acetone pre-extraction (9.1.2).
Place a Teflon stirring rod in the crucible and preheat by adding 40 ml of boiling water for 30 s to 60 s.
Remove the water with vacuum and immediately decant the top 30 ml to 40 ml of the solution from the flask,
keeping the flask inverted over the crucible. Use minimum vacuum to evacuate excess liquid and close
vacuum before residue becomes dry.
NOTE Excessive vacuum and evacuating to dryness causes some samples to clog the crucible and so not wash
properly.
Rinse all unattached particles into the crucible using a fine stream of boiling water. Fill the crucible half-full
with hot water. Add 2 ml of working amylase solution (5.4) and stir.
React with amylase for a minimum of 45 s to 60 s while scraping particles from the bottom and sides of the
reflux flask using a rubber policeman. Evacuate the amylase solution and transfer any remaining residue from
the reflux flask into the crucible with 20 ml to 30 ml boiling water. Two rinses are usually sufficient. After
transferring residues from the flask, fill the crucible three-quarters full with boiling water and soak for 3 min.
Evacuate the water, add 40 ml to 50 ml of boiling water, soak for 3 min to 5 min, and repeat. If residues are
difficult to filter after the first soak, add an additional 2 ml of working amylase solution. If residues appear
translucent and become more difficult to filter with each additional soaking, eliminate the third water soak. If
plugged, the crucible may be back-flushed by removing it from the filter manifold and reinserting it.
Evacuate the water, refill the crucible with 40 ml to 50 ml acetone, stir to disperse particles, soak for 3 min to
5 min, and repeat. Rinse the stirring rod to remove any attached fibre particles. Do not evacuate water
completely from the fibre residues with vacuum before adding the acetone. Excessive drying clumps the
residues and makes particle dispersion in acetone difficult, which hampers acetone extraction.
Apply a vacuum to dry the sample. Remove the crucible from the manifold and air dry for 10 min to 60 min to
remove acetone.
9.1.5 Drying
Dry crucibles at 105 °C ± 1 °C for a minimum of 8 h. Leave to cool in the dessicator and weigh to the nearest
0,000 1 g (m and m ).
ce be
9.1.6 Ashing
Ignite the crucible with the residue in a furnace at 500 °C ± 20 °C for 5 h or until carbon-free. Leave to cool in
the dessicator and weigh to the nearest 0,000 1 g (m and m ).
ca ba
9.2 Determination using Fibertec-type apparatus
9.2.1 Test portion
Add the filtering aid to the P2 crucible, dry at 105 °C ± 1 °C for 2 h to 4 h and weigh to the nearest 0,000 1 g
(m or m ). Mix material thoroughly and weigh 0,5 g ± 0,050 0 g of air-dry feed, or an equivalent amount of wet
c b
test sample (m ), into the crucible.
s
If results are to be reported on a dry matter basis, weigh a second sample at the same time for determination
of the dry matter.
Include an in-house reference sample and two blanks for the first 20 to 30 samples in a run, and add one
reference and one blank for each additional 20 to 30 samples.
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ISO 16472:2006(E)
9.2.2 Preliminary defatting
Generally samples with unknown fat contents should be pre-extracted. Those with > 10 % fat shall be pre-
extracted to remove the fat.
Place the crucible on the cold-extraction unit and extract four times with 20 ml to 30 ml of acetone (allow the
material to soak for at least 5 min and stir three times during each soaking). Apply vacuum to remove traces of
acetone, air-dry for 10 to 15 min to ensure that all traces of acetone are removed.
9.2.3 Digestion
Start up the Fibertec-type apparatus, following the instructions of the manufacturer.
Add 0,5 g ± 0,1 g of sodium sulfite and 50 ml ± 5 ml of ND solution (5.5) to each crucible and mix using back-
pressure (this is critical for starchy feeds that stick to the bottom during refluxing). Do not add the ND and
sodium sulfite to samples more than 60 min before refluxing. Add 2 ml of standardized amylase solution (5.4)
and heat to boiling within 10 min. Use back pressure to mix the amylase with the ND solution and the sample.
Boil for 60 min. Samples may foam vigorously for 1 min to 2 min (do not reduce the temperature of the heating
unit). Rinse the sides of the flask with a minimum amount of ND, using a bottle with fine nozzle, 5 min to
10 min after adding the amylase, and rinse as needed to resuspend particles on the side of the flask (twice
max.).
9.2.4 Filtration
Before the initial filtration, observe the mixture to determine if lipid globules are present on the surface or if the
solution is milky, which indicates a high-fat material that should be rerun after acetone pre-extraction (9.2.2).
Evacuate the solution without allowing residues to become dry. Use minimum vacuum to evacuate excess
liquid, but close vacuum before residue becomes dry.
NOTE 1 Excessive vacuum and evacuating to dryness causes some samples to clog the crucible and so not wash
properly.
Add 30 ml of hot water (80 °C) and 2 ml of standardized amylase solution (5.4). Use back-pressure to mix the
amylase in the initial water soak. Remove amylase-water soak after a minimum of 60 s of reaction.
NOTE 2 Crucibles can be removed from the hot to the cold filtration unit for the remaining hot water soaks for samples
that are easy to filter. This allows the next set of samples to begin ND extraction on the hot filtration unit. Samples that are
difficult to filter can be washed on the Fibertec heating unit with heat reduced to minimize particle agitation.
Add 30 ml of hot water, soak for 3 min to 5 min, and remove the water. If residues are difficult to filter after the
first soak, add an additional 2 ml of amylase solution. If residues appear translucent and become more difficult
to filter with each additional soaking, eliminate the third water soak. If plugged, the crucibles may be back-
flushed using minimum back-pressure.
Do not evacuate the water completely from the fibre residues with vacuum before the acetone wash.
Excessive drying clumps the residues and makes particle dispersion in acetone difficult, which hampers
acetone extraction.
Move crucibles to the cold extraction unit. Fill crucibles with 30 ml of acetone and use minimum back-pressure
to disperse the particles. Soak for 3 min to 5 min and evacuate. Repeat the acetone wash.
Dry the residue under vacuum, remove the crucible from the manifold and air-dry for 10 min to 60 min to
remove acetone.
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ISO 16472:2006(E)
9.2.5 Drying
Dry the crucibles at 105 °C ± 1 °C for a minimum of 8 h. Leave to cool in the dessicator and weigh to the
nearest 0,000 1 g (m and m ).
ce be
9.2.6 Ashing
Ignite the crucible with the residue in a furnace at 500 °C ± 20 °C for 5 h or until carbon-free. Leave to cool in
the dessicator and weigh to the nearest 0,000 1 g (m and m ).
ca ba
9.3 Modifications for specific types of samples
9.3.1 If the extracted ND solution appears milky and opaque and filtration is slow during transfer of residues
or after the first water soaking, a high starch content is suspected. Add an additional treatment with 2 ml of
amylase during the second water soaking. Shorten soaking times to the minimum to keep the soaking
solutions as hot as possible (> 85 °C).
9.3.2 If the residue clogs the crucible during transfer and additional amylase does not improve filtration, the
feed material may contain proteinaceous, gum or mucilage residues (as is the case with meat products and
some oil seed meals). Preheating the crucible with boiling water is crucial for filtering these materials. The
best filter aid for these materials is 12 g to 15 g (6 g to 8 g for Fibertec P2) of silica sand (sand, cristobalite,
1)
acid-purified, 40 mesh to 200 mesh, Fluka Cat. No. 84880 or equivalent) . The gummy substances in these
feed materials will stick to sand particles, which prevents them from clogging the fritted disc and allows the
residues to be washed. All filter aids shall be added to the crucibles (including blanks) before the initial
masses are recorded.
9.3.3 If the fibre residue has a glossy, translucent sheen and filtration becomes more difficult with each
water soaking, pectic substances are suspected. Preheat the crucible with boiling water and transfer residues
as quickly as possible without settling when removed from the reflux unit. Reduce all soaking times to the
minimum to maintain a temperature of > 85 °C to prevent cooling and jelling of pectin in the crucible. The
following filter aids may improve filtration (in order of preference): 12 g to 15 g (6 g to 8 g for Fibertec P2) silica
sand, 0,25 g (0,15 g for Fibertec P2) glass wool and glass microfibre mats (4,25 cm Whatman GF/D or
1)
equivalent) .
9.3.4 If fat globules are observed floating on the surface of the ND or wash water and the sample is difficult
to filter, or if the sample is known to contain > 10 % fat, it should be pre-extracted with acetone or ether (see
9.1.2 or 9.2.2).
9.3.5 If the sample contains fine particles, flocculant precipitates, dirt (fine clay) or faecal matter, but not
pectic substances or starch, increase the settling time to a maximum of 2 min after removal from the refluxing
unit and use a filter aid in the crucible. Filter aids (in order of preference) include: glass microfibre mats,
ceramic fibre, 12 g to 15 g of silica sand, and 0,25 g of glass wool. Microfibre mats can be gently scraped to
renew the surface during filtration.
9.3.6 If all other modifications fail, reduce the test sample amount to 0,3 g and repeat the analysis with a
filter aid in the crucible. Reducing the sample amount will magnify the effects of weighing errors and increase
variation in results. Sometimes reducing the sample amount and increasing the ND amount to 70 ml to 100 ml
is beneficial. If the fibre content is < 1,5 %, do not reduce the sample amount; if filtration is not possible, report
results as “difficult to analyse, fibre content < 1,5 %”.
9.3.7 Do not add acetone before all the rinse water has been removed. Al
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16472
Première édition
2006-04-15
Aliments des animaux — Détermination
du contenu en fibre par traitement à
l'amylase et au détergent neutre (aNDF)
Animal feeding stuffs — Determination of amylase-treated neutral
detergent fibre content (aNDF)
Numéro de référence
ISO 16472:2006(F)
©
ISO 2006
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 2
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 4
9 Mode opératoire . 4
9.1 Mode opératoire relatif à la méthode courante décrite dans la Référence [1] . 4
9.2 Détermination avec un appareillage de type Fibertec . 6
9.3 Modification applicables pour certains types d'échantillons . 7
9.4 Assurance qualité. 8
10 Calculs et expression des résultats. 9
10.1 Calculs . 9
10.2 Expression des résultats . 10
11 Fidélité . 10
11.1 Essai interlaboratoires . 10
11.2 Répétabilité. 10
11.3 Reproductibilité. 11
12 Rapport d'essai . 11
Annexe A (informative) Résultats d'essai interlaboratoires . 12
Annexe B (informative) Étalonnage de la solution de travail d'alpha-amylase thermostable. 15
Bibliographie . 17
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ISO 16472:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16472 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,
Aliments des animaux.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16472:2006(F)
Aliments des animaux — Détermination du contenu en fibre par
traitement à l'amylase et au détergent neutre (aNDF)
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l'utilisation de
substances, de manipulations ou d'appareils dangereux. La présente Norme internationale n'a pas
pour objectif de traiter tous les risques associés à la sécurité de son utilisation. L'utilisateur du
présent document est responsable de définir les consignes de sécurité à observer et de déterminer
les réglementations à appliquer avant toute utilisation.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination du contenu en fibres résiduelles,
insolubles, traitées à l'amylase et au détergent neutre, dans tous les types d'aliments pour animaux.
Elle inclut une méthode par gravimétrie courante et une méthode de référence.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6498, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
contenu en fibres traitées à l'amylase et au détergent neutre
contenu en aNDF
fraction massique de fractions fibreuses insolubles, déterminée selon le mode opératoire décrit dans la
présente Norme internationale
NOTE Le contenu en aNDF est exprimé en pourcentage en masse.
4 Principe
Une solution de détergent neutre (ND) et une alpha-amylase thermostable sont utilisées pour dissoudre les
pectines, les amidons, les sucres, les lipides et les protéines faciles à digérer dans les aliments, laissant une
fibre résiduelle insoluble; il s'agit principalement de composants de la paroi cellulaire des végétaux (cellulose,
hémicellulose et lignine) d'une part et, d'autre part, de matière azotée indigeste dans les produits pour
animaux.
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ISO 16472:2006(F)
5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ainsi que de l'eau
distillée ou déminéralisée, ou bien de pureté équivalente.
5.1 Sulfite de sodium, anhydre (Na SO ).
2 3
5.2 Semoule de maïs sec (gruaux de maïs, maïs cru), réduit en poudre dans un broyeur à dents pour
passer au travers d'un tamis de 1 mm d'ouverture de maille.
5.3 Solution d'iode, contenant 2 g d'iodure de potassium et 1 g d'iode dans 100 ml d'eau.
Conserver dans un flacon ambré ou opaque.
5.4 Alpha-amylase thermostable, en solution ou en extrait aqueux de poudre d'enzyme lyophilisée
(environ 1 g d'extrait de poudre pour 100 ml d'eau).
EXEMPLE Enzymes Termamyl 120 l de Novo ou équivalent.
Étalonner la solution d'alpha-amylase thermostable ou l'extrait de poudre d'enzyme de sorte que deux ajouts
de 2 ml éliminent l'amidon contenu dans 0,5 g d'amidon de maïs cru (5.2). Pour plus d'informations sur le
mode opératoire relatif à l'étalonnage d'une solution d'alpha-amylase thermostable, voir l'Annexe B.
5.5 Solution de détergent neutre (ND)
Verser entre 400 ml et 500 ml d'eau dans une fiole de 1 l. Ajouter 4,0 g d'hydroxyde de sodium (NaOH),
14,6 g d'EDTA, 4,56 g d'hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ) et 6,81 g de borate de sodium
2 4
décahydraté (Na B O ,10 H O), puis mélanger jusqu'à dissolution (chauffer si nécessaire). L'hydroxyde de
2 4 7 2
sodium et l'EDTA peuvent être remplacés par 18,6 g d'EDTA disodique.
Sous une hotte, ajouter 30 g de lauryl sulfate de sodium, puis, après dissolution, ajouter 10 ml de triéthylène
glycol (agent antimousse). Ajouter de l'eau jusqu'à 950 ml environ puis mélanger. Ajuster le pH entre 6,95 et
7,05 à l'aide d'acide chlorhydrique (HCl) concentré ou d'hydroxyde de sodium (NaOH), puis diluer avec de
l'eau jusqu'à 1 000 ml. Si le pH s'écarte de ces valeurs de plus de 0,5, mettre la solution au rebut.
Conserver la solution de ND à température ambiante. En cas de précipitation, chauffer à 25 °C puis mélanger
avant usage. Noter dans un journal des réactifs la date à laquelle la solution de ND a été préparée, ainsi que
les mesurages de pH et les ajustements effectués.
6 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Balance analytique, d'une précision de l'ordre de 0,1 mg pour le pesage et la lecture.
6.2 Broyeur cyclonique muni d'un tamis de 2 mm d'ouverture de maille, ou broyeur à dents muni d'un
tamis de 1 mm d'ouverture de maille, pour broyer les échantillons jusqu'à l'obtention de particules
géométriques dont la taille moyenne est comprise entre 200 µm et 260 µm.
6.3 Appareillage de reflux, muni de dispositifs de chauffage individuels et de réfrigérants d'eau froide
conçus pour des béchers de 600 ml.
Tout appareillage conventionnel adapté à la détermination de fibres brutes peut être accepté. Étalonner les
réglages des dispositifs de chauffage de sorte que 50 ml d'eau soient portés à ébullition en 4 min à 5 min lors
de l'utilisation des réfrigérants d'eau froide. Il est possible d'utiliser un appareillage de type Fibertec pouvant
bouillir 50 ml d'eau en 10 min.
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6.4 Creusets de Gooch munis d'un disque en verre fritté, creusets de porosité grossière (de 40 µm à
60 µm), forme haute, de 40 ml à 50 ml de capacité ou de type P2 (porosité de 40 µm à 100 µm) de 26 ml à
28 ml de capacité.
Nettoyer les nouveaux creusets et incinérer à 500 °C pendant 1 h. Pour nettoyer les creusets après chaque
utilisation, incinérer à 500 °C pendant 3 h, retirer les cendres, plonger dans une solution détergente, puis
traiter aux ultrasons pendant 7 min à 10 min. Rincer les creusets dans l'eau chaude et immerger dans de l'eau
à température ambiante pendant au moins 30 min. Fermer chaque creuset avec un bouchon en caoutchouc
muni d'un port raccordé à un piège et à une pompe à vide. Rétrobalayer chaque creuset avec de l'eau en
plongeant et en retirant de manière répétée la partie inférieure du creuset dans l'eau. Cette technique permet
d'intensifier le rinçage.
Occasionnellement, vérifier le taux de filtration de la manière suivante. Remplir chaque creuset avec 50 ml
d'eau distillée (25 ml pour les creusets Fibertec de type P2) et relever le temps nécessaire pour évacuer l'eau
entièrement, sans système de vide (normalement 180 s ± 60 s pour les creusets de Gooch et 75 s ± 30 s pour
ceux de type P2). Si le temps d'évacuation est < 100 s (ou < 35 s pour les creusets de type P2), mettre le
creuset au rebut. S'il est < 120 s (ou < 45 s pour les creusets de type P2), vérifier la présence éventuelle de
fissures dans le verre fritté. Si le temps de filtration est > 240 s (ou > 105 s pour les creusets de type P2),
nettoyer le creuset avec un solution de nettoyage acide ou alcaline. Si le nettoyage n'améliore pas le taux de
filtration, mettre le creuset au rebut.
Les creusets de type P2 peuvent également être remplacés par des creusets métalliques en acier inoxydable,
munis d'un tamis métallique en acier inoxydable de 90 µm de taille d'ouverture de maille.
6.5 Collecteur filtrant à vide (de type Fibertec, par exemple), permettant le trempage approprié des
résidus fibreux.
Il convient d'utiliser un collecteur étanche au vide pour fermer le creuset afin de réduire la formation de
mousse dans les lignes sous vide. Utiliser un tuyau à vide à parois épaisses pour raccorder le collecteur à un
piège (entre 4 l et 18 l) et à une pompe à vide. Il est recommandé d'utiliser un réservoir de vide (18 l) entre le
piège et la pompe à vide, afin de s'assurer que la capacité de mise sous vide est suffisante pour éliminer la
mousse.
6.6 Alimentation en eau bouillante
Utiliser un générateur d'eau bouillante en continu, tel que décrit sans la Référence [1], ou tout autre appareil
adapté. L'appareil doit être capable de fournir de l'eau bouillante (> 95 °C) en quantité suffisante pour que
tous les échantillons puissent être nettoyés en même temps, grâce à une buse produisant une vapeur fine
(débit de 35 ml à 40 ml par 10 s; une pointe de pipette en plastique jetable de 2,5 ml est une buse acceptable).
Une buse fine permet de réduire la quantité d'eau nécessaire pour transférer les particules dans le creuset,
tout en exerçant une pression hydraulique suffisante pour l'élimination des résidus accrochés aux parois du
flacon. Il est primordial que l'eau soit portée à ébullition au moment de la verser dans les creusets, notamment
pour les échantillons qui contiennent des amidons, des substances pectiques, des mucilages ou encore des
glycoprotéines. Pour les appareils de type Fibertec, utiliser une seringue munie d'une buse de pulvérisation à
jet conique pour rincer les réfrigérants, ainsi qu'une seringue jetable de 60 ml munie d'une aiguille de
calibre 12 et d'une longueur de 10 cm pour détacher les résidus adhérant aux réfrigérants.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 6497.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié
lors du transport et de l'entreposage.
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ISO 16472:2006(F)
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer les échantillons conformément à l'ISO 6498.
Pour conserver les échantillons et les broyer sans difficulté, il convient de les sécher à l'air (environ 90 % de
matière sèche).
Sécher les échantillons humides à < 60 °C pour prévenir la création d'artéfact de fibre. La taille des particules
de l'échantillon a une influence sur la quantité de matériaux résiduels après extraction. Broyer les échantillons
représentatifs jusqu'à l'obtention de particules géométriques dont la taille moyenne est comprise entre 220 µm
et 260 µm (voir 6.2).
Le broyage permet de subdiviser l'échantillon, la fraction la plus riche en fibres constituant la dernière fraction
passant au tamis. Ne pas mettre au rebut les matériaux dans le broyeur, mais les ajouter aux matériaux déjà
présents dans le réceptacle du broyeur. Mélanger l'échantillon broyé en le plaçant sur une feuille de papier
carrée (environ 40 cm × 40 cm) avec des pliures le long des deux diagonales. Relever les coins opposés de la
feuille pour faire glisser l'échantillon vers la pliure centrale. Aplatir la feuille de nouveau, la tourner de 90° et
relever les deux autres coins. Répéter l'opération 11 fois. Transférer l'échantillon dans un récipient adapté.
NOTE Les échantillons humides peuvent également être analysés pour déterminer leur contenu en aNDF.
Cependant, cette méthode n'est pas courante, car il est difficile de broyer les échantillons à une taille de particule
équivalente à celle donnée plus haut.
9 Mode opératoire
9.1 Mode opératoire relatif à la méthode courante décrite dans la Référence [1]
9.1.1 Prise d'essai
Sécher les creusets vides à 105 °C ± 1 °C pendant 4 h et les peser. Enregistrer à 0,000 1 g près la masse des
creusets vides pour les échantillons (m ) ou les blancs (m ).
c b
Mélanger le matériau avec soin et peser 1 g ± 0,001 g d'aliments séchés à l'air, ou bien une quantité
équivalente d'échantillon pour essai humide (m ) dans un creuset ou un bécher à reflux, en fonction du
s
dégraissage préalable.
Les échantillons hétérogènes nécessitant un broyage doivent être séchés (voir Article 8). Seuls les
échantillons humides dont l'homogénéisation est facile peuvent être pesés directement.
Si les résultats sont consignés sur la base de la matière sèche, peser un deuxième échantillon en même
temps afin de déterminer la teneur en matière sèche.
Inclure, dans les 20 à 30 premiers échantillons consécutifs, un échantillon de référence interne ainsi que deux
blancs, puis ajouter chaque fois un échantillon de référence et un blanc pour les 20 à 30 échantillons suivants.
9.1.2 Dégraissage préalable
Il convient de préextraire les échantillons dont la teneur en matières grasses est > 5 % ainsi que ceux dont la
teneur est > 10 % afin d'éliminer les matières grasses.
Pour préextraire avec de l'acétone, placer la prise d'essai dans un creuset et peser. Ensuite, placer la prise
d'essai dans le collecteur filtrant, extraire quatre fois avec 40 ml à 50 ml d'acétone (laisser tremper le matériau
pendant au moins 5 min et agiter trois fois lors de chaque trempage). Retirer les traces d'acétone à l'aide de
la pompe à vide, sécher à l'air pendant 10 min à 15 min pour s'assurer que toutes les traces d'acétone ont été
enlevées et enfin transférer dans le bécher à reflux. Après extraction du ND, utiliser le même creuset afin de
récupérer les fibres résiduelles pour l'échantillon pour essai.
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ISO 16472:2006(F)
En cas d'utilisation d'un agent filtrant, ce dernier doit être séché et pesé avec le creuset, puis transféré dans
un autre récipient avant de peser l'échantillon pour essai dans le creuset et de l'extraire avec de l'acétone.
Après l'extraction du ND, remettre l'agent filtrant dans le creuset avant la filtration des fibres résiduelles.
9.1.3 Minéralisation
Ajouter 0,5 g ± 0,1 g de sulfite de sodium (5.1) à l'aide d'une écope étalonnée ainsi que 50 ml ± 5 ml de
solution de ND (5.5) dans chaque bécher à reflux, puis agiter (cela est primordial pour les aliments riches en
amidons qui collent au fond du bécher lors du reflux). Ne pas ajouter de ND ni de sulfite de sodium dans les
échantillons dans les 60 min précédant le reflux.
Porter à ébullition pendant 4 min à 5 min, puis ajouter 2 ml de solution d'amylase normalisée (5.4), remettre
en suspension les particules accrochées dans le fond ou sur les parois et enfin agiter.
Procéder au reflux pendant 60 min à température d'ébullition afin de provoquer un mouvement intensif des
particules, mais sans moussage excessif pour éviter que les particules débordent du bécher. Les échantillons
peuvent mousser pendant 1 min à 2 min (ne pas baisser la température du dispositif de chauffage). Après
avoir ajouté l'amylase, rincer pendant 5 min à 10 min les parois du bécher avec une petite quantité de solution
de ND, à l'aide d'un flacon muni d'une buse fine, puis rincer pendant le temps nécessaire pour remettre en
suspension les particules sur les parois du bécher (deux fois tout au plus).
9.1.4 Filtration
Retirer l'échantillon extrait du dispositif de chauffage et laisser les particules se déposer pendant 30 s à 60 s.
Avant le transfert, observer le mélange afin de déterminer la présence de globules de lipides à la surface ou
de vérifier si la solution a un aspect laiteux. Ces caractéristiques signifient que le matériau a une teneur
élevée en matières grasses et qu'il convient de procéder à une nouvelle analyse après préextraction par
l'acétone (9.1.2).
Placer un agitateur en Téflon dans le creuset, puis préchauffer en ajoutant 40 ml d'eau bouillante pendant
30 s à 60 s. Remplacer l'eau par du vide puis, dans le bécher, décanter immédiatement la couche supérieure
de la solution, entre 30 ml et 40 ml, en maintenant le bécher incliné au-dessus du creuset. Utiliser seulement
la quantité de vide nécessaire pour évacuer l'excès de liquide et arrêter la mise sous vide avant que les
résidus s'assèchent.
NOTE L'apport excessif de vide et l'assèchement pendant l'évacuation entraînent l'obstruction du creuset par
certains échantillons, ce qui rend le nettoyage difficile.
Rincer toutes les particules détachées du creuset sous un filet d'eau bouillante. Remplir la moitié du creuset
avec de l'eau chaude. Ajouter 2 ml de solution d'amylase de travail (5.4) puis agiter.
Laisser réagir avec l'amylase pendant au moins 45 s à 60 s tout en grattant les particules accrochées dans le
fond et sur les parois du bécher à reflux, à l'aide d'un bout en caoutchouc. Évacuer la solution d'amylase et
transférer tout résidu encore présent dans le bécher à reflux vers un creuset contenant entre 20 ml et 30 ml
d'eau bouillante. En général, deux rinçages suffisent. Après le transfert des résidus du bécher, remplir les
trois quarts du creuset avec de l'eau bouillante, puis laisser tremper pendant 3 min.
Évacuer l'eau, ajouter 40 ml à 50 ml d'eau bouillante, laisser tremper 3 min à 5 min puis recommencer. Si les
résidus sont difficiles à filtrer après le premier trempage, ajouter encore 2 ml de solution d'amylase de travail.
Si les résidus ont un aspect translucide et deviennent plus difficiles à filtrer après chaque trempage
supplémentaire, éliminer le troisième trempage. S'il est raccordé, le creuset peut être rétrobalayé. Pour ce
faire, il suffit de le retirer du collecteur filtrant puis de le réinsérer.
Évacuer l'eau, remplir de nouveau le creuset avec 40 ml à 50 ml d'acétone, agiter pour disperser les
particules, laisser tremper 3 min à 5 min puis recommencer. Rincer l'agitateur pour retirer les particules
fibreuses accrochées. Avant d'ajouter l'acétone, ne pas évacuer entièrement l'eau des fibres résiduelles avec
du vide. Un séchage excessif entraîne l'agglutination des résidus ainsi qu'une dispersion difficile des
particules dans l'acétone, gênant ainsi l'extraction à l'acétone.
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Appliquer le vide pour sécher l'échantillon, retirer le creuset du collecteur et sécher à l'air pendant 10 min à
60 min pour éliminer l'acétone.
9.1.5 Séchage
Sécher les creusets à 105 °C ± 1 °C pendant au moins 8 h, laisser refroidir dans un dessiccateur, puis peser à
0,000 1 g près (m et m ).
ce be
9.1.6 Incinération
Enflammer le creuset ainsi que les résidus dans un fourneau à 500 °C ± 20 °C, pendant 5 h ou bien jusqu'à
l'élimination du carbone. Laisser refroidir dans le dessiccateur, puis peser à 0,000 1 g près (m et m ).
ca ba
9.2 Détermination avec un appareillage de type Fibertec
9.2.1 Prise d'essai
Ajouter l'agent filtrant dans le creuset de type P2, sécher à 105 °C ± 1 °C pendant 2 h à 4 h, puis peser à
0,000 1 g près (m ou m ). Mélanger le matériau avec soin et peser 0,5 g ± 0,050 0 g d'aliments séchés à l'air,
c b
ou bien une quantité équivalente d'échantillon pour essai humide (m ) dans un creuset.
s
Si les résultats sont consignés sur la base de la matière sèche, peser un deuxième échantillon en même
temps afin de déterminer la matière sèche.
Inclure, dans les 20 à 30 premiers échantillons consécutifs, un échantillon de référence interne ainsi que deux
blancs, puis ajouter chaque fois un échantillon de référence et un blanc pour les 20 à 30 échantillons suivants.
9.2.2 Dégraissage préalable
En général, il convient de préextraire les échantillons dont la teneur en matières grasses est inconnue ainsi
que ceux dont la teneur est > 10 % afin d'éliminer les matières grasses.
Placer le creuset sur l'appareil pour extraction à froid et extraire quatre fois en ajoutant de 40 ml à 50 ml
d'acétone (laisser tremper le matériau au moins 5 min et agiter trois fois lors de chaque trempage). Appliquer
le vide pour éliminer toute trace d'acétone, sécher à l'air pendant 10 min à 15 min et, enfin, vérifier que toute
trace d'acétone a bien été éliminée.
9.2.3 Minéralisation
Démarrer l'appareillage de type Fibertec en suivant la notice d'utilisation.
Ajouter 0,5 g ± 0,1 g de sulfite de sodium et 50 ml ± 5 ml de solution de ND (5.5) dans chaque creuset, puis
mélanger en exerçant une contre-pression (primordial pour les aliments riches en amidons qui restent au fond
du creuset lors du reflux). Ne pas ajouter de ND ni de sulfite de sodium dans les échantillons dans les 60 min
précédant le reflux. Ajouter 2 ml de solution d'amylase normalisée (5.4), puis porter à ébullition pendant
10 min. Exercer une contre-pression pour mélanger l'amylase avec la solution de ND et l'échantillon.
Faire bouillir pendant 60 min. Les échantillons peuvent mousser pendant 1 min à 2 min (ne pas baisser la
température du dispositif de chauffage). Après avoir ajouté l'amylase, rincer pendant 5 min à 10 min les parois
du bécher avec une petite quantité de ND à l'aide d'un flacon muni d'une buse fine, puis rincer pendant le
temps nécessaire pour remettre en suspension les particules sur les parois du bécher (deux fois tout au plus).
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9.2.4 Filtration
Avant la filtration initiale, observer le mélange afin de déterminer la présence de globules lipides à la surface
ou bien de vérifier si la solution a un aspect laiteux. Ces caractéristiques indiquent que le matériau est riche
en matières grasses et qu'il convient de l'analyser de nouveau après préextraction à l'acétone (9.2.2).
Évacuer la solution sans laisser les résidus s'assécher. Utiliser seulement la quantité de vide nécessaire pour
évacuer l'excès de liquide, mais arrêter la mise sous vide avant que les résidus s'assèchent.
NOTE 1 L'apport excessif de vide et l'assèchement pendant l'évacuation entraînent l'obstruction du creuset par
certains échantillons, ce qui rend le nettoyage difficile.
Ajouter 30 ml d'eau chaude (80 °C) et 2 ml de solution d'amylase normalisée (5.4). Exercer une contre-pression
afin de mélanger l'amylase dans l'eau utilisée précédemment pour le trempage. Arrêter l'immersion dans l'eau
et l'amylase après au moins 60 s de réaction.
NOTE 2 Les creusets peuvent être transférés de l'appareil à filtration à chaud vers celui à froid pour permettre
l'utilisation de l'eau chaude restante pour le trempage des échantillons faciles à filtrer. Ainsi, il est possible de commencer
à extraire le ND de la prochaine série d'échantillons sur l'appareil à filtration à chaud. Les échantillons difficiles
...
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