Horizontal methods for molecular biomarker analysis -- Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products

ISO/TS 21569-4:2016 specifies a procedure for the detection of a DNA sequence of the promoter region of the nopaline synthase gene (P-nos) from Agrobacterium tumefaciens and a procedure for the detection of the DNA transition sequence between P-nos and the neomycin-phosphotransferase gene (nptII) from the Tn5 transposon of Escherichia coli K12. The nos-promoter and the P-nos-nptII-construct are frequently found in genetically modified plants. The P-nos and P-nos-nptII specific methods are based on real-time PCR and can be used for qualitative screening purposes. For identification and quantification of a specific genetically modified plant (event) a follow-up analysis has to be carried out. The methods described are applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. They may also be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of these methods requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from the relevant matrix. The DNA sequence amplified by the P-nos element-specific method can be detected in samples which contain DNA of the naturally occurring Ti-plasmid of A. tumefaciens. For this reason, it is necessary to confirm a positive screening result. Further analyses are required using construct-specific or event specific methods.

Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés

L'ISO/TS 21569-4:2016 spécifie un mode opératoire permettant la détection d'une séquence d'ADN de la région du promoteur du gčne codant la nopaline synthase (P-nos) d'Agrobacterium tumefaciens et un mode opératoire permettant la détection de la séquence d'ADN de transition entre le P-nos et le gčne de la néomycine phosphotransférase (nptII) du transposon Tn5 d'Escherichia coli K12. Le promoteur nos et le construit P-nos-nptII sont fréquemment observés dans les plantes génétiquement modifiées. Les méthodes spécifiques de P-nos et P-nos-nptII sont basées sur une méthode par PCR en temps réel et peuvent ętre utilisées ŕ des fins de criblage qualitatif. Pour l'identification et la quantification d'une plante génétiquement modifiée (événement) spécifique, une analyse complémentaire doit ętre effectuée. Les méthodes décrites sont applicables ŕ l'analyse de l'ADN extrait de produits alimentaires. Elles peuvent ętre également utilisées pour analyser l'ADN extrait d'autres produits tels que des aliments pour animaux et des semences. L'application de ces méthodes exige qu'une quantité adéquate d'ADN amplifiable soit extraite de la matrice étudiée. La séquence d'ADN amplifiée par la méthode spécifique ŕ l'élément P-nos peut ętre détectée dans des échantillons contenant l'ADN du plasmide Ti d'A. tumefaciens présent dans la nature. Pour cette raison, il est nécessaire de confirmer un résultat positif de criblage. D'autres analyses sont nécessaires au moyen de méthodes spécifiques aux construits ou spécifiques aux événements.

General Information

Status
Published
Publication Date
01-Nov-2016
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
06-Oct-2016
Completion Date
02-Nov-2016
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ISO/TS 21569-4:2016 - Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs -- Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-4
First edition
2016-11-01
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 4:
Real-time PCR based screening
methods for the detection of the P-nos
and P-nos-nptII DNA sequences
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 4: Méthodes de dépistage PCR en temps réel pour la détection
des séquences ADN P-nos et P-nos-nptII
Reference number
ISO/TS 21569-4:2016(E)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2016, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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ii © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 PCR reagents ............................................................................................................................................................................................. 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Preparation of test sample ............................................................................................................................................................ 3

7.2 Preparation of DNA extracts ........................................................................................................................................................ 3

7.3 PCR setup ..................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Temperature-time programme ................................................................................................................................................. 4

8 Accept/reject criteria ...................................................................................................................................................................................... 4

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 4

9 Validation status and performance criteria ............................................................................................................................. 5

9.1 General .......................................................................................................................................................................................................... 5

9.2 Robustness of the method ............................................................................................................................................................. 5

9.3 Collaborative trial ................................................................................................................................................................................. 5

9.4 Sensitivity .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Specificity .................................................................................................................................................................................................... 7

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................10

© ISO 2016 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,

as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the

Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,

Horizontal methods for molecular biomarker analysis.

A list of all the parts in the ISO/TS 21569 series can be found on the ISO website.

iv © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-4:2016(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 4:
Real-time PCR based screening methods for the detection
of the P-nos and P-nos-nptII DNA sequences
1 Scope

This document specifies a procedure for the detection of a DNA sequence of the promoter region of the

nopaline synthase gene (P-nos) from Agrobacterium tumefaciens and a procedure for the detection of the

DNA transition sequence between P-nos and the neomycin-phosphotransferase gene (nptII) from the

Tn5 transposon of Escherichia coli K12. The nos-promoter and the P-nos-nptII-construct are frequently

found in genetically modified plants. The P-nos and P-nos-nptII specific methods are based on real-

time PCR and can be used for qualitative screening purposes. For identification and quantification of a

specific genetically modified plant (event) a follow-up analysis has to be carried out.

The methods described are applicable for the analysis of DNA extracted from foodstuffs. They may also

be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The

application of these methods requires the extraction of an adequate amount of amplifiable DNA from

the relevant matrix.

The DNA sequence amplified by the P-nos element-specific method can be detected in samples which

contain DNA of the naturally occurring Ti-plasmid of A. tumefaciens. For this reason, it is necessary to

confirm a positive screening result. Further analyses are required using construct-specific or event

specific methods.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Qualitative nucleic acid based methods

ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Quantitative nucleic acid based methods

ISO 21571:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — Nucleic acid extraction

ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.

© ISO 2016 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(E)

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at http://www.iso.org/obp
4 Principle

DNA is extracted from the test sample applying a suitable method (see ISO 21571). The DNA analysis

consists of two parts:

a) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target taxon

specific real-time PCR (according to ISO 21570), see also Reference [1];

b) detection of the P-nos and/or P-nos-nptII sequence in a real-time PCR, see References [2], [3] and [4].

5 Reagents and materials
5.1 General

For the purpose of this document, only chemicals and water of recognized analytical grade, appropriate

for molecular biology shall be used. Unless stated otherwise, solutions should be prepared by dissolving

the corresponding reagents in water and be autoclaved. For all operations in which gloves are used, it

should be ensured that these are powder-free. The use of aerosol-protected pipette tips as protection

against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase (for hot-start PCR).
5.2.2 PCR buffer solution (containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside
triphosphates, dNTPs).

Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and

polymerases which lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Tables 1 and 2).
Table 1 — Oligonucleotides for detection of P-nos element
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[4]
P-nos as target sequence :
Primer p-nos-F1 5’-AAg CAC ATA CgT CAg AAA CCA TTA TT-3’ 400 nmol/l
Primer p-nos-R 5’-TCA gTg gAg CAT TTT TgA CAA gAA-3’ 400 nmol/l
Probe p-nos-Tm 5’-(FAM)-CgC gTT CAA AAg TCg CCT AAg gTC AC-(BBQ)-3’ 100 nmol/l

FAM: 6-Carboxyfluorescein, BBQ: BlackBerry® Quencher. This information is given for convenience of users of

this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products from other

manufacturers may be used if they can be shown to give equivalent or better results.

2 © ISO 2016 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(E)
Table 2 — Oligonucleotides for detection of P-nos-nptII construct
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in the PCR
[4]
P-nos-nptII as target sequence :
Primer p-nos-F2 5’-TTC CCC TCg gTA TCC AAT TAg Ag-3’ 400 nmol/l
Primer NPTII-R 5’-gAT TgT CTg TTg TgC CCA gTC A-3’ 400 nmol/l
Probe NPTII-Tm2 5’-(FAM)-AgC CgA ATA gCC TCT CCA CCC AAg C-(BBQ)-3’ 100 nmol/l

FAM: 6-Carboxyfluorescein, BBQ: BlackBerry® Quencher. This information is given for convenience of users of

this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products from other

manufacturers may be used if they can be shown to give equivalent or better results.

6 Apparatus

Requirements concerning apparatus and materials shall be according to ISO 21569. In addition to the

usual laboratory equipment, the following equipment is required.

6.1 Real-time PCR device, suitable for the excitation of fluorescent molecules and the detection of

fluorescence signals generated during PCR.
7 Procedure
7.1 Preparation of test sample

It should be ensured that the test sample used for DNA extraction is representative of the laboratory

sample, e.g. by grinding or homogenizing of the samples. Measures and operational steps to be taken

into consideration are described in ISO 21571 and ISO 24276.
7.2 Preparation of DNA extracts

Concerning the preparation of DNA from the test sample, the general instructions and measures

described in ISO 21571 shall be followed. It is recommended to choose one of the DNA extraction

methods d
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-4
Première édition
2016-11-01
Méthodes horizontales d’analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 4:
Méthodes de criblage par PCR en
temps réel pour la détection des
séquences ADN P-nos et P-nos-nptII
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 4: Real-time PCR based screening methods for the detection of
the P-nos and P-nos-nptII DNA sequences
Numéro de référence
ISO/TS 21569-4:2016(F)
ISO 2016
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Réactifs PCR ............................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Préparation de l’échantillon pour essai ............................................................................................................................. 3

7.2 Préparation des extraits d’ADN ................................................................................................................................................. 3

7.3 Réaction PCR ............................................................................................................................................................................................. 3

7.4 Programme d’amplification ......................................................................................................................................................... 4

8 Critères d’acceptation/rejet ..................................................................................................................................................................... 4

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

8.2 Identification ............................................................................................................................................................................................ 5

9 État de validation et critères de performance ....................................................................................................................... 5

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

9.2 Robustesse de la méthode ............................................................................................................................................................. 5

9.3 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 5

9.4 Sensibilité .................................................................................................................................................................................................... 7

9.5 Spécificité ..................................................................................................................................................................................................... 8

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................10

© ISO 2016 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation

de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation

mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien

suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.

Une liste de toutes les parties de l’ISO/TS 21569 est disponible sur le site de l’ISO.

iv © ISO 2016 – Tous droits réservés
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-4:2016(F)
Méthodes horizontales d’analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d’analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 4:
Méthodes de criblage par PCR en temps réel pour la
détection des séquences ADN P-nos et P-nos-nptII
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie un mode opératoire permettant la détection d’une séquence d’ADN de la

région du promoteur du gène codant la nopaline synthase (P-nos) d’Agrobacterium tumefaciens et un

mode opératoire permettant la détection de la séquence d’ADN de transition entre le P-nos et le gène

de la néomycine phosphotransférase (nptII) du transposon Tn5 d’Escherichia coli K12. Le promoteur

nos et le construit P-nos-nptII sont fréquemment observés dans les plantes génétiquement modifiées.

Les méthodes spécifiques de P-nos et P-nos-nptII sont basées sur une méthode par PCR en temps réel

et peuvent être utilisées à des fins de criblage qualitatif. Pour l’identification et la quantification d’une

plante génétiquement modifiée (événement) spécifique, une analyse complémentaire doit être effectuée.

Les méthodes décrites sont applicables à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Elles

peuvent être également utilisées pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments

pour animaux et des semences. L’application de ces méthodes exige qu’une quantité adéquate d’ADN

amplifiable soit extraite de la matrice étudiée.

La séquence d’ADN amplifiée par la méthode spécifique à l’élément P-nos peut être détectée dans des

échantillons contenant l’ADN du plasmide Ti d’A. tumefaciens présent dans la nature. Pour cette raison,

il est nécessaire de confirmer un résultat positif de criblage. D’autres analyses sont nécessaires au

moyen de méthodes spécifiques aux construits ou spécifiques aux événements.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21570, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques

ISO 21571:2005, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes

génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques

ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement

modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(F)
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp
4 Principe

L’ADN est extrait de l’échantillon pour essai en appliquant une méthode appropriée (voir l’ISO 21571).

L’analyse de l’ADN comprend deux parties:

a) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple au moyen d’une

PCR en temps réel spécifique pour le taxon cible (conformément à l’ISO 21570), voir également la

Référence [1];

b) détection des séquences P-nos et/ou P-nos-nptII par une PCR en temps réel, voir les

Références [2],[3] et [4].
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités

Pour les besoins du présent document, seules des substances chimiques et de l’eau de qualité analytique

reconnue, appropriées pour la biologie moléculaire, doivent être utilisées. Sauf indication contraire,

il convient de préparer les solutions par dissolution des réactifs correspondants dans l’eau et par

traitement à l’autoclave. Pour toutes les opérations nécessitant le port de gants, il convient de s’assurer

que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination croisée, il est recommandé d’utiliser

des embouts de pipette protégés contre les aérosols.
5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable (pour PCR «à démarrage à chaud»).

5.2.2 Solution tampon pour PCR (contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides

triphosphates, dNTP).

Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts

à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent

être également utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableaux 1 et 2).
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 21569-4:2016(F)
Tableau 1 — Oligonucléotides pour la détection de l’élément P-nos
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[4]
P-nos comme séquence cible :
Amorce p-nos-F1 5’-AAg CAC ATA CgT CAg AAA CCA TTA TT-3’ 400 nmol/l
Amorce p-nos-R 5’-TCA gTg gAg CAT TTT TgA CAA gAA-3’ 400 nmol/l
Sonde p-nos-Tm 5’-(FAM)-CgC gTT CAA AAg TCg CCT AAg gTC AC-(BBQ)-3’ 100 nmol/l

FAM: carboxy-6-fluorescéine, BBQ: Extincteur BlackBerry®. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs

du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.

Des produits équivalents commercialisés par d’autres fabricants peuvent être utilisés s’il peut être démontré qu’ils donnent

des résultats similaires ou meilleurs.
Tableau 2 — Oligonucléotides pour la détection du construit P-nos-nptII
Concentration finale
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
dans la PCR
[4]
P-nos-nptII comme séquence cible :
Amorce p-nos-F2 5’-TTC CCC TCg gTA TCC AAT TAg Ag-3’ 400 nmol/l
Amorce NPTII-R 5’-gAT TgT CTg TTg TgC CCA gTC A-3’ 400 nmol/l
Sonde NPTII-Tm2 5’-(FAM)-AgC CgA ATA gCC TCT CCA CCC AAg C-(BBQ)-3’ 100 nmol/l

FAM: carboxy-6-fluorescéine, BBQ: Extincteur BlackBerry®. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs

du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.

Des produits équivalents commercialisés par d’autres fabricants peuvent être utilisés s’il peut être démontré qu’ils donnent

des résultats similaires ou meilleurs.
6 Appareillage

Les exigences concernant l’appareillage et les matériaux doivent être conformes à l’ISO 21569. Outre le

matériel courant de laboratoire, l’équipement suivant est requis.

6.1 Appareil de PCR en temps réel, approprié pour l’excitation des molécules fluorescentes et pour

la détection des signaux de fluorescence générés pendant la PCR.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon pour essai

Il convient de s’assurer que l’échantillon pour essai utilisé pour l’extraction de l’ADN soit représentatif

de l’échantillon pour laboratoire, par exemple en broyant ou homogénéisant les échantillons. Les

mesures et étapes opératoires à prendre en considération sont décrites dans l’ISO 21571 et l’ISO 24276.

7.2 Préparation des extraits d’ADN

Concernant la préparation d’ADN de l’échantillon pour essai, il convient de suivre les instructions

générales et les mesures spécifiées dans l’ISO 21571. Il est recommandé de choisir l’une des méthodes

d’extraction d’ADN décrites dans l’ISO 21571:2005, Annexe A.
7.3 Réaction PCR

La méthode est décrite pour un volume total de 25 µl par réaction PCR. Le mélange réactionnel est

indiqué dans le Tableau 3.

Les réactifs sont totalement décongelés à température ambiante. Il convient de s’assurer que chaque

réactif est soigneusement mélangé et brièvement centrifu
...

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