ISO 21427-2:2006
(Main)Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei — Part 2: Mixed population method using the cell line V79
Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei — Part 2: Mixed population method using the cell line V79
ISO 21427-2:2006 specifies a method for the determination of genotoxicity of water and waste water using a mammalian in vitro test which detects damage, induced by water-soluble substances, to the chromosomes or the mitotic apparatus of V79 cells from the Chinese hamster. The micronucleus test allows the identification of substances that cause cytogenetic damage which results in the formation of micronuclei containing lagging chromosome fragments and/or whole chromosomes. The assay is based on the increase in the frequency of micronucleated cells after incubation with and without metabolic activation.
Qualité de l'eau — Évaluation de la génotoxicité par le mesurage de l'induction de micronoyaux — Partie 2: Méthode de la population mélangée à l'aide de la lignée de cellules V79
L'ISO 21427‑2:2006 spécifie une méthode permettant de déterminer la génotoxicité de l'eau et des eaux usées par un essai réalisé in vitro sur des mammifères pour détecter les dommages induits par les substances hydrosolubles sur les chromosomes ou l'appareil mitotique des cellules V79 du hamster chinois. L'essai du micronoyau permet d'identifier les substances provoquant des dommages cytogénétiques à l'origine de la formation de micronoyaux contenant des fragments de chromosome retardataires et/ou des chromosomes entiers retardataires. L'analyse est basée sur l'augmentation de la fréquence des cellules micronucléées après une incubation avec et sans activation métabolique.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21427-2
First edition
2006-11-15
Water quality — Evaluation of
genotoxicity by measurement of the
induction of micronuclei —
Part 2:
Mixed population method using the cell
line V79
Qualité de l'eau — Évaluation de la génotoxicité par le mesurage de
l'induction de micronoyaux —
Partie 2: Méthode de la population mélangée à l'aide de la lignée de
cellules V79
Reference number
ISO 21427-2:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO 21427-2:2006(E)
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ISO 21427-2:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 3
5 Interferences . 3
6 Reagents and media. 3
7 Apparatus . 7
8 Test facility criteria . 7
9 Procedure . 8
10 Evaluation and assessment. 12
11 Precision. 14
12 Test report . 14
Annex A (informative) Bromodeoxyuridine (BrdU) method. 15
Annex B (informative) Evaluation schemes. 17
Annex C (normative) S9 fraction . 18
Annex D (informative) Precision data. 19
Bibliography . 20
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ISO 21427-2:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21427-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
ISO 21427 consists of the following parts, under the general title Water quality — Evaluation of genotoxicity by
measurement of the induction of micronuclei:
⎯ Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae
⎯ Part 2: Mixed population method using the cell line V79
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21427-2:2006(E)
Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement
of the induction of micronuclei —
Part 2:
Mixed population method using the cell line V79
WARNING — Persons using this part of ISO 21427 should be familiar with normal laboratory practice.
This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It
is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure
compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this part of ISO 21427 be
carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This part of ISO 21427 specifies a method for the determination of genotoxicity of water and waste water
using a mammalian in vitro test which detects damage, induced by water-soluble substances, to the
chromosomes or the mitotic apparatus of V79 cells from the Chinese hamster.
The micronucleus test allows the identification of substances that cause cytogenetic damage which results in
the formation of micronuclei containing lagging chromosome fragments and/or whole chromosomes.
The assay is based on the increase in the frequency of micronucleated cells after incubation with and without
metabolic activation.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply:
3.1
cell lines
distinct families of cells grown in culture originated from a single clone
3.2
cofactor solution
aqueous solution of chemicals (e.g. NADP, Glucose-6-phosphate and inorganic salts) needed for the activity
of the enzymes in the S9 fraction
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ISO 21427-2:2006(E)
3.3
dilution level D
denominator of the dilution coefficient (using the numerator 1) of a mixture of water or waste water with
dilution water as integral number
NOTE For undiluted water or waste water, this coefficient is per definition 1:1. The corresponding smallest possible D
value is 1.
3.4
D value
smallest value of D at which, under the conditions of this part of ISO 21427, no increase in the number of
micronuclei per culture is detected
NOTE In the case of more than one D value (at maximum two are possible, see 9.2), the highest D value is decisive.
3.5
karyotype
characteristic of the nucleus of a cell, including its size, form and chromosome number
3.6
micronuclei
small particles consisting of acentric fragments of chromosomes and/or entire chromosomes which lag behind
at anaphase stage of cell division and form, after telophase, single or multiple micronuclei in the cytoplasm
3.7
mitotic index
percentage of cells of a cell population under division at a particular time of observation
3.8
plating efficiency
measure of the number of colonies originated from single cells
3.9
proliferation index
rate at which cells are dividing within the culture
3.10
proliferation rate
rate with which cells replicate, calculated by a formula which takes into account 1, 2, 4 and 8 cell stages of
clones
3.11
S9 fraction
9 000 g supernatant of a tissue homogenate in 0,15 mol/l KCl, obtained from livers of male rats (200 g to
300 g) pretreated with an appropriate substance or substance combination for enzyme induction
3.12
S9 mix
mixture of the S9 fraction and the cofactor solution
3.13
stock culture
frozen culture for the preservation of the characteristics of V79 cells
3.14
survival index
percentage of surviving cells compared to all cells, used as index of toxicity
3.15
test culture
culture of cells used for the study
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4 Principle
The possible clastogenic and/or aneugenic activity of the test sample is detected by comparing, for the
respective activation condition, the number of micronucleated cells in cultures treated with the negative control
and the number in cultures treated with undiluted and diluted test samples, respectively.
During cell division, chromatid fragments without centromers will not move to the nuclei of the daughter cells
and will stay within the cytoplasm. Part of the chromosome aberrations induced by the test item will be
chromatid fragments without centromers and will, therefore, not be incorporated in the nuclei of the daughter
cells. In addition, spindle disorders may lead to chromosomes which are not incorporated into the nucleus.
These particles will form micronuclei in the plasma.
V79 cells are exposed for 24 h (4 h with the S9 mix) to a range of concentrations of a test sample. Thereafter,
slides are prepared, and cells are stained and evaluated for the presence of micronucleated cells. An
increased incidence of these micronucleated cells in comparison to the negative control indicates that the test
item may cause chromosome breaks or spindle disorders in V79 cells in vitro.
5 Interferences
Biologically relevant alterations of the culture conditions may induce chromosome aberration due to secondary
[16]
mechanisms resulting in artificial positive and, therefore, irrelevant results . Those factors are, e.g. stronger
changes in osmolality or pH, precipitation of test sample and phagocytosis thereof, and strong cytotoxic
effects of the test sample. Therefore, test samples should be monitored at least for changes in pH or
osmolality of the cultures using the same proportion of test item per culture as will be used later under test
conditions. If there is a shift in pH in the culture, the test item should be adjusted to pH 7,0 ± 0,2. If there is a
change in osmolality, the highest concentration used in the test has to be reduced so that no relevant
alteration of osmolality occurs in the cultures. To avoid artifacts based on phagocytosis or severe cytotoxicity,
limitations are given for the highest concentration, which should be used for testing (see 9.1 and 9.2).
6 Reagents and media
As far as possible use “reagent grade” chemicals.
If chemicals with different amounts of water of crystallization are used, calculate the needed amounts
accordingly.
Always perform autoclaving for 20 min at 121 °C ± 2 °C. Cover vessels loosely (e.g. with aluminium foil).
Never seal air-tight.
6.1 Water.
Prepare all aqueous solutions with water of a conductivity of u 5 µS/cm.
6.2 Reagents.
6.2.1 Glucose-6-phosphate dihydrate, C H O PNa · 2 H O.
6 11 9 2 2
6.2.2 Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate disodium salt, NADP, C H N Na O P .
21 26 7 2 17 3
6.2.3 Magnesium chloride hexahydrate, MgCl · 6 H O.
2 2
6.2.4 Potassium dihydrogenphosphate, KH PO .
2 4
6.2.5 di-Sodium hydrogenphosphate dihydrate, Na HPO · 2 H O.
2 4 2
6.2.6 Ethanol (absolute), C H OH.
2 5
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6.2.7 Glacial acetic acid, CH COOH.
3
6.2.8 Formaldehyde, HCHO, 37 % volume fraction.
6.2.9 tri-Sodium citrate dihydrate, HOC(COONa)(CH COONa) ·2 H O.
2 2 2
6.2.10 di-Sodium hydrogenphosphate, Na HPO .
2 4
6.2.11 Sodium dihydrogenphosphate, NaH PO .
2 4
1)
6.2.12 May-Grünwald-solution, modified .
6.2.13 Hydrochloric acid, c(HCl) = 1 mol/l.
6.2.14 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 1 mol/l.
6.2.15 Dimethyl sulfoxide (DMSO), C H SO .
2 6 4
6.2.16 Positive controls.
6.2.16.1 Cyclophosphamide, monohydrate, C H Cl N O P·H O.
7 15 2 2 2 2
CAS Registration No: 6055-19-2.
6.2.16.2 Ethyl-methane sulfonate (EMS), CH SO CH CH .
3 3 2 3
CAS Registration No: 62-50-0.
6.2.17 Sodium citrate solution for hypotonic treatment.
Prepare a 1,5 % solution of tri-sodium citrate in water.
6.2.18 Fixation solution.
Mix 50 ml of glacial acetic acid with 150 ml of ethanol, add 2,5 ml of a 37 % formaldehyde solution.
1)
6.2.19 Buffer solution according to WEISE (pH 7,2) .
This solution is commercially available in ampoules. Dilute the contents of one ampoule in water and, using a
1 000 ml measuring flask, bring to volume with water.
1)
6.2.20 Giemsa solution .
Prepare a 2,6 % Giemsa solution in buffer according to WEISE (pH 7,2) (6.2.19). Filter prior to use.
6.2.21 Phosphate buffer.
Dissolve 2,13 g of Na HPO in 1 l water. Dissolve 1,8 g of NaH PO in 1 l water. Mix both solutions at the
2 4 2 4
ratio of 4:1 and adjust to a final pH of 7,4.
1)
6.2.22 MEM-medium (= Minimal Essential Medium) with stabilized glutamine .
1)
6.2.23 Fetal bovine serum (= FCS) .
1) This reagent is commercially available. This information is given for the convenience of users of this part of ISO 21427
and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
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1)
6.2.24 Penicillin/Streptomycin solution, 10 000 E/10 000 µg/ml .
1)
6.2.25 Amphotericin-B solution, 250 µg/ml .
1)
6.2.26 Trypsin/EDTA solution, 0,25 % .
1)
6.2.27 Hanks' Balanced Salt Solution (= HBSS) .
2+ 2+ 1)
6.2.28 Hanks' Balanced Salt Solution (= HBSS) without Ca and Mg .
6.2.29 Potassium chloride solution.
Dissolve 4 g of potassium chloride, in 1 l water.
6.3 Preparation of culture media
6.3.1 Culture medium with FCS.
This medium is used as general culture medium and for treatment of cells without the S9 mix.
Mix 500 ml of MEM-medium, 50 ml of FCS, 5 ml of Penicillin/Streptomycin solution and 5 ml of
Amphotericin-B solution.
The medium is stable for up to 4 weeks if stored in a refrigerator at 4 °C ± 2 °C.
6.3.2 Culture medium without FCS.
This medium is used only for the treatment period of cells under activation condition (S9 mix).
Mix 500 ml of MEM-medium, 5 ml of Penicillin/Streptomycin solution and 5 ml of Amphotericin-B solution.
The medium is stable for up to 4 weeks if stored in a refrigerator at 4 °C ± 2 °C.
6.4 Cell system.
6.4.1 Cell line, storage
The V79 cell line is a permanent cell line of Chinese hamster lung cells with
⎯ a high proliferation rate (cell cycle length about 12 h to 16 h);
⎯ a high plating efficiency (W 90 %);
⎯ a stable karyotype (modal number of chromosomes = 22).
Store permanent cultures (1 ml samples including 7 % DMSO) in liquid nitrogen at about −196 °C. Prior to
freezing, check each batch for mycoplasma contamination. Karyotype and plating efficiency (colony-forming
ability) should be determined at least prior to the first use of a thawed culture.
6.4.2 Cultivation
To start a culture, thaw a permanent culture in a water bath at 37 °C and add 0,5 ml of this sample to a
2
25 cm culture flask filled already with approximately 5 ml of MEM (minimal essential medium; composed of
medium, glutamine and antibiotics) including 10 % FCS (fetal calf serum). Cultivate the cells at 37 °C, using
5 % carbon dioxide and a humidity of at least 90 %. Subcultivate the cells twice a week.
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2
Withdraw the flasks (25 cm ) from the incubator and place them on a clean bench. Open the flasks singly and
remove the medium by suction. Wash the cells once with 5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBBS, without
2+ 2+
Ca and Mg ) for about 5 min. Thereafter, remove the medium again.
Trypsinize the cells for about 5 min using about 1,0 ml of trypsine (0,25 %) and approximately 1,0 ml HBBS
2+ 2+
(without Ca and Mg ) to separate the cells from the bottom of the culture flask.
Stop this reaction by adding approximately 3 ml of MEM including 10 % FCS.
Pipette this mixture several times to separate the cells from the flask and to obtain homogenous single cell
suspensions.
2)
Count the number of cells in a 10 µl sample in a hemocytometer .
Dilute the suspension to the required cell density (30 000 to 80 000 per culture) using MEM including 10 % of
FCS.
6.4.3 Duration of cell cycle
The cell cycle length of the V79 cells is normally about 12 h to 16 h. Determine its laboratory specific length
3)
using the BrdU method (see Annex A).
6.5 Metabolic activation
6.5.1 S9 fraction
For the treatment of enzyme induction and preparation of the S9 fraction, see Annex C. If the S9 fraction is
commercially purchased, it shall have been prepared (including enzyme induction) according to Annex C.
6.5.2 S9 mix
Prepare the needed amount of the S9 fraction freshly on the day of test or, if stored frozen, thaw at room
temperature. Immediately thereafter, prepare the S9 mix by mixing the following compounds under sterile
conditions:
a) 1 aliquot of S9 fraction;
b) 9 aliquots of S9 supplement (cofactor solution).
Keep the S9 mix permanently on ice (e.g. in a double-walled separator funnel containing iced water in
between these walls) and use it only on the same day. At the end of this day, discard the remaining S9 mix.
The concentrations of cofactors in the S9 mix are as follows:
MgCl 8 mmol/l
2
KCl 33 mmol/l
Glucose-6-phosphate 5 mmol/l
NADP 4 mmol/l
Phosphate buffer (pH 7,4) 15 mmol/l
2) Alternatively, an automatic cell or particle counter device may be used.
3) BrdU stands for bromodeoxyuridine.
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ISO 21427-2:2006(E)
7 Apparatus
7.1 Cryo-vials, 1 ml, 2 ml, 5 ml.
2 2
7.2 Cell culture flasks, 25 cm , 75 cm .
7.3 Culture chambers, appropriate for 4 microscope slides, approx. 9 cm × 13 cm.
7.4 Microscope slides with frosted part.
7.5 CO incubator.
2
7.6 Laminar-airflow work bench.
7.7 Water bath.
7.8 Vacuum pump.
7.9 Inverse microscope.
7.10 Light microscope.
7.11 Bunsen burner.
7.12 Centrifuge.
7.13 Freezer (−80 °C).
7.14 Analytical balance.
7.15 Glass pipettes, 1 ml, 5 ml, 10 ml.
7.16 Adjustable volume pipettes.
7.17 Neubauer counting chamber.
7.18 Photographic clips.
7.19 Dewar tank for storage of the cells in liquid nitrogen.
7.20 Tweezers.
7.21 Cuvettes including holders for staining.
7.22 Sterile filters, 0,22 µm.
8 Test facility criteria
The test facility is qualified for the execution of this part of ISO 21427 if the in vitro micronucleus test is
established in this facility according to the following criteria:
⎯ a couple of independent experiments shall already have been performed;
⎯ a couple of known mutagenic and non-mutagenic chemicals shall already have been tested.
It should be decided case by case whether and to what extent additional instructions may be necessary for the
application of this part of ISO 21427.
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ISO 21427-2:2006(E)
9 Procedure
9.1 Sampling and samples
Test samples as soon as possible after sampling, i.e. on the day of collection. Divide large samples into
appropriate portions in advance, since thawed samples may only be used on the same day as they were
thawed.
High or low pH-values of the test sample may trigger cell toxic effects lowering the possible maximum testable
concentration. Therefore, pH of the test sample should be monitored and adjusted, if necessary, to pH
7,0 ± 0,2 using either HCl or NaOH solution (6.2.13 and 6.2.14). Select the concentrations of acid or alkali
such that the added volumes are as small as possible. Avoid over-titration. The change of the sample pH and
the resulting effects shall be taken into consideration (see ISO 5667-16).
Shake test samples thoroughly before use.
Centrifuge the samples containing solids and use only the liquid supernatant for further processing.
Sterilize all the samples by filtration through sterile filters (7.22). Do not extract or concentrate the samples.
NOTE 1 If necessary, keep the samples at 0 °C to 5 °C for up to 48 h and below −18 °C for up to two months,
respectively.
NOTE 2 See ISO 5667-16.
If dilutions are necessary, perform these with sterilized water (6.1).
9.2 Experimental size
Use two cultures per experimental group. Evaluate 1 000 cells per culture for micronuclei. See Table 1.
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ISO 21427-2:2006(E)
Table 1 — Experimental size
Treatment group S9 mix Treatment time Time of harvest
h h
negative control
dilution water - 24 24
a
undiluted test item - 24 24
1:2 - 24 24
1:4 - 24 24
1:8 - 24 24
1:16 - 24 24
1:32 - 24 24
positive control EMS (6.2.16.2)
350 µg/ml - 24 24
negative control
dilution water + 4 24
a
undiluted test item + 4 24
1:2 + 4 24
1:4 + 4 24
1:8 + 4 24
1:16 + 4 24
1:32 + 4 24
positive control cyclophosphamide
(6.2.16.1)
2,5 µg/ml + 4 24
a
If osmolality is relevantly altered, the highest dilution which does not alter osmolality of the culture.
9.3 Negative controls
Treat the cultures of the negative controls with the dilution water in the same volume as other cultures are
treated with test item.
9.4 Positive controls
Dissolve the positive controls in MEM to result in a concentration of EMS of 1,75 mg/ml and in a concentration
of cyclophosphamide of 12,5 µg/ml. Apply a volume of 1 ml per culture.
Store the stock solutions of the positive controls at −80 °C. In this case, they should be thawed shortly prior to
treatment.
9.5 Time schedule
Seeding of cells
− 6 h
0 h Treatment
+ 4 h Washing of cultures (only those with S9 mix)
+ 24 h Harvest and slide preparation
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ISO 21427-2:2006(E)
9.6 Preparatory steps
2
Thaw permanent cultures in a water bath at 37 °C. Add 0,5 ml of a thawed culture to a 25 cm flask which
already contains 5 ml of MEM (including 10 % FCS). Incubate cultures at 37 °C, using an atmosphere
containing a volume fraction of 5 % CO and at least 90 % humidity, to reach a confluency (contact inhibition)
2
of 50 % to maximally 100 % (about 2 d to 4 d). To remove dead cells, replace the medium about 30 h after
culture initiation. Use the remaining cells for experiments. (They may also be used for further subculturing.)
Discard cells which have undergone more than 15 passages because they cannot be used for further
experiments.
9.7 Preparation of test cultures
9.7.1 General
2+ 2+
Wash the cells once with 5 ml HBBS (without Ca and Mg ) for about 5 min and then remove the medium
by suction.
Trypsinize the cells for about 5 min using about 1,0 ml of trypsin (0,25 %) and approximately 1,0 ml of HBBS
2+ 2+
(without Ca and Mg ) to separate the cells from the bottom of the culture flask.
Stop this reaction by adding approximately 3 ml of MEM including 10 % FCS.
Pipette this mixture several times to separate cells from the flask and to obtain homogenous, single cell
suspensions.
4)
Count the number of cells in a 10 µl sample in a hemocytometer .
Dilute the suspension to the required cell density (30 000 to 80 000 per 5 ml culture) using MEM including
10 % FCS.
9.7.2 Seeding
Add 5 ml of cell suspension to each chamber of a culture dish (7.3), of which each chamber contains a slide.
Each chamber represents one culture.
Incubate the dishes for 6 h at 37 °C, in an atmosphere containing a volume fraction of 5 % CO and at least
2
90 % humidity.
Prior to treatment, check the dishes visually for cell attachment. (See Annex B.)
9.7.3 Preparation of S9 mix
Prepare the S9 mix according to 6.5.2.
9.8 Treatment of test cultures
9.8.1 Treatment without S9 mix
Remove the medium from the culture chambers approximately 6 h after seeding. Add 4 ml of fresh medium
(with FCS). Thereafter, add the test sample, then either the positive control or the dilution water for the
negative control in a volume of 1 ml (final volume of 5 ml). Incubate the cultures for 24 h at 37 °C, in an
atmosphere containing a volume fraction of 5 % CO volume fraction and at least 90 % humidity. Higher
2
concentrations of test sample can be applied as long as the validity and cytotoxicity criteria (3.14, 9.8.5, 10.2)
are met. If higher amounts of sample are used, the concentration of the medium has to be adjusted.
4) Alternatively, an automatic cell or particle counter device may be used.
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ISO 21427-2:2006(E)
9.8.2 Treatment with S9 mix
Remove the medium from the chambers approximately 6 h after seeding. Add to each chamber 1 ml of the S9
mix and 3 ml of fresh medium (without FCS). Thereafter, add the test sample, then either the positive control
or the dilution water for the negative control in a volume of 1 ml per culture, resulting in a final volume of 5 ml.
Incubate cultures for 4 h at 37 °C, in an atmosphere containing a volume fraction of 5 % CO and at least
2
90 % humidity. Higher concentrations of test sample can be applied as long as the validity and cytotoxicity
criteria (3.14, 9.8.5, 10.2) are met. If higher amounts of sample are used, the concentration of the medium has
to be adjusted.
After 4 h, remove the medium and wash the cultures twice with 5 ml HBSS. Add 5 ml of MEM (incl. 10 % FCS)
and incubate for further 20 h at 37 °C, in an atmosphere containing a volume fraction of 5 % CO and at least
2
90 % humidity.
9.8.3 Processing of cell cultures
[13]
Prepare cells as follows :
⎯ remove the culture medium completely;
⎯ treat each culture for 3 min with 5 ml of sodium citrate-solution (6.2.17) at a temperature of 37 °C
(hypotonic treatment);
⎯ remove the sodium citrate-solution and replace it by approximately 5 ml of fixation solution (6.2.18) at a
temperature of about 4 °C for about 5 min; remove and replace the fixation solution by the same amount
of fresh fixation solution (4 °C) for about 5 min;
⎯ remove the slides from the culture chambers. Allow the fixation solution to drip off and dry the slides at
ambient temperature.
9.8.4 Staining
⎯ After the slides have dried, stain for 3 min in May-Grünwald-solution, modified (6.2.12);
⎯ rinse the slides with WEISE-buffer (6.2.19) and place the slides for approximately 20 min in a Giemsa-
solution (6.2.20);
⎯ rinse twice with WEISE-buffer and remove surplus of staining material in xylene. Thereafter, cover the
slides with coverslips and examine the slides as in 10.3.
9.8.5 Treatment for determination of the survival index
2
Seed approximately 250 000 cells into 25 cm flasks already containing 5 ml of MEM (including 10 % FCS)
per negative control or test sample concentration. Cultivate the cells for 30 h at 37 °C in an atmosphere
containing a volume fraction of 5 % CO and at least 90 % humidity (9.6). Thereafter, treat the cells with
2
dilution water or test sample conce
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21427-2
Première édition
2006-11-15
Qualité de l'eau — Évaluation de la
génotoxicité par le mesurage de
l'induction de micronoyaux —
Partie 2:
Méthode de la population mélangée à
l'aide de la lignée de cellules V79
Water quality — Evaluation of genotoxicity by measurement of the
induction of micronuclei —
Part 2: Mixed population method using the cell line V79
Numéro de référence
ISO 21427-2:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO 21427-2:2006(F)
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Version française parue en 2009
Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21427-2:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions .1
4 Principe.3
5 Interférences .3
6 Réactifs et milieux .3
7 Appareillage .7
8 Critères relatifs à l'installation d'essai .8
9 Mode opératoire.8
10 Évaluation et estimation .12
11 Fidélité .14
12 Rapport d'essai.14
Annexe A (informative) Méthode à la bromodésoxyuridine (BrdU) .16
Annexe B (informative) Schémas d'évaluation .18
Annexe C (normative) Fraction S9 .19
Annexe D (informative) Données de fidélité.20
Bibliographie.21
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
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ISO 21427-2:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21427-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
L'ISO 21427 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Évaluation
de la génotoxicité par le mesurage de l'induction de micronoyaux:
⎯ Partie 1: Évaluation de la génotoxicité à l'aide de larves d'amphibiens
⎯ Partie 2: Méthode de la population mélangée à l'aide de la lignée de cellules V79
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 21427-2:2006(F)
Qualité de l'eau — Évaluation de la génotoxicité par le
mesurage de l'induction de micronoyaux —
Partie 2:
Méthode de la population mélangée à l'aide de la lignée de
cellules V79
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente partie de l'ISO 21427 connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n'a pas pour objectif de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. L'utilisateur est tenu d'établir des
pratiques de sécurité et d'hygiène appropriées et de s'assurer de leur conformité aux réglementations
nationales existantes.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais menés conformément à la présente partie
de l'ISO 21427 soient réalisés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 21427 spécifie une méthode permettant de déterminer la génotoxicité de l'eau et
des eaux usées par un essai réalisé in vitro sur des mammifères pour détecter les dommages induits par les
substances hydrosolubles sur les chromosomes ou l'appareil mitotique des cellules V79 du hamster chinois.
L'essai du micronoyau permet d'identifier les substances provoquant des dommages cytogénétiques à
l'origine de la formation de micronoyaux contenant des fragments de chromosome retardataires et/ou des
chromosomes entiers retardataires.
L'analyse est basée sur l'augmentation de la fréquence des cellules micronucléées après une incubation avec
et sans activation métabolique.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
lignées cellulaires
familles distinctes de cellules cultivées provenant d'un seul clone
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ISO 21427-2:2006(F)
3.2
solution de cofacteurs
solution aqueuse de produits chimiques (par exemple NADP, glucose-6-phosphate et sels inorganiques)
nécessaires à l'activité des enzymes de la fraction S9
3.3
degré de dilution D
dénominateur du coefficient de dilution (en utilisant le numérateur 1) d'un mélange d'eau ou d'eaux usées et
d'eau de dilution, sous forme d'un nombre entier
NOTE Lorsque l'eau ou les eaux usées ne sont pas diluées, ce coefficient est par définition 1:1. La plus faible
valeur D correspondante possible est 1.
3.4
valeur D
plus faible valeur de D à laquelle, dans les conditions définies dans la présente partie de l'ISO 21427, aucune
augmentation du nombre de micronoyaux par culture n'est observée
NOTE En présence de plus d'une valeur D (deux sont possibles au maximum, voir 9.2), la valeur D la plus élevée est
déterminante.
3.5
caryotype
caractéristique du noyau d'une cellule, définie par la taille, la forme et le nombre de chromosomes
3.6
micronoyaux
petites particules formées de fragments acentriques de chromosomes et/ou de chromosomes entiers, qui ne
migrent pas au cours de l'anaphase de la division cellulaire et qui, après la télophase, forment un ou plusieurs
micronoyaux dans le cytoplasme
3.7
index mitotique
pourcentage de cellules en division dans une population de cellules à un moment d'observation particulier
3.8
efficacité d'ensemencement
mesure du nombre de colonies issues de cellules uniques
3.9
index de prolifération
vitesse à laquelle les cellules se divisent dans la culture
3.10
vitesse de prolifération
vitesse à laquelle les cellules se répliquent, calculée par une formule tenant compte des stades 1, 2, 4 et
8 cellules des clones
3.11
fraction S9
9 000 g de surnageant d'un homogénat tissulaire dans 0,15 mol/l de KCl, obtenu à partir de foies de rats
mâles (200 g à 300 g) prétraités par une substance ou une combinaison de substances appropriée pour
l'induction enzymatique
3.12
mélange S9
mélange de la fraction S9 et de la solution de cofacteurs
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21427-2:2006(F)
3.13
culture souche
culture congelée afin de conserver les caractéristiques des cellules V79
3.14
index de survie
pourcentage de cellules survivantes par rapport au nombre total de cellules, utilisé comme indice de toxicité
3.15
culture d'essai
culture cellulaire utilisée pour l'étude
4 Principe
L'éventuelle activité clastogène et/ou aneugène de l'échantillon pour essai est détectée en comparant, pour la
condition d'activation respective, le nombre de cellules micronucléées dans des cultures traitées par le témoin
négatif et leur nombre dans des cultures traitées respectivement par des échantillons pour essai non dilués et
dilués.
Au cours de la division cellulaire, les fragments de chromatides dépourvus de centromère ne se déplaceront
pas vers les noyaux des cellules filles et resteront dans le cytoplasme. Certaines aberrations
chromosomiques induites par l'élément d'essai consistent en des fragments de chromatides dépourvus de
centromère qui ne seront donc pas incorporés dans les noyaux des cellules filles. De plus, des anomalies du
fuseau peuvent générer des chromosomes qui ne sont pas incorporés dans le noyau. Ces particules
formeront des micronoyaux dans le plasma.
Les cellules V79 sont exposées pendant 24 h (4 h avec le mélange S9) à une gamme de concentrations d'un
échantillon pour essai. Des lames sont ensuite préparées, les cellules sont colorées et la présence de cellules
micronucléées est évaluée. Une incidence accrue de ces cellules micronucléées par rapport au témoin négatif
indique que l'élément d'essai peut provoquer une fragmentation des chromosomes ou des anomalies du
fuseau dans les cellules V79 in vitro.
5 Interférences
Des modifications biologiquement pertinentes des conditions de culture peuvent induire une aberration
chromosomique due à des mécanismes secondaires donnant un positif artificiel et donc des résultats non
[16]
pertinents . Ces facteurs sont, par exemple, des variations plus importantes de l'osmolalité ou du pH, la
précipitation de l'échantillon pour essai et sa phagocytose, et des effets cytotoxiques importants de
l'échantillon pour essai. Par conséquent, il convient de surveiller les échantillons pour essai, au moins en ce
qui concerne les variations du pH ou de l'osmolalité des cultures, en utilisant la même proportion d'élément
d'essai par culture que celle qui sera utilisée ultérieurement dans les conditions d'essai. En cas de variation
du pH de la culture, il convient de régler le pH de l'élément d'essai à 7,0 ± 0,2. En cas de variation de
l'osmolalité, la plus forte concentration utilisée lors de l'essai doit être réduite afin d'éviter toute variation
correspondante de l'osmolalité dans les cultures. Pour éviter les artéfacts dus à la phagocytose ou à une
cytotoxicité sévère, il convient de respecter les limites indiquées pour la concentration la plus élevée lors des
essais (voir 9.1 et 9.2).
6 Réactifs et milieux
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
Si des produits chimiques ayant différentes teneurs en eau de cristallisation sont utilisés, calculer les
quantités requises en conséquence.
Toujours effectuer le passage à l'autoclave pendant 20 min à 121 °C ± 2 °C. Recouvrir les récipients sans
serrage (par exemple à l'aide d'une feuille d'aluminium). Ne jamais les fermer de manière étanche.
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6.1 Eau.
Préparer toutes les solutions aqueuses avec de l'eau ayant une conductivité inférieure ou égale à 5 µS/cm.
6.2 Réactifs.
6.2.1 Glucose-6-phosphate dihydraté, C H O PNa , 2H O.
6 11 9 2 2
6.2.2 Nicotinamide-adénine-dinucléotide phosphate, sel disodique, NADP, C H N Na O P .
21 26 7 2 17 3
6.2.3 Chlorure de magnésium hexahydraté, MgCl , 6H O.
2 2
6.2.4 Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO .
2 4
6.2.5 Hydrogénophosphate disodique dihydraté, Na HPO , 2H O.
2 4 2
6.2.6 Éthanol (absolu), C H OH.
2 5
6.2.7 Acide acétique glacial, CH COOH.
3
6.2.8 Formaldéhyde, HCHO, 37 % en fraction volumique.
COONa) , 2H O.
6.2.9 Citrate trisodique dihydraté, HOC(COONa)(CH
2 2 2
6.2.10 Hydrogénophosphate disodique, Na HPO .
2 4
6.2.11 Dihydrogénophosphate de sodium, NaH PO .
2 4
1)
6.2.12 Solution de May-Grünwald, modifiée .
6.2.13 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l.
6.2.14 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l.
6.2.15 Diméthylsulfoxyde (DMSO), C H SO.
2 6
6.2.16 Témoins positifs.
6.2.16.1 Cyclophosphamide, monohydraté, C H Cl N O P, H O.
7 15 2 2 2 2
Numéro CAS: 6055-19-2.
6.2.16.2 Sulfonate d'éthylméthane (EMS), CH SO CH CH .
3 3 2 3
Numéro CAS: 62-50-0.
6.2.17 Solution de citrate de sodium pour traitement hypotonique.
Préparer une solution aqueuse à 1,5 % de citrate trisodique.
6.2.18 Solution de fixation.
Mélanger 50 ml d'acide acétique glacial avec 150 ml d'éthanol, ajouter 2,5 ml d'une solution de formaldéhyde
à 37 %.
1) Ce réactif est disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l'intention des
utilisateurs de la présente partie de l'ISO 21427 et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
4 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21427-2:2006(F)
1)
6.2.19 Solution tampon selon WEISE (pH 7,2) .
Cette solution est commercialisée en ampoules. Diluer le contenu d'une ampoule dans de l'eau et, à l'aide
d'une fiole jaugée de 1 000 ml, compléter avec de l'eau.
1)
6.2.20 Solution de Giemsa .
Préparer une solution de Giemsa à 2,6 % dans la solution tampon selon WEISE (pH 7,2) (6.2.19). Filtrer
avant utilisation.
6.2.21 Tampon phosphate.
Dissoudre 2,13 g de Na HPO dans 1 l d'eau. Dissoudre 1,8 g de NaH PO dans 1 l d'eau. Mélanger ces
2 4 2 4
deux solutions dans un rapport de 4:1 et ajuster le pH final à 7,4.
1)
6.2.22 Milieu MEM (= Milieu Essentiel Minimum) avec glutamine stabilisée .
1)
6.2.23 Sérum fœtal de veau (= FCS) .
1)
6.2.24 Solution de pénicilline/streptomycine, 10 000 E/10 000 µg/ml .
1)
6.2.25 Solution d'amphotéricine B, 250 µg/ml .
1)
6.2.26 Solution de trypsine/EDTA, 0,25 % .
1)
6.2.27 Solution saline équilibrée de Hanks (= HBSS) .
2+ 2+ 1)
6.2.28 Solution saline équilibrée de Hanks (= HBSS) sans Ca ni Mg .
6.2.29 Solution de chlorure de potassium.
Dissoudre 4 g de chlorure de potassium dans 1 l d'eau.
6.3 Préparation des milieux de culture.
6.3.1 Milieu de culture avec FCS.
Ce milieu est utilisé comme milieu de culture général et pour le traitement des cellules sans le mélange S9.
Mélanger 500 ml du milieu MEM, 50 ml de FCS, 5 ml de la solution de pénicilline/streptomycine et 5 ml de la
solution d'amphotéricine B.
Le milieu est stable pendant 4 semaines s'il est conservé au réfrigérateur à 4 °C ± 2 °C.
6.3.2 Milieu de culture sans FCS.
Ce milieu n'est utilisé que pendant la période de traitement des cellules en condition d'activation (mélange S9).
Mélanger 500 ml du milieu MEM, 5 ml de la solution de pénicilline/streptomycine et 5 ml de la solution
d'amphotéricine B.
Le milieu est stable pendant 4 semaines s'il est conservé au réfrigérateur à 4 °C ± 2 °C.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 5
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ISO 21427-2:2006(F)
6.4 Système cellulaire.
6.4.1 Lignée cellulaire, conservation
La lignée cellulaire V79 est une lignée cellulaire permanente de cellules de poumon de hamster chinois ayant
⎯ une vitesse de prolifération élevée (durée du cycle cellulaire de l'ordre de 12 h à 16 h);
⎯ une efficacité d'ensemencement élevée (W 90 %);
⎯ un caryotype stable (nombre modal de chromosomes = 22).
Conserver les cultures permanentes (échantillons de 1 ml contenant 7 % de DMSO) dans de l'azote liquide à
environ −196 °C. Avant la congélation, vérifier chaque lot afin de détecter une éventuelle contamination par
les mycoplasmes. Il convient de déterminer le caryotype et l'efficacité d'ensemencement (aptitude à former
des colonies) au moins avant la première utilisation d'une culture décongelée.
6.4.2 Culture
Pour commencer une culture, décongeler une culture permanente dans un bain-marie à 37 °C et introduire
2
0,5 ml de cet échantillon dans un flacon de culture de 25 cm contenant déjà environ 5 ml de MEM (milieu
essentiel minimum, constitué d'un milieu, de glutamine et d'antibiotiques), y compris 10 % de FCS (sérum
fœtal de veau). Cultiver les cellules à 37 °C, en utilisant 5 % de dioxyde de carbone et une humidité d'au
moins 90 %. Repiquer les cellules deux fois par semaine.
2
Retirer les flacons (25 cm ) de l'incubateur et les placer sur une paillasse propre. Ouvrir les flacons un à un et
éliminer le milieu par aspiration. Laver les cellules une fois à l'aide de 5 ml de la solution saline équilibrée de
2+ 2+
Hanks (HBBS, sans Ca ni Mg ) pendant environ 5 min. Procéder ensuite à une nouvelle élimination du
milieu.
Trypsiniser les cellules pendant environ 5 min à l'aide de 1,0 ml environ de trypsine (0,25 %) et 1,0 ml environ
2+ 2+
de HBBS (sans Ca ni Mg ) afin de décoller les cellules du fond du flacon de culture.
Stopper cette réaction en ajoutant environ 3 ml de MEM contenant 10 % de FCS.
Pipetter ce mélange plusieurs fois afin de décoller les cellules du flacon et d'obtenir une suspension
homogène de cellules isolées.
2)
Compter les cellules dans un échantillon de 10 µl à l'aide d'un hémocytomètre .
Diluer la suspension jusqu'à la densité cellulaire requise (30 000 à 80 000 par culture) en utilisant un milieu
MEM contenant 10 % de FCS.
6.4.3 Durée du cycle cellulaire
La durée du cycle cellulaire des cellules V79 est normalement de 12 h à 16 h environ. Déterminer leur durée
3)
de vie spécifique en laboratoire par la méthode à la BrdU (voir Annexe A).
2) Il est également possible d’utiliser un compteur automatique de cellules ou de particules.
3) BrdU signifie bromodésoxyuridine.
6 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21427-2:2006(F)
6.5 Activation métabolique
6.5.1 Fraction S9
Pour le traitement d'induction enzymatique et la préparation de la fraction S9, voir l'Annexe C. Si la fraction S9
est achetée dans le commerce, elle doit avoir été préparée (y compris l'induction enzymatique) conformément
à l'Annexe C.
6.5.2 Mélange S9
Préparer la quantité nécessaire de fraction S9 le jour même de l'essai ou, si elle congelée, décongeler à
température ambiante. Immédiatement après, préparer le mélange S9 en mélangeant les composés suivants
dans des conditions stériles:
a) 1 aliquote de fraction S9;
b) 9 aliquotes de supplément S9 (solution de cofacteurs).
Conserver le mélange S9 en permanence sur de la glace (par exemple dans une ampoule à décanter à
double paroi contenant de l'eau glacée entre les deux parois) et l'utiliser uniquement le jour même. À la fin de
la journée, jeter le mélange S9 restant. Les concentrations de cofacteurs dans le mélange S9 sont les
suivantes:
MgCl 8 mmol/l
2
KCl 33 mmol/l
Glucose-6-phosphate 5 mmol/l
NADP 4 mmol/l
15 mmol/l
Tampon phosphate (pH 7,4)
7 Appareillage
7.1 Fioles cryogéniques, 1 ml, 2 ml, 5 ml.
2 2
7.2 Flacons de culture cellulaire, 25 cm , 75 cm .
7.3 Boîtes de Petri, adaptées à 4 lames pour microscope, d'environ 9 cm × 13 cm.
7.4 Lames pour microscope avec partie givrée (dépolie).
7.5 Incubateur à CO .
2
7.6 Poste de travail à flux d'air laminaire.
7.7 Bain-marie.
7.8 Pompe à vide.
7.9 Microscope inversé.
7.10 Microscope optique.
7.11 Bec Bunsen.
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ISO 21427-2:2006(F)
7.12 Centrifugeuse.
7.13 Congélateur (−80 °C).
7.14 Balance analytique.
7.15 Pipettes en verre, 1 ml, 5 ml, 10 ml.
7.16 Pipettes à volume réglable.
7.17 Chambre de comptage de Neubauer.
7.18 Pinces pour pellicules et épreuves photographiques.
7.19 Vase de Dewar pour la conservation des cellules dans l'azote liquide.
7.20 Pincettes.
7.21 Cuvettes contenant des supports pour la coloration.
7.22 Filtres stériles, 0,22 µm.
8 Critères relatifs à l'installation d'essai
L'installation d'essai est qualifiée pour la mise en œuvre de la présente partie de l'ISO 21427 si le test des
micronoyaux est réalisé in vitro dans cette installation conformément aux critères suivants:
⎯ deux expériences indépendantes doivent déjà avoir été réalisées;
⎯ une paire de produits chimiques mutagène et non mutagène connus doit déjà avoir été testée.
Il convient de décider au cas par cas si, et dans quelle mesure, des instructions supplémentaires sont
nécessaires pour l'application de la présente partie de l'ISO 21427.
9 Mode opératoire
9.1 Échantillonnage et échantillons
Soumettre les échantillons à essai dès que possible après l'échantillonnage, c'est-à-dire le jour même du
prélèvement. Fractionner à l'avance les gros échantillons en portions appropriées, car les échantillons
décongelés ne peuvent être utilisés que le jour où ils ont été décongelés.
Des valeurs élevées ou faibles du pH de l'échantillon pour essai peuvent déclencher des effets toxiques pour
les cellules, avec pour conséquence une baisse de la concentration maximale pouvant être soumise à essai.
Il convient donc de surveiller et de régler, si nécessaire, le pH de l'échantillon pour essai à 7,0 ± 0,2 en
utilisant une solution de HCl ou de NaOH (6.2.13 et 6.2.14). Choisir des concentrations d'acide ou de base
telles que les volumes ajoutés soient aussi faibles que possible. Éviter un titrage excessif. La variation du pH
de l'échantillon et les effets qui en découlent doivent être pris en compte (voir l'ISO 5667-16).
Secouer vigoureusement les échantillons pour essai avant leur utilisation.
Centrifuger les échantillons contenant des solides et n'utiliser que le surnageant liquide pour le traitement
ultérieur.
8 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 21427-2:2006(F)
Stériliser tous les échantillons par filtration à travers des filtres stériles (7.22). Ne pas extraire ou concentrer
les échantillons.
NOTE 1 Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés respectivement à une température comprise entre 0 °C
et 5 °C pendant 48 h au maximum, et à une température inférieure à −18 °C pendant deux mois au maximum.
NOTE 2 Voir l'ISO 5667-16.
Si des dilutions sont nécessaires, elles doivent être réalisées avec de l'eau stérilisée (6.1).
9.2 Étendue expérimentale
Utiliser deux cultures par groupe expérimental. Rechercher les micronoyaux sur 1 000 cellules par culture.
Voir Tableau 1.
Tableau 1 — Étendue expérimentale
Groupe de traitement Mélange S9 Durée du traitement Temps de récolte
h h
témoin négatif
eau de dilution 24 24
−
a
élément d'essai non dilué − 24 24
1:2 24 24
−
1:4 24 24
−
1:8 24 24
−
1:16 24 24
−
1:32 24 24
−
témoin positif EMS (6.2.16.2)
350 µg/ml 24 24
−
témoin négatif
eau de dilution 4 24
+
a
élément d'essai non dilué + 4 24
1:2 4 24
+
1:4 + 4 24
1:8 + 4 24
1:16 + 4 24
1:32 + 4 24
témoin positif cyclophosphamide (6.2.16.1)
2,5 µg/ml
+ 4 24
a
Si l'osmolalité varie en conséquence, la plus forte dilution qui n'altère pas l'osmolalité de la culture.
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ISO 21427-2:2006(F)
9.3 Témoins négatifs
Traiter les cultures de témoins négatifs avec un volume d'eau de dilution égal au volume d'élément d'essai
employé pour traiter les autres cultures.
9.4 Témoins positifs
Dissoudre les témoins positifs dans le milieu MEM de manière à obtenir une concentration d'EMS de
1,75 mg/ml et une concentration de cyclophosphamide de 12,5 µg/ml. Appliquer un volume de 1 ml par
culture.
Conserver les solutions mères de témoins positifs à −80 °C. Dans ce cas, il convient de les décongeler juste
avant le traitement.
9.5 Calendrier
− 6 h Ensemencement
0 h Traitement
Lavage des cultures (uniquement celles contenant le mélange S9)
+ 4 h
+ 24 h Récolte et préparation des lames
9.6 Étapes préparatoires
Décongeler les cultures permanentes dans un bain-marie à 37 °C. Introduire 0,5 ml de la culture décongelée
2
dans un flacon de 25 cm contenant déjà 5 ml de milieu MEM (y compris 10 % de FCS). Incuber les cultures à
37 °C, en utilisant une atmosphère contenant une fraction volumique de 5 % de CO et ayant une humidité
2
d'au moins 90 %, de manière à atteindre une confluence (inhibition de contact) comprise entre 50 % et au
maximum 100 % (environ 2 jours à 4 jours). Pour extraire les cellules mortes, remplacer le milieu 30 h environ
après le début de la culture. Utiliser les cellules restantes pour les expériences. (Elles peuvent aussi être
utilisées pour un repiquage ultérieur.) Rejeter les cellules qui ont subi plus de 15 mises en culture parce
qu'elles ne peuvent plus être utilisées pour d'autres expériences.
9.7 Préparation des cultures d'essai
9.7.1 Généralités
2+ 2+
Laver les cellules une fois avec 5 ml de HBBS (sans Ca ni Mg ) pendant environ 5 min, puis éliminer le
milieu par aspiration.
Trypsiniser les cellules pendant environ 5 min à l'aide de 1,0 ml environ de trypsine (0,25 %) et 1,0 ml environ
2+ 2+
de HBBS (sans Ca ni Mg ) afin de décoller les cellules du fond du flacon de culture.
Stopper cette réaction en ajoutant environ 3 ml de MEM contenant 10 % de FCS.
Pipetter ce mélange plusieurs fois afin de décoller les cellules du flacon et d'obtenir une suspension
homogène de cellules isolées.
4)
Compter les cellules dans un échantillon de 10 µl à l'aide d'un hémocytomètre .
Diluer la suspension jusqu'à la densité cellulaire requise (30 000 à 80 000 par 5 ml de culture) en utilisant un
milieu MEM contenant 10 % de FCS.
4) Il est également possible d’utiliser un compteur automatique de cellules ou de particules.
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