ISO 14593:1999

Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (CO2 headspace test)

This International Standard specifies a method, by analysis of inorganic carbon, for the evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic substances at a given concentration of microorganisms. This International Standard is applicable to organic compounds which are: a) water-soluble under the test conditions; b) poorly water-soluble under the test conditions, in which case special measures may be necessary to achieve a good dispersion of the compound (see ISO 10634); c) volatile; d) not inhibitory to the test microorganisms at the concentration chosen for the test. In this test, biogenically produced inorganic carbon is measured in situ in the test vessels in such a manner that the rate measured nearly equals the rate of microbial production. NOTE 1 The conditions described in this International Standard do not always correspond to the optimal conditions for allowing the maximum degree of biodegradation to occur. For alternative biodegradation methods see ISO 15462. NOTE 2 With highly volatile substances, losses to the gaseous phase can be minimized by reducing the volume of the headspace. However, there should be sufficient oxygen in the test system to prevent biodegradation being oxygen-limited. NOTE 3 The presence of an inhibitory effect can be determined as specified in 8.3, or by using any other method for determining the inhibitory effect of a substance on bacteria (see, for example, ISO 8192).

Qualité de l'eau — Évaluation en milieu aqueux de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques — Méthode par analyse du carbone inorganique dans des récipients hermétiquement clos (Essai au CO2 dans l'espace de tête)

La présente Norme internationale prescrit une méthode pour l'évaluation, par analyse du carbone inorganique en milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie ultime de composés organiques présents à une concentration donnée sous l'action de micro-organismes. La méthode de la présente Norme internationale s'applique à des composés organiques: a) solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai; b) peu soluble dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas il peut être nécessaire de prendre des mesures particulières afin d'assurer une bonne dispersion du composé (voir par exemple l'ISO 10634); c) volatils; d) n'ayant pas d'effet inhibiteur sur les micro-organismes soumis à l'essai, à la concentration choisie pour l'essai. Au cours de cet essai, le carbone inorganique produit biologiquement est dosé in situ dans les récipients d'essai de telle manière que le taux mesuré soit presque égal au taux de production microbienne. NOTE 1 Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas toujours aux conditions optimales permettant d'obtenir un degré maximal de biodégradation. Voir l'ISO 15462 pour d'autres méthodes de biodégradation. NOTE 2 Pour des substances très volatiles, les pertes dans la phase gazeuse peuvent être minimisées en réduisant le volume de l'espace de tête. Cependant, il convient que la quantité d'oxygène présente dans le système d'essai soit suffisante pour éviter que le processus de biodégradation soit limité par un manque d'oxygène. NOTE 3 L'existence d'un effet inhibiteur peut être mise en évidence suivant la méthode prescrite en 8.3, ou par toute autre méthode de détermination de l'effet inhibiteur d'une substance sur des bactéries (voir par exemple l'ISO 8192).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 17-Mar-1999
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 16-Dec-2020

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14593
First edition
1999-03-15
Water quality — Evaluation of ultimate
aerobic biodegradability of organic
compounds in aqueous medium — Method
by analysis of inorganic carbon in sealed
vessels (CO headspace test)
2
Qualité de l’eau — Évaluation en milieu aqueux de la biodégradabilité
aérobie ultime des composés organiques — Méthode par analyse du
carbone inorganique dans des récipients hermétiquement clos (Essai
au CO dans l'espace de tête)
2
A
Reference number
ISO 14593:1999(E)

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ISO 14593:1999(E)
Contents
1 Scope .1
2 Normative reference .1
3 Terms and definitions .2
4 Principle.3
5 Test environment.4
6 Reagents.4
7 Apparatus .5
8 Procedure .5
9 Calculation and expression of results.9
10 Expression of results .10
11 Validity of results.10
12 Precision of the method.11
13 Test report .11
Annex A (informative) Example of a biodegradation curve .12
Annex B (informative) Statistical treatment of results.13
Annex C (informative) Interlaboratory ring test. 14
Bibliography.15
©  ISO 1999
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
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Printed in Switzerland
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© ISO
ISO 14593:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14593 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee
SC 5, Biological methods.
Annexes A, B and C of this International Standard are for information only.
iii

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INTERNATIONAL STANDARD  © ISO ISO 14593:1999(E)
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability
of organic compounds in aqueous medium — Method by analysis
of inorganic carbon in sealed vessels (CO headspace test)
2
WARNING — Activated sludge and sewage may contain potentially pathogenic organisms and should be
handled with appropriate precautions. Hazardous test compounds and those whose properties are
unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard specifies a method, by analysis of inorganic carbon, for the evaluation in an aqueous
medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic substances at a given concentration of microorganisms.
This International Standard is applicable to organic compounds which are:
a) water-soluble under the test conditions;
b) poorly water-soluble under the test conditions, in which case special measures may be necessary to achieve a
good dispersion of the compound (see ISO 10634);
c) volatile;
d) not inhibitory to the test microorganisms at the concentration chosen for the test.
In this test, biogenically produced inorganic carbon is measured in situ in the test vessels in such a manner that the
rate measured nearly equals the rate of microbial production.
NOTE 1 The conditions described in this International Standard do not always correspond to the optimal conditions for
allowing the maximum degree of biodegradation to occur. For alternative biodegradation methods see ISO 15462.
NOTE 2 With highly volatile substances, losses to the gaseous phase can be minimized by reducing the volume of the
headspace. However, there should be sufficient oxygen in the test system to prevent biodegradation being oxygen-limited.
NOTE 3 The presence of an inhibitory effect can be determined as specified in 8.3, or by using any other method for
determining the inhibitory effect of a substance on bacteria (see, for example, ISO 8192).
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For
undated reference, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of IEC and ISO
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 10634:1995, Water quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic
compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium.
1

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3 Terms and definitions
For the purposes of this International Standard, the following terms and definitions apply.
3.1
ultimate aerobic biodegradation
breakdown of a chemical compound or organic matter by microorganisms in the presence of oxygen to carbon
dioxide, water and mineral salts of any other elements present (mineralization) and the production of new biomass
3.2
primary biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms resulting in the loss of a specific
property
3.3
activated sludge
biomass produced in the aerobic treatment of wastewater by the growth of bacteria and other microorganisms in the
presence of dissolved oxygen
3.4
concentration of suspended solids
amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge
and drying at about 105 �C to constant mass
3.5
total organic carbon
TOC
all that carbon present in organic matter which is dissolved and suspended in the water sample
3.6
dissolved organic carbon
DOC
that part of the organic carbon in the water sample which cannot be removed by specified phase separation
-2
NOTE For example, by centrifugation at 40 000 m⋅s for 15 min or by membrane-filtration using membranes with pores of
diameter 0,2 mm to 0,45 mm.
3.7
total inorganic carbon
TIC
all that inorganic carbon in the water deriving from carbon dioxide and carbonate
3.8
dissolved inorganic carbon
DIC
that part of the inorganic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation
-2
NOTE For example, by centrifugation at 40 000 m⋅s for 15 min or by membrane-filtration using membranes with pores of
diameter 0,2 mm to 0,45 mm.
3.9
theoretical amount of inorganic carbon
ThIC
theoretical maximum amount of inorganic carbon formed after oxidizing a chemical compound completely
NOTE It is calculated from the molecular formula and expressed in this case as milligrams carbon per milligram (or gram)
test compound.
2

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ISO 14593:1999(E)
3.10
lag phase
time from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading microorganisms are achieved and the
biodegradation degree of a chemical compound or organic matter has increased to about 10 % of the maximum
level of biodegradation
NOTE It is normally recorded in days.
3.11
maximum level of biodegradation
maximum biodegradation degree of a chemical compound or organic matter in a test, above which no further
biodegradation takes place during the test
NOTE It is normally recorded in percent.
3.12
biodegradation phase
time from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of biodegradation has been
reached
NOTE It is normally recorded in days.
3.13
plateau phase
time from the end of the biodegradation phase until the end of the test
NOTE It is normally recorded in days.
3.14
pre-exposure
pre-incubation of an inoculum in the presence of the test chemical compound or organic matter, with the aim of
enhancing the ability of this inoculum to biodegrade the test material by adaptation and/or selection of the
microorganisms
3.15
preconditioning
pre-incubation of an inoculum under the conditions of the subsequent test in the absence of the test chemical
compound or organic matter, with the aim of improving the performance of the test by acclimatization of the
microorganisms to the test conditions
4 Principle
The test compound, as the sole source of carbon and energy, is added to a mineral salts medium inoculated with a
mixed population of microorganisms and incubated in sealed vessels with a headspace of air. The concentration of
the compound used normally yields an initial organic carbon concentration in the medium of 2 mg/l to 40 mg/l,
usually 20 mg/l. Biodegradation (mineralization to carbon dioxide) is determined by measuring the net increase in
total inorganic carbon (TIC) levels over time compared with unamended blanks. The test generally runs for 28 d.
The extent of biodegradation is expressed as a percentage of the theoretical amount of inorganic carbon (ThIC)
based on the amount of test compound added initially.
For sufficiently water-soluble substances, dissolved organic carbon (DOC) removal during the test may also be
determined (see for example ISO 7827).
If a suitable analytical method is available, the primary biodegradation of the test compound during the test may
also be determined.
3

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ISO 14593:1999(E)
5 Test environment
o o
Incubation shall take place in the dark or in diffused light, at a temperature within the range 20 C to 25 C which
o
shall not vary by more than – 2 C during the test.
6 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
6.1  Distilled or deionized water, containing less than 1 mg/l total organic carbon.
6.2  Test medium.
6.2.1  Composition
a) Solution a)
Dissolve:
Anhydrous potassium dihydrogenphosphate (KH PO ) 8,50 g
2 4
Anhydrous dipotassium hydrogenphosphate (K HPO ) 21,75 g
2 4
Disodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO ⋅ 2H O) 33,40 g
2 4 2
Ammonium chloride (NH Cl) 0,50 g
4
in water (6.1), quantity necessary to make up to 1 000 ml
In order to check this buffer solution, it is recommended to measure the pH, which should be at about 7,4. If this is
not the case, prepare a new solution.
b) Solution b)
Dissolve 36,40 g of calcium chloride dihydrate (CaCl ⋅2H O) in water (6.1), quantity necessary to make up to
2 2
1 000 ml.
c) Solution c)
Dissolve 22,50 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ⋅ 7H O) in water (6.1), quantity necessary to make up
4 2
to 1 000 ml.
d) Solution d)
Dissolve 0,25 g iron(III) chloride hexahydrate (FeCl ⋅6H O) in water (6.1), quantity necessary to make up to
3 2
1 000 ml. To avoid precipitation, prepare this solution freshly before use or add a drop of concentrated hydrochloric
acid (HCl).
6.2.2  Preparation of the test medium
For 1 l of test medium, mix 10 ml of solution a) with 800 ml water (6.1) and then add 1 ml each of solutions b), c)
and d) and make up to 1 000 ml with water (6.1).
6.3  Concentrated orthophosphoric acid (H PO ) (> 85 % mass per volume).
3 4
4

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ISO 14593:1999(E)
6.4  Sodium hydroxide solution.
Dissolve 280 g of sodium hydroxide (NaOH) in 1 l of water (6.1) to obtain a solution of concentration c = 7 mol/l.
Use either a freshly prepared solution or determine the concentration of dissolved inorganic carbon (DIC) of this
solution and consider this value when calculating the test result (see clause 9).
7 Apparatus
Ensure that all glassware is thoroughly cleaned and, in particular, free from both organic and toxic matter. Use usual
laboratory equipment, and the following apparatus.
7.1  Carbon analyzer, instrument for measuring inorganic and (optionally) organic carbon, such as the appropriate
parts of a total organic carbon (TOC) analyser or a gas chromatograph.
7.2  Gas-tight glass vessels of known volume, for example, serum bottles of 160 ml capacity sealed with butyl
rubber septa and aluminium crimp seals or any other gas-tight system.
7.3  Orbital shaker.
7.4  Syringes of high precision for aqueous and gaseous samples.
7.5  Glass bottles to take, for example, 5 l medium.
7.6  Centrifuge.
7.7  pH-meter.
7.8  Device for filtration, with membrane filters of suitable porosity (nominal aperture diameter between 0,20 μm
and 0,45 μm) which adsorb organic substances or release organic carbon to a minimum degree.
7.9  CO -free air production system.
2
Prepared by passing air through soda lime granules or a solution of sodium hydroxide (see, for example, ISO 9439).
Alternatively, a mixture of 80 % N /20 % O may be used. The absence of CO in the air can be confirmed by
2 2 2
passage through barium hydroxide solution (a white precipitate indicates the presence of CO ).
2
8 Procedure
8.1 Preparation of the test solutions
8.1.1 Test compound
Prepare a stock solution of a sufficiently water-soluble test compound in water (6.1) or the test medium (6.2.2) at a
concentration preferably 100-fold greater than the final concentration to be used in the test. Add the stock solution
to the test medium (6.2.2) to give a final TOC concentration of between 2 mg/l and 40 mg/l (see 8.3), preferably
20 mg/l TOC.
Add substances of low water-solubility directly, in solid or liquid form, to the inoculated medium in the appropriate
test vessels. Liquid test compounds, including those which are volatile, may be injected directly into sealed vessels
using a high-precision microsyringe. Determine the added amount exactly.
Poorly soluble substances can often be dispensed as a dispersion produced using a non-biodegradable emulsifying
agent and/or ultrasonication. Refer to ISO 10634 for guidance on the preparation and treatment of poorly water-
soluble substances.
5

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ISO 14593:1999(E)
8.1.2 Reference substance
Prepare a stock solution of the reference substance (an organic substance of known biodegradability such as
aniline or sodium benzoate) in water (6.1) in the same way as in 8.1.1, and then dilute in the test medium (6.2.2) to
give a final TOC concentration of 20 mg/l.
8.1.3 Solution to check inhibition
If required (when e.g. no information on the toxicity of test compound is available), prepare a solution containing, in the
test medium (6.2.2), both the test compound (8.1.1) and the reference compound (8.1.2) preferably at concentrations
of organic carbon of 20 mg/l for each.
8.2 Preparation of the inoculum
8.2.1 General
Prepare the inoculum using the sources described in 8.2.2, 8.2.3 and 8.2.4, or using a mixture of these sources, to
obtain a microbial population that offers sufficient biodegradative activity. Check this activity by means of the
reference substance (8.1.2). Based on experience (clause 12 and annex C), the usual inoculum is activated sludge
at a dry solids concentration of 4 mg/l. The carbon dioxide production of the blanks should be as low as possible
(see clause 11). To reduce the influence of the blanks, it may be helpful to precondition the inoculum by aeration for
up to one week before it is used. Use a suitable volume for inoculation (see note 2 below).
Normally the inoculum should not be pre-exposed to the test compound, to allow a general prediction of the
degradation behaviour in the environment. In certain circumstances, depending on the purpose of the test, pre-
exposed inocula may be used, provided that this is clearly stated in the test results (e.g. biodegradation = x %,
using pre-exposed inocula) and the method of the pre-exposure is detailed in the test report.
NOTE 1 Pre-exposed inocula can be obtained from laboratory biodegradation tests conducted under a variety of conditions
(e.g. ISO 9888 Zahn-Wellens test; ISO 9887 SCAS test) or from samples collected from locations where relevant
environmental conditions exist (for example treatment plants dealing with similar substances or contaminated areas).
NOTE 2 Based on experience, suitable volume means:
 sufficient to give a population which offers enough biodegradation activity;
 degrades the reference compound by the stipulated percentage (see clause 11);
2 5
gives between 10
 to 10 colony forming units per millilitre in the final mixture;
gives normally a concentration of 4 mg/l suspended solids of activated sludge in the final mixture (higher concentrations

up to 30 mg/l are generally possible but may influence significantly the CO production of the blanks and are therefore not
2
recommended);
 the quantity of dissolved organic carbon provided by the inoculum should be less than 10 % of the initial concentration of
organic carbon introduced by the test compound;
 generally 1 ml to 10 ml of inoculum are sufficient for 1 000 ml of test solution.
8.2.2 Inoculum from an activated sludge plant
Collect activated sludge from the aeration tank of a full-scale or a laboratory wastewater treatment plant which
treats predominantly domestic sewage. If necessary, remove coarse particles by filtration through a sieve (for

2
example, 1 mm mesh size) and keep the sludge aerobic thereafter. Since it is necessary for the inoculum blank to
have as low an evolution of CO as p
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 14593
Première édition
1999-03-15
Qualité de l’eau — Évaluation en milieu
aqueux de la biodégradabilité aérobie
ultime des composés organiques —
Méthode par analyse du carbone
inorganique dans des récipients
hermétiquement clos (Essai au CO dans
2
l'espace de tête)
Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic
compounds in aqueous medium — Method by analysis of inorganic carbon
in sealed vessels (CO headspace test)
2
A
Numéro de référence
ISO 14593:1999(F)

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ISO 14593:1999(F)
Sommaire
1 Domaine d'application.1
2 Référence normative .1
3 Termes et définitions.2
4 Principe.3
5 Environnement d'essai.4
6 Réactifs.4
7 Appareillage .5
8 Mode opératoire.5
9 Calculs et expression des résultats.9
10 Expression des résultats .11
11 Validité des résultats.11
12 Fidélité de la méthode .11
13 Rapport d'essai .12
Annexe A (informative) Exemple de courbe de biodégradation.13
Annexe B (informative) Traitement statistique des résultats.14
Annexe C (informative) Essai interlaboratoire .15
(informative)
Annexe D Bibliographie .16
©  ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet [e-mail]
Imprimé en Suisse
ii

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© ISO
ISO 14593:1999(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14593 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A, B et C de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d'information.
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NORME INTERNATIONALE  © ISO ISO 14593:1999(F)
Qualité de l'eau — Évaluation en milieu aqueux de la
biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques —
Méthode par analyse du carbone inorganique dans des récipients
hermétiquement clos (Essai au CO dans l'espace de tête)
2
AVERTISSEMENT — Les boues activées et les eaux d'égouts peuvent contenir des organismes
potentiellement pathogènes. Il convient donc de prendre des précautions appropriées lors de leur
manipulation. Il convient de manipuler avec précaution les composés pour analyse toxiques, de même que
ceux dont les propriétés sont inconnues.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour l'évaluation, par analyse du carbone inorganique en
milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie ultime de composés organiques présents à une concentration donnée
sous l'action de micro-organismes.
La méthode de la présente Norme internationale s'applique à des composés organiques:
a) solubles dans l'eau dans les conditions de l'essai;
b) peu soluble dans l'eau dans les conditions de l'essai, auquel cas il peut être nécessaire de prendre des
mesures particulières afin d'assurer une bonne dispersion du composé (voir par exemple l'ISO 10634);
c) volatils;
d) n'ayant pas d'effet inhibiteur sur les micro-organismes soumis à l'essai, à la concentration choisie pour l'essai.
Au cours de cet essai, le carbone inorganique produit biologiquement est dosé in situ dans les récipients d'essai de
telle manière que le taux mesuré soit presque égal au taux de production microbienne.
NOTE 1 Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas toujours aux conditions
optimales permettant d'obtenir un degré maximal de biodégradation. Voir l'ISO 15462 pour d'autres méthodes de
biodégradation.
NOTE 2 Pour des substances très volatiles, les pertes dans la phase gazeuse peuvent être minimisées en réduisant le
volume de l'espace de tête. Cependant, il convient que la quantité d'oxygène présente dans le système d'essai soit suffisante
pour éviter que le processus de biodégradation soit limité par un manque d'oxygène.
NOTE 3 L'existence d'un effet inhibiteur peut être mise en évidence suivant la méthode prescrite en 8.3, ou par toute autre
méthode de détermination de l'effet inhibiteur d'une substance sur des bactéries (voir par exemple l'ISO 8192).
2 Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les amendements
ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords
fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer l'édition la plus
récente du document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du document
1

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ISO 14593:1999(F)
normatif en référence s'applique. Les membres de l’ISO et de la CEI possèdent le registre des Normes
internationales en vigueur.
ISO 10634:1995, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la préparation et le traitement des composés
organiques peu solubles dans l'eau en vue de l'évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux.
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
biodégradation aérobie ultime
décomposition d'un composé chimique ou d'une matière organique par des micro-organismes, en présence
d'oxygène, en dioxyde de carbone, eau et sels minéraux de tout autre élément présent (minéralisation) et
production de nouvelle biomasse
3.2
biodégradation primaire
modification structurelle (transformation) d'un composé chimique par des micro-organismes, entraînant la perte
d'une propriété spécifique
3.3
boue activée
biomasse produite par la croissance de bactéries ou d'autres micro-organismes en présence d'oxygène dissous,
lors du traitement aérobie des eaux usées
3.4
concentration en matières en suspension
quantité de matière solide obtenue par filtration ou centrifugation d'un volume connu de
boue activée et séchage à environ 105 °C jusqu'à masse constante
3.5
carbone organique total
COT
totalité du carbone présent dans la matière organique, dissous et en suspension dans l'eau
3.6
carbone organique dissous
COD
fraction du carbone organique présent dans l'eau qui ne peut être éliminée par la méthode de séparation des
phases spécifiée
– 2
NOTE Par exemple par centrifugation à 40 000 m·s pendant 15 min ou par filtration sur membrane dont le diamètre des
pores est de 0,2 m à 0,45 m.
m m
3.7
carbone inorganique total
CIT
totalité du carbone inorganique présent dans l'eau provenant du dioxyde de carbone et des carbonates
3.8
carbone inorganique dissous
CID
fraction du carbone inorganique présent dans l'eau qui ne peut être éliminée par la méthode de séparation des
phases spécifiée
– 2
NOTE Par exemple par centrifugation à 40 000 m·s pendant 15 min ou par filtration sur membrane dont le diamètre des
pores est de 0,2 mm à 0,45 mm.
2

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ISO 14593:1999(F)
3.9
quantité théorique de carbone inorganique
CITh
quantité théorique maximale de carbone inorganique formé après l'oxydation complète d'un composé chimique
NOTE Elle est calculée à partir de la formule moléculaire et est exprimée dans ce cas en milligrammes de carbone par
milligramme (ou par gramme) du composé à analyser.
3.10
phase de latence
délai s'écoulant entre le début d'un essai et le moment où l'adaptation et/ou la sélection des micro-organismes
dégradants est achevée, et où le degré de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique
représente environ 10 % du niveau maximal de biodégradation
NOTE Elle est généralement exprimée en jours.
3.11
niveau maximal de biodégradation
taux maximal de biodégradation d'un composé chimique ou d'une matière organique au cours d'un essai, au-delà
duquel aucune biodégradation ne survient plus pendant l'essai
NOTE Il est généralement exprimé en pourcentage.
3.12
phase de biodégradation
durée entre la fin de la phase de latence d'un essai et le moment où environ 90 % du niveau maximal de
biodégradation a été atteint
NOTE Elle est généralement exprimée en jours.
3.13
phase de plateau
durée entre la fin de la phase de biodégradation et la fin de l'essai
NOTE Elle est généralement exprimée en jours.
3.14
préexposition
préincubation d'un inoculum en présence du composé chimique ou de la matière organique à analyser, destinée à
accroître l'aptitude de l'inoculum à dégrader le matériau d'essai par adaptation et/ou par sélection des micro-
organismes
3.15
préconditionnement
préincubation d'un inoculum dans les conditions de l'essai, en l'absence du composé chimique ou de la matière
organique à analyser, destinée à améliorer l'efficacité de l'essai par acclimatation des micro-organismes aux
conditions d'essai
4 Principe
Le composé à analyser, unique source de carbone et d'énergie, est ajouté à un milieu de sels minéraux inoculé à
l'aide d'une population mixte de micro-organismes, puis incubé dans des récipients hermétiquement clos dont
l'espace de tête est rempli d'air. La concentration du composé utilisé produit normalement une concentration initiale
en carbone organique dans le milieu comprise entre 2 mg/l et 40 mg/l (20 mg/l en général). La biodégradation
(minéralisation en dioxyde de carbone) est déterminée par mesurage de l'augmentation nette des niveaux de
carbone inorganique total (CIT) sur une certaine durée, comparée avec des blancs qui n'ont pas été inoculés.
L'essai dure en général 28 jours. La biodégradation est exprimée en pourcentage de la quantité théorique de
carbone inorganique (CITh) calculée sur la base de la quantité de composé à analyser ajoutée initialement.
3

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Dans le cas de composés suffisamment solubles dans l'eau, l'élimination du carbone organique dissous (COD)
pendant l'essai peut également être déterminée (voir par exemple l'ISO 7827).
S'il existe une méthode d'analyse appropriée, la biodégradation primaire du composé à analyser peut également
être déterminée pendant l'essai.
5 Environnement d'essai
L'incubation doit avoir lieu à l'abri de la lumière ou sous lumière diffuse, à une température comprise entre 20 °C et
25 °C, maintenue constante à – 2 °C près tout au long de l'essai.
6 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1  Eau distillée ou déionisée, contenant moins de 1 mg/l de COD.
6.2  Milieu d'essai.
6.2.1  Composition
a) Solution a)
Dissoudre:
 Dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO )
2 4 8,50 g
 Monohydrogénophosphate de dipotassium anhydre (K HPO )
2 4 21,75 g
 Monohydrogénophosphate de disodium dihydraté (Na HPO ,2H O)
2 4 2 33,40 g
 Chlorure d'ammonium (NH Cl)
4 0,50 g
 dans de l'eau (6.1), quantité suffisante pour
1 000 ml

Il est recommandé de mesurer le pH pour vérifier cette solution tampon. Il convient que le pH soit d'environ 7,4.
Si ce n'est pas le cas, préparer une nouvelle solution.
b) Solution b)
Dissoudre 36,40 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans de l'eau (6.1), en quantité suffisante
2 2
pour 1 000 ml.
c) Solution c)
Dissoudre 22,50 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans de l'eau (6.1), en quantité
4 2
suffisante pour 1 000 ml.
d) Solution d)
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans de l'eau (6.1), en quantité suffisante
3 2
pour 1 000 ml. Afin d'éviter toute précipitation, préparer cette solution extemporanément ou ajouter une goutte
d'acide chlorhydrique concentré (HCl).
4

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6.2.2  Préparation du milieu d'essai
Pour 1 000 ml de milieu d'essai, ajouter à environ 800 ml d'eau (6.1), 10 ml de solution a) puis 1 ml de chacune des
solutions b) à d). Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1).
6.3  Acide orthophosphorique concentré (H PO ) (> 85 % masse par volume).
3 4
6.4  Solution d'hydroxyde de sodium.
Dissoudre 280 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans 1 l d'eau (6.1) pour obtenir une solution à 7 mol/l. Soit utiliser
une solution préparée extemporanément, soit déterminer la concentration de carbone inorganique dissous (CID) de
cette solution et tenir compte de cette valeur lors du calcul du résultat d'essai (voir l'article 9).
7 Appareillage
S’assurer que la verrerie de laboratoire a été soigneusement nettoyée et, plus particulièrement, qu'elle est exempte
de substances organiques et de substances toxiques. Utiliser un matériel courant de laboratoire, ainsi que
l'appareillage suivant.
7.1  Analyseur de carbone, instrument de mesurage du carbone inorganique et (éventuellement) organique, tel
qu'un analyseur de carbone organique total (COT) ou un chromatographe en phase gazeuse.
7.2  Récipients en verre étanches aux gaz de volume connu, par exemple des flacons à sérum de 160 ml de
capacité, fermés hermétiquement à l'aide d'un septum en caoutchouc butyle et sertis par des joints en aluminium ou
tout autre système étanche aux gaz.
7.3  Agitateur orbital.
7.4  Seringues de haute précision, pour échantillons aqueux ou gazeux.
7.5  Flacons en verre, pour préparer par exemple 5 l de milieu.
7.6  Centrifugeuse.
7.7  pH-mètre.
7.8  Dispositif de filtration, muni de membranes filtrantes de porosité appropriée (diamètre nominal d'ouverture
des pores compris entre 0,20 mm et 0,45 mm), dans lesquelles l'adsorption des composés organiques ou le
relargage du carbone organique est réduit au minimum.
7.9  Système de production d'air exempt de CO , préparé en faisant passer l'air à travers des granules à base
2
de soude et de chaux ou à travers une solution d'hydroxyde de sodium (voir par exemple l'ISO 9439). Il est
également possible d'utiliser un mélange composé à 80 % de N et à 20 % de O . L'absence de CO dans l'air peut
2 2 2
être confirmée par passage dans une solution d'hydroxyde de baryum (un précipité blanc indique la présence de
CO ).
2
8 Mode opératoire
8.1 Préparation des solutions d'essai
8.1.1 Composé à analyser
Préparer une solution mère à partir d'un composé à analyser dont la solubilité dans l'eau est suffisante, dans de
l'eau (6.1) ou dans le milieu d'essai (6.2.2) à une concentration de préférence 100 fois supérieure à la concentration
finale à utiliser pendant l'essai. Ajouter la solution mère au milieu d'essai (6.2.2) afin d'obtenir une concentration
finale en COT comprise entre 2 mg/l et 40 mg/l (voir 8.3), de préférence égale à 20 mg/l.
5

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Ajouter directement les substances peu solubles dans l'eau, sous forme solide ou liquide, au milieu inoculé, dans
les récipients d'essai appropriés. Les composés liquides à analyser, ainsi que les composés liquides volatils,
peuvent être injectés directement dans des récipients hermétiquement clos à l'aide de microseringues de haute
précision. Déterminer exactement la quantité ajoutée.
Les substances peu solubles peuvent souvent être préparées sous forme d'une dispersion à l'aide d'un agent
émulsifiant non biodégradable et/ou par ultrasons. Voir l'ISO 10634 pour la préparation et le traitement des
substances peu solubles dans l'eau.
8.1.2 Composé de référence
Préparer une solution mère du composé de référence (substance organique de biodégradabilité connue, telle que
l'aniline ou le benzoate de sodium) dans de l'eau (6.1) en suivant le mode opératoire décrit en 8.1.1, puis diluer
dans le milieu d'essai (6.2.2) pour obtenir une concentration finale en COT de 20 mg/l.
8.1.3 Solution témoin de l'inhibition
Si nécessaire (par exemple lorsque aucune information n'est disponible sur la toxicité du composé à analyser),
préparer une solution contenant, dans le milieu d'essai (6.2.2), à la fois le composé à analyser (8.1.1) et le composé
de référence (8.1.2), de préférence à des concentrations en carbone organique égales à 20 mg/l pour chaque
composé.
8.2 Préparation de l'inoculum
8.2.1 Généralités
Préparer l'inoculum à partir des sources décrites en 8.2.2, 8.2.3 et 8.2.4, ou à partir d'un mélange de ces sources,
afin d'obtenir une population microbienne offrant une activité de biodégradation suffisante. Vérifier cette activité au
moyen du composé de référence (8.1.2). Sur la base de l'expérience (voir l'article 12 et l'annexe C), l'inoculum
courant est une boue activée dont la concentration en matière sèche est de 4 mg/l. Il convient que la production de
dioxyde de carbone dans la solution à blanc soit aussi faible que possible (voir l'article 11). Il peut s'avérer utile,
pour réduire l'influence du blanc, de préconditionner l'inoculum par aération pendant une semaine au maximum
avant utilisation. Utiliser un volume convenable pour l'inoculation (voir la note 2 ci-après).
Généralement, il convient de ne pas préexposer l'inoculum au composé à analyser dans l'intention de permettre
une prévision générale du comportement de dégradation au sein de l'environnement. Dans certaines circonstances,
selon l'objectif de l'essai, il est possible d'utiliser des inocula préexposés, à condition de clairement le mentionner
dans le rapport d'essai (par exemple pourcentage de biodégradation = x %, avec inocula préexposés) et à condition
que la méthode de préexposition soit détaillée dans le rapport d'essai.
NOTE 1 Des inocula préexposés peuvent être obtenus à partir d'essais de biodégradation en laboratoire effectués dans
diverses conditions (par exemple essai de Zahn-Wellens selon l'ISO 9888 et essai SCAS selon l'ISO 9887) ou à partir
d'échantillons prélevés en des lieux où sont réunies les conditions d'environnement appropriées (par exemple usines assurant
le traitement de composés identiques ou zones contaminées).
NOTE 2 Sur la base de l'expérience, un volume convenable signifie:
 qu'il est suffisant pour permettre d'obtenir une population offrant une activité de biodégradation suffisante;
 qu'il assure la dégradation du composé de référence au pourcentage stipulé (voir l'article 11);
2 5
 qu'il fournit entre 10 et 10 unités formant colonies par millilitre dans le mélange final;
 que la concentration des matières en suspension de la boue activée est normalement de 4 mg/l dans le mélange final
(des teneurs plus fortes, jusqu'à 30 mg/l, sont en général admises, mais peuvent influer de manière significative sur les
productions de CO dans les solutions à blanc, et sont en conséquence peu recommandées);
2
 qu’il convient que la quantité de carbone organique dissous apportée par l'inoculum soit inférieure à 10 % de la
concentration initiale en carbone organique introduite par le composé à analyser;
 qu'en général 1 ml à 10 ml d'inoculum suffisent pour une solution d'essai de 1 000 ml.
6

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8.2.2 Inoculum provenant d'une usine de traitement des boues activées
Prélever les boues activées dans le bassin d'aération d'une station de traitement des eaux usées ou d'un
laboratoire, traitant principalement des eaux usées domestiques. Éliminer si nécessaire les grosses particules par
2
filtration sur un tamis (ayant, par exemple, une ouverture de maille de 1 mm ) et conserver ensuite la boue dans
des conditions aérobies. Étant donné la nécessité pour le blanc de l'inoculum de présenter une production de CO
2
aussi faible que possible, la boue peut nécessiter un traitement supplémentaire. Par exemple, décanter ou
– 2
centrifuger la boue (par exemple à 10 800 m�s pendant 10 min), éliminer le surnageant, remettre en suspension
les matières décantées ou centrifugées dans le milieu d'essai (6.2.2) afin d'obtenir une concentration en matières
en suspension d'environ 3 g/l (voir par exemple l'ISO 11923). De manière alternative ou complémentaire, aérer la
boue pendant une nuit avant de l'utiliser. Pour réduire encore davantage la valeur du blanc, la boue peut, avant
utilisation, être préconditionnée aux conditions d'essai en la diluant dans le milieu d'essai (6.2.2) afin d'obtenir la
concentration finale et en l'aérant avec de l'air humide pendant une semaine au maximum à la température de
l'essai. Utiliser un inoculum apportant 4 mg/l de matières sèches en suspension dans le mélange final d'essai (voir
la note 2 en 8.2.1).
8.2.3 Inoculum provenant d'eaux usées
Prélever un échantillon dans l'affluent ou dans l'effluent d'une usine de traitement des eaux usées ou d'un
laboratoire traitant principalement des eaux usées domestiques. Conserver cet échantillon dans des conditions
aérobies et l'utiliser le jour du prélèvement (ou du préconditionnement, le cas échéant). Filtrer grossièrement
l'effluent afin d'en éliminer les grosses particules et mesurer son pH. Avant utilisation, faire passer dans le filtrat de
l'air exempt de CO (7.9) pendant environ 1 h, tout en maintenant le pH à 6,5 à l'aide d'acide orthophosphorique
2
(6.3), ramener le pH à sa valeur d'origine, puis laisser l'échantillon décanter pendant 1 h. Prélever ensuite dans le
surnageant un volume convenable pour inoculation.
NOTE Ce mode opératoire d'aération réduit la teneur en CIT présent dans l'inoculum. Par exemple, lorsque le maximum
des 100 ml d'effluent filtré par litre de volume d'essai est utilisé comme inoculum, il convient que la quantité de CIT produite en
28 jours dans les récipients à blanc soit de 0,4 mg/l à 1,3 mg/l (voir l'annexe D, référence [9]). Les valeurs de CIT dans les
blancs peuvent varier selon l'inoculum utilisé.
8.2.4 Inoculum provenant d'une eau de surface
Prélever un échantillon dans une eau de surface appropriée. Conserver l'échantillon dans des conditions aérobies
et l'utiliser le jour du prélèvement. Si nécessaire, concentrer l'échantillon par filtration ou centrifugation. Utiliser un
volume convenable comme inoculum.
8.3 Mode opératoire d'essai
8.3.1  Prévoir un nombre suffisant de récipients d'essai (7.2) pour avoir:
 des récipients d'essai (nommés F ) destinés au composé à analyser (8.1.1);
T
 des récipients pour essai à blanc (nommés F ) contenant le milieu d'essai et l'inoculum;
B
 des récipients destinés à vérifier le mode opératoire (nommés F ) contenant le composé de référence (8.1.2);
C
 le cas échéant, des récipients destinés à mettre en évidence un éventuel effet inhibiteur du composé à
analyser (nommés F );
I
 le cas échéant, des récipients destinés à mettre en évidence une éventuelle élimination abiotique (nommés
F ), contenant le composé à analyser mais sans inoculum, stérilisé à l'autoclave ou par ajout d'un composé
S
inorganique toxique approprié afin d'empêcher toute activité microbienne. Utiliser, par exemple, 5 ml/l d'une
solution contenant 10 g/l de chlorure de mercure(II) (HgCl ). Ajouter la même quantité de substance toxique
2
deux semaines après le début de l'essai.
Dans des flacons en verre de grande capacité (7.5), procéder aux additions indiquées dans le Tableau 1.
7

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Le nombre de récipients nécessaires est fonction de la fréquence de l'analyse et des limites de confiance requises
pour le pourcentage final de biodégradation (voir l'annexe B). Généralement, au moins cinq séries de récipients F ,
T
F et F sont analysées à la fin de l'essai.
B C
Tableau 1 — Répartition finale du composé à analyser et du composé de référence dans les récipients
d’essai
Composé Composé
Milieu d'essai Inoculum
Récipient à analyser de référence
(6.2.2) (8.2)
(8.1.1) (8.1.2)
+
F Composé à analyser + 2 mg/l à 40 mg/l —+
T
de COT
F Témoin à blanc + — — +
B
+
F Témoin de l'inoculum + — +
C
20 mg/l de COT
F Témoin de l’élimination + +
S
stérilisé 2 mg/l à 40 mg/l ——
abiotique (facultatif)
de COT
+ +
F Témoin d'inhibition (facultatif) + 2 mg/l à 40 mg/l 20 mg/l de COT
+
I
de COT
8.3.2  Tour à tour, mélanger soigneusement les contenus de chacun des flacons (7.5) et verser des aliquotes
appropriées (par exemple 100 ml) dans les récipients d'essai étiquetés (7.2). Ajouter directement dans les
récipients d'essai les composés à analyser solubles dans l'eau à partir des solutions mères et les composés à
analyser peu solubles dans l'eau (voir 8.1.1). Ajouter de l'eau pour obtenir le même volume dans chaque récipient.
Veiller à ce que le rapport du volume liquide au volume de l’espace de tête ainsi que la concentration en composé à
analyser soient tels que la quantité d'oxygène disponible dans l'espace de tête soit suffisante pour permettre une
biodégradation complète (éviter par exemple une forte concentration en substrat et un petit espace de tête).
Généralement, le rapport des volumes espace de tête/liquide est de 1:2.
Une fois toutes les additions faites, fermer hermétiquement chaque récipient au moyen, par exemple, d'un septum
en caoutchouc butyle et d'une capsule d'aluminium. Placer les récipients sur un agitateur orbital à l'abri de la
lumière ou sous lumière diffuse à la température de l'essai (voir l'article 5) et mettre l'agitateur en marche à une
vitesse suffisante pour assurer un mélange homogène du contenu de chaque récipient (par exemple de 150 tr/min
à 200 tr/min).
Les jours où une analyse est prévue, étalonner l'analyseur de carbone (7.1) comme requis (voir 8.4). Utiliser de
nouveaux récipients pour analyse le jour de l'échantillonnage, au moins une fois par semaine ou plus si une courbe
de dégradation complète est demandée. Sortir de l'agitateur le nombre requis de réplicats représentant F , F , F
T B C
et, le cas échéant, F et F . L'essai doit normalement durer 28 jours mais peut être prolongé si le processus de
I S
biodégradation a commencé. L'essai peut être arrêté avant la fin de la période de 28 jours si le processus de
biodégradation a atteint un plateau.
8.4 Détermination du carbone inorganique total (CIT)
8.4.1 Généralités
Il existe deux méthodes pour mesurer la quantité de CIT produite pendant l'essai. Ces méthodes peuvent donner
des résultats présentant de légères différences. En conséquence, il est recommandé d'en choisir une seule et de
ne pas en changer pendant toute la durée de l'essai.
8

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8.4.2 Acidification à pH ,, 3
Étalonner l'analyseur de carbone (7.1) à l'aide d'étalons appropriés (par exemple fraction massique de 1 % de CO
2
dans N ). Injecter à travers le septum de chaque récipient d'essai de l'acide orthophosphorique concentré (6.3)
2
pour réduire le pH du milieu à une valeur inférieure à 3 (ajouter par exemple 1 ml à 100 ml de milieu d'essai).
Replacer les récipients sur l'agit
...