ISO 5667-16:2017

Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples

ISO 5667-16:2017 gives practical guidance on sampling, pre-treatment, performance and evaluation of environmental samples in the context of performing biological tests. Information is given on how to cope with the problems of biotesting arising from the sample and the suitability of the test design. It is intended to convey practical experience concerning precautions to be taken by describing methods successfully proven to solve or to circumvent some of the experimental problems of biotesting of, for example, waters. Primarily dealt with are substance-related problems concerning sampling and pre-treatment of environmental samples (e.g. waste water samples) for the performance of biotests. This guidance is on ecotoxicological testing with organisms (single-species biotests; in vivo and in vitro). Some features addressed in this document also apply to biotests using single-cell systems (in vitro bioassays) and biodegradation studies as far as sampling and sample preparations are concerned. Testing of substances in the water solubility range is also addressed. Reference has been made as far as possible to existing International Standards and guidelines. Information taken from published papers or oral communication has been utilized as well. ISO 5667-16:2017 is applicable to biological tests for determining the effect of environmental samples like treated communal and industrial waste water, groundwater, fresh water, aqueous extracts (e.g. leachates, eluates), pore water of sediments and whole sediments. This document is also applicable to chemical substances. ISO 5667-16:2017 is not applicable to bacteriological examination of water. Appropriate methods for bacteriological examination are described in other documents (see ISO 19458[17]).

Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des échantillons

ISO 5667-16:2017 fournit des lignes directrices pour l'échantillonnage, le prétraitement, la mise en ?uvre et l'évaluation des échantillons environnementaux dans le cadre de la réalisation d'essais biologiques. Des informations sont données sur la manière de traiter les problèmes, pour les essais biologiques, liés à l'échantillon et à l'adaptation du dispositif expérimental. Elles sont destinées à diffuser une expérience pratique concernant les précautions à prendre en décrivant des méthodes qui se sont révélées satisfaisantes pour résoudre ou éliminer certains problèmes expérimentaux au cours des essais biologiques des eaux, par exemple. ISO 5667-16:2017 traite en premier lieu des problèmes liés aux substances en ce qui concerne l'échantillonnage et le prétraitement des échantillons environnementaux (par exemple échantillons d'eaux résiduaires) pour la réalisation d'essais biologiques. Ces lignes directrices portent sur les essais écotoxicologiques réalisés avec des organismes (essais biologiques monospécifiques; in vivo et in vitro). Certaines caractéristiques traitées dans le présent document s'appliquent également à l'échantillonnage et la préparation d'échantillons pour les essais biologiques utilisant des systèmes unicellulaires (essais biologiques in vitro) et les études de biodégradation. Les essais sur substances dans la gamme de solubilité dans l'eau sont également traités. Il a été fait référence aux Normes internationales et aux directives existantes dans toute la mesure du possible. Des informations provenant de publications ou de communications orales ont également été utilisées. ISO 5667-16:2017 s'applique aux essais biologiques destinés à déterminer l'effet des échantillons environnementaux tels que les eaux résiduaires communales et industrielles traitées, les eaux souterraines, les eaux douces, les extraits aqueux (par exemple lixiviats et éluats), l'eau interstitielle des sédiments et les sédiments entiers. Il s'applique également aux substances chimiques. ISO 5667-16:2017 n'est pas applicable à l'examen bactériologique des eaux. Des méthodes appropriées pour l'examen bactériologique sont décrites dans d'autres documents (voir l'ISO 19458[17]).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 11-Apr-2017
• ICS: 13.060.45 - Examination of water in general
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 6 - Sampling (general methods)
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 6 - Sampling (general methods)
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 13-Sep-2022

Relations

• Revises: ISO 5667-16:1998 - Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
• Effective Date: 14-Dec-2013

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5667-16
Second edition
2017-04
Water quality — Sampling —
Part 16:
Guidance on biotesting of samples
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons
Reference number
ISO 5667-16:2017(E)
ISO 2017
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ISO 5667-16:2017(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland

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ISO 5667-16:2017(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 General guidance regarding test design ....................................................................................................................................... 5

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 5

4.2 Replicates ..................................................................................................................................................................................................... 5

4.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 5

4.2.2 Lowest ineffective dilution (LID) ....................................................................................................................... 5

4.2.3 Hypothesis testing — two-sample comparisons ................................................................................. 6

4.2.4 Concentration and dilution response relationship ............................................................................ 6

5 Evaluation .................................................................................................................................................................................................................... 7

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

5.2 Statistical analysis ................................................................................................................................................................................ 7

6 Sampling and transportation .................................................................................................................................................................. 7

6.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

6.2 Sampling equipment .......................................................................................................................................................................... 8

6.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 8

6.2.2 Sample container ............................................................................................................................................................. 8

6.3 Filling status of sample containers ........................................................................................................................................ 9

6.4 Sample identification and records ......................................................................................................................................... 9

6.5 Sub-sampling ............................................................................................................................................................................................ 9

6.6 Transportation .....................................................................................................................................................................................10

6.7 Contamination during sampling ...........................................................................................................................................10

6.8 Sampling quality control techniques ................................................................................................................................10

7 Pre-treatment .......................................................................................................................................................................................................11

7.1 General ........................................................................................................................................................................................................11

7.2 Preservation and storage ............................................................................................................................................................11

7.3 Thawing .....................................................................................................................................................................................................12

7.4 Homogenization ..................................................................................................................................................................................12

7.5 Separation of soluble and particulate matter ............................................................................................................12

7.6 Preconcentration ................................................................................................................................................................................13

7.6.1 General...................................................................................................................................................................................13

7.6.2 Extraction methods ....................................................................................................................................................14

7.7 pH adjustment ......................................................................................................................................................................................14

8 Apparatus and equipment .......................................................................................................................................................................14

8.1 Selection of apparatus ...................................................................................................................................................................14

8.2 Cleaning of apparatus and equipment .............................................................................................................................15

9 Impairment of test performance ......................................................................................................................................................15

9.1 Problems and preventive measures for samples containing removable ingredients .............15

9.1.1 General...................................................................................................................................................................................15

9.1.2 Volatilization ...................................................................... ...............................................................................................16

9.1.3 Foaming ................................................................................................................................................................................16

9.1.4 Adsorption .................. .................................................... ....................................................................................................16

9.1.5 Precipitation/flocculation ....................................................................................................................................16

9.1.6 Degradation .......................................................................................................................................................................16

9.2 Problems and preventive measures concerning coloured and/or turbid samples ..................17

10 Preparation of stock solutions and test batches ..............................................................................................................17

10.1 Water-soluble substances ..........................................................................................................................................................17

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ISO 5667-16:2017(E)

10.2 Poorly soluble substances ..........................................................................................................................................................17

10.2.1 General...................................................................................................................................................................................17

10.2.2 Testing in the water solubility range ...........................................................................................................17

10.2.3 Dispersions and emulsions ..................................................................................................................................18

10.2.4 Special problems with mixtures of substances or technical products ...........................18

10.2.5 Limit test ..............................................................................................................................................................................19

11 Quality assurance for biotesting .......................................................................................................................................................19

11.1 General ........................................................................................................................................................................................................19

11.2 Quality assurance in the context of the investigation of environmental samples .....................19

12 Reporting ...................................................................................................................................................................................................................20

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................23

iv © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 5667-16:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.

This document was prepared by ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 6, Sampling (general

methods).

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 5667-16:1998), which has been technically

revised.
A list of all parts in the ISO 5667 series can be found on the ISO website.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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ISO 5667-16:2017(E)
Introduction

Biological tests are suitable for determining the effect of environmental samples or chemical substances

on the respective test organism under the specific standardized test conditions. Environmental samples

are e.g. treated communal and industrial waste water, fresh water, aqueous extracts of solid material

(e.g. leachates, eluates), pore water of sediments. The effect can be stimulative or inhibiting, and can be

determined by the reaction of the test organism (e.g. death, growth, morphological and physiological

changes or generally, changes in molecular mechanisms of action). Inhibiting effects can be triggered

by toxic water constituents or by other noxious influences.

The toxicity measurable in the biological test is the result of the interaction between a single toxic

substance, a mixture of substances or the constituents of an environmental sample and the test

organism. The protective potential of the biological system, i.e. the test organism, for instance by

metabolic detoxification and excretion, is an integral part of the biological test.

Apart from the direct toxic effect of one or more sample constituents, biological effects can be exerted

by the combined action of all constituents of a sample. Such a combined effect includes the impact of, for

example, substances which are not toxic per se but affect the chemical or physical properties of the test

batches by interfering with the test specific additives (e.g. nutrients, salts) and, consequently, the living

conditions for the test organisms. This applies for instance to oxygen-depleting substances, coloured

substances or turbid matter which reduce light exposure.

Biological tests also include those tests which examine the effect of organisms on substances (e.g.

microbial degradation studies).

The results of the biological test refer primarily to the organism used in the test and the defined

conditions stipulated for the test procedure. A harmful effect stated by means of standardized biological

tests can justify concern that aquatic organisms and biocoenosis might be endangered. The results,

however, do not permit direct or extrapolative conclusions as to the occurrence of similar effects in

the aquatic environment. This applies in particular to suborganismic tests, as important properties

and physiological functions of intact organisms (e.g. protective integuments, repair mechanisms) are

removed or deactivated.

In principle there is no test organism which can be used to test all the effects on the biocoenosis or

the ecosystem possible under the various combinations of abiotic and biotic conditions. Only a few

(“model”) species representing relevant ecological functions can be tested in practice.

Besides these fundamental and practical limitations in the selection of test organisms some issues

should be taken into account during sampling and sample treatment in order to avoid a change in the

sample properties. This applies to the method of sampling, including the sampling equipment and

sample container as well as the transport to the laboratory. The method of sample pre-treatment and

storage, as well as the preparation of, for example, stock solutions, may have an influence on the test

result as well.

Furthermore, the sample to be tested can pose experimental problems on biotesting. Environmental

samples (e.g. waste water, eluates) are complex mixtures and may contain, for example, sparingly

soluble, volatile, unstable, coloured substances or suspended, sometimes colloidal, particles. The

complexity and heterogeneity of materials give rise to a variety of experimental problems when

performing biotests.

Special problems are related to the instability of the test material due to reactions and processes such as

— physical (e.g. phase separation, sedimentation, volatilization),
— chemical (e.g. hydrolysis, photodegradation, precipitation), and/or

— biological (e.g. biodegradation, biotransformation, biological uptake in organisms).

Other problems, especially if spectrometric measurements are applied, relate to turbidity and colour of

the test batch.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 5667-16:2017(E)

The statistical analysis of the data from biological testing of environmental samples should be

conducted according to the current state of the art if not stipulated by the specific biotest standard.

Finally, it is recommended to implement and maintain a quality management system regardless if a

laboratory is involved in testing of substances or environmental samples.

This document is one of a group of International Standards dealing with the sampling of waters and

sediments and is intended to be read in conjunction with the other parts of the ISO 5667 series, in

particular with ISO 5667-1, ISO 5667-3 and ISO 5667-15.
© ISO 2017 – All rights reserved vii
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 5667-16:2017(E)
Water quality — Sampling —
Part 16:
Guidance on biotesting of samples
1 Scope

This document gives practical guidance on sampling, pre-treatment, performance and evaluation of

environmental samples in the context of performing biological tests. Information is given on how to

cope with the problems of biotesting arising from the sample and the suitability of the test design.

It is intended to convey practical experience concerning precautions to be taken by describing methods

successfully proven to solve or to circumvent some of the experimental problems of biotesting of, for

example, waters.

Primarily dealt with are substance-related problems concerning sampling and pre-treatment of

environmental samples (e.g. waste water samples) for the performance of biotests.

This guidance is on ecotoxicological testing with organisms (single-species biotests; in vivo and in

vitro). Some features addressed in this document also apply to biotests using single-cell systems (in

vitro bioassays) and biodegradation studies as far as sampling and sample preparations are concerned.

Testing of substances in the water solubility range is also addressed.

Reference has been made as far as possible to existing International Standards and guidelines.

Information taken from published papers or oral communication has been utilized as well.

This document is applicable to biological tests for determining the effect of environmental samples

like treated communal and industrial waste water, groundwater, fresh water, aqueous extracts (e.g.

leachates, eluates), pore water of sediments and whole sediments. This document is also applicable to

chemical substances.

This document is not applicable to bacteriological examination of water. Appropriate methods for

[17]
bacteriological examination are described in other documents (see ISO 19458 ).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
blank
mixture of water and nutrients without test organism
© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 5667-16:2017(E)
3.2
cell density
number of cells per unit volume of medium
Note 1 to entry: Cell density is expressed in cells per millilitre.
[6]
[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.1]
3.3
control

control medium (3.4), or control sediment (3.5), including organisms used in the test, without test sample

3.4
control medium
combination of dilution water and/or nutrient medium used in the test
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.6]
3.5
control sediment
defined artificial or natural sediment used in the test
3.6
dilution level

reciprocal value of the volume fraction of test sample in dilution water (3.7) in which the test is

conducted

EXAMPLE 250 ml of waste water in a total volume of 1 000 ml (volume fraction of 25 %) represents dilution

level D = 4.
[13]

[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.2, modified — “waste water” replaced by “test sample”]

3.7
dilution water
water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions

Note 1 to entry: The composition of the water is specified in the respective standard.

[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7, modified — “Note 1 to entry” has been added]
3.8
effective concentration

concentration of the test material in water or sediment that causes x % change in response during a

specified time interval

[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.8.1, modified — “quantal” has been removed from the term and

abbreviated term; “soil” and “(e.g. immobility)” have been removed from the definition; the EXAMPLE

[20]
and Notes 1 and 2 to entry are not included]
3.9
field blank

container prepared in the laboratory using reagent water or other blank matrix and sent with the

sampling personnel for exposure to the sampling environment to verify possible contamination during

sampling
[9]
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
2 © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 5667-16:2017(E)
3.10
growth rate
proportional rate of increase in biomass per unit of time: (1/day)

[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.2, modified — “specific grow rate” replaced by “growth rate”; formula and

[6]
Note 1 to entry not included]
3.11
lowest ineffective dilution
dilution factor
LID

lowest ineffective dilution tested, expressed as dilution level D (3.6), at which no inhibition, or only

effects not exceeding the test-specific variability, are observed
[13]
[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.5]
3.12
nutrient medium

solution of nutrients and micronutrients in water which are essential for the growth of the test organism

[18]

[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.17, modified — “duckweed” replaced by “the test organism”]

3.13
positive control

well-characterized reference substance (3.14) that, when evaluated by a specific test method,

demonstrates the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriately positive or reactive

response in the test system

[SOURCE: ISO 10993-12:2010, 3.14, modified — “any” removed before “well-characterized”; “material

[8]
and/or substance, which” replaced by “reference substance that”
3.14
reference substance
known substance to verify the sensitivity of the method
3.15
reference batch

mixture of dilution water, test specific additives and reference substance, including test organisms

3.16
replicate

one of a selected number of identical test batches (3.24) or identical reference batches (3.15)

3.17
sample
portion of material selected from a large quantity of material

Note 1 to entry: The method of sample selection can be described in the sampling plan.

Note 2 to entry: The material is from the environment (e.g. waste water, sediment or an eluate), a chemical

substance or preparation or related material.
[15]

[SOURCE: ISO 16133:2004, 2.11, modified — Notes 1 and 2 to entry have been added]

3.18
sample pre-treatment

collective noun for all procedures used for conditioning a sample to a defined state which allows

subsequent examination

Note 1 to entry: Depending on the requirements of the method sample, pre-treatment includes for example

preservation and storage, centrifugation, filtration, homogenization, preconcentration and pH adjustment.

© ISO 2017 – All rights reserved 3
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ISO 5667-16:2017(E)
3.19
sample storage

process, and the result, of keeping a sample available under predefined conditions for a (usually)

specified time interval between collection and further treatment of a sample
Note 1 to entry: Specified time is the maximum time interval.
[2]
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.3]
3.20
stock culture

culture of a single species to conserve the original defined species in the laboratory

[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.21, modified — deleted “duckweed”, “Lemna” “and to provide inoculum for

[18]
the pre-culture”]
3.21
stock solution

solution with accurately known analyte concentration(s), prepared from chemicals with an

appropriate purity
[10]
[SOURCE: ISO 11885:2007, 3.23]
3.22
storage time

period of time between filling of the sample container and further treatment of the sample in the

laboratory, if stored under predefined conditions

Note 1 to entry: Sampling finishes as soon as the sample container has been filled with the sample. Storage time

ends when the sample is taken by the analyst to start sample preparation prior to analysis.

[2]
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.4, modified — Note 2 to entry not included]
3.23
sub-sample
representative portion removed from a sample
[5]
[SOURCE: ISO 5667-19:2004, 3.7]
3.24
test batch
test medium including organisms used for testing
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.22]
3.25
test medium

mixture of test sample or test substance, dilution water and nutrients (without test organisms)

[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.23, modified “combination” replaced by “mixture”, after test sample added

“or test substance”, deleted “/or”, “nutrient medium used in the test” replaced by “nutrients (without

[18]
test organisms)”]
3.26
test sample
sample to be tested, after finishing all preparations

EXAMPLE Preparations include centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and measurement

of conductivity.
[11]
[SOURCE: ISO 13829:2000, 3.7]
4 © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 5667-16:2017(E)
3.27
test substance
chemical substance under investigation added to the test system
[14]
[SOURCE: ISO 15473:2002, 3.10]
3.28
test material
material to be tested
[16]
[SOURCE: ISO 17126:2005, 3.3, modified — EXAMPLES removed]
4 General guidance regarding test design
4.1 General

For each test, several replicates of the control and the treatment groups should be examined. The

minimum number of replicates is usually prescribed in the respective standard. An example of how the

required number of observations (replicates) can be calculated is given in 4.2.3.

It is recommended to minimize the influence of differences in testing conditions (e.g. light, temperature)

for example by randomizing the design for location of the test vessels in the test chamber.

To assure that the laboratory test conditions (including the condition and sensitivity of the test

organisms) are adequate and have not changed significantly, a reference substance should be tested as

a positive control.
4.2 Replicates
4.2.1 General

Mainly three statistical approaches are performed in statistical analysis of the results from ecotoxicity

tests with environmental samples.
a) determining the lowest i
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 5667-16
Deuxième édition
2017-04
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16:
Lignes directrices pour les essais
biologiques des échantillons
Water quality — Sampling —
Part 16: Guidance on biotesting of samples
Numéro de référence
ISO 5667-16:2017(F)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 5667-16:2017(F)
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© ISO 2017, Publié en Suisse

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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 5667-16:2017(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Lignes directrices relatives au dispositif expérimental .............................................................................................. 5

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 5

4.2 Réplicats ....................................................................................................................................................................................................... 5

4.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 5

4.2.2 Plus faible dilution sans effet (DMSE) ........................................................................................................... 6

4.2.3 Tests d’hypothèses — comparaisons de deux échantillons ........................................................ 6

4.2.4 Relation concentration/effet et dilution/effet ....................................................................................... 7

5 Évaluation .................................................................................................................................................................................................................... 7

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 7

5.2 Analyse statistique ............................................................................................................................................................................... 8

6 Échantillonnage et transport ................................................................................................................................................................... 8

6.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 8

6.2 Matériel d’échantillonnage ........................................................................................................................................................... 9

6.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9

6.2.2 Récipient pour échantillons ................................................................................................................................... 9

6.3 Condition de remplissage des récipients pour échantillons.........................................................................10

6.4 Identification et enregistrement des échantillons ................................................................................................10

6.5 Sous-échantillonnage .....................................................................................................................................................................10

6.6 Transport ..................................................................................................................................................................................................11

6.7 Contamination en cours d’échantillonnage ................................................................................................................11

6.8 Techniques de contrôle qualité de l’échantillonnage..........................................................................................11

7 Prétraitement .......................................................................................................................................................................................................12

7.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................12

7.2 Préservation et conservation ...................................................................................................................................................12

7.3 Décongélation .......................................................................................................................................................................................13

7.4 Homogénéisation ...............................................................................................................................................................................13

7.5 Séparation des matières solubles et particulaires ................................................................................................13

7.6 Préconcentration ................................................................................................................................................................................14

7.6.1 Généralités .........................................................................................................................................................................14

7.6.2 Méthodes d’extraction .............................................................................................................................................15

7.7 Ajustement du pH ..............................................................................................................................................................................15

8 Matériel et équipements ...........................................................................................................................................................................16

8.1 Choix du matériel ...............................................................................................................................................................................16

8.2 Nettoyage du matériel et des équipements .................................................................................................................16

9 Détérioration des performances lors de la réalisation de l’essai...................................................................17

9.1 Problèmes et mesures préventives concernant les échantillons contenant des

ingrédients susceptibles d’être éliminés .......................................................................................................................17

9.1.1 Généralités .........................................................................................................................................................................17

9.1.2 Volatilisation .....................................................................................................................................................................17

9.1.3 Moussage .............................................................................................................................................................................18

9.1.4 Adsorption .................. .................................................... ....................................................................................................18

9.1.5 Précipitation/floculation .......................................................................................................................................18

9.1.6 Dégradation .......................................................................................................................................................................18

9.2 Problèmes et mesures préventives concernant les échantillons colorés et/ou turbides ....18

10 Préparation de solutions mères et de lots d’essai ..........................................................................................................19

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ISO 5667-16:2017(F)

10.1 Substances solubles dans l’eau ..............................................................................................................................................19

10.2 Substances faiblement solubles ............................................................................................................................................19

10.2.1 Généralités .........................................................................................................................................................................19

10.2.2 Essai dans la gamme de solubilité dans l’eau .......................................................................................19

10.2.3 Dispersions et émulsions ......................................................................................................................................20

10.2.4 Problèmes spécifiques aux mélanges de substances ou de produits techniques .20

10.2.5 Essai limite .........................................................................................................................................................................21

11 Assurance qualité pour les essais biologiques ...................................................................................................................21

11.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................21

11.2 Assurance qualité dans le contexte de l’analyse des échantillons environnementaux ......... .22

12 Rapport........................................................................................................................................................................................................................22

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................26

iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 5667-16:2017(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 6, Échantillonnage (méthodes générales).

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 5667-16:1998), qui a fait l’objet

d’une révision technique.

Une liste de toutes les parties de la série de normes ISO 5667 est disponible sur le site Internet de l’ISO.

© ISO 2017 – Tous droits réservés v
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ISO 5667-16:2017(F)
Introduction

Les essais biologiques sont appropriés pour la détermination des effets d’échantillons environnementaux

ou les substances chimiques sur l’organisme d’essai dans des conditions d’essai normalisées spécifiées.

Les échantillons environnementaux sont, par exemple, les eaux résiduaires communales et industrielles

traitées, les eaux douces, les extraits aqueux (par exemple lixiviats et éluats) de matières solides,

l’eau interstitielle des sédiments. Les effets peuvent être la stimulation ou l’inhibition et peuvent

être déterminés par la réaction de l’organisme d’essai (par exemple mort, croissance, modifications

morphologiques et physiologiques ou, de manière générale, modifications dans les mécanismes d’action

moléculaires). Les effets d’inhibition peuvent être déclenchés par des constituants toxiques de l’eau ou

par d’autres influences nocives.

La toxicité mesurable au cours de l’essai biologique est le résultat de l’interaction entre une substance

toxique unique, un mélange de substances ou les constituants d’un échantillon environnemental et

l’organisme d’essai. Le potentiel de protection du système biologique, à savoir l’organisme d’essai, par

exemple par détoxication métabolique et excrétion, fait partie intégrante de l’essai biologique.

Hormis les effets toxiques directs d’un ou plusieurs constituants de l’échantillon, des effets biologiques

peuvent se produire par l’action combinée de tous les constituants d’un échantillon. Ces effets combinés

incluent l’impact, par exemple, de substances non toxiques en elles-mêmes, mais qui affectent les

propriétés chimiques ou physiques des lots d’essai en interférant avec les additifs spécifiques de l’essai

(par exemple nutriments, sels) et, par conséquent, les conditions de vie des organismes d’essai. Ceci

s’applique par exemple aux substances consommant l’oxygène, aux substances colorées ou aux matières

turbides qui réduisent l’exposition à la lumière.

Les essais biologiques comprennent également les essais qui étudient l’effet des organismes sur les

substances (par exemple les études de dégradation microbienne).

Les résultats de l’essai biologique font principalement référence à l’organisme utilisé pour l’essai et aux

conditions définies stipulées pour le mode opératoire. Un effet nocif établi au moyen d’essais biologiques

normalisés peut renseigner sur un danger potentiel pour les organismes et les biocénoses aquatiques.

Cependant, les résultats ne permettent pas de tirer des conclusions directes ou d’extrapolation en ce

qui concerne la présence d’effets similaires dans le milieu aquatique. Ceci s’applique en particulier

aux essais suborganismiques, dans la mesure où des propriétés et des fonctions physiologiques

importantes des organismes entiers (par exemple téguments protecteurs, mécanismes de réparation)

sont supprimées ou désactivées.

En principe, aucun organisme d’essai ne peut être utilisé pour évaluer tous les effets possibles sur

la biocénose ou l’écosystème dans les diverses combinaisons de conditions abiotiques et biotiques

possibles. Seules quelques espèces («modèles») représentant les fonctions écologiques majeures

peuvent en pratique être soumises à essai.

Outre ces limitations fondamentales et pratiques dans la sélection des organismes d’essai, il convient

de tenir compte de certains problèmes au cours de l’échantillonnage et du traitement des échantillons,

afin d’éviter toute modification des propriétés de l’échantillon. Cela s’applique à la méthode

d’échantillonnage, y compris le matériel d’échantillonnage et le récipient, ainsi que le transport vers le

laboratoire. La méthode de prétraitement et de conservation de l’échantillon, ainsi que la préparation,

par exemple, de solutions mères, peuvent également avoir une influence sur le résultat de l’essai.

En outre, l’échantillon à soumettre à essai peut poser des problèmes d’expérimentation en matière

d’essai biologique. Les échantillons environnementaux (par exemple eaux résiduaires, éluats) sont des

mélanges complexes et peuvent contenir, par exemple, des substances difficilement solubles, volatiles,

instables, colorées ou des particules en suspension, parfois colloïdales. La complexité et l’hétérogénéité

des matériaux entraînent toute une variété de problèmes expérimentaux lors de la réalisation des

essais biologiques.
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ISO 5667-16:2017(F)

Des problèmes spécifiques sont liés à l’instabilité du matériau soumis à essai en raison des réactions et

des procédés, tels que ceux de nature:
— physique (par exemple séparation de phases, sédimentation, volatilisation);
— chimique (par exemple hydrolyse, photodégradation, précipitation); et/ou

— biologique (par exemple biodégradation, biotransformation, capacité d’absorption biologique dans

les organismes).

D’autres problèmes, particulièrement en cas d’application de mesures spectrométriques, sont liés à la

turbidité et à la couleur du lot d’essai.

Il convient de procéder à l’analyse statistique des données issues des essais biologiques concernant les

échantillons environnementaux en fonction de l’état actuel de la technique, sauf indication contraire

dans la norme spécifique relative aux essais biologiques.

Pour finir, il est recommandé de mettre en œuvre et de maintenir un système de management de

la qualité, qu’un laboratoire prenne part ou non à des essais sur des substances ou des échantillons

environnementaux.

Le présent document fait partie d’un groupe de Normes internationales relatives à l’échantillonnage des

eaux et sédiments et est destiné à être lu conjointement avec les autres parties de la série de normes

ISO 5667, en particulier avec l’ISO 5667-1, l’ISO 5667-3 et l’ISO 5667-15.
© ISO 2017 – Tous droits réservés vii
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NORME INTERNATIONALE ISO 5667-16:2017(F)
Qualité de l’eau — Échantillonnage —
Partie 16:
Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons
1 Domaine d’application

Le présent document fournit des lignes directrices pour l’échantillonnage, le prétraitement, la mise

en œuvre et l’évaluation des échantillons environnementaux dans le cadre de la réalisation d’essais

biologiques. Des informations sont données sur la manière de traiter les problèmes, pour les essais

biologiques, liés à l’échantillon et à l’adaptation du dispositif expérimental.

Elles sont destinées à diffuser une expérience pratique concernant les précautions à prendre en

décrivant des méthodes qui se sont révélées satisfaisantes pour résoudre ou éliminer certains

problèmes expérimentaux au cours des essais biologiques des eaux, par exemple.

Le présent document traite en premier lieu des problèmes liés aux substances en ce qui concerne

l’échantillonnage et le prétraitement des échantillons environnementaux (par exemple échantillons

d’eaux résiduaires) pour la réalisation d’essais biologiques.

Ces lignes directrices portent sur les essais écotoxicologiques réalisés avec des organismes (essais

biologiques monospécifiques; in vivo et in vitro). Certaines caractéristiques traitées dans le présent

document s’appliquent également à l’échantillonnage et la préparation d’échantillons pour les

essais biologiques utilisant des systèmes unicellulaires (essais biologiques in vitro) et les études de

biodégradation. Les essais sur substances dans la gamme de solubilité dans l’eau sont également traités.

Il a été fait référence aux Normes internationales et aux directives existantes dans toute la mesure du

possible. Des informations provenant de publications ou de communications orales ont également été

utilisées.

Le présent document s’applique aux essais biologiques destinés à déterminer l’effet des échantillons

environnementaux tels que les eaux résiduaires communales et industrielles traitées, les eaux

souterraines, les eaux douces, les extraits aqueux (par exemple lixiviats et éluats), l’eau interstitielle

des sédiments et les sédiments entiers. Il s’applique également aux substances chimiques.

Le présent document n’est pas applicable à l’examen bactériologique des eaux. Des méthodes appropriées

[17]

pour l’examen bactériologique sont décrites dans d’autres documents (voir l’ISO 19458 ).

2 Références normatives
Il n’y a aucune référence normative dans le présent document.
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques, destinées à être utilisées pour la

normalisation, aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .

— Plateforme de consultation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.

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ISO 5667-16:2017(F)
3.1
blanc
mélange d’eau et de nutriments ne contenant pas d’organisme d’essai
3.2
densité cellulaire
nombre de cellules par unité de volume de milieu

Note 1 à l’article: La densité cellulaire est exprimée en cellules par millilitre.

[6]
[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.1]
3.3
témoin

milieu témoin (3.4) ou sédiment témoin (3.5), incluant les organismes utilisés dans le cadre de l’essai,

sans échantillon d’essai
3.4
milieu témoin
combinaison de l’eau de dilution et/ou du milieu nutritif utilisée pour l’essai
[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.6]
3.5
sédiment témoin
sédiment artificiel ou naturel défini utilisé au cours de l’essai
3.6
niveau de dilution

inverse de la valeur de la fraction volumique de l’échantillon soumis à essai dans l’eau de dilution (3.7)

dans laquelle l’essai est réalisé

EXEMPLE 250 ml d’eaux résiduaires dans un volume total de 1 000 ml (fraction volumique de 25 %)

représentent un niveau de dilution D = 4.

[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.2, modifié — la phrase « des eaux résiduaires dans l’eau de dilution dans

laquelle l’essai est réalisé » a été remplacée par la phrase « de l’échantillon soumis à essai dans l’eau de

[13]
dilution dans laquelle l’essai est réalisé »]
3.7
eau de dilution

eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions

Note 1 à l’article: La composition de l’eau est spécifiée dans la norme correspondante.

[18]
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7, modifié —Note 1 à l’article a été ajoutée]
3.8
concentration efficace

concentration du matériau soumis à essai dans l’eau ou le sédiment qui entraîne x % de variation de la

réponse sur un intervalle de temps spécifié

[SOURCE: ISO/TS 20281:2006, 3.8.1, modifié — le mot « quantique » a été supprimé du terme et du

terme abrégé ; « sol » et « (par exemple immobilité) » ont été supprimés de la définition ; l’EXEMPLE et

[20]
les Notes 1 et 2 à l’article ne sont pas incluses]
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 5667-16:2017(F)
3.9
blanc de terrain

récipient préparé dans le laboratoire utilisant de l’eau pure ou toute autre matrice de blanc et destiné

à être emporté par le personnel d’échantillonnage sur le terrain, pour être exposé à l’environnement

dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de

l’échantillonnage
[9]
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.10
taux de croissance
taux proportionnel de l’augmentation de la biomasse par unité de temps: (1/jour)

[SOURCE: ISO 10253:2016, 3.2, modifié — le mot « spécifique » a été supprimé du terme et du terme

abrégé ; la phrase « de la densité cellulaire » a été remplacée par la phrase « de la biomasse » dans la

[6]
définition ; la formule et la Note 1 à l’article ne sont pas incluses]
3.11
plus faible dilution sans effet
facteur de dilution
DMSE

niveau de dilution D (3.6) pour lequel aucune inhibition n’est observée ou bien uniquement des effets ne

dépassant pas la variabilité spécifique à l’essai
[13]
[SOURCE: ISO 15088:2007, 3.5]
3.12
milieu nutritif

solution aqueuse contenant les nutriments et les micronutriments essentiels pour la croissance de

l’organisme d’essai

[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.17, modifié — la phrase « des lentilles d’eau » a été remplacée par la phrase

[18]
« « de l’organisme d’essai »]
3.13
témoin positif

substance de référence (3.14) bien caractérisée, qui, soumise à essai conformément à une méthode

d’essai spécifique, démontre l’aptitude du système d’essai à conduire à une réponse reproductible,

judicieusement positive ou réactive vis-à-vis du système d’essai particulier

[SOURCE: ISO 10993-12:2012, 3.14, modifié — « matériau ou substance » a été remplacé par « substance

[8]
de référence »]
3.14
substance de référence
substance connue utilisée pour vérifier la sensibilité de la méthode
3.15
lot de référence

mélange d’eau de dilution, d’additifs spécifiques à l’essai et de substance de référence, incluant les

organismes d’essai
3.16
réplicat

un parmi un nombre sélectionné de lots d’essai (3.24) identiques ou de lots de référence (3.15) identiques

3.17
échantillon
quantité de matériau prélevée dans un volume plus important de matériau

Note 1 à l’article: La méthode de sélection des échantillons peut être décrite dans le plan d’échantillonnage.

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ISO 5667-16:2017(F)

Note 2 à l’article: Le matériau provient de l’environnement (par exemple eaux résiduaires, sédiment ou éluat),

d’une substance ou préparation chimique ou d’un matériau associé.
[15]

[SOURCE: ISO 16133:2004, 2.11, modifié — les Notes 1 et 2 à l’article ont été ajoutées]

3.18
prétraitement des échantillons

nom générique regroupant tous les modes opératoires utilisés pour le conditionnement d’un échantillon

afin de l’amener à un état défini permettant de le soumettre à un examen

Note 1 à l’article: Selon les exigences de la méthode, le prétraitement des échantillons inclut par exemple la

préservation et la conservation, la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, la préconcentration et

l’ajustement du pH.
3.19
conservation d’un échantillon

processus, et son résultat, consistant à garder un échantillon disponible dans des conditions prédéfinies,

pour un laps de temps (en général) déterminé entre le prélèvement et le traitement de cet échantillon

Note 1 à l’article: Le temps déterminé est le laps de temps maximal.
[2]
[SOURCE: ISO 5667-3:2012, 3.3]
3.20
culture mère

culture monospécifique destinée à conserver en laboratoire l’espèce définie d’origine

[SOURCE: IS
...