ISO 19040-3:2018
(Main)Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
This document specifies a method for the determination of the estrogenic potential of water and waste water by means of a reporter gene assay utilizing stably transfected human cells. This reporter gene assay is based on the activation of the human estrogen receptor alpha. This method is applicable to: — fresh water; — waste water; — aqueous extracts and leachates; — eluates of sediments (fresh water); — pore water; — aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures; — drinking water; — the limit of quantification (LOQ) of this method for the direct analysis of water samples is between 0,3 ng/l and 1 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ) based on the results of the international interlaboratory trial (see Annex F). The upper working range was evaluated [based on the results of the international interlaboratory trial (see Table F.3)] up to a level of 75 ng EEQ/l. Samples showing estrogenic potencies above this threshold have to be diluted for a valid quantification. Extraction and pre concentration of water samples can prove necessary if their estrogenic potential is below the given LOQ.
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel oestrogène de l'eau et des eaux résiduaires — Partie 3: Essai in vitro sur cellules humaines avec gène rapporteur
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l'eau et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur utilisant des cellules humaines transfectées de façon stable. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des œstrogènes humains alpha. Cette méthode est applicable: — aux eaux douces; — aux eaux résiduaires; — aux extraits aqueux et lixiviats; — aux éluats de sédiments (eau douce); — aux eaux interstitielles; — aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques; — à l’eau potable; — la limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est comprise entre 0,3 ng/l et 1 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de l’essai interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le domaine de mesure supérieur a été évalué [sur la base des résultats de l’essai interlaboratoires international (voir le Tableau F.3)] jusqu’à un niveau de 75 ng d’EEQ/l. Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19040-3
First edition
2018-08
Water quality — Determination of
the estrogenic potential of water and
waste water —
Part 3: In vitro human cell-based
reporter gene assay
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel oestrogène de l'eau et
des eaux résiduaires —
Partie 3: Essai in vitro sur cellules humaines avec gène rapporteur
Reference number
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Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Interferences . 4
5 Principle . 4
6 Apparatus and materials. 4
7 Reagents, cells and media . 5
8 Sampling and samples . 9
8.1 General . 9
8.2 Bottles and material for sampling . 9
8.3 Bottles and material pre-cleaning . 9
8.4 Sampling procedure . 9
8.5 Transport of samples . 9
8.6 Pretreatment of sample .10
8.7 Storage of samples .10
9 Procedure.10
9.1 Cell culture maintenance .10
9.1.1 Freezing cells .10
9.1.2 Starting a new cell culture .10
9.1.3 Culturing cells .11
9.2 Human cell reporter gene assay test procedure .11
9.2.1 Seeding the cells (day 1) .11
9.2.2 Preparation of the E2-reference (day 2) .11
9.2.3 Preparation of the sample dilutions (day 2) .12
9.2.4 Field blank .12
9.2.5 Exposing the cells (day 2) .12
9.2.6 Harvesting the cells (day 3) .13
9.2.7 Measurement of luminescence (day 3) .13
9.3 Data analysis .13
9.3.1 Calculation of the reporter gene induction .13
9.3.2 Calculation of the percentage of maximum response .14
9.3.3 Calculation of the dose-response curve .14
10 Validity criteria .14
10.1 Validity criteria for the assay .14
10.2 Validity criteria for samples.15
11 Assessment criteria .15
12 Test report .15
Annex A (informative) Settings of the luminometer .16
Annex B (informative) Plate setup .17
Annex C (informative) Bioassay characteristics and details .18
Annex D (informative) Test set up for chemicals and extracts .20
Annex E (informative) Preparation of dilution series .22
Annex F (informative) Performance data .23
Annex G (informative) Statistical assessment .33
Annex H (informative) Calculation of 17β-estradiol equivalents .34
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Annex I (informative) Measurement of the lowest ineffective dilution (LID) of waste
water — A simplified evaluation for testing of waste water .36
Bibliography .39
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ISO 19040-3:2018(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
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described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
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URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
A list of all parts in the ISO 19040 series can be found on the ISO website.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 19040-3:2018(E)
Water quality — Determination of the estrogenic potential
of water and waste water —
Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the estrogenic potential of water and waste
water by means of a reporter gene assay utilizing stably transfected human cells. This reporter gene
assay is based on the activation of the human estrogen receptor alpha.
This method is applicable to:
— fresh water;
— waste water;
— aqueous extracts and leachates;
— eluates of sediments (fresh water);
— pore water;
— aqueous solutions of single substances or of chemical mixtures;
— drinking water;
— the limit of quantification (LOQ) of this method for the direct analysis of water samples is between
0,3 ng/l and 1 ng/l 17β-estradiol equivalents (EEQ) based on the results of the international
interlaboratory trial (see Annex F). The upper working range was evaluated [based on the results of
the international interlaboratory trial (see Table F.3)] up to a level of 75 ng EEQ/l. Samples showing
estrogenic potencies above this threshold have to be diluted for a valid quantification. Extraction
and pre concentration of water samples can prove necessary if their estrogenic potential is below
the given LOQ.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
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ISO 19040-3:2018(E)
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org ./obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
culture medium
nutrients presented in a form and phase (liquid or solidified) which support cellular growth
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24, modified — “cellular” replaces “microbiological”]
3.2
dilution level
D
denominator of the dilution coefficient (using the numerator 1) of a mixture of water or waste water
with dilution water as integral number
Note 1 to entry: For undiluted water or waste water, this coefficient per definition is 1→1. The corresponding and
smallest possible value of D is 1. In this document, the arrow indicates the transition from initial total volume to
final total volume.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.3
dilution water
sterile water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.4
EC
50
effective concentration of a compound which causes 50 % of an effect
Note 1 to entry: In the sense of the present document the EC is the effective concentration of a compound which
50
induces 50 % of the maximal reporter gene activity which can be achieved by this compound.
3.5
extract
test sample after extraction and possible removal of extraction vehicle
3.6
field blank
container prepared in the laboratory, using reagent water or other blank matrix, and sent with the
sampling personnel for exposure to the sampling environment to verify possible contamination during
sampling
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.7
induction rate
quotient of the mean value of wells with enhanced reporter gene activity measured on the plates treated
with a dose of the test sample or with a positive control, and the mean value of the corresponding wells
treated with the negative control using the same cells under identical conditions
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modified — “wells with enhanced reporter gene activity measured”
replaces “mutant colonies”; “corresponding wells” replaces “corresponding plates”, “quotient” replaces
“difference”; “cells” replaces “strain”.]
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ISO 19040-3:2018(E)
3.8
limit of quantification
LOQ
lowest value that can be determined with an acceptable level of accuracy and precision
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18]
3.9
lowest ineffective-dilution value
LID
lowest dilution within a test batch which does not show any effect, i.e. no statistically significant
increase in the reporter gene activity compared with the negative control
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modified — “increase in the reporter gene activity” replaces “increase
in the number of revertant wells”]
3.10
negative control
dilution water without test sample
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.11
passage number
the number of subcultures from cells in a new culture vessel (cell culture flask or micro titer plate)
3.12
reference compound
compound with one or more property values that are sufficiently reproducible and well established to
enable the calibration of the measurement method
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modified — “compound” replaces “material”; “the calibration of the
measurement method” replaces “use of the material or substance for the calibration of an apparatus,
the assessment of a measurement method or for the assignment of values to materials”.]
3.13
relative light units
RLU
amount of reporter gene activity as measured by light produces using a luminometer, expressed as
relative light units
3.14
reporter gene activity
quantitative activity of a gene attached to the promoter sequence of another gene
3.15
stock culture
frozen culture of cells for the preservation of the characteristics of the cell line
[SOURCE: ISO 21427-2:2006, 13, modified — “the cell line” replaces “V79 cells”]
3.16
subculturing
transfer of part of a cell culture into a new cell culture vessel during cell culture
3.17
test sample
undiluted, diluted or otherwise prepared portion of a sample to be tested, after completion of all
preparation steps such as centrifugation, filtration, homogenization, pH adjustment and determination
of ionic strength
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
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ISO 19040-3:2018(E)
4 Interferences
Toxic effects present in the test samples may lead to a reduction of cell viability and hence to a reduction
of the measured cellular response. Consequently, estrogenic effects of a sample may be masked by acute
toxic effects leading to false negative test results (see Clause 9 for further information). In this case, the
sample should be diluted further until no cytotoxicity is observed (see manual of cytotoxicity test used).
The use of inappropriate sampling devices and/or sampling flask may influence the test result because
of the possible adsorption of active compounds on surfaces leading to false negative results. On the
other hand, active compounds could be released into the sample from sampling flasks, especially if
plastic ware is used, and false positive results might be generated. See Clause 7 for more information.
High salinity can cause toxic effects due to the resulting osmotic pressure. The ER(α) CALUX cells
(References [10] to [16]) tolerates a conductivity of the sample up to 34,000 µS/cm (1,0 % w/w salinity).
Bacterial and fungal contaminations can negatively influence the response of the cells. Therefore,
antibiotics are added to the cell culture medium. Contamination of the cells is assessed by visual
observation (microscope) when testing the sample. See Clause 9 for further information.
If filtered samples are tested in order to remove bacteria from the sample solid particles are separated
from the sample also. Thus, substances with estrogenic activity which are adsorbed on particles might
not be detected.
Anti-estrogenic compounds and other non-toxic inhibitory compounds might mask estrogenic effects.
The presence of interfering compounds can be assessed by samples which are spiked with a defined
amount of an estrogenic compound with defined properties (e.g. 17β-estradiol) leading to a known
induction of the test system.
Compounds with estrogenic properties might be present as inactive conjugates. A chemical de-
conjugation can be necessary in order to quantify the overall estrogenic potential of a sample.
5 Principle
Estrogen receptor (ER) - mediated signaling is essential in estrogen action and the mechanism of
estrogen receptor signaling is well established. Upon estrogen binding the estrogen receptor becomes
activated, and binds to recognition sequences in promoter regions of target genes, the so-called
estrogen responsive elements (EREs). These EREs have been linked to a promoter element and a gene
transcribing for the easily measurable protein luciferase. In these cells, the ligand-activated receptor
will activate luciferase transcription, and the transcribed luciferase protein will emit light when a
substrate is added. The signal dose-dependently increases as a result of increasing concentrations of
ligand. The luciferase activity in cellular lysates is measured with a luminometer, allowing reliable,
sensitive and quantitative measurements.
6 Apparatus and materials
Beside the equipment which is usually present in a laboratory for cell culture the following apparatus
and materials are needed. For suitable sampling devices see Clause 8.
6.1 Laminar air flow cabinet, standard: “biological hazard”.
6.2 Water bath, 37 °C.
6.3 CO incubator, 5 % CO , 37 °C, humidity 100 %.
2 2
6.4 Inverted phase-contrast microscope.
6.5 Freezer, at least ≤−18 °C and at ≤−70 °C.
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6.6 Shaking apparatus for micro-test plates.
6.7 Centrifuge.
6.8 Laboratory balance.
6.9 Sterile pipettes, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml and 25 ml, glassware or plastics.
6.10 Pipette controller.
2
6.11 Cell culture flasks, 75 cm with filter lids.
6.12 Sterile plastic containers, 12 ml and 50 ml with sterile cap.
6.13 Sterile plates with 12 wells.
6.14 Multi-channel multi-stepper pipette (repeater pipette), including 5 ml and 10 ml tips.
6.15 Pipettes, 1 μl, 50 μl, 200 μl and 1 000 μl, with sterile tips.
6.16 Multi-channel pipettes, up to 50 μl and up to 300 μl.
6.17 Sterile polystyrene 96-well plates, with flat transparent bottom and lid, appropriate for cell
culture, volume 300 μl per well.
6.18 Microplate luminometer with two injectors, for addition of substrate and stop reagent.
6.19 Cell counter or hemacytometer.
6.20 pH meter.
6.21 Cryovials, sterile, 2 ml.
6.22 Liquid nitrogen container for long term cell storage.
6.23 Filter, cellulose acetate, 0,45 µm pore size.
7 Reagents, cells and media
7.1 Reagents
As far as possible, use "reagent grade" chemicals. If (different) hydrates are used that differ from the
compounds specified, ensure that the appropriate mass of the main compound is employed.
7.1.1 Dimethyl sulfoxide (DMSO).
7.1.2 Glycerol for molecular biology, ≥99 %, molecular weight: 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.3 17β-estradiol, ≥98 %, (C H O ), molecular weight: 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.4 Ethylene-diamine-tetra-acetate (EDTA), CAS: 6381-92-6.
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7.1.5 Trypsine, CAS: 9002-07-7.
7.1.6 Fetal calf serum (FCS).
7.1.7 DMEM/F12 medium with phenol red as pH indicator.
7.1.8 Non-essential amino acids (100x).
7.1.9 Penicillin-streptomycin (100x), concentration used 5 000 units penicillin per ml / 5 000 μg
streptomycin per ml).
7.1.10 Phosphate buffered saline pH 7,2 (PBS), without calcium and magnesium.
7.1.11 Adenosine-5'-triphosphate (ATP), CAS: 34369-07-8.
7.1.12 Trans-1, 2-diaminocyclohexane-N, N, N', N'-tetraacetic acid monohydrate (CDTA),
CAS: 125572-95-4.
7.1.13 Dithiothreitol (DTT), CAS: 3483-12-3.
7.1.14 2-amino-2-(hydroxyl-methyl)-1,3-propanediol (TRIS), CAS: 77-86-1.
7.1.15 Dextran T500.
7.1.16 Activated charcoal.
7.1.17 Coenzyme A, free acid grade, Add CAS: 85-61-0.
7.1.18 D-Luciferin sodium salt, CAS: 103404-75-7.
7.1.19 Magnesium hydroxide carbonate pentahydrate, C H Mg O , CAS: 56378-72-4.
4 2 5 14
7.1.20 Magnesium sulfate, CAS: 7487-88-9.
7.1.21 Sodium bicarbonate, CAS: 144-55-8.
7.1.22 Cell culture medium powder, Sigma, D2902, without phenol red and sodium bicarbonate.
7.1.23 Tricine, CAS: 5704-04-1.
7.1.24 Acetone, (purity p.a.), CAS: 67-64-1.
7.1.25 Sodium hydroxide, molecular weight 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.26 Triton X-100, CAS: 9002-93-1.
7.1.27 Hydrochloric acid solution, 1 M (HCl), molecular weight 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.2 Water, grade 3, as defined in ISO 3696; water with a conductivity up to 5 µS/cm is acceptable.
If sterile water is needed, autoclave or sterilize by filtration (cellulose acetate, 0,2 µm). Water as
specified here is also used for the stepwise dilution of the test sample.
6 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 19040-3:2018(E)
7.3 Cell line.
A genetically modified human cell line, expressing the human estrogen receptor (hERα and/or hERβ)
and containing a reporter plasmid for luciferase. More detailed descriptions of the individual cell lines
are given in Annex C.
7.4 Media.
Always use sterile solutions, glassware, etc. Carry out all procedures under aseptic conditions and in the
sterile environment of a laminar flow cabinet (biological hazard standard). If autoclaving is necessary,
always autoclave for 20 min at (121 ± 2) °C. Cover vessels loosely, never seal air tight.
7.4.1 Cell culture medium.
Add 5,4 ml non-essential amino acids (7.1.8), 42 ml FCS (7.1.6) and 1 ml of penicillin-streptomycin
(7.1.9) to a bottle containing 500 ml DMEM/F12 medium with phenol red. Complete cell culture medium
should be kept at 4 °C and stored for no longer than eight weeks.
7.4.2 Freezing medium.
Add 1 ml non-essential amino acids, 10 ml DMSO, 20 ml FCS and 1 ml penicillin-streptomycin (7.1.9) to
68 ml of DMEM/F12 medium with phenol red. Distribute 20 ml batches in a sterile manner over sterile
tubes. Complete freezing medium should be kept at (−20 ± 1) °C until use and kept on ice on use.
7.4.3 Concentrated assay medium.
7.4.3.1 3x concentrated assay medium.
Dissolve the contents of one vial of cell culture medium powder (7.1.22) in 250 ml of water (at room
temperature) and then dissolve 3,7 g sodium bicarbonate (7.1.21) in the same solution. Adjust the
pH to 7,4 using a 1 mol/l HCl or 1 mol/l NaOH solution. Add water to a final volume of 300 ml and
filter sterilize. Add 12 ml of non-essential amino acids (7.1.8), 55 ml stripped serum (7.4.8) and 37 ml
penicillin-streptomycin (7.1.9). Complete media should be kept at (4 ± 1) °C and stored for no longer
than eight weeks.
7.4.3.2 1x concentrated assay medium.
Dilute 100 ml of 3x concentrated assay medium with 200 ml of water and filter sterilize. Complete
media should be kept at (4 ± 1) °C and stored for no longer than eight weeks.
7.4.4 Trypsin solution.
Add 20 ml of trypsin (7.1.5) to 980 ml PBS (7.1.10) and add 0,2 g EDTA (7.1.4). Sterile filter the trypsin
solution and aliquot into 50 ml portions. The expiration date is 3 months from the day of preparation.
Store the tubes of trypsin at −20 °C.
7.4.5 Stop reagent.
Dissolve 8,0 g of sodium hydroxide in one litre of demineralized water, to achieve a final concentration
of 0,2 M.
7.4.6 Substrate mixture.
Completely dissolve tricine (7.1.23) and magnesium sulfate (7.1.20) in 500 ml of demineralized water,
until the solution is clear and colourless. Add the remaining chemicals from Table 1 and add 400 ml of
water. Adjust the pH to 7,8 using 1 mol/l solution of HCl and/or NaOH. Adjust to a final volume of 1 l.
Store at (−20 ± 1) °C for a maximum of 3 months or (−80 ± 1) °C for a maximum of 12 months.
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ISO 19040-3:2018(E)
Table 1 — Preparation of substrate mixture (1 000 ml)
Compound Weight Molecular weight Molarity
g g/mol Mmol/l
Tricine 3,58 179,2 20
C H Mg O 0,52 485,69 1,1
4 2 5 14
MgSO4 0,31 120,37 2,6
EDTA 0,037 372,23 0,10
DTT 5,14 154,2 33,3
Coenzyme A 0,21 767,6 0,27
Luciferin 0,15 320,32 0,47
ATP 0,29 551,1 0,53
7.4.7 Lysis mixture.
Completely dissolve the compounds listed in Table 2 into 500 ml of demineralized water. Adjust pH to
7,8 using 1 mol/l HCl and/or 1 mol/l NaOH solutions. Adjust final volume to 1 l and aliquot into 40 ml
portions. Store at ≤−18 °C (change for all T issues) for a maximum of 1 year, store at 4 °C for a maximum
of one mont
...
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NORME INTERNATIONALE
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Style Definition: Heading 2: Font: Bold, Tab stops: Not at
ISO 19040-3:2018(F)
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Date: 2022-10-01
Style Definition: Heading 4: Font: Bold
ISO/TC 147/SC 5
Style Definition: Heading 5: Font: Bold
Style Definition: Heading 6: Font: Bold
Secrétariat: DIN
Style Definition: ANNEX
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel œstrogéniqueoestrogène de Style Definition: RefNorm
l’eaul'eau et des eaux résiduaires en fonction des agonistes et des antagonistes du Style Definition: Body Text_Center
récepteur des œstrogènes — Partie 3: Essai in vitro sur cellules humaines avec
Style Definition: Dimension_100
gène rapporteur
Style Definition: Figure Graphic
Style Definition: Figure subtitle
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water
Style Definition: List Continue 1
related to agonists and antagonists of the estrogen receptor — Part 3: In vitro human
Style Definition: List Number 1
cell-based reporter gene assay
Style Definition: AMEND Terms Heading: Font: Bold
Style Definition: AMEND Heading 1 Unnumbered: Font:
Bold
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peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans
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l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Sommaire Page
Avant-propos . Error! Bookmark not defined.
1 Domaine d’application . Error! Bookmark not defined.
2 Références normatives . Error! Bookmark not defined.
3 Termes et définitions . Error! Bookmark not defined.
4 Interférences . Error! Bookmark not defined.
5 Principe . Error! Bookmark not defined.
6 Appareillage et matériel. Error! Bookmark not defined.
7 Réactifs, cellules et milieux . Error! Bookmark not defined.
8 Échantillonnage et échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . Error! Bookmark not defined.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.5 Transport des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.6 Prétraitement de l’échantillon . Error! Bookmark not defined.
8.7 Conservation des échantillons . Error! Bookmark not defined.
9 Mode opératoire . Error! Bookmark not defined.
9.1 Entretien de la culture cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.1.1 Congélation des cellules . Error! Bookmark not defined.
9.1.2 Démarrage d’une nouvelle culture cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.1.3 Culture des cellules . Error! Bookmark not defined.
9.2 Mode opératoire d’essai sur cellules humaines avec gène rapporteur . Error! Bookmark not
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9.2.1 Ensemencement des cellules (jour 1) . Error! Bookmark not defined.
9.2.2 Préparation de la référence E2 (jour 2) . Error! Bookmark not defined.
9.2.3 Préparation des dilutions d’échantillon (jour 2) . Error! Bookmark not defined.
9.2.4 Blanc de terrain. Error! Bookmark not defined.
9.2.5 Exposition des cellules (jour 2). Error! Bookmark not defined.
9.2.6 Récolte des cellules (jour 3) . Error! Bookmark not defined.
9.2.7 Mesurage de la luminescence (jour 3) . Error! Bookmark not defined.
9.3 Analyse des données . Error! Bookmark not defined.
9.3.1 Calcul de l’induction du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
9.3.2 Calcul du pourcentage de réponse maximale . Error! Bookmark not defined.
9.3.3 Calcul de la courbe dose-effet . Error! Bookmark not defined.
10 Critères de validité . Error! Bookmark not defined.
10.1 Critères de validité pour l’essai . Error! Bookmark not defined.
10.2 Critères de validité pour les échantillons . Error! Bookmark not defined.
11 Critères d’évaluation . Error! Bookmark not defined.
12 Rapport d’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe A (informative) Réglages du luminomètre . Error! Bookmark not defined.
Annexe B (informative) Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
Annexe C (informative) Caractéristiques et détails de l’essai biologique . Error! Bookmark not
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iii
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ISO 19040-3:2018(F)
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits . Error!
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Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution . Error! Bookmark not defined.
Annexe F (informative) Données de performance . Error! Bookmark not defined.
Annexe G (informative) Évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Annexe H (informative) Calcul des équivalents 17β- œstradiol . Error! Bookmark not defined.
Annexe I (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires . Error! Bookmark
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Bibliographie . Error! Bookmark not defined.
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iv
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ISO 19040-3:2018(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/foreword.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO. Formatted: Pattern: Clear
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Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 19040-3:2018(F)
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel
œstrogéniqueoestrogène de l’eaul'eau et des eaux résiduaires
en fonction des agonistes et des antagonistes du récepteur des
œstrogènes — Partie 3: Essai in vitro sur cellules humaines
avec gène rapporteur
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité
qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des
pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent document
soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l'eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur utilisant des cellules humaines
transfectées de façon stable. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des
œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou de l’œstrogénicité
d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il ne répond pas aux
molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur comme les
modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable;
— la limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 0,3 ng/l et 1 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de
l’essai interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le domaine de mesure supérieur a été évalué
[sur la base des résultats de l’essai interlaboratoires international (voir le Tableau F.3)] jusqu’à un
niveau de 75 ng d’EEQ/l. Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil
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1
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ISO 19040-3:2018(F)
doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des
échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ
donnée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences
du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non
datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
Commented [eXtyles2]: The match came back with a
different title. The original title was: Eau pour laboratoire à
usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de consultation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance cellulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24, modifiée — «cellulaire» remplace «microbiologique »] Commented [eXtyles3]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.2
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
niveau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
D
Formatted: Pattern: Clear
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux résiduaires
et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1. La
valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition entre
le volume total initial et le volume total final.
Commented [eXtyles4]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
3.3
Formatted: Pattern: Clear
eau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
eau stérile ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
Formatted: Pattern: Clear
3.4
Formatted: Pattern: Clear
CE
50
Formatted: Pattern: Clear
concentration efficace d’un composé produisant 50 % d’un effet
Formatted: Pattern: Clear
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2
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ISO 19040-3:2018(F)
Note 1 à l’article: Au sens du présent document, la CE est la concentration efficace d’un composé qui induit 50 %
50
de l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.5
extrait
échantillon pour essai après extraction et élimination éventuelle du milieu d’extraction
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc, et
destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement dans
lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.7
Formatted: Pattern: Clear
taux d’induction
Formatted: Pattern: Clear
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai ou avec un témoin positif, à la valeur moyenne
des puits correspondants traités avec le témoin négatif à l’aide des mêmes cellules, dans des conditions
identiques
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur Formatted: Pattern: Clear
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
Formatted: Pattern: Clear
correspondantes»; «rapport» remplace «différence»; «cellules» remplace «souche »]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.8
limite de quantification Commented [eXtyles5]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
LDQ
valeur la plus faible d’une caractéristique à déterminer pouvant être mesurée avec un niveau acceptable
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
d’exactitude et de fidélité
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18] Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.9
Formatted: Pattern: Clear
plus faible dilution sans effet
Formatted: Pattern: Clear
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
Formatted: Pattern: Clear
«augmentation du nombre de puits de révertants »]
Formatted: Pattern: Clear
3.10
Formatted: Pattern: Clear
témoin négatif
Commented [eXtyles6]: The reference is to a withdrawn
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
standard which has been replaced
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
Formatted: Pattern: Clear
3.11
Formatted: Pattern: Clear
nombre de passages
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
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3
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ISO 19040-3:2018(F)
nombre de repiquages de cellules dans un nouveau récipient de culture (flacon de culture cellulaire ou
microplaque)
3.12
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode Formatted: Pattern: Clear
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
Formatted: Pattern: Clear
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.13
unités de lumière relative Commented [eXtyles7]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
RLU
niveau d’activité du gène rapporteur tel que mesuré par la lumière produite à l’aide d’un luminomètre,
ISO 7405:2018, Médecine bucco-dentaire — Évaluation de
exprimé en unités de lumière relative
la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en
médecine bucco-dentaire
3.14
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
3.15
culture mère
culture congelée afin de conserver les caractéristiques de la lignée cellulaire
[SOURCE: ISO 21427-2:2006, 13, modifiée — «de la lignée cellulaire» remplace «des cellules V79 »] Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.16
Formatted: Pattern: Clear
repiquage
Formatted: Pattern: Clear
transfert d’une partie d’une culture cellulaire dans un nouveau récipient de culture cellulaire pendant la
culture cellulaire
3.17
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution de
toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, l’ajustement
du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92] Commented [eXtyles8]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
4 Interférences
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
Formatted: Pattern: Clear
Les effets toxiques présents dans les échantillons pour essai peuvent entraîner une réduction de la
Formatted: Pattern: Clear
viabilité des cellules et donc une réduction de la réponse cellulaire mesurée. En conséquence, les effets
œstrogéniques d’un échantillon peuvent être masqués par des effets toxiques aigus et conduire à des
Formatted: Pattern: Clear
résultats d’essai faux négatifs (voir l’Article 9 pour de plus amples informations). Dans ce cas, il convient
Formatted: Pattern: Clear
de diluer l’échantillon jusqu’à ce qu’aucune cytotoxicité ne soit plus observée (consulter le manuel de
Formatted: Pattern: Clear
l’essai de cytotoxicité utilisé).
L’utilisation de dispositifs et/ou flacons d’échantillonnage inappropriés peut avoir une influence sur le
résultat d’essai, car l’adsorption éventuelle de composés actifs sur les surfaces conduit à des résultats
faux négatifs. D’autre part, des composés actifs peuvent être libérés dans l’échantillon par les flacons
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4
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ISO 19040-3:2018(F)
d’échantillonnage, en particulier si le matériel utilisé est en plastique, et des résultats faux positifs
peuvent être générés. Voir l’Article 7 pour de plus amples informations. Formatted: Pattern: Clear
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. Les cellules
ER(α) CALUX (Références [10] à [16]) tolèrent une conductivité de l’échantillon pouvant aller jusqu’à Formatted: Pattern: Clear
34,000 µS/cm (salinité de 1,0 % en fraction massique). Les contaminations bactériennes et fongiques
Formatted: Pattern: Clear
peuvent avoir une influence négative sur la réponse des cellules. Par conséquent, des antibiotiques sont
ajoutés au milieu de culture cellulaire. La contamination des cellules est évaluée par un examen visuel
(au microscope) lors des essais de l’échantillon. Voir l’Article 9 pour de plus amples informations.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Des composés antiœstrogéniques et d’autres composés inhibiteurs non toxiques peuvent masquer les
effets œstrogéniques. La présence de composés interférents peut être évaluée à l’aide d’échantillons
dopés avec une quantité définie d’un composé œstrogénique ayant des propriétés définies (par exemple
17β-œstradiol) provoquant une induction connue du système d’essai.
Les composés ayant des propriétés œstrogéniques peuvent être présents sous forme de conjugués
inactifs. Une déconjugaison chimique peut être nécessaire pour quantifier le potentiel œstrogénique
global d’un échantillon.
5 Principe
La signalisation induite par le récepteur des œstrogènes (ER) est essentielle dans l’action des œstrogènes
et le mécanisme de signalisation du récepteur des œstrogènes est bien établi. La liaison des œstrogènes
à leur récepteur active ce dernier, qui se lie à des séquences de reconnaissance dans les régions
promotrices des gènes cibles, appelées éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). Ces ERE ont été liés
à un élément promoteur et à un gène induisant la transcription de la protéine luciférase facilement
mesurable. Dans ces cellules, le récepteur activé par le ligand activera la transcription de la luciférase, et
la protéine luciférase transcrite émettra une lumière lorsqu’un substrat sera ajouté. Le signal augmente
en fonction de la dose du fait des concentrations croissantes de ligand. L’activité de la luciférase dans les
lysats cellulaires est mesurée à l’aide d’un luminomètre permettant d’obtenir des mesures fiables,
sensibles et quantitatives.
6 Appareillage et matériel
Outre le matériel généralement présent dans un laboratoire pour la culture cellulaire, l’appareillage et le
matériel suivants sont nécessaires. Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8.
Formatted: Pattern: Clear
6.1 Hotte à flux laminaire, standard: «risque biologique».
6.2 Bain-marie, 37 °C.
6.3 Incubateur à CO , 5 % CO , 37 °C, humidité 100 %.
2 2
6.4 Microscope à contraste de phase inversé.
6.5 Congélateur, au moins ≤ −18 °C et ≤ −70 °C.
6.6 Agitateur pour microplaques.
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5
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ISO 19040-3:2018(F)
6.7 Centrifugeuse.
6.8 Balance de laboratoire.
6.9 Pipettes stériles, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml et 25 ml, en verre ou en plastique.
6.10 Pipeteur.
2
6.11 Flacons de culture cellulaire, 75 cm avec bouchons filtrants.
6.12 Récipients en plastique stériles, 12 ml et 50 ml avec bouchon stérile.
6.13 Plaques stériles à 12 puits.
6.14 Pipette à canaux multiples à répétition (pipette à répétition), avec embouts de 5 ml et 10 ml.
6.15 Pipettes, 1 μl, 50 μl, 200 μl et 1 000 μl, à embouts stériles.
6.16 Pipettes à canaux multiples, jusqu’à 50 μl et jusqu’à 300 μl.
6.17 Plaques stériles en polystyrène à 96 puits, à fond plat et couvercle transparents, appropriées
pour la culture cellulaire, volume 300 μl par puits.
6.18 Luminomètre pour microplaques avec deux injecteurs, pour l’addition de substrat et de réactif
d’arrêt.
6.19 Compteur de cellules ou hématimètre.
6.20 pH-mètre.
6.21 Flacons cryogéniques, stériles, 2 ml.
6.22 Récipient d’azote liquide pour le stockage à long terme des cellules.
6.23 Filtre, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,45 µm.
7 Réactifs, cellules et milieux
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif». Si les (différents)
hydrates utilisés diffèrent des composés spécifiés, s’assurer que la masse appropriée du composé
principal est employée.
7.1.1 Sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
7.1.2 Glycérol pour biologie moléculaire, ≥ 99 %, masse moléculaire: 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.3 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C18H24O2, masse moléculaire: 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
7.1.4 Sel d’acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA), CAS: 6381-92-6.
7.1.5 Trypsine, CAS: 9002-07-7.
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7.1.6 Sérum fœtal bovin (FCS).
7.1.7 Milieu DMEM/F12 avec rouge de phénol comme indicateur de pH.
7.1.8 Acides aminés non essentiels (100x).
7.1.9 Pénicilline-streptomycine (100x), concentration utilisée 5 000 unités de pénicilline par
ml/5 000 μg de streptomycine par ml.
7.1.10 Tampon phosphate salin pH 7,2 (PBS), sans calcium ni magnésium.
7.1.11 Adénosine-5’-triphosphate (ATP), CAS: 34369-07-8.
7.1.12 Acide trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tétraacétique monohydraté (CDTA),
CAS: 125572-95-4.
7.1.13 Dithiothréitol (DTT), CAS: 3483-12-3.
7.1.14 2-amino-2-(hydroxyl-méthyl)-1,3-propanediol (TRIS), CAS: 77-86-1.
7.1.15 Dextrane T500.
7.1.16 Charbon actif.
7.1.17 Coenzyme A, qualité acide libre, CAS: 85-61-0.
7.1.18 D-luciférine, sel sodique, CAS: 103404-75-7.
7.1.19 Hydroxycarbonate de magnésium pentahydraté, C H Mg O , CAS: 56378-72-4.
4 2 5 14
7.1.20 Sulfate de magnésium, CAS: 7487-88-9.
7.1.21 Bicarbonate de sodium, CAS: 144-55-8.
7.1.22 Milieu de culture cellulaire en poudre, Sigma, D2902, sans rouge de phénol ni bicarbonate de
sodium.
7.1.23 Tricine, CAS: 5704-04-1.
7.1.24 Acétone, (pureté «pour analyses »), CAS: 67-64-1.
7.1.25 Hydroxyde de sodium, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.26 Triton X-100, CAS: 9002-93-1.
7.1.27 Solution d’acide chlorhydrique, 1 M (HCl), masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou égale Formatted: Pattern: Clear
à 5 µS/cm est acceptable.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stéril
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 19040-3
Première édition
2018-08
Qualité de l'eau — Détermination du
potentiel oestrogène de l'eau et des
eaux résiduaires —
Partie 3:
Essai in vitro sur cellules humaines
avec gène rapporteur
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water
and waste water —
Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
Numéro de référence
ISO 19040-3:2018(F)
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Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 2
4 Interférences . 4
5 Principe. 4
6 Appareillage et matériel .5
7 Réactifs, cellules et milieux .6
8 Échantillonnage et échantillons .9
8.1 Généralités . 9
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . 9
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . 10
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . 10
8.5 Transport des échantillons . 10
8.6 Prétraitement de l’échantillon . 10
8.7 Conservation des échantillons . 11
9 Mode opératoire .11
9.1 Entretien de la culture cellulaire . 11
9.1.1 Congélation des cellules . 11
9.1.2 Démarrage d’une nouvelle culture cellulaire . 11
9.1.3 Culture des cellules . 11
9.2 Mode opératoire d’essai sur cellules humaines avec gène rapporteur .12
9.2.1 Ensemencement des cellules (jour 1) . .12
9.2.2 Préparation de la référence E2 (jour 2) .12
9.2.3 Préparation des dilutions d’échantillon (jour 2) .13
9.2.4 Blanc de terrain .13
9.2.5 Exposition des cellules (jour 2) . 14
9.2.6 Récolte des cellules (jour 3) . 14
9.2.7 Mesurage de la luminescence (jour 3) . 14
9.3 Analyse des données . 14
9.3.1 Calcul de l’induction du gène rapporteur . 14
9.3.2 Calcul du pourcentage de réponse maximale . 15
9.3.3 Calcul de la courbe dose-effet . 15
10 Critères de validité .16
10.1 Critères de validité pour l’essai . 16
10.2 Critères de validité pour les échantillons . 16
11 Critères d’évaluation .16
12 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Réglages du luminomètre .18
Annexe B (informative) Préparation de la plaque .19
Annexe C (informative) Caractéristiques et détails de l’essai biologique .20
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits .22
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution .24
Annexe F (informative) Données de performance .25
Annexe G (informative) Évaluation statistique .35
Annexe H (informative) Calcul des équivalents 17β- œstradiol .36
iii
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Annexe I (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires .38
Bibliographie .41
iv
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/foreword.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 19040-3:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel oestrogène
de l'eau et des eaux résiduaires —
Partie 3:
Essai in vitro sur cellules humaines avec gène rapporteur
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité
de l’utilisateur d’établir des pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de
l'eau et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur utilisant des cellules humaines
transfectées de façon stable. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des
œstrogènes humains alpha.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable;
— la limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 0,3 ng/l et 1 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de
l’essai interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le domaine de mesure supérieur a été évalué
[sur la base des résultats de l’essai interlaboratoires international (voir le Tableau F.3)] jusqu’à un
niveau de 75 ng d’EEQ/l. Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce
seuil doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des
échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ
donnée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
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ISO 19040-3:2018(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de consultation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance cellulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24, modifiée — «cellulaire» remplace «microbiologique »]
3.2
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux
résiduaires et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l'article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.3
eau de dilution
eau stérile ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.4
EC
50
concentration efficace d’un composé produisant 50 % d’un effet
Note 1 à l'article: Au sens du présent document, la EC est la concentration efficace d’un composé qui induit 50 %
50
de l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.5
extrait
échantillon pour essai après extraction et élimination éventuelle du milieu d’extraction
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc,
et destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement
dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
2
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3.7
taux d’induction
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai ou avec un témoin positif, à la valeur moyenne
des puits correspondants traités avec le témoin négatif à l’aide des mêmes cellules, dans des conditions
identiques
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
correspondantes»; «rapport» remplace «différence»; «cellules» remplace «souche »]
3.8
limite de quantification
LDQ
valeur la plus faible d’une caractéristique à déterminer pouvant être mesurée avec un niveau acceptable
d’exactitude et de fidélité
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18]
3.9
plus faible dilution sans effet
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
«augmentation du nombre de puits de révertants »]
3.10
témoin négatif
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.11
nombre de passages
nombre de repiquages de cellules dans un nouveau récipient de culture (flacon de culture cellulaire ou
microplaque)
3.12
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
3.13
unités de lumière relative
RLU
niveau d’activité du gène rapporteur tel que mesuré par la lumière produite à l’aide d’un luminomètre,
exprimé en unités de lumière relative
3.14
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
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3.15
culture mère
culture congelée afin de conserver les caractéristiques de la lignée cellulaire
[SOURCE: ISO 21427-2:2006, 13, modifiée — «de la lignée cellulaire» remplace «des cellules V79 »]
3.16
repiquage
transfert d’une partie d’une culture cellulaire dans un nouveau récipient de culture cellulaire pendant
la culture cellulaire
3.17
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution
de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,
l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
4 Interférences
Les effets toxiques présents dans les échantillons pour essai peuvent entraîner une réduction de la
viabilité des cellules et donc une réduction de la réponse cellulaire mesurée. En conséquence, les effets
œstrogéniques d’un échantillon peuvent être masqués par des effets toxiques aigus et conduire à des
résultats d’essai faux négatifs (voir l’Article 9 pour de plus amples informations). Dans ce cas, il convient
de diluer l’échantillon jusqu’à ce qu’aucune cytotoxicité ne soit plus observée (consulter le manuel de
l’essai de cytotoxicité utilisé).
L’utilisation de dispositifs et/ou flacons d’échantillonnage inappropriés peut avoir une influence sur le
résultat d’essai, car l’adsorption éventuelle de composés actifs sur les surfaces conduit à des résultats
faux négatifs. D’autre part, des composés actifs peuvent être libérés dans l’échantillon par les flacons
d’échantillonnage, en particulier si le matériel utilisé est en plastique, et des résultats faux positifs
peuvent être générés. Voir l’Article 7 pour de plus amples informations.
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. Les
cellules ER(α) CALUX (Références [10] à [16]) tolèrent une conductivité de l’échantillon pouvant
aller jusqu’à 34,000 µS/cm (salinité de 1,0 % en fraction massique). Les contaminations bactériennes
et fongiques peuvent avoir une influence négative sur la réponse des cellules. Par conséquent, des
antibiotiques sont ajoutés au milieu de culture cellulaire. La contamination des cellules est évaluée par
un examen visuel (au microscope) lors des essais de l’échantillon. Voir l’Article 9 pour de plus amples
informations.
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Des composés antiœstrogéniques et d’autres composés inhibiteurs non toxiques peuvent masquer les
effets œstrogéniques. La présence de composés interférents peut être évaluée à l’aide d’échantillons
dopés avec une quantité définie d’un composé œstrogénique ayant des propriétés définies (par exemple
17β-œstradiol) provoquant une induction connue du système d’essai.
Les composés ayant des propriétés œstrogéniques peuvent être présents sous forme de conjugués
inactifs. Une déconjugaison chimique peut être nécessaire pour quantifier le potentiel œstrogénique
global d’un échantillon.
5 Principe
La signalisation induite par le récepteur des œstrogènes (ER) est essentielle dans l’action des
œstrogènes et le mécanisme de signalisation du récepteur des œstrogènes est bien établi. La liaison
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des œstrogènes à leur récepteur active ce dernier, qui se lie à des séquences de reconnaissance dans
les régions promotrices des gènes cibles, appelées éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). Ces ERE
ont été liés à un élément promoteur et à un gène induisant la transcription de la protéine luciférase
facilement mesurable. Dans ces cellules, le récepteur activé par le ligand activera la transcription de
la luciférase, et la protéine luciférase transcrite émettra une lumière lorsqu’un substrat sera ajouté. Le
signal augmente en fonction de la dose du fait des concentrations croissantes de ligand. L’activité de la
luciférase dans les lysats cellulaires est mesurée à l’aide d’un luminomètre permettant d’obtenir des
mesures fiables, sensibles et quantitatives.
6 Appareillage et matériel
Outre le matériel généralement présent dans un laboratoire pour la culture cellulaire, l’appareillage et
le matériel suivants sont nécessaires. Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8.
6.1 Hotte à flux laminaire, standard: «risque biologique».
6.2 Bain-marie, 37 °C.
6.3 Incubateur à CO , 5 % CO , 37 °C, humidité 100 %.
2 2
6.4 Microscope à contraste de phase inversé.
6.5 Congélateur, au moins ≤ −18 °C et ≤ −70 °C.
6.6 Agitateur pour microplaques.
6.7 Centrifugeuse.
6.8 Balance de laboratoire.
6.9 Pipettes stériles, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml et 25 ml, en verre ou en plastique.
6.10 Pipeteur.
2
6.11 Flacons de culture cellulaire, 75 cm avec bouchons filtrants.
6.12 Récipients en plastique stériles, 12 ml et 50 ml avec bouchon stérile.
6.13 Plaques stériles à 12 puits.
6.14 Pipette à canaux multiples à répétition (pipette à répétition), avec embouts de 5 ml et 10 ml.
6.15 Pipettes, 1 μl, 50 μl, 200 μl et 1 000 μl, à embouts stériles.
6.16 Pipettes à canaux multiples, jusqu’à 50 μl et jusqu’à 300 μl.
6.17 Plaques stériles en polystyrène à 96 puits, à fond plat et couvercle transparents, appropriées
pour la culture cellulaire, volume 300 μl par puits.
6.18 Luminomètre pour microplaques avec deux injecteurs, pour l’addition de substrat et de
réactif d’arrêt.
5
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ISO 19040-3:2018(F)
6.19 Compteur de cellules ou hématimètre.
6.20 pH-mètre.
6.21 Flacons cryogéniques, stériles, 2 ml.
6.22 Récipient d’azote liquide pour le stockage à long terme des cellules.
6.23 Filtre, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,45 µm.
7 Réactifs, cellules et milieux
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif». Si les (différents)
hydrates utilisés diffèrent des composés spécifiés, s’assurer que la masse appropriée du composé
principal est employée.
7.1.1 Sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
7.1.2 Glycérol pour biologie moléculaire, ≥ 99 %, masse moléculaire: 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.3 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire: 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.4 Sel d’acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA), CAS: 6381-92-6.
7.1.5 Trypsine, CAS: 9002-07-7.
7.1.6 Sérum fœtal bovin (FCS).
7.1.7 Milieu DMEM/F12 avec rouge de phénol comme indicateur de pH.
7.1.8 Acides aminés non essentiels (100x).
7.1.9 Pénicilline-streptomycine (100x), concentration utilisée 5 000 unités de pénicilline par
ml/5 000 μg de streptomycine par ml.
7.1.10 Tampon phosphate salin pH 7,2 (PBS), sans calcium ni magnésium.
7.1.11 Adénosine-5’-triphosphate (ATP), CAS: 34369-07-8.
7.1.12 Acide trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tétraacétique monohydraté (CDTA),
CAS: 125572-95-4.
7.1.13 Dithiothréitol (DTT), CAS: 3483-12-3.
7.1.14 2-amino-2-(hydroxyl-méthyl)-1,3-propanediol (TRIS), CAS: 77-86-1.
7.1.15 Dextrane T500.
7.1.16 Charbon actif.
6
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7.1.17 Coenzyme A, qualité acide libre, CAS: 85-61-0.
7.1.18 D-luciférine, sel sodique, CAS: 103404-75-7.
7.1.19 Hydroxycarbonate de magnésium pentahydraté, C H Mg O , CAS: 56378-72-4.
4 2 5 14
7.1.20 Sulfate de magnésium, CAS: 7487-88-9.
7.1.21 Bicarbonate de sodium, CAS: 144-55-8.
7.1.22 Milieu de culture cellulaire en poudre, Sigma, D2902, sans rouge de phénol ni bicarbonate de
sodium.
7.1.23 Tricine, CAS: 5704-04-1.
7.1.24 Acétone, (pureté «pour analyses »), CAS: 67-64-1.
7.1.25 Hydroxyde de sodium, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.26 Triton X-100, CAS: 9002-93-1.
7.1.27 Solution d’acide chlorhydrique, 1 M (HCl), masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou
égale à 5 µS/cm est acceptable.
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de
cellulose, 0,2 µm). L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la dilution progressive de
l’échantillon pour essai.
7.3 Lignée cellulaire.
Lignée cellulaire humaine génétiquement modifiée, exprimant le récepteur des œstrogènes humains
(hERα et/ou hERβ) et contenant un plasmide rapporteur pour la luciférase. Des descriptions plus
détaillées des lignées cellulaires individuelles sont données dans l’Annexe C.
7.4 Milieu.
Utiliser toujours des solutions, une verrerie, etc. stériles. Effectuer tous les modes opératoires dans
des conditions d’asepsie et dans l’environnement stérile d’une hotte à flux laminaire (standard pour
les risques biologiques). Si un passage à l’autoclave est nécessaire, toujours effectuer cette opération
pendant 20 min à (121 ± 2) °C. Couvrir légèrement les récipients; ne jamais les fermer hermétiquement.
7.4.1 Milieu de culture cellulaire.
Introduire 5,4 ml d’acides aminés non essentiels (7.1.8), 42 ml de FCS (7.1.6) et 1 ml de
pénicillinestreptomycine (7.1.9) dans un flacon contenant 500 ml de milieu DMEM/F12 avec du rouge
de phénol. Il convient de conserver le milieu de culture cellulaire préparé à 4 °C pendant huit semaines
au maximum.
7.4.2 Milieu de congélation.
Ajouter 1 ml d’acides aminés non essentiels, 10 ml de DMSO, 20 ml de FCS et 1 ml de
pénicillinestreptomycine (7.1.9) à 68 ml de milieu DMEM/F12 avec du rouge de phénol. Répartir des
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lots de 20 ml de façon stérile dans des tubes stériles. I
...
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