ISO 6651:1983
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of aflatoxin B1 content
Animal feeding stuffs — Determination of aflatoxin B1 content
Aliments des animaux — Dosage de l'aflatoxine B1
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
International Standard 6651
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDlZATIONOME~YHAPOnHAR OPTAHHIAUHR fl0 CTAHAAPTH3AUHHWRGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B,
O
content
Aliments des animaux - Dosage de raflatoxine 6,
First edition - 1983-04-01
- UDC 636.085:543.544 Ref. No. IS0 6651-1983 (E)
W
-
Descriptors : animal feeding products, chemical analysis, determination of content, aflatoxins.
8
Price based on 8 pages
s
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Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of developing International
Standards is carried out through IS0 technical committees. Every member body
interested in a subject for which a technical committee has been authorized has the
right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council.
International Standard IS0 6651 was developed by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products, and was circulated to the member bodies in March 1981.
It has been approved by the member bodies of the following countries:
Iran Portugal
Australia
Austria Iraq Romania
Brazil Ireland South Africa, Rep. of
Canada Israel Spain
Chile Italy Sri Lanka
Tanzania
Denmark Kenya
Dominican Republic Korea, Rep. of Thailand
Egypt, Arab Rep. of Malaysia Turkey
Ethiopia Mexico USSR
New Zealand Yugoslavia
France
Hungary Philippines
Poland
India
The member bodies of the following countries expressed disapproval of the document
on technical grounds:
United Kingdom
USA
This International Standard has also been approved by the International Union of Pure
and Applied Chemistry (IUPAC).
O International Organization for Standardization, 1983 O
Printed in Switzerland
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IS0 6651-1983 (E)
INTERNATIONAL STANDARD
Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin BI
content
Evaporation of the eluate and dissolution of the residue in a
1 Scope
specified volume of chloroform or mixture of benzene and
acetonitrile.
This International Standard specifies two methods for the
determination of the aflatoxin BI content of animal feeding
Thin-layer chromatography, one-dimensional for method A and
stuffs.
two-dimensional for method B, of an aliquot portion of this
solution.
2 Field of application
Determination of the aflatoxin BI content, either visually or by
fluorodensitometry, by examination of the chromatogram
Method A is applicable to the following simple feeding
2.1
under UV light and comparison with known quantities of stan-
stuffs :
dard aflatoxin BI applied to the same plate as the test portion
-
oilseeds and oilseed residues, and in particular ground-
extract.
nut, copra, linseed, soya, sesame, babassu palm;
Confirmation of the identity of aflatoxin BI by formation of the
- manioc meal;
hemiacetal derivative.
- maize germ expeller;
5 Reagents
- cereals and cereal products;
All reagents shall be of recognized analytical quality. The water
- pea meal;
used shall be distilled water or water of at least equivalent
purity.
- potato pulp and flour.
In the presence of substances interfering with the determina-
Chloroform, stabilized with 0,5 to 1,0 % of 96 % (V/ V)
5.1
tion by method A, it is recommended that the determination be
ethanol.
carried out in accordance with method B.
5.2 n-hexane.
2.2 Method B is applicable to mixed feeding stuffs and to
simple feeding stuffs not mentioned in 2.1.
5.3 Diethyl ether, anhydrous, free from peroxides.
This method is not applicable to feeding stuffs containing citrus
Benzene/acetonitrile (98 + 2) mixture.
5.4
Pulp.
Mix 98 volumes of benzene with 2 volumes of acetonitrile.
2.3 The lower limit of detection of aflatoxin BI is 0,Ol mg/kg.
5.5 Chloroform/methanol (97 + 3) mixture.
3 Reference
Mix 97 volumes of chloroform with 3 volumes of methanol.
IS0 6498, Animal feeding stuffs - Preparation of test
samples. 1 )
5.6 Developing solvents.2)
4 Principle 5.6.1 Chloroform/acetone (90 + IO) mixture.
Extraction of the test portion with chloroform, filtration, and Mix 90 volumes of chloroform with 10 volumes of acetone, in
purification of an aliquot portion on a silica gel column. an unsaturated tank.
1) At present at the stage of draft.
2) The solvents should be used in covered tanks. When saturated tanks are specified, this is achieved by lining the tanks with absorbent paper and
1
allowing the interiors to become saturated with solvent vapour.
1
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IS0 6651-1983 (E)
Calculate the concentration of aflatoxin Bl, in micrograms per
5.6.2 Diethyl ether/methanol/water (96 + 3 + 1)
millilitre of solution, from the formulae :
mixture.
Mix 96 volumes of diethyl ether, 3 volumes of methanol and 1
a) for the chloroform solution :
volume of water, in an unsaturated tank.
312 x A x 1 O00
5.6.3 Diethyl ether/methanol/water (94 + 4.5 + 1.5)
20 600
mixture.
Mix 94 volumes of diethyl ether with 4,5 volumes of methanol
b) for the solution in the benzene/acetonitrile mixture :
and 1,5 volumes of water, in a saturated tank.
312 x A x 1 000
-
5.6.4 Chloroform/methanol (94 + 6) mixture.
19 800
Mix 94 volumes of chloroform with 6 volumes of methanol, in a
saturated tank.
5.14.2 Dilution
Dilute the stock solution (5.14.11, as appropriate, away from
5.6.5 Chloroform/methanol (97 + 3) mixture.
daylight, to obtain a standard solution with a concentration of
aflatoxin B1 of about 0,l pg/ml.
Mix 97 volumes of chloroform with 3 volumes of methanol, in a
saturated tank.
If kept in a refrigerator at 4 OC, this solution is stable for 2
weeks.
5.7 Silica gel, for column chromatography, of particle size
0,05 to 0.20 mm.
5.14.3 Testing of chromatographic purity of the solution
5.8 Silica gel, G-HR or equivalent, for thin layer
Onto a plate (6.71, apply a spot of 5 pI of the standard aflatoxin
chromatography.
Bl solution of concentration 8 to 10 pg/ml (5.14.1). Develop
the chromatogram as indicated in 8.5.1. Under UV light, the
5.9 Diatomaceous earth (Hyflosupercel), acid-washed.
chromatogram shall show only one spot and no fluorescence
shall be perceptible in the original deposition zone.
5.10 Sodium sulphate, anhydrous granules.
5.15 Aflatoxin Bl and B, (see the warning in 5.141, solu-
5.11 Trifluoroacetic acid. tions for qualitative testing, containing about 0,l pg of afla-
toxin BI and B, per millilitre, in the chloroform (5.1) or in the
benzene/acetonitrile mixture (5.4).
5.12
Inert gas, for example nitrogen.
These concentrations are given as a guide. They shall be ad-
5.13 Sulphuric acid, 50 % ( V/ V) solution.
justed so as to obtain the same intensity of fluorescence for
8.5.1).
both aflatoxins (see
5.14 Aflatoxin Bl, standard solution containing about
0.1 pg of aflatoxin Bl per millilitre, in the chloroform (5.1) or in
the benzene/acetonitrile mixture (5.4).
6 Apparatus
Usual laboratory equipment, and in particular
WARNING - Aflatoxins are highly carcinogenic and
must be handled with great care.
6.1 Grinder/mixer.
Prepare and check the solution as follows.
6.2 Sieve, of aperture size 3,0 mm (see IS0 565).
5.14.1 Preparation of stock solution and determination
of concentration
Shaking apparatus or magnetic stirrer.
6.3
Prepare a solution of aflatoxin B1 in the chloroform (5.1) or the
benzene/acetonitrile mixture (5.4) such that the concentration
6.4 Chromatographic tubes, made of glass (internal
is between 8 and 10 pg/ml. Determine the absorption spectrum
diameter 22 mm, length 300 mm), with a PTFE tap and a
between 330 and 370 nm by means of the spectrophotometer
250 ml reservoir, plugged at the bottom end with cotton or
(6.9).
glass wool.
Measure the absorbance (A) at 363 nm in the case of the
6.5 Rotary vacuum evaporator, with a 500 ml round-
chloroform solution, or at 348 nm in the case of the
benzene/acetonitrile mixture solution. bottomed flask.
2
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IS0 6651-1983 (E)
8 Procedure
6.6 Apparatus for thin layer chromatography (TLC), i.e.
that necessary for the preparation of the plates (6.7) and ap-
plication of spots (capillary pipettes or microsyringes), a
8.1 Preparation of the test sample
developing tank, and spraying apparatus for applying the
sulphuric acid (5.13) to the plates.
If the sample contains more than 5 % of fat, it shall be
8.1.1
defatted with light petroleum before grinding.
6.7 Glass TLC plates, 200 mm x 200 mm, prepared as In such cases, the analytical results shall be expressed in terms
follows (the quantities indicated are sufficient to cover five of the mass of the non-defatted sample.
plates).
8.1.2 Grind the laboratory sample so that it completely passes
Place 30 g of the silica gel (5.8) in a conical flask, add 60 ml of
through the sieve (6.2). Mix thoroughly. (See IS0 6498.)
water, stopper and shake for 1 min. Spread the suspension on
the plates so as to obtain a uniform layer 0,25 mm thick. Leave
8.2 Test portion
to dry in the air and then store in a desiccator containing silica
gel. At the time of use, activate the plates by keeping them in
Weigh 50 g of the prepared test sample into the conical flask
an oven at 110 OC for 1 h.
(6.13).
Ready-to-use plates are suitable if they give results similar to
those obtained with the plates prepared as indicated above. 8.3 Extraction
(.
Add to the test portion (8.2) 25 g of the diatomaceous earth
6.8 Long-wavelength (360 nm) UV lamp.
(5.91, 25 ml of water, and 250 ml of the chloroform (5.1) ac-
curately measured from a measuring cylinder. Stopper the
The intensity of irradiation shall make it possible for a spot of
flask, and shake or stir for 30 min using the apparatus (6.3).
1 ,O ng of aflatoxin BI to be clearly distinguished on a TLC plate
Filter through the fluted filter paper (6.111, taking care to
at a distance of 10 cm from the lamp.
discard the first 10 ml of the filtrate, and subsequently collect at
least 50 ml of the filtrate.
WARNING - UV light is dangerous to the eyes. Protec-
tive goggles shall be worn.
8.4 Column clean-up
8.4.1 Preparation of the column
6.9 Spectrophotometer, suitable for making measure-
ments in the UV region of the spectrum.
Fill two-thirds of the chromatographic tube (6.4) with the
chloroform (5.1) and add 5 g of the sodium sulphate (5.10).
Check that the upper surface of the sodium sulphate layer is
6.10 Fluorodensitometer (optional).
flat, then add 10 g, in small portions, of the silica gel (5.7). Stir
carefully after each addition to eliminate air bubbles. Leave to
stand for 15 min and then carefully add 10 g of the sodium
6.11 Fluted filter paper.
sulphate (5.10). Open the tap and allow the liquid to flow until it
is just above the upper surface of the sodium sulphate layer.
e
Close the tap.
6.12 Graduated tube, of capacity 10,O ml, with a
polyethylene stopper.
8.4.2 Purification
Transfer, by means of the pipette (6.14). 50 ml of the filtrate
6.13 Conical flask, of capacity 500 ml, with a ground glass
collected in 8.3 to a 250 ml conical flask, and add 100 ml of the
stopper.
n-hexane (5.2). Mix and quantitatively transfer the mixture to
the column, rinsing the flask with the n-hexane. Open the tap
Pipette, of capacity 50 ml. and allow the liquid to flow at a rate of 8 to 12 ml/min until it is
6.14
level with the upper surface of the sodium sulphate layer. Close
the tap. Discard the liquid collected and pour 100 ml of the
6.15 Balance. diethyl ether (5.3) into the column. Again open the tap and
allow the liquid to flow until it is level with the upper surface of
the sodium sulphate layer. During these operations, ensure that
the column does not run dry.
7 Sampling
Elute with 150 ml of the chloroform/methanol mixture (5.5)
Take the laboratory sample from the material to be sampled in
and collect the whole of the eluate in the 500 ml flask of the
accordance with the International Standard for the material
rotary evaporator (6.5). Evaporate to dryness on the rotary
concerned unless sampling for the determination of aflatoxin is
evaporator, preferably under a stream of inert gas (5.121, at a
excluded from its field of application. If no appropriate Interna-
OC, and under reduced pressure.
temperature not exceeding 50
tional Standard exists, agreement should be reached between
the parties concerned, taking into account the characteristics NOTE - If a rotary evaporator is not available, add a boiling aid and
almost to dryness on a water bath.
of the material being sampled. evaporate
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-
at point B : 20 pl of the standard aflatoxin B, solution
Quantitatively transfer the residue, using the chloroform (5.1 1
or the benzene/acetonitrile mixture (5.41, to the 10 ml (5.14);
graduated tube (6.12). Again evaporate the solution, for exam-
-
at point C : 10 pI of the standard aflatoxin B, solution
ple in a water bath, preferably under a stream of inert gas
(5.14);
(5.121, and adjust the volume to 2,O ml with the chloroform
(5.1 I or the benzene/acetonitrile mixture (5.4).
- at point D : 20 pI of the standard aflatoxin 6, solution
(5.14);
8.5 Thin-layer chromatography
- at point E : 40 pI of the standard aflatoxin BI solution
(5.14).
8.5.1 Method A - One-dimensional thin-layer
Dry in a slow stream of air or inert gas (5.12). The spots ob-
chromatography
tained shall have a diameter of about 5 mm.
8.5.1.1 Choice of solvent
8.5.2.2 Development (see figure I)
The choice of solvent (5.6.1, 5.6.2, 5.6.3, 5.6.4 or 5.6.5) shall
Develop the chromatogram in direction I, in the dark, using the
be made beforehand to ensure that aflatoxins Bl and B, are
developing solvent
...
Norme internationale 6651
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION*ME~YHAPO&HAR OPrAHHIAUHR no CTAHAAF'T#3AUH#.ORGANlSATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
0 Aliments des animaux - Dosage de l'aflatoxine B,
Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B1 content
Première édition - 1983-04-01
fl
- CDU 636.085:W.W Réf. no : IS0 6651-1983 (FI
!&
Descripteurs : produit d'alimentation animale, analyse chimique, dosage, aflatoxine.
I
zi
Prix basé sur 8 pages
s
---------------------- Page: 1 ----------------------
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de I'ISO). L'élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I'ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
correspondant. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I'ISO, participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I'ISO.
La Norme internationale IS0 6651 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires, et a été soumise aux comités membres en mars 1981.
Les comités membres des pays suivants l'ont approuvée :
Afrique du Sud, Rép. d' France Philippines
Australie Hongrie Pologne
Autriche Inde Portugal
Brésil Iran Roumanie
Iraq Sri Lanka
Canada
Chili Irlande Tanzanie
Corée, Rép. de Israël Thailande
Danemark Italie Turquie
Dominicaine, République Kenya URSS
d' Malaisie Yougoslavie
Égypte, Rép. arabe
Espagne Mexique
Éthiopie Nouvelle-Zélande
Les comités membres des pays suivants l'ont désapprouvée pour des raisons techni-
ques :
Royaume-Uni
USA
Cette Norme internationale a également été approuvée par l'Union internationale de
chimie pure et appliquée (UICPA).
O Organisation internationale de normalisation, 1983 O
Imprimé en Suisse
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IS0 6651-1983 (FI
NOR M E I N TE R NAT1 O NALE
Aliments des animaux - Dosage de l‘aflatoxine B
Chromatographie sur couche mince, monodimensionnelle pour
1 Objet
le procédé A et bidimensionnelle pour le procédé B, d’une par-
tie aliquote de cette solution.
La présente Norme internationale spécifie deux procédés de
dosage de l‘aflatoxine B1 dans les aliments des animaux.
Détermination de la teneur en aflatoxine B1, par mesure visuelle
ou à l’aide d’un fluorodensitomètre, de l’intensité de fluores-
2 Domaine d’application
cence du chromatogramme examiné à la lumière UV, par com-
8
paraison avec des quantités connues d’un étalon d‘aflatoxine
Procédé A, applicable aux aliments simples suivants:
2.1
B1 placé sur la même plaque que l’échantillon.
Confirmation de l’identité de l’aflatoxine BI par formation du
- graines oléagineuses et tourteaux, et, en particulier
dérivé hémiacétal.
d’arachide, de coprah, de lin, de soja, de sésame, de
babassu;
5 Réactifs
- farine de manioc;
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue et
- tourteaux de germes de maïs;
l’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou de l’eau de pureté
- céréales et produits céréaliers; équivalente.
- farine de pois;
5.1 Chloroforme, stabilisé par 0,5 à 1,0 % d’éthanol à 96 %
-
pulpe et fécule de pommes de terre. (VI M.
En présence de substances interférentes qui entravent les
5.2 n-Hexane.
déterminations selon le procédé A, il est recommandé d’effec-
tuer la détermination selon le procédé B.
5.3 Oxyde diéthylique, anhydre, exempt de peroxydes.
2.2 Procédé B, applicable aux aliments composés ainsi
Mélange benzènelacétonitrile (98 + 2).
5.4
qu’aux aliments simples non mentionnés en 2.1.
e
Mélanger 98 volumes de benzène avec 2 volumes d’acétonitrile.
Ce procédé ne s‘applique pas aux aliments contenant des
pulpes d‘agrumes.
5.5 Mélange chloroforme/méthanol (97 + 3).
La limite de détection de l’aflatoxine Bl se situe à
2.3
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de
0.01 mg/kg.
méthanol.
3 Référence
5.6 Solvants de développement.2)
IS0 6498, Aliments des animaux - Préparation des échantil-
5.6.1 Mélange chloroforme/acétone (90 + 10).
lons pour essai. 1)
Mélanger 90 volumes de chloroforme avec 10 volumes d’acé-
4 Principe
tone, en cuve non saturée.
Extraction au chloroforme sur une prise d’essai, filtration puis 5.6.2 Mélange oxyde diéthylique/méthanol/eau
purification d’une partie aliquote sur colonne de gel de silice. (96 + 3 + 1).
Évaporation de I’éluat et dissolution du résidu dans un volume
déterminé de chloroforme ou d‘un mélange benzène- Mélanger 96 volumes d’oxyde diéthylique avec 3 volumes de
acétonitrile. méthanol et 1 volume d‘eau, en cuve non saturée.
1) Actuellement au stade de projet.
2) Les solvants doivent être utilisés dans des cuves couvertes. Lorsque des cuves saturées sont spécifiées, ceci est réalisé en les recouvrant intérieu-
rement avec du papier filtre et en laissant la cuve se saturer avec les vapeurs de solvant.
1
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IS0 6651-1983 (FI
5.6.3 Mélange oxyde diéthylique/méthanol/eau b) pour la solution dans le mélange benzène/acétonitrile :
(94 + 4,5 + 1,5).
312 x A x 1 O00
Mélanger 94 volumes d'oxyde diéthylique avec 4,5 volumes de
19 800
méthanol et 1.5 volumes d'eau, en cuve saturée.
5.14.2 Dilution
5.6.4 Mélange chloroformelméthanol (94 + 6).
Effectuer à l'abri de la lumière les dilutions convenables de la
Mélanger 94 volumes de chloroforme avec 6 volumes de métha-
solution mère (5.14.1) pour obtenir une solution étalon dont la
nol, en cuve saturée.
concentration en aflatoxine Bl soit d'environ 0,l pg/ml.
Conservée au réfrigérateur à 4 OC, cette solution est stable
5.6.5 Mélange chloroforme/méthanol (97 + 3).
durant 2 semaines.
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de métha-
nol, en cuve saturée.
5.14.3 Contrôle de la pureté chromatographique de la
solution
5.7 Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granu-
Déposer sur une plaque (6.7) une tache de 5 pI de la solution
lométrie : 0,05 à 0.20 mm.
mère d'aflatoxine Bl de concentration 8 à 10 pg/ml (5.14.1).
Développer le chromatogramme comme indiqué en 8.5.1. Sous
Gel de silice, G-HR ou équivalent, pour chromatogra-
5.8
lumière UV, la fluorescence ne doit donner lieu qu'à la percep-
phie sur couche mince.
tion d'une seule tache et aucune fluorescence ne doit être per-
çue dans la zone du dépôt d'origine.
5.9 Terre de diatomées (Hyflosupercell, lavée à l'acide.
5.15 Aflatoxines Bl et B, (voir l'avertissement en 5.141,
solutions pour l'essai qualitatif, contenant environ O, 1 pg
5.10 Sulfate de sodium, granulés anhydres.
d'aflatoxines BI et B2 par millilitre dans le chloroforme (5.1) ou
dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4).
5.11 Acide trif luoroacétique.
Ces concentrations sont données à titre indicatif. Elles doivent
être ajustées de manière à obtenir la même intensité de fluores-
5.12 Gaz inerte, par exemple azote.
cence pour les deux aflatoxines (voir 8.5.1).
5.13 Acide sulfurique, solution à 50 % ( V/ W.
6 Appareillage
5.14 Aflatoxine Bl, solution étalon contenant environ
0,l pg d'aflatoxine Bl par millilitre dans le chloroforme (5.1) ou Matériel courant de laboratoire, et notamment
dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4).
6.1 Broyeur.
AVERTISSEMENT - Les aflatoxines sont fortement can-
cérigènes et doivent être manipulées avec beaucoup de
précaution.
Tamis, de 1,0 mm d'ouverture de maille (voir IS0 565).
6.2
Préparer et contrôler la solution comme indiqué ci-après.
Appareil à secouer ou agitateur magnétique.
6.3
5.14.1 Préparation de la solution mère et détermination
de sa concentration
6.4 Tube pour chromatographie, en verre (diamètre inté-
rieur 22 mm, longueur 300 mm), avec robinet de PTFE et réser-
Préparer une solution d'aflatoxine Bl, dans le chloroforme (5.1)
voir de 250 ml, muni à son extrémité d'un tampon de coton ou
ou dans le mélange benzène/acétonitrile (5.4), de concentra-
de laine de verre.
8 et 10 pg/ml. Déterminer son spectre
tion comprise entre
d'absorption entre 330 et 370 nm à l'aide du spectrophotomètre
6.5 Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon
(6.9).
à fond rond de 500 ml.
Relever I'absorbance (A) à 363 nm dans le cas d'une solution
chloroformique, ou à 348 nm dans le cas d'une solution dans le
6.6 Appareillage pour chromatographie sur couche
mélange benzène/acétonitrile.
mince, à savoir matériel nécessaire à la préparation des pla-
ques (6.7) et au dépôt des taches (pipettes capillaires ou micro-
Calculer la concentration d'aflatoxine BI, en microgrammes par
seringues), cuve de développement et appareil pour pulvériser
millilitre de solution, à partir des formules suivantes :
l'acide sulfurique (5.13) sur les plaques.
a) pour la solution chloroformique :
6.7 Plaques de verre pour chromatographie sur couche
312 x A x IO00
mince, 200 mm x 200 mm préparées comme suit (les quanti-
20 600 tés indiquées conviennent pour recouvrir cinq plaques).
2
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IS0 6651-1983 (FI
Introduire 30 g de gel de silice (5.8) dans une fiole conique, 8.1.2 Broyer l'échantillon pour laboratoire, de façon qu'il
ajouter 60 ml d'eau, boucher et agiter durant 1 min. Étendre la
passe en totalité au travers du tamis (6.2). Bien homogénéiser.
suspension sur les plaques, de manière à obtenir une couche
(Voir IS0 6498.)
uniforme de 0,25 mm d'épaisseur. Laisser sécher à l'air et con-
server ensuite dans un dessiccateur garni de gel de silice. Au
8.2 Prise d'essai
moment de l'emploi, activer les plaques en les maintenant
durant 1 h dans une étuve à 110 OC.
Peser à 0,Ol g près, 50 g de l'échantillon pour essai dans la fiole
conique (6.13).
Les plaques prêtes à l'emploi conviennent dans la mesure où
elles donnent des résultats semblables à ceux des plaques pré-
parées comme indiqué ci-dessus.
8.3 Extraction
6.8 Lampe UV à ondes longues (360 nm). Ajouter à la prise d'essai (8.2) 25 g de terre de diatomées (5.91,
puis 25 ml d'eau et 250 ml de chloroforme (5.1) mesurés avec
L'intensité d'irradiation doit permettre de distinguer encore net- soin à l'aide d'une éprouvette. Boucher la fiole, secouer ou agi-
1,0 ng d'aflatoxine BI sur une plaque pour
tement une tache de ter durant 30 min à l'aide de l'appareil (6.3). Filtrer sur papier
chromatographie sur couche mince, à une distance de 10 cm de filtre (6.1 1) en ayant soin d'éliminer les 10 premiers millilitres de
la lampe. filtrat et de recueillir une quantité de filtrat supérieure à 50 ml.
AVERTISSEMENT - La lumière UV étant dangereuse
0
pour les yeux, il y a lieu de porter des lunettes protec- 8.4 Purification
trices.
8.4.1 Préparation de la colonne
Spectrophotomètre, permettant d'effectuer les mesu-
6.9
Remplir les deux tiers du tube pour chromatographie (6.4) avec
res dans l'ultra-violet.
du chloroforme (5.1) et ajouter 5 g de sulfate de sodium (5.10).
S'assurer que la surface supérieure de la couche de sulfate de
6.10 Fluorodensitomètre (éventuellement).
sodium est plane, puis ajouter par petites fractions 10 g de gel
de silice (5.7). Remuer avec précaution après chaque addition
6.11 Papier filtre à plis.
pour éliminer les bulles d'air. Laisser décanter durant 15 min et
ajouter ensuite avec précaution 10 g de sulfate de sodium
(5.10). Ouvrir le robinet et laisser s'écouler le liquide jusqu'à
6.12 Tube gradué, de 10,O ml de capacité, avec bouchon de
proximité immédiate de la surface supérieure de la couche de
polyéthylène.
sulfate de sodium. Fermer le robinet.
6.13 Fiole conique, de 500 ml de capacité, à bouchon rodé.
8.4.2 Purification
6.14 Pipette, de 50 ml de capacité.
Prélever à la pipette (6.14) 50 ml du filtrat recueilli en 8.3 dans
une fiole conique de 250 ml, ajouter 100 ml de n-hexane (5.2).
Mélanger et transvaser quantitativement le mélange dans la
O Balance.
colonne en rinçant avec du n-hexane. Ouvrir le robinet et laisser
s'écouler le liquide à une vitesse de 8 à 12 ml/rnin, jusqu'à la
surface supérieure de la couche de sulfate de sodium. Fermer le
7 Échantillonnage
robinet. Eliminer le liquide récupéré et ajouter dans la colonne
100 ml d'oxyde diéthylique (5.3). Ouvrir le robinet et éliminer à
Prélever l'échantillon pour laboratoire sur le produit à échantil-
à la Norme internationale relative au nouveau le liquide jusqu'à la surface supérieure de la couche de
lonner, en se conformant
sulfate de sodium. Veiller lors de ces opérations à ce que la
produit concerné, sauf si l'échantillonnage en vue de la déter-
mination de l'aflatoxine est exclu de son domaine d'application. colonne ne soit pas mise à sec.
S'il n'existe pas de Norme internationale appropriée, les parties
concernées doivent se mettre d'accord, en tenant compte des 150 ml du mélange chloroforme/méthanol (5.5)
Verser ensuite
caractéristiques du produit à échantillonner. et récupérer la totalité de I'éluat dans le ballon de 500 ml de
l'évaporateur rotatif (6.5). Évaporer à sec à l'aide de I'évapora-
teur rotatif, de préférence sous un courant de gaz inerte (5.12).
à pression réduite et à une température ne dépassant pas 50 OC.
8 Mode opératoire
NOTE - En l'absence d'un évaporateur rotatif, ajouter un régularisa-
8.1 Préparation de l'échantillon pour essai
teur d'ébullition et évaporer presque jusqu'à sec sur un bain d'eau.
8.1.1 Si l'échantillon contient plus de 5 % de matières gras- Transvaser quantitativement le résidu dans le tube gradué de
ses, celui-ci doit être dégraissé à l'éther de pétrole avant 10 ml (6.12) à l'aide de chloroforme (5.1) ou du mélange
d'effectuer le broyage. benzène/acétonitrile (5.4). Évaporer à nouveau la solution, par
exemple dans un bain d'eau, de préférence sous un courant de
Les résultats devront alors être rapportés à la masse d'échantil- gaz inerte (5.121, et amener ensuite le volume à 2,O ml avec du
lon non dégraissé. chloroforme (5.1) ou du mélange benzène/acétonitrile (5.4).
3
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IS0 6651-1983 (FI
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au point D : 20 pI de la solution étalon (5.14);
8.5 Chromatographie sur couche mince
-
au point E : 40 pl de la solution étalon (5.14).
8.5.1
Procédé A - Chromatographie mono-
dimensionnelle
Sécher à l’aide d’un léger courant d’air ou de gaz inerte (5.12).
Les taches obtenues doivent avoir un diamètre de 5 mm
8.5.1.1 Choix du solvant
environ.
Le choix du solvant (5.6.1, 5.6.2,5.6.3, 5.6.4 et 5.6.5) doit être
effectué au préalable afin de s‘assurer que les aflatoxines BI et
8.5.2.2 Développement (voir figure 1)
B2 sont complètement séparées lorsque l
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.