ISO 11348-1:2007
(Main)Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 1: Method using freshly prepared bacteria
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 1: Method using freshly prepared bacteria
ISO 11348 describes three methods for determining the inhibition of the luminescence emitted by the marine bacterium Vibrio fischeri (NRRL B‑11177). ISO 11348-1:2007 specifies a method using freshly prepared bacteria. This method is applicable to: waste water; aqueous extracts and leachates; fresh water (surface and ground water); sea and brackish water; eluates of sediment (fresh water, brackish and sea water); pore water; single substances, diluted in water.
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries luminescentes) — Partie 1: Méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées
L'ISO 11348 décrit trois méthodes de détermination de l'inhibition de la luminescence émise par la bactérie marine Vibrio fischeri (NRRL B-11177). L'ISO 11348-1:2007 spécifie une méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées. Cette méthode est applicable aux eaux usées, aux extraits aqueux et aux lixiviats, aux eaux douces (eaux de surface ou souterraines), à l'eau de mer ou aux eaux saumâtres, aux éluats de sédiments (eau douce, eau saumâtre et eau de mer), aux eaux interstitielles et aux substances individuelles diluées dans l'eau.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 11348-1
Второе издание
2007-12-01
Качество воды. Определение
ингибиторного воздействия проб воды
на испускание света бактериями Vibrio
fischeri (тест на люминесцентные
бактерии).
Часть 1.
Метод с применением
свежеприготовленных бактерий
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples
on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) —
Part 1: Method using freshly prepared bacteria
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 11348-1:2007(R)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe — торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2007
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Сущность метода.2
4 Мешающие элементы .2
5 Реактивы и материалы.2
6 Аппаратура.4
7 Отбор проб и предварительная подготовка проб .5
8 Выращивание люминесцентных бактерий .6
9 Методика .8
10 Оценка.9
11 Обработка результатов.11
12 Критерии достоверности .13
13 Прецизионность.13
14 Протокол испытания.13
Приложение A (информативное) Метод коррекции цвета .15
Приложение B (информативное) Уровень разведения D. Приготовление серии разведений .18
Приложение C (информативное) Показатели прецизионности.21
Приложение D (информативное) Анализ проб соленой воды со свежеполученными
люминесцентными бактериями.22
Библиография.25
© ISO 2007 — Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член ISO, заинтересованный
в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в
этом комитете. Международные организации, правительственные и неправительственные, имеющие
связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO непосредственно сотрудничает с
Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам электротехнической
стандартизации.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего документа могут быть объектом патентных
прав. ISO не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных
прав.
ISO 11348-1 был разработан Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 5,
Биологические методы.
Настоящее второе издание отменяет и заменяет первое издание (ISO 11348-1:1998), которое прошло
технический пересмотр.
ISO 11348 включает следующие части под общим заголовком Качество воды. Определение
ингибиторного воздействия проб воды на световое излучение бактерий Vibrio fischeri (Тест на
люминесцентные бактерии):
Часть 1. Метод с применением свежеприготовленных бактерий
Часть 2. Метод с применением высушенных бактерий
Часть 3. Метод с применением бактерий лиофильной сушки
iv © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
Введение
Измерения, установленные в ISO 11348 можно осуществить, используя свежеприготовленные
бактерии, а также бактериальные препараты после обычной или сублимационной сушки.
Стандартизованные методы, разработанные и осуществленные DIN Normenausschuss Wasserwesen и
ISO/TC 147/SC 5/WG 1 показали, что в определенных случаях такие разные способы подготовки
бактерий могут давать отличающиеся результаты, особенно в присутствии тяжелых металлов.
Изменчивая чувствительность вызвана различиями в составе используемых для получения бактерий
обычной и лиофильной сушки сред. Эти защитные среды влияют на биологическую доступность
ядовитых веществ и/или излучение света люминесцентными бактериями. Это означает, что
происхождение и тип препарата необходимо принимать в расчет при интерпретации результатов. Это
иногда трудно сделать, поскольку бактерии обычной и лиофильной сушки могут быть получены от
разных поставщиков. Это, в свою очередь, может означать, что состав подробно неизвестен и поэтому
не может быть истолкован пользователем.
По этой причине в дополнение к измерениям токсичности высушенных бактерий (ISO 11348-2) и
бактерий лиофильной сушки (ISO 11348-3), описывается процедура, использующая
свежеприготовленные бактерии, в данной части ISO 11348, выполнение которой может толковаться
пользователем очень подробно.
Лаборатории, ответственные за результаты, имеют возможность выбора наиболее подходящего
метода на основе оценки специалистов и информации об испытуемой пробе воды.
© ISO 2007 — Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 11348-1:2007(R)
Качество воды. Определение ингибиторного воздействия
проб воды на испускание света бактериями Vibrio fischeri
(тест на люминесцентные бактерии).
Часть 1.
Метод с применением свежеприготовленных бактерий
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ— Пользователи настоящей части ISO 11348 должны быть знакомы с
обычной лабораторной практикой. Настоящий международный стандарт не ставит цели решить
все проблемы, связанные с безопасностью, если таковые возникают в процессе его
использования. Пользователь сам несет ответственность за установление соответствующих
правил безопасности и охраны здоровья, а также за обеспечения соответствия всем
регламентным требованиям.
ВНИМАНИЕ— Чрезвычайно важно, чтобы все испытания, проводимые в соответствии с
настоящей частью ISO 11348, выполнялись персоналом с соответствующей подготовкой.
1 Область применения
ISO 11348 описывает три метода для определения подавления люминесценции, производимой
морскими бактериями Vibrio fischeri (NRRL B-11177). В данной части ISO 11348 устанавливается метод
с использованием свежеприготовленных бактерий.
Этот метод применим к:
сточной воде;
водным экстрактам и продуктам выщелачивания;
свежей воде (поверхностным и грунтовым водам);
морской и солоноватой воде;
элюатам отстоя (свежей, солоноватой и морской воды);
внутрипоровой воде;
отдельным веществам, растворенным в воде.
2 Нормативные ссылки
Нижеследующие документы являются обязательными для применения данного документа. Для
датированных ссылок действительно только указанное издание. В случае недатированных ссылок
используется последняя редакция документа, на который дается ссылка (включая все изменения).
ISO 5667-16, Качество воды. Отбор проб. Часть 16: Руководство по биотестированию образцов
© ISO 2007 — Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
ISO 5814, Качество воды. Определение содержания растворенного кислорода. Электрохимический
метод с применением зонда
ISO 7027, Качество воды. Определение мутности
3 Сущность метода
Подавление излучения света культурами Vibrio fischeri определяют посредством анализа серии. Оно
заключается в соединении установленных объемов испытуемой пробы или разбавленной пробы с
суспензией люминесцентных бактерий в пробирке.
Критерием испытания является люминесценция, измеренная по прошествии установленного времени
контакта, от 15 мин до 30 мин, иногда по выбору 5 мин, принимая во внимание поправочный
коэффициент (f ), который является мерой изменения интенсивности контрольных проб в течение
kt
времени экспонирования. Эффект подавления, вызванного пробой воды, можно определить как LID
(см. Приложение B) или как EC и/или значений EC с помощью серии разведений. (EC =
20 50
эффективная концентрация).
4 Мешающие элементы
Нерастворимые, плохо растворимые или летучие вещества, или вещества, вступающие в реакцию с
водой для разбавления или с суспензией, или изменяющие свое состояние во время периода
испытания, могут повлиять на результаты или ухудшить воспроизводимость результатов испытания.
Убыль люминесценции, вызванная поглощением света или рассеянием света, может произойти в
случае сильно окрашенных или мутных вод. Такие помехи можно скомпенсировать путем обработки на
мутность (7.2) или, например, путем использования двухкамерной трубки коррекции поглощения (см.
Приложение A).
[6]
Поскольку кислород требуется для биолюминесценции , пробы с высоким потреблением кислорода
(и/или низкой концентрацией кислорода) могут вызывать дефицит кислорода и поэтому являются
ингибиторными.
Легко биологически разлагающиеся питательные вещества в пробе могут привести к независимому от
[1]
примесей понижению биолюминесценции .
Пробы, значения pH которых выпадает за диапазон от pH = 6,0 до pH = 8,5, влияют на люминесценцию
[6], [7]
бактерий . Регулирование рН пробы требуется, если токсичный эффект pH не желателен.
Поскольку испытуемые микроорганизмы Vibrio fischeri являются морскими бактериями, испытание проб
солоноватой воды с помощью стандартного метода часто приводит к стимуляции биолюминесценции,
что может замаскировать ингиюирующие эффекты (см. Приложение D).
Концентрация соли в исходной пробе, превышающая 30 г/л NaCl, или содержание других веществ,
дающих аналогичную осмолярность, может привести, наряду с добавлением соли, требуемым
испытанием, к гиперосмотическим эффектам. Результирующая концентрация соли в испытуемых
пробах не должна превышать осмолярность раствора концентрацией 35 г/л NaCl, чтобы избежать
таких эффектов.
5 Реактивы и материалы
Используют химические реактивы признанной аналитической чистоты. Воду используют
дистиллированную или равноценной чистоты.
2 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
5.1 Испытуемые бактерии.
Используют штамм люминесцентных бактерий, принадлежащих виду Vibrio fischeri NRRL B-11177.
Бактериальный штамм можно приобрести в виде имеющихся в продаже высушенных бактерий или
бактерий лиофильной сушки, или из коллекции культур, например, в Deutsche Sammlung für
Mikrorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 10, D-38124 Braunschweig, Germany, или NRRL,
ARS Culture collection NCAUR, 1815 N, University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Бактериальные
суспензии, используемые для измерения токсичности, должны быть свежеприготовленными из культур.
5.2 Раствор хлорида натрия, в качестве разбавителя.
Растворяют 20 г хлорида натрия (NaCl) в воде и доводят до 1 л водой.
5.3 Раствор гидроксида натрия, например, c(NaOH) = 1 моль/л.
5.4 Соляная кислота, например, c(HCl) = 1 моль/л.
Для регулировки pH может потребоваться использовать кислоты или основания низкой или высокой
концентрации.
5.5 Раствор для получения свежеприготовленных бактерий.
8,0 г D(+)-глюкозы моногидрат (C H O ·H O)
6 12 6 2
20,0 г Хлорид натрия (NaCl)
2,035 г Гексагидрат хлорида магния (MgCl ·6 H O)
2 2
0,30 г Хлорид калия (KCl)
11,9 г N-(2-Гидроксиэтил)пиперазин-N-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES)
Растворяют в воде, перемешивают в течение примерно 30 мин и регулируют pH до 7,0 ± 0,2 раствором
гидроксида натрия (5.3) или соляной кислоты (5.4). Доводят до объема 1 л водой.
Этот раствор можно хранить порциями при температуре от −18 °C до −20 °C.
5.6 Контрольные вещества.
Готовят следующие исходные растворы контрольных веществ с раствором хлорида натрия (5.2) в
качестве растворителя по отдельности, без регулировки pH:
219,8 мг/л Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO ·7 H O)
4 2
9 мг/л 3,5-дихлорофенол (C H OCl ) (чистота W 99 %)
6 4 2
22,6 мг/л Дихромат калия (K Cr O )
2 2 7
Эти концентрации примерно вдвое превышают ожидаемые значения EC для соответствующих
50
контрольных веществ в данной части ISO 11348. Требуемые объемы зависят от установочных
параметров испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ Можно использовать имеющиеся в продаже химические препараты с определенной
концентрацией ZnSO и K Cr O (титрисол) для приготовления исходных растворов контрольных веществ.
4 2 2 7
5.7 Жидкий питательный бульон для предварительных и основных культур.
30 г Хлорид натрия (NaCl)
6,10 г Моногидрат дигидрофосфата натрия (NaH PO ·H O)
2 4 2
2,75 г Тригидрат гидрофосфата калия (K HPO ·3 H O)
2 4 2
© ISO 2007 — Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
0,204 г Гептагидрат сульфата магния (MgSO ·7 H O)
4 2
0,500 г Гидрофосфат аммония [(NH ) HPO ]
4 2 4
3 мл Глицерин
5,00 г Казопептон
0,50 г Экстракт дрожжей
Растворяют компоненты в воде и доводят pH до 7,0 ± 0,2 раствором гидроксида натрия (5.3) или
соляной кислоты (5.4). Доводят до объема 1 л водой. Переносят 50 мл каждого раствора в колбы
Эрленмейера (например, 250 мл) и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 20 мин.
Казопептон и экстракт дрожжей, предлагаемые различными поставщиками, могут отличаться по
качеству. При возникновении проблем (например, подавлении роста), рекомендуется приобрести
продукт у другого изготовителя.
5.8 Агаризованная среда для исходных культур.
Доводят рН жидкого питательного бульона (5.7) до pH 7,0 ± 0,2.
Добавляют 12 г агара на литр и растворяют при небольшом нагревании; стерилизуют и переносят в
стерильные чашки Петри.
5.9 Защитная среда.
66 г D(+)-Глюкозы моногидрат (C H O ·H O)
6 12 6 2
4 г Хлорид натрия (NaCl)
2 г L-Гистидин
0,5 г Альбумин бычьей сыворотки, BSA
Полностью растворяют в воде при температуре примерно 37 °C и доводят pH до 7,0 ± 0,2 при
комнатной температуре раствором гидроксида натрия (5.3) или соляной кислоты (5.4) по мере
необходимости. Доводят водой до 100 мл.
Разрушение бактериальных клеток при замораживании предотвращают с помощью защитной среды.
BSA от разных поставщиков может иметь разное качество. При возникновении проблем рекомендуется
сменить изготовителя.
Готовят защитную среду непосредственно перед каждым применением.
6 Аппаратура
6.1 Термоблок с термостатическим контролем, для поддержания испытуемых проб при
температуре 15 °C ± 1 °C. В процессе одного эксперимента температура не должна отклоняться более
чем на ± 0,3 °C.
6.2 Водяная баня или термоблок, Чтобы поддерживать объем не менее 12 мл (например, сосуд с
реактивом) раствора, приготовленного в 5.5, при температуре 15 °C ± 1 °C.
6.3 Люминометр, измерительная ячейка, поддерживаемая при температуре 15 °C ± 1 °C,
оснащенная подходящими пробирками.
6.4 Пробирки, изготовленные из химически стойкого материала, подходящие к выбранному
люминометру вместимостью, которая помогает снимать показания по максимально возможно площади
поверхности и вмещается в термоблок (6.1).
4 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
6.5 pH-метр.
6.6 Хронометр.
6.7 Поршневые пипетки или пластиковые шприцы, 100 мкл, 500 мкл и 1 000 мкл.
6.8 Поршневые пипетки, переменного объема, от 10 мл до 200 мл и от 200 мкл до 5 000 мкл.
6.9 Центрифуга с охлаждением.
6.10 Магнитный смеситель и магнитная мешалка.
6.11 Инкубационный вибратор, для инкубирования колб Эрленмейера.
6.12 Автоклав.
6.13 Инкубатор.
6.14 Спектральный фотометр или фотометр с фильтром и пробирки, с оптической длиной пути
1 см.
6.15 Бактериологическая петля для посева культур (или игла).
6.16 Кондуктометр.
6.17 Морозильная камера, для хранения растворов и суспензий.
6.18 Зонд для определения кислорода, в соответствии с ISO 5814.
7 Отбор проб и предварительная подготовка проб
7.1 Отбор проб
Пробы собирают в химически инертные чистые контейнеры в соответствии с ISO 5667-16. Контейнеры
наполняют полностью и герметично закрывают. Пробы испытывают, по возможности, быстро после
отбора. Там где необходимо, хранят пробы при температуре от 2 °C до 5 °C в темном месте в
контейнерах не более 48 ч. До 2 месяцев можно хранить при температуре u −18 °C. Не допускается
использовать специальные химические вещества для хранения. Выполняют необходимую регулировку
pH и добавляют соль непосредственно перед испытанием.
7.2 Подготовка пробы
Измеряют концентрацию кислорода во всех пробах. Для испытания требуется концентрация кислорода
> 3 мг/л. Если концентрация кислорода в неразбавленной пробе меньше 3 мг/л, используют
адекватные методы для насыщения пробы кислородом, например, аэрацию или перемешивание.
Измеряют pH всех проб. если значение pH попадает в диапазон от 6,0 до 8,5, в регулировании рН
обычно нет необходимости. Регулировка значения pH, однако, может изменять природу пробы. С
другой стороны, pH пробы и pH испытуемой партии могут отличаться в результате буферной емкости
испытательной среды. Может потребоваться осуществлять испытания на пробах с отрегулированным
рН и на пробах с не отрегулированным рН.
Если необходимо, регулируют pH пробы путем добавления либо соляной кислоты (5.4), либо раствор
гидроксида натрия (5.3). В зависимости от цели испытания pH можно довести до 7,0 ± 0,2 или выше до
(8,5 ± 0,2) с нижним пределом (6,0 ± 0,2). Выбирают концентрацию соляной кислоты или раствора
гидроксида натрия , так чтобы ограничить добавляемый объем до не более 5 % от общего объема.
© ISO 2007 — Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
Добавляют 20 г раствора хлорида натрия на литр пробы воды или к нейтрализованной пробе воды.
Для проб с высокой концентрацией солей измеряют соленость и добавляют такое количество соли,
которое необходимо для регулирования осмолярности до 20 г/л NaCl.
Если проба содержит от 20 г/л до 50 г/л эквивалента NaCl, соли добавлять не требуется.
Результирующая концентрация соли в испытуемых пробах не должна превышать осмолярности 35 г/л
раствора хлорида натрия.
Дополнительную информацию в отношении проб соленой воды см. Приложение D.
Очень мутные пробы необходимо выдержать в течение 1 ч, чтобы дать отстояться, или
центрифугировать, например, в течение 10 мин при 5 000g, или фильтровать. Используют для
испытания надосадочную жидкость или фильтрат.
8 Выращивание люминесцентных бактерий
8.1 Исходные культуры
Переносят люминесцентные бактерии штамма Vibrio fischeri NRRL B-11177 (5.1) в условиях
стерильности в чашки Петри, содержащие агаризованную среду для исходных культур (5.8).
Инкубируют в инкубаторе в течение от 2 дней до 3 дней при температуре 20 °C ± 1 °C.
Маркируют отдельные люминесцентные колонии при визуальном наблюдении в темноте и после этого
держат чашки в холодильнике.
Переносят помеченные колонии в условиях стерильности в другие, свежие чашки после хранения в
течение 1 недели – максимум двух недель.
Имеющиеся в продаже флаконы и консервированными бактериями обычно разливают в нестерильных
условиях. Для выращивания чистых культур рекомендуется выполнить несколько пересевов
отдельных колоний. Чтобы предотвратить генные изменения, можно каждые шесть месяцев открывать
новый флакон с консервированными бактериями и использовать эти бактерии.
ПРИМЕЧАНИЕ Люминесценция колоний люминесцентных бактерий может ослабляться при хранении.
8.2 Подготовка предварительных культур
Высевают 50 мл предварительного питательного бульона (5.7) в колбах Эрленмейера (например,
вместимостью 250 мл) в условиях стерильности отдельные колонии люминесцентных бактерий
исходной культуры возрастом от 2 дней до 3 дней.
Встряхивают в течение 21 ч ± 1 ч при температуре 20 °C ± 1 °C с периодичностью не менее
–1
180 об·мин .
Определяют мутность разведения 1 к 10 культур в растворе хлорида натрия (5.2), например, в
формазиновых единицах ослабления (излучения) (FAU) при длине волны 578 нм, в соответствии с
ISO 7027.
8.3 Подготовка основной культуры
Засевают 50 мл основного питательного бульона (5.7) в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл
соответствующим количеством подготовленной культуры (8.2), чтобы получить расчетную начальную
мутность 10 FAU.
6 © ISO 2007 — Все права сохраняются
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
Встряхивают в течение 20 ч ± 1 ч при температуре 20 °C ± 1 °C с периодичностью не менее
–1
180 об·мин .
Определяют мутность, в единицах FAU, в разведении 1 к 10 в растворе хлорида натрия (5.2)
фотометрически при длине волны 578 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ Следуя указанным выше условиям, неразбавленная основная культура обычно имеет мутность
от 700 FAU до1 800 FAU.
8.4 Подготовка исходной суспензии
Предварительно охлаждают раствор хлорида натрия (5.2) и защитную среду (5.9) на льду.
Центрифугируют бактериальную суспензию из основной культуры (8.3) при температуре 4 °C ± 2 °C в
предварительно охлажденной центрифуге, в течение от 15 мин до 20 мин при 6 000g ± 2 000g.
Декантируют надосадочную жидкость и снова суспендируют осадок в 5 -10 мл на 50 мл основной
культуры, в охлажденном на льду растворе хлорида натрия (5.2).
Повторяют центрифугирование в тех же условиях.
Декантируют надосадочную жидкость и снова суспендируют осадок в 0,5 мл, на 50 мл основной
культуры, в охлажденном на льду растворе хлорида натрия (5.2).
Переносят бактериальную суспензию в предварительно охлажденный химический стакан (например,
вместимостью 100 мл) и помещают на лед.
Медленно добавляют при постоянном охлаждении на льду и перемешивании примерно 4 мл защитной
среды (5.9) на 50 мл основной культуры.
Фотометрически определяют мутность разведения 1 к 100 раствором хлорида натрия (5.2).
Добавляют предварительно охлажденную защитную среду (5.9) быстро до значения расчетной
мутности равного 2 500 FAU ± 500 FAU или эквивалентной (см. Примечание к 8.1).
Для приготовления подходящей исходной суспензии рекомендуется добавлять не менее 10 мл
защитной среды на миллилитр суспензии в растворе хлорида натрия. После добавления защитной
среды биолюминесценция заметно уменьшается, но восстанавливается после добавления разведения.
Продолжают перемешивание не менее 15 мин, чтобы получить гомогенную смесь.
Распределяют аликвотные количества по 100 мкл в подходящие пробирки (6.4).
Удобно использовать пробирки такого типа , как описаны в следующей процедуре (Раздел 9).
Для использования в будущем, хранят исходные суспензии в морозильной камере при температуре
u −20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ Исходную суспензию можно использовать для определения в течение нескольких месяцев. При
температуре–70 °C суспензию можно хранить даже более длительные периоды.
Повторно замороженные исходные суспензии можно использовать только для предварительных
испытаний.
Исходные суспензии можно использовать для определений пока выполняется критерий достоверности
(см. Раздел 12).
© ISO 2007 — Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 11348-1:2007(R)
9 Методика
Готовят контрольные пробы согласно 5.6. Анализируют каждую серию бактерий со всеми тремя
контрольными веществами. Анализируют не менее одного из трех контрольных веществ параллельно
с каждой пробиркой исходной суспензии, оттаянной для анализа.
Пробы готовят в соответствии с 7.2.
Берут пробирку, содержащую исходную суспензию (8.4) из морозильной камеры и помещают на
водяную баню при температуре 20 °C ± 2 °C , чтобы она оттаяла.
Испытуемую суспензию готовят в два этапа:
Добавляют 0,5 мл раствора (5.5) на 100 мкл исходной суспензии в пробирке, поддерживаемой при
температуре 15 °C ± 1 °C, и гомогенизируют путем осторожного встряхивания пробирки.
Выдерживают в течение 15 мин.
Пипетируют этот раствор, например, в реакционный сосуд вместимостью 20 мл и добавляют 11,5 мл
раствора (5.5), поддерживаемого при температуре 15 °C ± 1 °C, и гомогенизируют путем осторожного
встряхивания реакционного сосуда.
Выдерживают в течение 15 мин.
Готовят первый набор пробирок (6.4), серии разведения пробы, контрольную пробу (5.6) и требуемые
контроли (5.2).
Обычная подготовка серии разведения описана в Приложении B. В зависимости от цели анализа и
статистических требований в отношении результатов испытания, могут использоваться другие
пропорции разведений с концентрациями, распределенными в геометрическом ряду или
логарифмическом ряду. Благодаря смешению равных объемов пробы/разбавленной пробы и
испытуемой суспензии самая высокая концентрация пробы в анализе составляет, как правило, 50 %
собственно пробы. Для испытания практически неразбавленных проб воды (80 % пробы), требуется
дополнительная контрольная серия (см. B.2 и Таблицу 1).
Поддерживают пробирки, содержащие раствор хлорида натрия (5.2) для контроля, контрольные пробы
(5.6), сами пробы (7.2) и пробы серии разведения (Таблица B.1) при температуре 15 °C ± 1 °C.
Выбирают условия испытания, которые гарантируют максимальное отклонение температуры в
термоблоке в процессе одного эксперимента не более ± 0,3 °C.
Для испытаний с равными объемами исходной суспензии и пробы пипетируют порции по 500 мкл
исходной суспензии во второй соответствующий набор пробирок (6.4), поддерживаемых при
температуре 15 °C ± 1 °C в инкубаторе, с такими же интервалами времени (от 5 с до 20 с), как
используются для последующих измерений интенсивности излучения.
Выполняют два параллельных измерения на уровень разведения при температуре испытания
15 °C ± 1 °C.
Регулируют люминометр на удобные близкие к максимуму установочные параметры.
Определяют и регистрируют интенсивность люминесценции, I , испытуемых суспензий с помощью
0
люминометра.
Поскольку время контакта для всех испытуемых проб должно быть одинаковым, используют хронометр
(6.6) для измерения интенсивности люминесценции через ра
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11348-1
Second edition
2007-12-01
Water quality — Determination
of the inhibitory effect of water samples
on the light emission of Vibrio fischeri
(Luminescent bacteria test) —
Part 1:
Method using freshly prepared bacteria
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons
d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de bactéries
luminescentes) —
Partie 1: Méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées
Reference number
ISO 11348-1:2007(E)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2007
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 2
4 Interferences . 2
5 Reagents and materials . 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling and sample pretreatment. 5
8 Cultivation of luminescent bacteria. 5
9 Procedure . 7
10 Evaluation. 8
11 Expression of results . 10
12 Criteria of validity. 11
13 Precision. 12
14 Test report . 12
Annex A (informative) Colour-correction method. 13
Annex B (informative) Dilution level D – Preparation of the dilution series. 16
Annex C (informative) Precision data. 19
Annex D (informative) Testing salt water samples with the luminescent bacteria test with freshly
cultured bacteria. 20
Bibliography . 23
© ISO 2007 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11348-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11348-1:1998), which has been technically
revised.
ISO 11348 consists of the following parts, under the general title Water quality — Determination of the
inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test):
⎯ Part 1: Method using freshly prepared bacteria
⎯ Part 2: Method using liquid-dried bacteria
⎯ Part 3: Method using freeze-dried bacteria
iv © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
Introduction
The measurements specified in ISO 11348 can be carried out using freshly prepared bacteria, as well as
freeze-dried or liquid-dried bacterial preparations.
Standardized work carried out by DIN Normenausschuss Wasserwesen and ISO/TC 147/SC 5/WG 1 has
shown that, in special cases, these different techniques may deliver different results, especially in the
presence of heavy metals.
Such varying sensitivity is caused by differences in media composition used in the preparation of freeze-dried
or liquid-dried bacteria. These protective media influence the bioavailability of toxicants and/or the light
emission of luminescent bacteria. This means that the origin and type of preparation need to be taken into
account when interpreting the results. This may be difficult sometimes, as freeze-dried and liquid-dried
bacteria may be obtained from different suppliers. This, in turn, can mean that the composition is not known in
detail and therefore cannot be interpreted by the user.
For this reason, in addition to toxicity measurements with liquid-dried bacteria (ISO 11348-2) and freeze-dried
bacteria (ISO 11348-3), a procedure with freshly prepared bacteria is described in this part of ISO 11348, the
performance of which can be interpreted by the user in every detail.
The laboratories responsible for the results have the opportunity to select the most suitable technique based
on expert judgement and information about the water sample to be tested.
© ISO 2007 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11348-1:2007(E)
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water
samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent
bacteria test) —
Part 1:
Method using freshly prepared bacteria
WARNING — Persons using this part of ISO 11348 should be familiar with normal laboratory practice.
This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It
is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to ensure
compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this part of
ISO 11348 be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
ISO 11348 describes three methods for determining the inhibition of the luminescence emitted by the marine
bacterium Vibrio fischeri (NRRL B-11177). This part of ISO 11348 specifies a method using freshly prepared
bacteria.
This method is applicable to:
⎯ waste water;
⎯ aqueous extracts and leachates;
⎯ fresh water (surface and ground water);
⎯ sea and brackish water;
⎯ eluates of sediment (fresh water, brackish and sea water);
⎯ pore water;
⎯ single substances, diluted in water.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 7027, Water quality — Determination of turbidity
© ISO 2007 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
3 Principle
The inhibition of light emission by cultures of Vibrio fischeri is determined by means of a batch test. This is
accomplished by combining specified volumes of the test sample or the diluted sample with the luminescent
bacteria suspension in a test tube.
The test criterion is the luminescence, measured after a contact time of 15 min or 30 min and optionally 5 min,
taking into account a correction factor (f ), which is a measure of intensity changes of control samples during
kt
the exposure time. The inhibitory effect of the water sample can be determined as LID (see Annex B) or as
EC - and/or EC -values by means of a dilution series. (EC is the effective concentration).
20 50
4 Interferences
Insoluble, slightly soluble or volatile substances or substances which react with the dilution water or the
suspension, or alter their state during the test period, may affect the result or impair the reproducibility of the
test results.
Losses of luminescence caused by light absorption or light scattering may occur in the case of strongly
coloured or turbid waters. This interference can be compensated by a sample treatment for turbidity (7.2) or,
for example, by using a double-chambered absorption correction test tube (see Annex A).
[6]
Since oxygen is required for the bioluminescence , samples with a high oxygen demand (and/or a low
oxygen concentration) may cause a deficiency of oxygen and be inhibitory.
Readily biodegradable nutrients in the sample may cause a pollutant-independent reduction in
[1]
bioluminescence .
[6], [7]
Samples with a pH outside the range of pH = 6,0 and pH = 8,5 affect the luminescence of the bacteria .
An adjustment of the sample is required when the toxic effect of pH is not wanted.
As the test organism Vibrio fischeri is a marine bacterium, testing salt-water samples with the standard
procedure often leads to stimulation effects of bioluminescence, which may mask inhibition effects (see
Annex D).
Salt concentrations in the initial sample exceeding 30 g/l NaCl, or contents of other compounds giving equal
osmolarity may lead, together with the salt spiking required by the test, to hyperosmotic effects. The resulting
salt concentration in the test samples should not exceed the osmolarity of a 35 g/l NaCl solution in order to
avoid these effects.
5 Reagents and materials
Use chemicals of recognized analytical grade quality. Use distilled water or water of equivalent purity.
5.1 Test bacteria.
Use a strain of luminescence bacteria belonging to the species Vibrio fischeri NRRL B-11177. The bacteria
strain can be taken from commercially available freeze-dried or liquid-dried reagents or from culture
collections, e.g. Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 10,
D-38124 Braunschweig, Germany, or NRRL, ARS Culture collection NCAUR, 1815 N, University Street,
Peoria, Illinois 61604, USA. The bacterial suspensions used for toxicity measurements shall be freshly
prepared from cultures.
5.2 Sodium chloride solution, as diluent.
Dissolve 20 g of sodium chloride (NaCl) in water and make up to 1 l with water.
2 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
5.3 Sodium hydroxide solution, e.g. c(NaOH) = 1 mol/l.
5.4 Hydrochloric acid, e.g. c(HCl) = 1 mol/l.
For the adjustment of the pH, it may be necessary to use acids or bases of lower or higher concentration.
5.5 Solution for freshly prepared bacteria.
8,0 g D(+)-Glucose monohydrate (C H O ·H O)
6 12 6 2
20,0 g Sodium chloride (NaCl)
2,035 g Magnesium chloride hexahydrate (MgCl ·6 H O)
2 2
0,30 g Potassium chloride (KCl)
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES)
11,9 g
Dissolve in water, stir for about 30 min and adjust the pH to 7,0 ± 0,2 with sodium hydroxide solution (5.3) or
hydrochloric acid (5.4). Make up to 1 l with water.
This solution may be stored in portions at −18 °C to −20 °C.
5.6 Reference substances.
Prepare the following reference-substance stock solutions with sodium chloride solution (5.2) as diluent
separately, without adjustment of the pH:
219,8 mg/l Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO ·7 H O)
4 2
9 mg/l 3,5-Dichlorophenol (C H OCl ) (purity W 99 %)
6 4 2
22,6 mg/l Potassium dichromate (K Cr O )
2 2 7
These concentrations are approximately twice the expected EC -values for the respective reference
50
substances in this part of ISO 11348. The volumes required depend on the test set-up.
NOTE It is possible to use commercially available chemical preparations with defined concentrations of ZnSO and
4
K Cr O (titrisol) for the preparation of the stock solutions of the reference substances.
2 2 7
5.7 Liquid broth for pre- and main cultures.
30 g Sodium chloride (NaCl)
6,10 g Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (NaH PO ·H O)
2 4 2
2,75 g Dipotassium hydrogenphosphate trihydrate (K HPO ·3 H O)
2 4 2
0,204 g Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ·7 H O)
4 2
0,500 g Diammonium hydrogenphosphate [(NH ) HPO ]
4 2 4
3 ml Glycerol
5,00 g Caso-peptone
0,50 g Yeast extract
Dissolve in water and adjust the pH to 7,0 ± 0,2 with sodium hydroxide solution (5.3) or hydrochloric acid (5.4).
Make up to 1 l with water. Transfer 50 ml each to Erlenmeyer flasks (e.g. 250 ml) and sterilize in an autoclave
at 121 °C for 20 min.
Caso-peptone and yeast extract offered by different suppliers can vary in quality. In case of problems (e.g.
growth inhibition), it is recommended to purchase the product from another manufacturer.
© ISO 2007 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
5.8 Agar medium for stock cultures.
Adjust the liquid broth (5.7) to pH 7,0 ± 0,2.
Add 12 g of agar per litre and dissolve by gentle warming; sterilize and transfer to sterile Petri dishes.
5.9 Protective medium.
66 g D(+)-Glucose monohydrate (C H O ·H O)
6 12 6 2
4 g Sodium chloride (NaCl)
2 g L-Histidine
0,5 g Bovine serum albumin, BSA
Dissolve completely in water at about 37 °C and adjust the pH to 7,0 ± 0,2 at room temperature with sodium
hydroxide solution (5.3) or hydrochloric acid (5.4) as necessary. Make up to 100 ml with water.
Damage of bacterial cells during the freezing procedure is prevented by the use of the protective medium.
BSA offered by different suppliers can vary in quality. If problems occur, it is recommended to purchase the
product from another manufacturer.
Prepare protective medium freshly before use.
6 Apparatus
6.1 Thermostatically controlled thermo-block, to maintain the test samples at a temperature of
15 °C ± 1 °C. Within one test, the temperature deviation should be at most ± 0,3 °C.
6.2 Water bath or thermostatically controlled thermo-block, to maintain at least 12 ml volume (e.g.
reagent vessel) of the solution prepared in 5.5 at 15 °C ± 1 °C.
6.3 Luminometer, measuring cell maintained at 15 °C ± 1 °C, equipped with suitable test tubes.
6.4 Test tubes, made of a chemically inert material, appropriate for the selected luminometer, with a
capacity which facilitates the taking of a reading over the largest possible surface area and able to fit into the
thermo-block (6.1).
6.5 pH-meter.
6.6 Chronometer.
6.7 Piston pipettes or plastic syringes, 100 µl, 500 µl and 1 000 µl.
6.8 Piston pipettes, with variable volume, 10 ml to 200 ml and 200 µl to 5 000 µl.
6.9 Refrigerated centrifuge.
6.10 Magnetic stirrer and magnetic stirring bar.
6.11 Incubated shaker, for incubation of Erlenmeyer flasks.
6.12 Autoclave.
6.13 Incubator.
6.14 Spectral- or filter-photometer and test tubes, of optical path length 1 cm.
4 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
6.15 Inoculating loop (or needle).
6.16 Conductometer.
6.17 Freezer, for the storage of solutions and suspensions.
6.18 Oxygen probe, in accordance with ISO 5814.
7 Sampling and sample pretreatment
7.1 Sampling
Collect samples in chemically inert, clean containers as specified in ISO 5667-16. Fill the containers
completely and seal them. Test the samples as soon as possible after collection. Where necessary, store
samples at 2 °C to 5 °C in the dark in the containers for not longer than 48 h. For periods up to two months,
store at u −18 °C. Do not use chemicals to preserve the samples. Perform the necessary pH-adjustment and
salt addition immediately before testing.
7.2 Sample preparation
Measure the oxygen concentration in all samples. An oxygen concentration > 3 mg/l is required for the test. If
the oxygen concentration of the undiluted sample is less than 3 mg/l, use adequate methods to oxygenate the
sample, e.g. aeration or stirring.
Measure the pH of all samples. If the pH is between 6,0 and 8,5, an adjustment is usually not necessary.
Adjustment of the pH-value, however, may alter the nature of the sample. On the other hand, the pH of the
sample and the pH of the test batch may differ because of the buffer capacity of the test medium. It may be
necessary to carry out tests on both the pH-adjusted and the non-pH-adjusted samples.
If necessary, adjust the pH of the sample by adding either hydrochloric acid (5.4) or sodium hydroxide solution
(5.3). Depending on the purpose of the test, the pH may be adjusted to 7,0 ± 0,2 or to the upper (8,5 ± 0,2)
and lower limits (6,0 ± 0,2). Choose the concentration of the hydrochloric acid or the sodium hydroxide
solution to restrict the volume added to not more than 5 % of total volume.
Add 20 g of sodium chloride per litre to the water sample or to the neutralized water sample.
For samples with high salt concentrations, measure the salinity and add the amount of salt which is necessary
to adjust the osmolarity to 20 g/l NaCl.
If the sample contains between 20 g/l and 50 g/l NaCl-equivalents, add no salt. The resulting salt
concentration in the test samples shall not exceed the osmolarity of a 35 g/l sodium chloride solution.
For salt water samples, Annex D gives further information.
Strongly turbid samples should be allowed to settle for 1 h or centrifuged, for example for 10 min at 5 000g, or
should be filtered. Use the supernatant or filtrate for the test.
8 Cultivation of luminescent bacteria
8.1 Stock culturing
Transfer luminescent bacteria of strain Vibrio fischeri NRRL B-11177 (5.1) under sterile conditions to Petri
dishes containing the agar medium for stock cultures (5.8).
Incubate in an incubator for 2 d to 3 d at 20 °C ± 1 °C.
© ISO 2007 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
Mark luminescent single colonies using visual observations in the dark, and store dishes in the refrigerator
afterwards.
Transfer marked colonies under sterile conditions to fresh dishes after a storage period of one week to a
maximum of two weeks.
Commercially available vials of preserved bacteria usually are not dispensed under sterile conditions. For
cultivation of pure cultures, several single-colony passages are recommended. To prevent genetic alterations,
a new vial of preserved bacteria can be opened and used approximately every 6 months.
NOTE The luminescence of luminescent bacterial colonies can decrease during storage.
8.2 Preparation of pre-cultures
Inoculate 50 ml of pre-culture broth (5.7) in Erlenmeyer flasks (e.g. 250 ml) under sterile conditions with one
luminescent single colony of a stock culture aged 2 d to 3 d.
–1
Shake for 21 h ± 1 h at 20 °C ± 1 °C with a periodicity of at least 180 r·min .
Determine the turbidity of a 1 in 10 dilution of the culture in sodium chloride solution (5.2), e.g. in formazine
absorption units (FAU) at 578 nm, as specified in ISO 7027.
8.3 Preparation of main culture
Inoculate 50 ml of the main culture broth (5.7) in 250 ml Erlenmeyer flasks with an appropriate volume of
pre-culture (8.2) to result in an estimated initial turbidity of 10 FAU.
–1
Shake for 20 h ± 1 h at 20 °C ± 1 °C with a periodicity of at least 180 r·min .
Determine turbidity, in FAU, of a 1 in 10 dilution in sodium chloride solution (5.2) photometrically at 578 nm.
NOTE Following the above conditions, the undiluted main culture usually exhibits a turbidity of 700 FAU to
1 800 FAU.
8.4 Preparation of stock suspension
Pre-cool sodium chloride solution (5.2) and protective medium (5.9) on ice.
Centrifuge bacterial suspension from the main culture (8.3) at 4 °C ± 2 °C in a pre-cooled refrigerated
centrifuge, for 15 min to 20 min at 6 000g ± 2 000g.
Decant supernatants and resuspend pellets in 5 ml to 10 ml, per 50 ml of main culture, of ice-cold sodium
chloride solution (5.2).
Repeat centrifugation under the same conditions.
Decant supernatant and resuspend pellets in 0,5 ml, per 50 ml of main culture, of ice-cold sodium chloride
solution (5.2).
Transfer the bacterial suspension to a precooled beaker (e.g. 100 ml) and place on ice.
Slowly add, under constant cooling on ice and stirring, about 4 ml of protective medium (5.9) per 50 ml of main
culture.
Photometrically determine the turbidity of a 1 in 100 dilution with sodium chloride solution (5.2).
Add pre-cooled protective medium (5.9) more quickly up to an estimated turbidity of 2 500 FAU ± 500 FAU or
equivalent (see Note in 8.1).
6 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
For the preparation of a suitable stock suspension, addition of at least 10 ml of protective medium per millilitre
suspension in sodium chloride solution is recommended. On addition of protective medium, bioluminescence
is markedly decreased but reappears after addition of dilution solution.
Continue stirring for about 15 min to obtain a homogeneous mixture.
Dispense aliquots of 100 µl into suitable test tubes (6.4).
It is convenient to use the type of tube to be used in the subsequent procedure (Clause 9).
For future use, store stock suspensions in a freezer at u −20 °C.
NOTE The stock suspension can be used for determinations for several months. At –70 °C the suspension can be
stored for even longer periods.
Refrozen stock suspensions may be used for preliminary tests only.
The stock suspensions may be used for testing purposes as long as the validity criteria (see Clause 12) are
met.
9 Procedure
Prepare the reference samples according to 5.6. Test each batch of bacteria with all three reference
substances. Test at least one of the three reference substances in parallel with each stock-suspension test
tube thawed for the tests.
Prepare the samples according to 7.2.
Take the tube containing the stock suspension (8.4) out of the freezer and place it in a water bath at
20 °C ± 2 °C to thaw the suspension.
Prepare the test suspension in two steps:
⎯ Add 0,5 ml of solution (5.5) per 100 µl of stock suspension in the test tube maintained at 15 °C ± 1 °C,
and homogenize by gentle shaking of the test tube.
⎯ Wait for about 15 min.
Pipette this suspension into, for example, a 20 ml reagent vessel and add 11,5 ml of solution (5.5), maintained
at 15 °C ± 1 °C, and homogenize by gentle shaking of the reagent vessel.
Wait for about 15 min.
Prepare in a first set of test tubes (6.4) the sample dilution series, the reference sample (5.6) and the controls
(5.2) required.
A common procedure for the preparation of the dilution series is described in Annex B. Depending on the
purpose of the test and the statistical requirements concerning the test results, other dilution designs with
concentrations in a geometric or a logarithmic series may be appropriate as well. Due to mixing of equal
volumes of sample/diluted sample and test suspension, the highest sample concentration in the test is 50 %
sample as a rule. For the testing of nearly undiluted water samples (80 % sample), an extra control batch is
needed (see B.2 and Table 1).
Maintain the test tubes containing the sodium chloride solution (5.2) for controls, the reference samples (5.6),
the samples (7.2) and the samples of the dilution series (Table B.1) at 15 °C ± 1 °C.
Chose test conditions which safeguard that the maximum temperature deviation in the thermo-block within
one test is at most ± 0,3 °C.
© ISO 2007 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 11348-1:2007(E)
For tests with equal volumes of test suspension and sample, pipette 500 µl portions of the test suspension
into a second, corresponding set of test tubes (6.4), maintained at 15 °C ± 1 °C in the incubator, at the same
time intervals (5 s to 20 s) as used for later intensity measurements.
Carry out two parallel determinations per dilution level at a test temperature of 15 °C ± 1 °C.
Adjust the luminometer instrument to a convenient, near-maximum setting.
Determine and record the luminescence intensity, I , of the test suspensions by means of a luminometer.
0
As the contact time for all test samples shall be equal, use a chronometer (6.6) for the measurement of the
luminescence intensities at equal time intervals, seriatim. An interval of 5 s to 20 s has been found convenient.
Measure all test suspensions, as differing luminescence may be expected due to possible inhomogeneities of
the test suspension.
Immediately after the initial luminescence measurement of a test suspension, make up this suspension to a
total volume of 1 ml with samples (7.2), diluted samples (Annex B), reference samples (5.6) or sodium
chloride solution (5.2), as appropriate. This is done by pipetting 500 µl each of samples (7.2), diluted samples
(Annex B), reference samples (5.6) or sodium chloride solution (5.2), prepared in the first set of test tubes, to
the test suspensions in each of the tubes in the corresponding second set of test tubes. Mix by hand, start the
chronometer and place the test tubes back into the thermo-block at 15 °C ± 1 °C.
Repeat for all the other test tubes, leaving the same time interval between successive additions.
Determine and record the luminescence intensity in all test tubes of the second set of test tubes, including
controls, after, optionally, 5 min (I ) and again after 15 min and 30 min (I , I ), as required, at intervals of 5 s
5 15 30
to 20 s.
Record the instrument adjustment.
10 Evaluation
10.1 Inhibitory effect on luminescent bacteria
Calculate the correction factor (f -value) from the measured luminescence intensity using Equation (1). This
kt
factor serves to correct the initial values I of all test samples before they can be used as reference values for
0
the determination of the water-dependent decrease in luminescence.
f = I /I (t = 5 min, 15 min, 30 min) (1)
kt kt 0
where
f is the correction factor for the contact time of 5 min, 15 min or 30 min;
kt
I is the luminescence intensity in the control sample after the contact
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11348-1
Deuxième édition
2007-12-01
Qualité de l'eau — Détermination de
l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau
sur la luminescence de Vibrio fischeri
(Essai de bactéries luminescentes) —
Partie 1:
Méthode utilisant des bactéries
fraîchement préparées
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples
on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) —
Part 1: Method using freshly prepared bacteria
Numéro de référence
ISO 11348-1:2007(F)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2007
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Principe. 2
4 Interférences . 2
5 Réactifs et matériaux. 2
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage et prétraitement des échantillons . 5
8 Culture des bactéries luminescentes . 6
9 Mode opératoire . 8
10 Évaluation. 9
11 Expression des résultats . 11
12 Critères de validité. 13
13 Fidélité . 13
14 Rapport d'essai . 13
Annexe A (informative) Méthode de correction de la couleur . 14
Annexe B (informative) Niveau de dilution D — Préparation des séries de dilutions. 17
Annexe C (informative) Données de fidélité . 20
Annexe D (informative) Essai de bactéries luminescentes sur des échantillons d'eau salée
utilisant des bactéries fraîchement cultivées . 21
Bibliographie . 25
© ISO 2007 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11348-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11348-1:1998), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
L'ISO 11348 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau —
Détermination de l'effet inhibiteur d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri (Essai de
bactéries luminescentes):
⎯ Partie 1: Méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées
⎯ Partie 2: Méthode utilisant des bactéries déshydratées
⎯ Partie 3: Méthode utilisant des bactéries lyophilisées
iv © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
Introduction
Les mesurages spécifiés dans l'ISO 11348 peuvent être réalisés au moyen de bactéries fraîchement
préparées, de même qu'avec des préparations bactériennes lyophilisées ou déshydratées.
Les travaux de normalisation menés par le DIN Normenausschuss Wasserwesen et l'ISO/TC 147/SC 5/WG 1
ont montré que, dans certains cas particuliers, ces différentes techniques pouvaient donner des résultats
différents, notamment en présence de métaux lourds.
Une telle variété dans la sensibilité résulte des différences de composition des milieux utilisés pour la
préparation de bactéries lyophilisées ou déshydratées. Ces milieux protecteurs influent sur la biodisponibilité
des produits toxiques et/ou sur l'émission de lumière des bactéries luminescentes. Cela signifie que l'origine
et le type de préparation doivent être pris en considération lors de l'interprétation des résultats. Cette prise en
compte peut se révéler parfois difficile, du fait que les bactéries lyophilisées et déshydratées peuvent être
obtenues auprès de fournisseurs différents. Il peut donc en résulter une méconnaissance des détails de la
composition, qui, par conséquent, ne peut pas être interprétée par l'utilisateur.
Pour cette raison, la présente partie de l'ISO 11348 comprend, en complément des mesurages de toxicité à
l'aide de bactéries déshydratées (ISO 11348-2) et de bactéries lyophilisées (ISO 11348-3), la description d'un
mode opératoire utilisant des bactéries fraîchement préparées dont les performances peuvent être
interprétées par l'utilisateur dans les moindres détails.
Les laboratoires responsables des résultats ont l'opportunité de sélectionner la technique la mieux adaptée,
en se fondant sur des jugements d'experts et des informations relatives aux échantillons d'eau soumis à essai.
© ISO 2007 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 11348-1:2007(F)
Qualité de l'eau — Détermination de l'effet inhibiteur
d'échantillons d'eau sur la luminescence de Vibrio fischeri
(Essai de bactéries luminescentes) —
Partie 1:
Méthode utilisant des bactéries fraîchement préparées
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente partie de l'ISO 11348 connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des pratiques d'hygiène et de sécurité adéquates et de s'assurer de la
conformité avec toutes les dispositions réglementaires nationales.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés selon la présente partie de l'ISO 11348 le
soient par du personnel qualifié.
1 Domaine d'application
L'ISO 11348 décrit trois méthodes de détermination de l'inhibition de la luminescence émise par la bactérie
marine Vibrio fischeri (NRRL B-11177). La présente partie de l'ISO 11348 spécifie une méthode utilisant des
bactéries fraîchement préparées.
Cette méthode est applicable:
⎯ aux eaux usées;
⎯ aux extraits aqueux et aux lixiviats;
⎯ aux eaux douces (eaux de surface ou souterraines);
⎯ à l'eau de mer ou aux eaux saumâtres;
⎯ aux éluats de sédiments (eau douce, eau saumâtre et eau de mer);
⎯ aux eaux interstitielles;
⎯ aux substances individuelles diluées dans l'eau.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
© ISO 2007 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
ISO 5814, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 7027, Qualité de l'eau — Détermination de la turbidité
3 Principe
L'inhibition de la luminescence produite par des cultures de Vibrio fischeri est déterminée au moyen d'un
essai par lots. Celui-ci est mis en œuvre par mélange de volumes spécifiés de l'échantillon soumis à essai, ou
de l'échantillon dilué, et de bactéries luminescentes mises en suspension dans une cuvette.
Le critère suivi est la luminescence, mesurée après un temps de contact de 15 min ou de 30 min, et
éventuellement de 5 min, prenant en compte un facteur de correction (f ) qui représente une mesure des
kt
changements d'intensité des témoins pendant le temps d'exposition. L'effet inhibiteur de l'échantillon d'eau
peut être déterminé sous la forme des valeurs de dilution minimale sans effet (DMSE) (voir Annexe B) ou des
valeurs de CE et/ou de CE , au moyen d'une série de dilutions (CE est la concentration effective).
20 50
4 Interférences
Des substances insolubles, faiblement solubles ou volatiles, ou des substances qui réagissent avec l'eau de
dilution ou avec la suspension, ou qui s'altèrent au cours de la période d'essai, sont susceptibles d'influer sur
les résultats ou de nuire à la reproductibilité des résultats d'essai.
Les pertes de luminescence, provoquées par l'absorption ou la diffusion de lumière, peuvent se produire en
présence d'eaux fortement colorées ou turbides. Cette interférence peut être compensée en soumettant
l'échantillon à un traitement contre la turbidité (7.2) ou, par exemple, en utilisant une cuvette de correction de
l'absorption à double compartiment (voir Annexe A).
[6]
La bioluminescence nécessitant de l'oxygène, les échantillons à forte demande en oxygène (et/ou
possédant une faible concentration en oxygène) peuvent provoquer un déficit en oxygène et être inhibiteurs.
La présence de substances nutritives à biodégradabilité rapide dans l'échantillon peut provoquer une
[1]
réduction de la bioluminescence indépendante de la pollution.
Les échantillons dont le pH se trouve en dehors de la plage de pH = 6,0 à pH = 8,5 affectent la luminescence
[6], [7]
des bactéries . Un ajustement de l'échantillon est nécessaire si l'effet toxique du pH est indésirable.
Étant donné que l'organisme d'essai Vibrio fischeri est une bactérie marine, les essais sur des échantillons
d'eau salée suivant le mode opératoire normalisé ont souvent pour résultat une stimulation de la
bioluminescence, susceptible de masquer des effets inhibiteurs (voir Annexe D).
Les concentrations en sel de l'échantillon initial supérieures à 30 g/l de NaCl, ou les teneurs en composés
autres produisant une osmolarité équivalente peuvent conduire, en association avec l'adjonction de sel requis
pour l'essai, à des effets hyperosmotiques. Pour éviter ces effets, il convient que la concentration en sel
résultante dans les échantillons soumis à essai n'excède pas l'osmolarité d'une solution de chlorure de
sodium à 35 g/l.
5 Réactifs et matériaux
Utiliser des substances chimiques de qualité analytique reconnue. Utiliser de l'eau distillée ou présentant une
pureté équivalente.
2 © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
5.1 Bactéries pour essai.
Utiliser une souche de bactéries luminescentes appartenant à l'espèce Vibrio fischeri NRRL B-11177. Les
souches de bactéries peuvent provenir de réactifs lyophilisés ou déshydratés disponibles dans le commerce
ou de collections de souches comme la Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 10, D-38124 Braunschweig, Allemagne, ou la NRRL, ARS Culture collection NCAUR, 1815
N. University Street, Peoria, Illinois, 61604, États-Unis. Les suspensions bactériennes utilisées pour les
mesurages de la toxicité doivent être fraîchement préparées à partir de cultures.
5.2 Solution de chlorure de sodium, utilisée comme diluant.
Dissoudre 20 g de chlorure de sodium (NaCl) dans de l'eau et compléter à 1 l avec de l'eau.
5.3 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l, par exemple.
5.4 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l, par exemple.
Il peut être nécessaire, pour l'ajustement du pH, d'utiliser des acides ou des bases de concentrations
supérieures ou inférieures.
5.5 Solution destinée aux bactéries fraîchement préparées.
8,0 g D(+)-Glucose monohydraté (C H O ,H O)
6 12 6 2
20,0 g Chlorure de sodium (NaCl)
2,035 g Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6H O)
2 2
0,30 g Chlorure de potassium (KCl)
11,9 g N-(2-Hydroxyéthyl)pipérazine-N-(2-acide éthanesulfonique) (HEPES)
Dissoudre dans de l'eau, agiter pendant environ 30 min et ajuster le pH à 7,0 ± 0,2 avec la solution
d'hydroxyde de sodium (5.3) ou d'acide chlorhydrique (5.4). Compléter à 1 l avec de l'eau.
Cette solution peut être conservée sous forme d'aliquotes de −18 °C à −20 °C.
5.6 Substances de référence.
Préparer les solutions mères des substances de référence suivantes en utilisant la solution de chlorure de
sodium (5.2) séparément comme diluant, sans ajustement du pH:
219,8 mg/l Sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO ,7H O)
4 2
9 mg/l 3,5-Dichlorophénol (C H OCl ) (pureté W 99,9 %)
6 4 2
22,6 mg/l Dichromate de potassium (K Cr O )
2 2 7
Ces concentrations représentent environ le double des valeurs de CE attendues pour les substances de
50
référence respectives dans la présente partie de l'ISO 11348. Les volumes nécessaires dépendent de la
configuration des essais.
NOTE Il est possible d'utiliser des préparations chimiques du commerce ayant des concentrations définies en ZnSO
4
et en K Cr O (Titrisol) pour préparer les solutions mères des substances de référence.
2 2 7
© ISO 2007 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
5.7 Milieu de culture liquide destiné aux précultures et aux cultures principales.
30 g Chlorure de sodium (NaCl)
6,10 g Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté (NaH PO ,H O)
2 4 2
2,75 g Hydrogénophosphate de dipotassium trihydraté (K HPO ,3H O)
2 4 2
0,204 g Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7 H O)
4 2
0,500 g Hydrogénophosphate de diammonium [(NH ) HPO ]
4 2 4
3 ml Glycérol
5,00 g Peptone de caséine
0,50 g Extrait de levure
Dissoudre dans de l'eau et ajuster le pH à 7,0 ± 0,2 avec la solution d'hydroxyde de sodium (5.3) ou l'acide
chlorhydrique (5.4). Compléter à 1 l avec de l'eau. Transférer par fractions de 50 ml dans des erlenmeyers (de
capacité 250 ml, par exemple) et stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 20 min.
La peptone de caséine et l'extrait de levure proposés par les différents fournisseurs peuvent être de qualité
variable. En cas de problèmes (tels qu'une inhibition de la croissance), il est recommandé de se procurer le
produit auprès d'un autre fabricant.
5.8 Milieu gélosé pour les cultures mères.
Ajuster le pH du milieu de culture liquide (5.7) à 7,0 ± 0,2.
Ajouter 12 g de gélose par litre et dissoudre en chauffant modérément; stériliser et transférer dans des boîtes
de Petri stériles.
5.9 Milieu protecteur.
66 g D(+)-Glucose monohydraté (C H O ,H O)
6 12 6 2
4 g Chlorure de sodium (NaCl)
2 g L-Histidine
0,5 g Albumine de sérum bovin, BSA
Dissoudre complètement dans de l'eau à environ 37 °C et ajuster si nécessaire le pH à 7,0 ± 0,2, avec la
solution d'hydroxyde de sodium (5.3) ou l'acide chlorhydrique (5.4), à température ambiante. Compléter
à 100 ml avec de l'eau.
Le milieu protecteur évite l'endommagement des cellules bactériennes durant la procédure de congélation.
L'albumine de sérum bovin proposée par les différents fournisseurs peut être de qualité variable. En cas de
problèmes, il est recommandé de se procurer le produit auprès d'un autre fabricant.
Préparer fraîchement le milieu protecteur avant emploi.
6 Appareillage
6.1 Bloc thermique thermostaté, destiné à maintenir les échantillons soumis à essai à une température
de 15 °C ± 1 °C. Au sein d'un essai, il convient que l'écart de température soit au plus de ± 0,3 °C.
4 © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
6.2 Bain-marie ou bloc thermique thermostaté, destiné à maintenir un volume d'au moins 12 ml
(récipient pour réactifs, par exemple) de la solution préparée en 5.5 à 15 °C ± 1 °C.
6.3 Luminomètre, dont la cellule de mesure est maintenue à 15 °C ± 1 °C, équipé de cuvettes appropriées.
6.4 Cuvettes, fabriquées à partir d'un matériau chimiquement inerte, adaptées au luminomètre choisi,
ayant une capacité suffisante pour favoriser la lecture sur la plus grande surface possible, et de taille adaptée
pour pouvoir être placées dans le bloc thermique (6.1).
6.5 pH-mètre.
6.6 Chronomètre.
6.7 Pipettes à piston ou seringues en plastique, de 100 µl, de 500 µl et de 1 000 µl.
6.8 Pipettes à piston, de volume variable, de 10 ml à 200 ml et de 200 µl à 5 000 µl.
6.9 Centrifugeuse réfrigérée.
6.10 Agitateur magnétique et barreau aimanté.
6.11 Agitateur incubateur, destiné à l'incubation des erlenmeyers.
6.12 Autoclave.
6.13 Incubateur.
6.14 Spectrophotomètre ou photomètre à filtre et cuvettes, de trajet optique de 1 cm.
6.15 Boucle (ou aiguille) d'ensemencement.
6.16 Conductimètre.
6.17 Congélateur, destiné à la conservation des solutions et suspensions.
6.18 Électrode à oxygène, selon l'ISO 5814.
7 Échantillonnage et prétraitement des échantillons
7.1 Échantillonnage
Recueillir les échantillons dans des récipients chimiquement inertes et propres, comme cela est spécifié dans
l'ISO 5667-16. Remplir complètement les récipients et les fermer hermétiquement. Soumettre les échantillons
à essai dès que possible après avoir effectué le prélèvement. Si nécessaire, conserver les échantillons à une
température comprise entre 2 °C et 5 °C, dans l'obscurité et dans les récipients, pendant une durée inférieure
à 48 h. En cas de période s'étendant jusqu'à deux mois, les conserver à une température u −18 °C. Ne pas
employer de substances chimiques pour la conservation des échantillons. Réaliser l'ajustement nécessaire du
pH, ainsi que l'ajout de sel, immédiatement avant l'essai.
7.2 Préparation des échantillons
Mesurer la concentration en oxygène de tous les échantillons. L'essai exige une concentration en
oxygène > 3 mg/l. Si la concentration en oxygène de l'échantillon non dilué est inférieure à 3 mg/l, oxygéner
l'échantillon de manière adaptée, par exemple par aération ou agitation.
© ISO 2007 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
Mesurer le pH de tous les échantillons. Si le pH se situe entre 6,0 et 8,5, aucun ajustement n'est
généralement nécessaire. L'ajustement du pH est toutefois susceptible d'altérer la nature de l'échantillon. En
revanche, le pH de l'échantillon et le pH du lot soumis à essai peuvent être différents en raison du pouvoir
tampon du milieu d'essai. Parfois, il peut s'avérer nécessaire d'effectuer les essais tant sur des échantillons
dont le pH est ajusté que sur ceux dont le pH n'est pas ajusté.
Si nécessaire, ajuster le pH de l'échantillon en ajoutant soit de l'acide chlorhydrique (5.4), soit la solution
d'hydroxyde de sodium (5.3). Selon l'objectif de l'essai, il est possible d'ajuster le pH à 7,0 ± 0,2, ou aux
limites supérieure (8,5 ± 0,2) ou inférieure (6,0 ± 0,2). Choisir la concentration d'acide chlorhydrique ou de
solution d'hydroxyde de sodium qui permet de réduire le volume ajouté afin que celui-ci n'excède pas 5 % du
volume total.
Ajouter 20 g de chlorure de sodium par litre dans l'échantillon d'eau ou dans l'échantillon d'eau neutralisé.
Pour les échantillons ayant des concentrations en sel élevées, mesurer la salinité et ajouter la quantité de sel
nécessaire pour ajuster l'osmolarité à 20 g/l NaCl.
Si l'échantillon contient entre 20 g/l et 50 g/l d'équivalents NaCl, ne pas ajouter de sel. La concentration en sel
résultante dans les échantillons soumis à essai ne doit pas excéder l'osmolarité d'une solution de chlorure de
sodium à 35 g/l.
L'Annexe D donne de plus amples informations concernant les échantillons d'eau salée.
Il convient de laisser décanter pendant 1 h les échantillons présentant une forte turbidité, ou bien de les
centrifuger, par exemple pendant 10 min à 5 000g, ou encore de les filtrer. Pour l'essai, utiliser le surnageant
ou le filtrat.
8 Culture des bactéries luminescentes
8.1 Cultures mères
Transférer, dans des conditions stériles, les bactéries luminescentes appartenant aux souches de
Vibrio fischeri NRRL B-11177 (5.1) dans des boîtes de Petri contenant le milieu gélosé nécessaire aux
cultures mères (5.8).
Incuber pendant 2 à 3 jours à 20 °C ± 1 °C dans un incubateur.
Marquer les colonies luminescentes isolées en effectuant des observations visuelles dans l'obscurité et
conserver ensuite les boîtes au réfrigérateur.
Transférer, dans des conditions stériles, les colonies marquées dans des boîtes neuves après une période de
conservation de 1 à 2 semaines au maximum.
Les flacons de bactéries conservées, disponibles dans le commerce, ne sont généralement pas fournis dans
des conditions stériles. Pour préparer des cultures pures, il est recommandé d'effectuer plusieurs passages
avec des colonies isolées. Afin d'éviter les altérations génétiques, il est possible d'ouvrir et d'utiliser un
nouveau flacon de bactéries conservées environ tous les 6 mois.
NOTE La luminescence des colonies bactériennes luminescentes peut décroître au cours de la conservation.
8.2 Préparation des précultures
Ensemencer 50 ml de milieu de préculture (5.7) dans des erlenmeyers (de capacité 250 ml, par exemple)
dans des conditions stériles, avec une colonie luminescente isolée provenant d'une culture mère et âgée
de 2 à 3 jours.
. −1
Agiter pendant 21 h ± 1 h à 20 °C ± 1 °C (agitation d'au moins 180 r min ).
6 © ISO 2007 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
e
Déterminer la turbidité d'une dilution au 1/10 de la culture dans une solution de chlorure de sodium (5.2)
exprimée, par exemple, en unités d'absorption de formazine (FAU) à 578 nm, comme cela est spécifié dans
l'ISO 7027.
8.3 Préparation de la culture principale
Ensemencer 50 ml de milieu de culture principale (5.7) dans des erlenmeyers de 250 ml avec un volume de
préculture (8.2) permettant d'obtenir une turbidité initiale estimée à 10 FAU.
. −1
Agiter pendant 20 h ± 1 h à 20 °C ± 1 °C (agitation d'au moins 180 r min ).
e
Déterminer la turbidité, en FAU, d'une dilution au 1/10 dans une solution de chlorure de sodium (5.2) par
photométrie, à 578 nm.
NOTE Selon les conditions indiquées ci-dessus, la culture principale non diluée présente normalement une turbidité
comprise entre 700 FAU et 1 800 FAU.
8.4 Préparation de la suspension mère
Refroidir au préalable la solution de chlorure de sodium (5.2) et le milieu protecteur (5.9) dans de la glace.
Centrifuger la suspension bactérienne provenant de la culture principale (8.3) à 4 °C ± 2 °C dans une
centrifugeuse préalablement réfrigérée, pendant 15 min à 20 min, à 6 000g ± 2 000g.
Transvaser le liquide surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml à 10 ml (par 50 ml de culture
principale) de solution de chlorure de sodium (5.2) refroidie dans de la glace.
Répéter la centrifugation dans les mêmes conditions.
Transvaser le liquide surnageant et remettre en suspension le culot dans 0,5 ml (par 50 ml de culture
principale) de solution de chlorure de sodium (5.2) refroidie dans de la glace.
Transférer la suspension bactérienne dans un bécher préalablement refroidi (de capacité 100 ml, par
exemple) et le placer dans de la glace.
Ajouter lentement environ 4 ml (par 50 ml de culture principale) de milieu protecteur (5.9) en agitant et en
refroidissant constamment dans la glace.
e
Déterminer, par photométrie, la turbidité d'une dilution au 1/100 dans une solution de chlorure de
sodium (5.2).
Ajouter plus rapidement du milieu protecteur (5.9) préalablement refroidi, jusqu'à obtenir une turbidité estimée
à 2 500 FAU ± 500 FAU ou équivalente (voir Note en 8.1).
Pour préparer une suspension mère convenable, il est recommandé d'ajouter au moins 10 ml de milieu
protecteur par millilitre de suspension dans la solution de chlorure de sodium (5.2). L'ajout de milieu
protecteur provoque une diminution notable de la bioluminescence, mais celle-ci réapparaît après l'ajout d'une
solution de dilution.
Poursuivre l'agitation pendant environ 15 min, afin d'obtenir un mélange homogène.
Répartir des portions aliquotes de 100 µl dans des cuvettes appropriées (6.4).
Il est pratique d'utiliser le type de cuvettes requis pour le mode opératoire décrit ci-dessous (voir Article 9).
En vue des utilisations ultérieures, conserver les suspensions mères dans un congélateur à une
température u −20 °C.
NOTE Les suspensions mères peuvent être utilisées pour les essais pendant plusieurs mois. Les suspensions
peuvent être conservées à −70 °C pendant des durées encore plus longues.
© ISO 2007 – Tous droits réservés 7
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 11348-1:2007(F)
Les suspensions mères recongelées ne peuvent être utilisées que pour les essais préliminaires.
Les suspensions mères peuvent être utilisées pour les besoins des essais aussi longtemps que les critères de
validité (voir Article 12) sont respectés.
9 Mode opératoire
Préparer les échantillons de référence conformément à 5.6. Tester chaque lot de bactéries avec chacune des
trois substances de référence. Tester au moins l'une des trois substances de référence en parallèle à chaque
cuvette de suspension mère décongelée pour les essais.
Préparer les échantillons conformément à 7.2.
Sortir du congélateur la cuvette contenant la suspension mère (8.4) et la placer dans un bain-marie
à 20 °C ± 2 °C pour d
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.