ISO 6800:1997
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of the composition of fatty acids in the 2-position of the triglyceride molecules
Animal and vegetable fats and oils — Determination of the composition of fatty acids in the 2-position of the triglyceride molecules
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la composition des acides gras en position 2 dans les triglycérides
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination dans les corps gras d'origines animale et végétale de la composition de la fraction des acides gras estérifiés en position 2 (position β ou position interne) dans les triglycérides. En raison des particularités d'action de la lipase pancréatique, la méthode s'applique seulement aux corps gras ayant un point de fusion inférieur à 45 °C. Elle n'est pas applicable sans restrictions à tous les corps gras, en particulier à ceux renfermant des quantités importantes -- soit d'acides gras ayant 12 atomes de carbone ou moins (par exemple huiles de coprah et de palmiste, matières grasses butyriques du beurre); -- soit d'acides gras ayant 20 atomes de carbone et plus et d'insaturation élevée (plus de quatre doubles liaisons) (par exemple huiles de poissons et d'animaux marins); -- soit d'acides gras possédant des fonctions oxygénées secondaires. NOTE -- Les acides gras avec doubles liens en position (n-16) à (n-11) (par exemple acide pétrosélinique) ne sont convertis que très lentement par lipase pancréatique, ce qui pourrait donner des résultats erronés.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6800
Second edition
1997-12-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of the composition of fatty
acids in the 2-position of the triglyceride
molecules
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la
composition des acides gras en position 2 dans les triglycérides
A
Reference number
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 6800 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 11, Animal and
vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6800:1985),
which has been technically revised.
Annexes A to C of this International Standard are for information only.
© ISO 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Switzerland
Internet central@iso.ch
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
©
INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 6800:1997(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of the
composition of fatty acids in the 2-position of the triglyceride
molecules
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the composition of fatty acids
which are esterified in the 2-position (ß or internal position) of the triglyceride molecules in animal and
vegetable fats and oils.
Because of the nature of pancreatic lipase action, the method is applicable only to fats and oils with a
melting point below 45 °C.
The method is not unreservedly applicable to all fats and oils, particularly those containing substantial
amounts of
- fatty acids with 12 or fewer carbon atoms (e.g. copra oil, palm kernel oil, butyric butter fats);
- fatty acids with 20 and more carbon atoms and of a high degree of unsaturation (more than four
double bonds) (e.g. fish oil and marine animal oil);
- fatty acids which have secondary groups containing oxygen.
NOTE — Fatty acids with double bonds in the (n-16) to (n-11) position (e.g. petroselinic acid) are converted only
very slowly by pancreatic lipase. This may lead to wrong results.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are
subject to revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below.
Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 660:1996, Animal and vegetable fats and oils – Determination of acid value and of acidity.
ISO 661:1989, Animal and vegetable fats and oils – Preparation of test sample.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use – Specification and test methods.
ISO 5508:1990, Animal and vegetable fats and oils – Analysis by gas chromatography of methyl esters
of fatty acids.
©
ISO
1)
ISO 5509:— Animal and vegetable fats and oils – Preparation of methyl esters of fatty acids.
3 Principle
After neutralization, where necessary, of any free fatty acids, purification of the test portion by column
chromatography. Partial enzymatic hydrolysis of the glycerides to yield 2-monoglycerides. Separation of
the monoglycerides by thin-layer chromatography (TLC) and determination of their fatty acid
composition by gas chromatography.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water in accordance with grade 2 of ISO 3696.
4.1 Reagents for the purification of the test portion
4.1.1 2-Propanol, or ethanol, 95 % (V/V).
4.1.2 Hexane (if available) or light petroleum (boiling range 30 °C to 60 °C).
4.1.3 2-Propanol, 50 % (V/V), or ethanol, 50 % (V/V).
4.1.4 Sodium hydroxide, 0,5 mol/l solution.
4.1.5 Phenolphthalein solution, 1 g per 100 ml of ethanol, 95 % (V/V).
4.1.6 Activated neutral alumina, for chromatography, Brockmann activity l, recently activated for 2 h
at 260 °C and kept in a desiccator.
4.1.7 Nitrogen.
4.2 Reagents for hydrolysis of the triglycerides
4.2.1 Diethyl ether, free from peroxides.
4.2.2. Hydrochloric acid, 6 mol/l solution.
4.2.3 Sodium cholate, 1 g/l solution of enzymatic quality.
4.2.4 Calcium chloride, 220 g/l solution.
2)
, 2-amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol , 1 mol/l, adjusted to pH 8 with
4.2.5 Buffer solution
hydrochloric acid (4.2.2) using a pH-meter.
Store this solution at between 0 °C and 4 °C and use within 14 days.
1) To be published. (Revision of ISO 5509:1978)
2) Alternative names are: tris(hydroxymethyl)methylamine; tris(hydroxymethyl)aminomethane.
©
ISO
4.2.6 Pancreatic lipase, with an activity of between 8 and 20 units/mg.
Store dry in a refrigerator. Before use, bring a portion of the powder to ambient temperature.
NOTE — Lipase of suitable activity is available commercially. If preferred, the lipase may be prepared and assayed
in accordance with the procedure described in annex A.
4.3 Reagents for the isolation of the 2-monoglycerides
4.3.1 Ethanol, 95 % (V/V).
4.3.2 Hexane (if available) or light petroleum, boiling range 30 °C to 60 °C.
4.3.3 Acetone.
4.3.4 Silica powder, with binder, for thin-layer chromatography.
4.3.5 Developing solvent, prepared as follows:
hexane (if available) or light petroleum: 70 ml
diethyl ether: 30 ml
formic acid, 98 % ( ) min.: 1 ml
V/V
, indicator solution, 2 g/l in ethanol, rendered slightly alkaline by
4.3.6 2',7'-Dichlorofluorescein
addition of a drop of 1 mol/l sodium hydroxide per 100 ml of the solution.
4.4 Reagents for the analysis of the 2-monoglycerides by gas chromatography
See ISO 5508 and ISO 5509.
5 Apparatus
Usual laboratoy equipment and, in particular, the following.
5.1 Apparatus for the purification of the test portion
5.1.1 Water bath, thermostatically controlled, and capable of being maintained at 30 °C to 40 °C.
5.1.2 Glass column, for chromatography, 13 mm internal diameter and 400 mm in length, equipped
with a sintered glass plate and a tap.
5.1.3 Rotary evaporator, with 250 ml flask.
, for bubbling nitrogen.
5.1.4 Tubing
, of 500 ml capacity.
5.1.5 Separating funnel
5.1.6 Round-bottom flask, of 100 ml capacity.
©
ISO
5.2 Apparatus for the hydrolysis of the triglycerides
5.2.1 Centrifuge.
5.2.2 Centrifuge tube, glass, of 10 ml capacity, with ground stopper.
5.2.3 Vibrating electric shaker, for vigorous agitation of the centrifuge tube.
5.2.4 Water bath, thermostatically controlled, and capable of being maintained at 40 °C ± 0,5 °C.
5.2.5 Hypodermic syringe, of 1 ml capacity, with thin needle.
5.2.6 Stopwatch.
5.3 Apparatus for the isolation of the 2-monoglycerides
5.3.1 Developing tank, for thin-layer chromatography, with ground glass lid, suitable for containing
glass plates 200 mm x 200 mm.
, for preparation of the plates.
5.3.2 Spreader and rack
, 200 mm x 200 mm.
5.3.3 Glass plates
5.3.4 Microsyringe, capable of dispensing drops of 3 μl to 4 μl.
5.3.5 Apparatus for spraying the indicator solution onto the plates
5.3.6 Microspatula.
5.3.7 Oven, capable of being maintained at 103 °C ± 2 °C.
5.3.8 Ultraviolet lamp, for examining chromatographic plates, for example with a wavelength of
254 nm.
, of 25 ml capacity, with of approximately 1 m length, with
5.3.9 Round-bottom flask air condenser
ground joint.
5.3.10 Conical flask, of 250 ml capacity, with ground stopper.
5.3.11 Conical flask, of 50 ml capacity (if necessary).
5.3.12 Filter, of sintered glass, porosity P 40 (16 μm to 40 μm) (if necessary).
5.3.13 Desiccator, containing an efficient desiccant.
5.4 Apparatus for the analysis of the 2-monoglycerides by gas chromatography
See ISO 5508 and ISO 5509.
6 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport and storage.
©
ISO
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
[1]
method is given in ISO 5555 .
7 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with ISO 661.
8 Procedure
NOTE — If it is required to check whether the repeatability requirement (see 10.2) is met, carry out two single
determinations in accordance with 8.1 to 8.6.
8.1 Determination of the acidity of the test sample
Determine the acidity of the test sample in accordance with ISO 660.
If the acidity is below 3 % (m/m), purify the sample through alumina in accordance with 8.3.
If the acidity exceeds 3 % (m/m), first neutralize the sample with sodium hydroxide in the presence of
solvent in accordance with 8.2 then purify through alumina in accordance with 8.3.
8.2 Neutralization with sodium hydroxide
Dissolve about 10 g of the test sample in 100 ml of hexane (if available) or light petroleum (4.1.2) and
transfer the solution to the separating funnel (5.1.5). Add 50 ml of 2-propanol or ethanol (4.1.1), a few
drops of phenolphthalein solution (4.1.5) and a volume of sodium hydroxide solution (4.1.4) equivalent
to the free acidity of the fat or oil, with an excess of 0,5 %. Shake vigorously for 1 min, add 50 ml of
water, shake again and allow to stand. When separated, run off the lower layer containing the soap and
any intermediate layers (mucilages and insoluble substances). Wash the hexane or light petroleum
solution of the neutralized oil with successive 25 ml or 30 ml portions of a solution of 2-propanol or
ethanol (4.1.3) until the pink colour of the phenolphthalein disappears.
Transfer the solution to the rotary evaporator flask (5.1.3) and remove most of the solvent by
evaporating under reduced pressure. Dry the oil at 30 °C to 40 °C under reduced pressure using a
nitrogen stream (4.1.7) until the solvent is completely removed.
8.3 Purification of the test portion through alumina
Prepare a suspension of 15 g of activated alumina (4.1.6) in 50 ml of hexane (if available) or light
petroleum (4.1.2) and pour, while shaking, into a glass column for chromatography (5.1.2). Ensure that
the alumina settles evenly and allow the solvent level to fall to 1 mm to 2 mm above the upper level of
the adsorbent. Carefully pour into the column a solution prepared by dissolving a test portion of 5 g,
neutralized if necessary, in 25 ml of hexane (if available) or light petroleum (4.1.2) and collect all the
liquid which elutes from the column in a 100 ml round-bottom flask (5.1.6).
Remove most of the solvent by evaporation under reduced pressure, then dry the oil at 30 °C to 40 °C
using a nitrogen stream (4.1.7) until the solvent is completely removed.
©
ISO
8.4 Hydrolysis of the triglycerides
8.4.1 Weigh approximately 0,1 g of the purified test portion (8.3) in a 10 ml centrifuge tube (5.2.2). If
this test portion is not liquid at ambient temperature, place the tube in a water bath set at between 60 °C
and 65 °C. If by then the test portion is not completely liquid, continue the immersion for not more than
another 10 s.
Remove the tube from the water bath and continue directly and in rapid succession with the procedure
steps 8.4.2 to 8.4.5.
8.4.2 Add to the liquefied test portion a previously weighed amount of 20 mg of lipase (4.2.6) and add
2 ml of the buffer solution (4.2.5). Shake carefully and add successively 0,5 ml of sodium cholate
solution (4.2.3) and 0,2 ml of calcium chloride solution (4.2.4).
Insert the stopper, shake carefully and place the tube immediately in the water bath set at 40 °C,
maintaining manual shaking for 60 s ± 2 s. These actions shall be executed within approximately 30 s.
8.4.3 Remove the tube from the water bath and shake vigorously at 40 °C for 120 s ± 2 s using the
shaker (5.2.3).
8.4.4 Immediately add 1 ml of hydrochloric acid (4.2.2) and approximately 1 ml of diethyl ether (4.2.1).
Insert the stopper and shake vigorously using the shaker (5.2.3).
8.4.5 Centrifuge and transfer the organic phase to a test tube using the syringe (5.2.5). If the test
portion was solid at ambient temperature, repeat the extraction with a further 1 ml portion of diethyl ether
and combine the extracts in the test tube.
8.5 Isolation of the 2-monoglycerides
8.5.1 Preparation of the plates
NOTE — Fully prepared plates are available commercially.
Carefully clean the glass plates (5.3.3) with ethanol (4.3.1), hexane or light petroleum (4.3.2) and
acetone (4.3.3) until any fatty matter is completely removed.
Weigh 30 g of silica (4.3.4) into a 250 ml conical flask (5.3.10). Add 60 ml of water. Insert the stopper
and shake vigorously for 1 min. Immediately introduce the slurry into the spreader (5.3.2). Spread a
layer 0,25 mm thick on the clean plates. Allow the plates to dry for at least 1 h in air.
In all cases, whether the plates have been prepared as above or commercially prepared, activate the
plates in the oven (5.3.7) set at 103 °C for 1 h. Before use, allow the plates to cool to ambient
temperature in the desiccator (5.3.13).
In order to avoid acyl migrations, the silica gel plates shall be impregnated with boric acid. The reaction
mixture shall be separated by TLC as soon as possible.
As certain silicas contain organic products which may affect the fatty acids during the analysis by
chromatography, it is recommended that a blank test be carried out to ensure that there are no such
substances present. Otherwise, clean the prepared plate
...
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STANDARD 6800
Second edition
1997-12-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of the composition of fatty
acids in the 2-position of the triglyceride
molecules
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la
composition des acides gras en position 2 dans les triglycérides
A
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
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ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 11, Animal and
vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6800:1985),
which has been technically revised.
Annexes A to C of this International Standard are for information only.
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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
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Animal and vegetable fats and oils — Determination of the
composition of fatty acids in the 2-position of the triglyceride
molecules
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the composition of fatty acids
which are esterified in the 2-position (ß or internal position) of the triglyceride molecules in animal and
vegetable fats and oils.
Because of the nature of pancreatic lipase action, the method is applicable only to fats and oils with a
melting point below 45 °C.
The method is not unreservedly applicable to all fats and oils, particularly those containing substantial
amounts of
- fatty acids with 12 or fewer carbon atoms (e.g. copra oil, palm kernel oil, butyric butter fats);
- fatty acids with 20 and more carbon atoms and of a high degree of unsaturation (more than four
double bonds) (e.g. fish oil and marine animal oil);
- fatty acids which have secondary groups containing oxygen.
NOTE — Fatty acids with double bonds in the (n-16) to (n-11) position (e.g. petroselinic acid) are converted only
very slowly by pancreatic lipase. This may lead to wrong results.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are
subject to revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below.
Members of IEC and ISO maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 660:1996, Animal and vegetable fats and oils – Determination of acid value and of acidity.
ISO 661:1989, Animal and vegetable fats and oils – Preparation of test sample.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use – Specification and test methods.
ISO 5508:1990, Animal and vegetable fats and oils – Analysis by gas chromatography of methyl esters
of fatty acids.
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ISO
1)
ISO 5509:— Animal and vegetable fats and oils – Preparation of methyl esters of fatty acids.
3 Principle
After neutralization, where necessary, of any free fatty acids, purification of the test portion by column
chromatography. Partial enzymatic hydrolysis of the glycerides to yield 2-monoglycerides. Separation of
the monoglycerides by thin-layer chromatography (TLC) and determination of their fatty acid
composition by gas chromatography.
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water in accordance with grade 2 of ISO 3696.
4.1 Reagents for the purification of the test portion
4.1.1 2-Propanol, or ethanol, 95 % (V/V).
4.1.2 Hexane (if available) or light petroleum (boiling range 30 °C to 60 °C).
4.1.3 2-Propanol, 50 % (V/V), or ethanol, 50 % (V/V).
4.1.4 Sodium hydroxide, 0,5 mol/l solution.
4.1.5 Phenolphthalein solution, 1 g per 100 ml of ethanol, 95 % (V/V).
4.1.6 Activated neutral alumina, for chromatography, Brockmann activity l, recently activated for 2 h
at 260 °C and kept in a desiccator.
4.1.7 Nitrogen.
4.2 Reagents for hydrolysis of the triglycerides
4.2.1 Diethyl ether, free from peroxides.
4.2.2. Hydrochloric acid, 6 mol/l solution.
4.2.3 Sodium cholate, 1 g/l solution of enzymatic quality.
4.2.4 Calcium chloride, 220 g/l solution.
2)
, 2-amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol , 1 mol/l, adjusted to pH 8 with
4.2.5 Buffer solution
hydrochloric acid (4.2.2) using a pH-meter.
Store this solution at between 0 °C and 4 °C and use within 14 days.
1) To be published. (Revision of ISO 5509:1978)
2) Alternative names are: tris(hydroxymethyl)methylamine; tris(hydroxymethyl)aminomethane.
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4.2.6 Pancreatic lipase, with an activity of between 8 and 20 units/mg.
Store dry in a refrigerator. Before use, bring a portion of the powder to ambient temperature.
NOTE — Lipase of suitable activity is available commercially. If preferred, the lipase may be prepared and assayed
in accordance with the procedure described in annex A.
4.3 Reagents for the isolation of the 2-monoglycerides
4.3.1 Ethanol, 95 % (V/V).
4.3.2 Hexane (if available) or light petroleum, boiling range 30 °C to 60 °C.
4.3.3 Acetone.
4.3.4 Silica powder, with binder, for thin-layer chromatography.
4.3.5 Developing solvent, prepared as follows:
hexane (if available) or light petroleum: 70 ml
diethyl ether: 30 ml
formic acid, 98 % ( ) min.: 1 ml
V/V
, indicator solution, 2 g/l in ethanol, rendered slightly alkaline by
4.3.6 2',7'-Dichlorofluorescein
addition of a drop of 1 mol/l sodium hydroxide per 100 ml of the solution.
4.4 Reagents for the analysis of the 2-monoglycerides by gas chromatography
See ISO 5508 and ISO 5509.
5 Apparatus
Usual laboratoy equipment and, in particular, the following.
5.1 Apparatus for the purification of the test portion
5.1.1 Water bath, thermostatically controlled, and capable of being maintained at 30 °C to 40 °C.
5.1.2 Glass column, for chromatography, 13 mm internal diameter and 400 mm in length, equipped
with a sintered glass plate and a tap.
5.1.3 Rotary evaporator, with 250 ml flask.
, for bubbling nitrogen.
5.1.4 Tubing
, of 500 ml capacity.
5.1.5 Separating funnel
5.1.6 Round-bottom flask, of 100 ml capacity.
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ISO
5.2 Apparatus for the hydrolysis of the triglycerides
5.2.1 Centrifuge.
5.2.2 Centrifuge tube, glass, of 10 ml capacity, with ground stopper.
5.2.3 Vibrating electric shaker, for vigorous agitation of the centrifuge tube.
5.2.4 Water bath, thermostatically controlled, and capable of being maintained at 40 °C ± 0,5 °C.
5.2.5 Hypodermic syringe, of 1 ml capacity, with thin needle.
5.2.6 Stopwatch.
5.3 Apparatus for the isolation of the 2-monoglycerides
5.3.1 Developing tank, for thin-layer chromatography, with ground glass lid, suitable for containing
glass plates 200 mm x 200 mm.
, for preparation of the plates.
5.3.2 Spreader and rack
, 200 mm x 200 mm.
5.3.3 Glass plates
5.3.4 Microsyringe, capable of dispensing drops of 3 μl to 4 μl.
5.3.5 Apparatus for spraying the indicator solution onto the plates
5.3.6 Microspatula.
5.3.7 Oven, capable of being maintained at 103 °C ± 2 °C.
5.3.8 Ultraviolet lamp, for examining chromatographic plates, for example with a wavelength of
254 nm.
, of 25 ml capacity, with of approximately 1 m length, with
5.3.9 Round-bottom flask air condenser
ground joint.
5.3.10 Conical flask, of 250 ml capacity, with ground stopper.
5.3.11 Conical flask, of 50 ml capacity (if necessary).
5.3.12 Filter, of sintered glass, porosity P 40 (16 μm to 40 μm) (if necessary).
5.3.13 Desiccator, containing an efficient desiccant.
5.4 Apparatus for the analysis of the 2-monoglycerides by gas chromatography
See ISO 5508 and ISO 5509.
6 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport and storage.
©
ISO
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
[1]
method is given in ISO 5555 .
7 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with ISO 661.
8 Procedure
NOTE — If it is required to check whether the repeatability requirement (see 10.2) is met, carry out two single
determinations in accordance with 8.1 to 8.6.
8.1 Determination of the acidity of the test sample
Determine the acidity of the test sample in accordance with ISO 660.
If the acidity is below 3 % (m/m), purify the sample through alumina in accordance with 8.3.
If the acidity exceeds 3 % (m/m), first neutralize the sample with sodium hydroxide in the presence of
solvent in accordance with 8.2 then purify through alumina in accordance with 8.3.
8.2 Neutralization with sodium hydroxide
Dissolve about 10 g of the test sample in 100 ml of hexane (if available) or light petroleum (4.1.2) and
transfer the solution to the separating funnel (5.1.5). Add 50 ml of 2-propanol or ethanol (4.1.1), a few
drops of phenolphthalein solution (4.1.5) and a volume of sodium hydroxide solution (4.1.4) equivalent
to the free acidity of the fat or oil, with an excess of 0,5 %. Shake vigorously for 1 min, add 50 ml of
water, shake again and allow to stand. When separated, run off the lower layer containing the soap and
any intermediate layers (mucilages and insoluble substances). Wash the hexane or light petroleum
solution of the neutralized oil with successive 25 ml or 30 ml portions of a solution of 2-propanol or
ethanol (4.1.3) until the pink colour of the phenolphthalein disappears.
Transfer the solution to the rotary evaporator flask (5.1.3) and remove most of the solvent by
evaporating under reduced pressure. Dry the oil at 30 °C to 40 °C under reduced pressure using a
nitrogen stream (4.1.7) until the solvent is completely removed.
8.3 Purification of the test portion through alumina
Prepare a suspension of 15 g of activated alumina (4.1.6) in 50 ml of hexane (if available) or light
petroleum (4.1.2) and pour, while shaking, into a glass column for chromatography (5.1.2). Ensure that
the alumina settles evenly and allow the solvent level to fall to 1 mm to 2 mm above the upper level of
the adsorbent. Carefully pour into the column a solution prepared by dissolving a test portion of 5 g,
neutralized if necessary, in 25 ml of hexane (if available) or light petroleum (4.1.2) and collect all the
liquid which elutes from the column in a 100 ml round-bottom flask (5.1.6).
Remove most of the solvent by evaporation under reduced pressure, then dry the oil at 30 °C to 40 °C
using a nitrogen stream (4.1.7) until the solvent is completely removed.
©
ISO
8.4 Hydrolysis of the triglycerides
8.4.1 Weigh approximately 0,1 g of the purified test portion (8.3) in a 10 ml centrifuge tube (5.2.2). If
this test portion is not liquid at ambient temperature, place the tube in a water bath set at between 60 °C
and 65 °C. If by then the test portion is not completely liquid, continue the immersion for not more than
another 10 s.
Remove the tube from the water bath and continue directly and in rapid succession with the procedure
steps 8.4.2 to 8.4.5.
8.4.2 Add to the liquefied test portion a previously weighed amount of 20 mg of lipase (4.2.6) and add
2 ml of the buffer solution (4.2.5). Shake carefully and add successively 0,5 ml of sodium cholate
solution (4.2.3) and 0,2 ml of calcium chloride solution (4.2.4).
Insert the stopper, shake carefully and place the tube immediately in the water bath set at 40 °C,
maintaining manual shaking for 60 s ± 2 s. These actions shall be executed within approximately 30 s.
8.4.3 Remove the tube from the water bath and shake vigorously at 40 °C for 120 s ± 2 s using the
shaker (5.2.3).
8.4.4 Immediately add 1 ml of hydrochloric acid (4.2.2) and approximately 1 ml of diethyl ether (4.2.1).
Insert the stopper and shake vigorously using the shaker (5.2.3).
8.4.5 Centrifuge and transfer the organic phase to a test tube using the syringe (5.2.5). If the test
portion was solid at ambient temperature, repeat the extraction with a further 1 ml portion of diethyl ether
and combine the extracts in the test tube.
8.5 Isolation of the 2-monoglycerides
8.5.1 Preparation of the plates
NOTE — Fully prepared plates are available commercially.
Carefully clean the glass plates (5.3.3) with ethanol (4.3.1), hexane or light petroleum (4.3.2) and
acetone (4.3.3) until any fatty matter is completely removed.
Weigh 30 g of silica (4.3.4) into a 250 ml conical flask (5.3.10). Add 60 ml of water. Insert the stopper
and shake vigorously for 1 min. Immediately introduce the slurry into the spreader (5.3.2). Spread a
layer 0,25 mm thick on the clean plates. Allow the plates to dry for at least 1 h in air.
In all cases, whether the plates have been prepared as above or commercially prepared, activate the
plates in the oven (5.3.7) set at 103 °C for 1 h. Before use, allow the plates to cool to ambient
temperature in the desiccator (5.3.13).
In order to avoid acyl migrations, the silica gel plates shall be impregnated with boric acid. The reaction
mixture shall be separated by TLC as soon as possible.
As certain silicas contain organic products which may affect the fatty acids during the analysis by
chromatography, it is recommended that a blank test be carried out to ensure that there are no such
substances present. Otherwise, clean the prepared plate
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6800
Deuxième édition
1997-12-15
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination de la
composition des acides gras en position 2
dans les triglycérides
Animal and vegetable fats and oils — Determination of the composition of
fatty acids in the 2-position of the triglyceride molecules
A
Numéro de référence
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6800 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 11, Corps
gras d'origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 6800:1985), dont elle constitue une révision technique.
Les annexes A à C de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d'information.
© ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet central@iso.ch
X.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
©
NORME INTERNATIONALE ISO ISO 6800:1997(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la
composition des acides gras en position 2 dans les triglycérides
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination dans les corps gras d'origines animale et
végétale de la composition de la fraction des acides gras estérifiés en position 2 (position b ou position interne)
dans les triglycérides.
En raison des particularités d'action de la lipase pancréatique, la méthode s'applique seulement aux corps gras
o
ayant un point de fusion inférieur à 45 C.
Elle n'est pas applicable sans restrictions à tous les corps gras, en particulier à ceux renfermant des quantités
importantes
— soit d'acides gras ayant 12 atomes de carbone ou moins (par exemple huiles de coprah et de palmiste,
matières grasses butyriques du beurre);
— soit d'acides gras ayant 20 atomes de carbone et plus et d'insaturation élevée (plus de quatre doubles liaisons)
(par exemple huiles de poissons et d'animaux marins);
— soit d'acides gras possédant des fonctions oxygénées secondaires.
NOTE — Les acides gras avec doubles liens en position (n-16) à (n-11) (par exemple acide pétrosélinique) ne sont convertis
que très lentement par lipase pancréatique, ce qui pourrait donner des résultats erronés.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 660:1996, Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de l'indice d'acide et de l'acidité.
ISO 661:1989,
Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai.
ISO 5508:1990, Corps gras d'origine animale et végétale — Analyse par chromatographie en phase gazeuse des
esters méthyliques d'acides gras.
1)
ISO 5509:— , Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation des esters méthyliques d'acides gras.
___________
1) À publier. (Révision de l'ISO 5509:1978)
©
ISO
3 Principe
Après neutralisation éventuelle des acides gras libres, purification de la prise d'essai par chromatographie sur
colonne. Hydrolyse enzymatique partielle des glycérides pour obtenir les mono-2 glycérides. Séparation des
monoglycérides par chromatographie sur couche mince et détermination de leur composition en acides gras par
chromatographie en phase gazeuse.
4 Réactifs
Tous les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique et l'eau utilisée doit être de qualité 2, conformément à
l'ISO 3696.
4.1 Réactifs pour la purification de la prise d'essai
4.1.1 Propanol-2 ou éthanol, à 95 % (V/V).
o o
4.1.2 Hexane ou, à défaut, éther de pétrole (intervalle de distillation 30 C à 60 C).
4.1.3 Propanol-2, à 50 % (V/V) ou éthanol, à 50 % (V/V).
4.1.4 Hydroxyde de sodium, solution à 0,5 mol/l.
4.1.5 Phénolphtaléine, solution à 1 g pour 100 ml dans l'éthanol à 95 % (V/V).
4.1.6 Alumine activée neutre, pour chromatographie, de degré d'activité Brockmann I, récemment activée
o
pendant 2 h à 260 C et conservée dans un dessiccateur.
4.1.7 Azote.
4.2 Réactifs pour l'hydrolyse des triglycérides
4.2.1 Oxyde diéthylique, exempt de peroxydes.
4.2.2 Acide chlorhydrique, solution à 6 mol/l.
, solution à 1 g/l, de qualité enzymatique.
4.2.3 Cholate de sodium
4.2.4 Chlorure de calcium, solution à 220 g/l de CaCl .
2)
4.2.5 Solution tampon, d'amino-2 hydroxyméthyl-2 propane diol-1,3 , à 1 mol/l, amenée à pH 8 par de l'acide
chlorhydrique (4.2.2) en utilisant un pH-mètre.
o o
Conserver cette solution entre 0 C et 4 C et l'utiliser dans les 14 d après préparation.
4.2.6 Lipase pancréatique, ayant une activité comprise entre 8 et 20 unités par milligramme.
Elle doit être conservée déshydratée au réfrigérateur. Avant utilisation pour l'analyse, porter une partie de la poudre
à la température ambiante.
NOTE — Il existe dans le commerce des lipases ayant une activité lipasique satisfaisante. Si l'on préfère, la lipase peut être
préparée et contrôlée selon la technique décrite en annexe A.
___________
2) Autres désignations: tris-(hydroxyméthyl) méthylamine; tris-(hydroxyméthyl) aminométhane.
©
ISO
4.3 Réactifs pour l'isolement des mono-2 glycérides
4.3.1 Éthanol, à 95 % (V/V).
o o
4.3.2 Hexane ou, à défaut, éther de pétrole (intervalle de distillation 30 C à 60 C).
4.3.3 Acétone.
4.3.4 Silice en poudre, avec liant, pour chromatographie en couche mince.
4.3.5 Solvant de développement, préparé comme suit:
hexane ou, à défaut, éther de pétrole: 70 ml
oxyde diéthylique: 30 ml
acide formique à 98 % (V/V) min.: 1 ml
4.3.6 Révélateur: solution méthanolique à 2 g/l de dichloro-2¢, 7¢ fluorescéine, légèrement alcalinisée par addition
d'une goutte d'hydroxyde de sodium à 1 mol/l pour 100 ml de solution.
4.4 Réactifs pour l'analyse des mono-2 glycérides par chromatographie en phase gazeuse
Voir ISO 5508 et ISO 5509.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
5.1 Appareillage pour la purification de la prise d'essai
o o
5.1.1 Bain d'eau thermostatique, réglable à une température comprise entre 30 C et 40 C.
5.1.2 Colonne en verre, pour chromatographie, de 13 mm de diamètre intérieur et 400 mm de longueur, équipée
d'une plaque en verre fritté et d'un robinet.
5.1.3 Évaporateur rotatif, avec ballon de 250 ml.
5.1.4 Tubulure, pour barbotage d'azote.
5.1.5 Ampoule à décanter, de 500 ml de capacité.
5.1.6 Ballon, de 100 ml de capacité.
5.2 Appareillage pour l'hydrolyse des triglycérides
5.2.1 Centrifugeuse.
5.2.2 Tube de centrifugeuse, en verre, de 10 ml de capacité, avec bouchon rodé.
5.2.3 Agitateur électrique vibrant, permettant une agitation énergique du tube de centrifugeuse.
o o
5.2.4 Bain d'eau thermostatique, réglable à une température de 40 C – 0,5 C.
5.2.5 Seringue hypodermique, de 1 ml de capacité, munie d'une aiguille mince.
5.2.6 Chronomètre.
©
ISO
5.3 Appareillage pour l'isolement des mono-2 glycérides
5.3.1 Cuve de développement, pour chromatographie en couche mince, avec couvercle en verre rodé,
susceptible de contenir des plaques en verre de 200 mm · 200 mm.
5.3.2 Étaleur et socle, pour la préparation des plaques.
5.3.3 Plaques en verre, de 200 mm · 200 mm.
5.3.4 Microseringue, permettant de délivrer des gouttelettes de 3 ml à 4 ml.
5.3.5 Appareil pour pulvériser le révélateur sur les plaques.
5.3.6 Microspatule.
o o
5.3.7 Étuve, réglable à 130 C – 2 C.
5.3.8 Lampe U.V., pour l'examen des plaques chromatographiques, de longueur d'onde 254 nm par exemple.
5.3.9 Ballon, de 25 ml de capacité, avec réfrigérant à air, d'environ 1 m de longueur, avec raccord rodé.
5.3.10 Fiole conique, de 250 ml de capacité, à bouchon rodé.
5.3.11 Fiole conique, de 50 ml de capacité (éventuellement).
5.3.12 Filtre, en verre fritté, de porosité P 40 (16 mm à 40 mm) (éventuellement).
5.3.13 Dessiccateur, contenant un agent desséchant efficace.
5.4 Appareillage pour l'analyse des mono-2 glycérides par chromatographie en phase gazeuse
Voir ISO 5508 et ISO 5509.
6 Échantillonnage
Il est essentiel que l'échantillon envoyé au laboratoire soit vraiment représentatif et qu'il ne soit ni endommagé ni
modifié par le transport et le stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Il est
[1]
recommandé de se référer à la méthode donnée dans l'ISO 5555 .
7 Préparation de l'échantillon
Préparer l'échantillon pour essai à partir de l'échantillon pour laboratoire conformément à l'ISO 661.
8 Mode opératoire
NOTE — Dans le cas où il est demandé de vérifier le respect de la prescription de répétabilité (voir 10.2), effectuer deux
déterminations séparées conformément à 8.1 à 8.6.
8.1 Détermination de l'acidité de l'échantillon pour essai
Déterminer l'acidité de l'échantillon pour essai selon l'ISO 660.
Si l'acidité est inférieure à 3 % (m/m), procéder à une purification de l'échantillon par passage sur alumine selon 8.3.
©
ISO
Si l'acidité est supérieure à 3 % (m/m), procéder préalablement à une neutralisation de l'échantillon par l'hydroxyde
de sodium en présence de solvant en opérant selon 8.2, puis effectuer une purification par passage sur alumine
selon 8.3.
8.2 Neutralisation par l'hydroxyde de sodium
Dissoudre environ 10 g d'échantillon pour essai dans 100 ml d'hexane ou d'éther de pétrole (4.1.2) et verser la
solution dans une ampoule à décanter (5.1.5). Ajouter 50 ml de propanol-2 ou d'éthanol (4.1.1), quelques gouttes
de solution de phénolphtaléine (4.1.5) et une quantité de la solution d'hydroxyde de sodium (4.1.4) correspondant à
l'action libre du corps gras, plus un excès de 0,5 %. Agiter énergiquement pendant 1 min, ajouter 50 ml d'eau, agiter
à nouveau et laisser reposer. Après décantation, éliminer la couche inférieure contenant les savons et les
éventuelles couches intermédiaires (mucilages et substances insolubles). Laver la solution d'hexane ou d'éther de
pétrole de l'huile neutralisée avec des quantités successives de 25 ml ou 30 ml d'une solution de propanol-2 ou
d'éthanol (4.1.3) jusqu'à disparition de la coloration rosée de la phénolphtaléine.
Verser la solution dans le ballon de l'évaporateur rotatif (5.1.3) et éliminer la plus grande partie du solvant par
o o
distillation sous pression réduite. Sécher l'huile de 30 C à 40 C sous pression réduite à l'aide d'un courant d'azote
(4.1.7), jusqu'à élimination totale du solvant.
8.3 Purification de la prise d'essai sur alumine
Préparer une suspension de 15 g d'alumine activée (4.1.6) dans 50 ml d'hexane ou d'éther de pétrole (4.1.2), et
verser, en agitant dans une colonne en verre pour chromatographie (5.1.2). Régulariser la répartition de l'alumine et
laisser s'écouler le solvant de 1 mm à 2 mm au-dessus du niveau supérieur de l'absorbant. Verser soigneusement
dans la colonne une solution préparée par dissolution de 5 g de prise d'essai, neutralisée si nécessaire, dans 25 ml
d'hexane ou d'éther de pétrole (4.1.2), et recueillir la totalité du liquide sortant de la colonne dans un ballon de
100 ml (5.1.6).
o o
Éliminer la plus grande partie du solvant par distillation sous pression réduite, puis sécher l'huile de 30 C à 40 C à
l'aide d'un courant d'azote (4.1.7) jusqu'à élimination totale du solvant.
8.4 Hydrolyse des triglycérides
8.4.1 Peser dans un tube de centrifugeuse de 10 ml (5.2.2) environ 0,1 g de la prise d'essai purifiée (8.3). Si la
o o
prise d'essai est solide, mettre le tube bans un bain d'eau maintenu de 60 C à 65 C jusqu'à liquéfaction pendant
30 s au maximum. Si la prise d'essai n'est toujours pas liquide, continuer l'immersion pendant 10 s de plus.
Retirer le tube du bain et procéder directement et sans délai aux étapes de la procédure décrites de 8.4.2 à 8.4.5.
8.4.2 Ajouter à la prise d'essai liquéfiée, une quantité pesée au préalable de 20 mg de lipase (4.2.6) et ajouter 2 ml
de solution tampon (4.2.5). Agiter avec précaution et ajouter successivement 0,5 ml de solution de cholate de
sodium (4.2.3) et 0,2 ml de solution de chlorure de calcium (4.2.4).
o
Mettre en place le bouchon, agiter avec précaution et placer aussitôt le tube dans le bain d'eau à 40 C, en
continuant à agiter manuellement pendant 60 s – 2 s au total.
Les actions mentionnées ci-dessus doivent être exécutées en moins de 30 s, sauf pour ce qui concerne l'agitation
pendant 60 s – 2 s.
o
8.4.3 Retirer le tube du bain et agiter énergiquement à 40 C pendant 120 s – 2 s à l'aide de l'agitateur (5.2.3).
8.4.4 Ajouter immédiatement 1 ml d'acide chlorhydrique (4.2.2) et approximativement 1 ml d'oxyde diéthylique
(4.2.1). Boucher et agiter énergiquement à l'aide de l'agitateur (5.2.3).
8.4.5 Centrifuger et transférer la phase organique dans un tube à essais, à l'aide de la seringue (5.2.5). Si la prise
d'essai était solide à la température ambiante, recommencer l'extrac
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6800
Deuxième édition
1997-12-15
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination de la
composition des acides gras en position 2
dans les triglycérides
Animal and vegetable fats and oils — Determination of the composition of
fatty acids in the 2-position of the triglyceride molecules
A
Numéro de référence
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6800 a été élaborée par le comité technique
ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 11, Corps
gras d'origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition
(ISO 6800:1985), dont elle constitue une révision technique.
Les annexes A à C de la présente Norme internationale sont données
uniquement à titre d'information.
© ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 6800:1997(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de la
composition des acides gras en position 2 dans les triglycérides
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination dans les corps gras d'origines animale et
végétale de la composition de la fraction des acides gras estérifiés en position 2 (position b ou position interne)
dans les triglycérides.
En raison des particularités d'action de la lipase pancréatique, la méthode s'applique seulement aux corps gras
o
ayant un point de fusion inférieur à 45 C.
Elle n'est pas applicable sans restrictions à tous les corps gras, en particulier à ceux renfermant des quantités
importantes
— soit d'acides gras ayant 12 atomes de carbone ou moins (par exemple huiles de coprah et de palmiste,
matières grasses butyriques du beurre);
— soit d'acides gras ayant 20 atomes de carbone et plus et d'insaturation élevée (plus de quatre doubles liaisons)
(par exemple huiles de poissons et d'animaux marins);
— soit d'acides gras possédant des fonctions oxygénées secondaires.
NOTE — Les acides gras avec doubles liens en position (n-16) à (n-11) (par exemple acide pétrosélinique) ne sont convertis
que très lentement par lipase pancréatique, ce qui pourrait donner des résultats erronés.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 660:1996, Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination de l'indice d'acide et de l'acidité.
ISO 661:1989,
Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai.
ISO 5508:1990, Corps gras d'origine animale et végétale — Analyse par chromatographie en phase gazeuse des
esters méthyliques d'acides gras.
1)
ISO 5509:— , Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation des esters méthyliques d'acides gras.
___________
1) À publier. (Révision de l'ISO 5509:1978)
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ISO
3 Principe
Après neutralisation éventuelle des acides gras libres, purification de la prise d'essai par chromatographie sur
colonne. Hydrolyse enzymatique partielle des glycérides pour obtenir les mono-2 glycérides. Séparation des
monoglycérides par chromatographie sur couche mince et détermination de leur composition en acides gras par
chromatographie en phase gazeuse.
4 Réactifs
Tous les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique et l'eau utilisée doit être de qualité 2, conformément à
l'ISO 3696.
4.1 Réactifs pour la purification de la prise d'essai
4.1.1 Propanol-2 ou éthanol, à 95 % (V/V).
o o
4.1.2 Hexane ou, à défaut, éther de pétrole (intervalle de distillation 30 C à 60 C).
4.1.3 Propanol-2, à 50 % (V/V) ou éthanol, à 50 % (V/V).
4.1.4 Hydroxyde de sodium, solution à 0,5 mol/l.
4.1.5 Phénolphtaléine, solution à 1 g pour 100 ml dans l'éthanol à 95 % (V/V).
4.1.6 Alumine activée neutre, pour chromatographie, de degré d'activité Brockmann I, récemment activée
o
pendant 2 h à 260 C et conservée dans un dessiccateur.
4.1.7 Azote.
4.2 Réactifs pour l'hydrolyse des triglycérides
4.2.1 Oxyde diéthylique, exempt de peroxydes.
4.2.2 Acide chlorhydrique, solution à 6 mol/l.
, solution à 1 g/l, de qualité enzymatique.
4.2.3 Cholate de sodium
4.2.4 Chlorure de calcium, solution à 220 g/l de CaCl .
2)
4.2.5 Solution tampon, d'amino-2 hydroxyméthyl-2 propane diol-1,3 , à 1 mol/l, amenée à pH 8 par de l'acide
chlorhydrique (4.2.2) en utilisant un pH-mètre.
o o
Conserver cette solution entre 0 C et 4 C et l'utiliser dans les 14 d après préparation.
4.2.6 Lipase pancréatique, ayant une activité comprise entre 8 et 20 unités par milligramme.
Elle doit être conservée déshydratée au réfrigérateur. Avant utilisation pour l'analyse, porter une partie de la poudre
à la température ambiante.
NOTE — Il existe dans le commerce des lipases ayant une activité lipasique satisfaisante. Si l'on préfère, la lipase peut être
préparée et contrôlée selon la technique décrite en annexe A.
___________
2) Autres désignations: tris-(hydroxyméthyl) méthylamine; tris-(hydroxyméthyl) aminométhane.
©
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4.3 Réactifs pour l'isolement des mono-2 glycérides
4.3.1 Éthanol, à 95 % (V/V).
o o
4.3.2 Hexane ou, à défaut, éther de pétrole (intervalle de distillation 30 C à 60 C).
4.3.3 Acétone.
4.3.4 Silice en poudre, avec liant, pour chromatographie en couche mince.
4.3.5 Solvant de développement, préparé comme suit:
hexane ou, à défaut, éther de pétrole: 70 ml
oxyde diéthylique: 30 ml
acide formique à 98 % (V/V) min.: 1 ml
4.3.6 Révélateur: solution méthanolique à 2 g/l de dichloro-2¢, 7¢ fluorescéine, légèrement alcalinisée par addition
d'une goutte d'hydroxyde de sodium à 1 mol/l pour 100 ml de solution.
4.4 Réactifs pour l'analyse des mono-2 glycérides par chromatographie en phase gazeuse
Voir ISO 5508 et ISO 5509.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment:
5.1 Appareillage pour la purification de la prise d'essai
o o
5.1.1 Bain d'eau thermostatique, réglable à une température comprise entre 30 C et 40 C.
5.1.2 Colonne en verre, pour chromatographie, de 13 mm de diamètre intérieur et 400 mm de longueur, équipée
d'une plaque en verre fritté et d'un robinet.
5.1.3 Évaporateur rotatif, avec ballon de 250 ml.
5.1.4 Tubulure, pour barbotage d'azote.
5.1.5 Ampoule à décanter, de 500 ml de capacité.
5.1.6 Ballon, de 100 ml de capacité.
5.2 Appareillage pour l'hydrolyse des triglycérides
5.2.1 Centrifugeuse.
5.2.2 Tube de centrifugeuse, en verre, de 10 ml de capacité, avec bouchon rodé.
5.2.3 Agitateur électrique vibrant, permettant une agitation énergique du tube de centrifugeuse.
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5.2.4 Bain d'eau thermostatique, réglable à une température de 40 C – 0,5 C.
5.2.5 Seringue hypodermique, de 1 ml de capacité, munie d'une aiguille mince.
5.2.6 Chronomètre.
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ISO
5.3 Appareillage pour l'isolement des mono-2 glycérides
5.3.1 Cuve de développement, pour chromatographie en couche mince, avec couvercle en verre rodé,
susceptible de contenir des plaques en verre de 200 mm · 200 mm.
5.3.2 Étaleur et socle, pour la préparation des plaques.
5.3.3 Plaques en verre, de 200 mm · 200 mm.
5.3.4 Microseringue, permettant de délivrer des gouttelettes de 3 ml à 4 ml.
5.3.5 Appareil pour pulvériser le révélateur sur les plaques.
5.3.6 Microspatule.
o o
5.3.7 Étuve, réglable à 130 C – 2 C.
5.3.8 Lampe U.V., pour l'examen des plaques chromatographiques, de longueur d'onde 254 nm par exemple.
5.3.9 Ballon, de 25 ml de capacité, avec réfrigérant à air, d'environ 1 m de longueur, avec raccord rodé.
5.3.10 Fiole conique, de 250 ml de capacité, à bouchon rodé.
5.3.11 Fiole conique, de 50 ml de capacité (éventuellement).
5.3.12 Filtre, en verre fritté, de porosité P 40 (16 mm à 40 mm) (éventuellement).
5.3.13 Dessiccateur, contenant un agent desséchant efficace.
5.4 Appareillage pour l'analyse des mono-2 glycérides par chromatographie en phase gazeuse
Voir ISO 5508 et ISO 5509.
6 Échantillonnage
Il est essentiel que l'échantillon envoyé au laboratoire soit vraiment représentatif et qu'il ne soit ni endommagé ni
modifié par le transport et le stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Il est
[1]
recommandé de se référer à la méthode donnée dans l'ISO 5555 .
7 Préparation de l'échantillon
Préparer l'échantillon pour essai à partir de l'échantillon pour laboratoire conformément à l'ISO 661.
8 Mode opératoire
NOTE — Dans le cas où il est demandé de vérifier le respect de la prescription de répétabilité (voir 10.2), effectuer deux
déterminations séparées conformément à 8.1 à 8.6.
8.1 Détermination de l'acidité de l'échantillon pour essai
Déterminer l'acidité de l'échantillon pour essai selon l'ISO 660.
Si l'acidité est inférieure à 3 % (m/m), procéder à une purification de l'échantillon par passage sur alumine selon 8.3.
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ISO
Si l'acidité est supérieure à 3 % (m/m), procéder préalablement à une neutralisation de l'échantillon par l'hydroxyde
de sodium en présence de solvant en opérant selon 8.2, puis effectuer une purification par passage sur alumine
selon 8.3.
8.2 Neutralisation par l'hydroxyde de sodium
Dissoudre environ 10 g d'échantillon pour essai dans 100 ml d'hexane ou d'éther de pétrole (4.1.2) et verser la
solution dans une ampoule à décanter (5.1.5). Ajouter 50 ml de propanol-2 ou d'éthanol (4.1.1), quelques gouttes
de solution de phénolphtaléine (4.1.5) et une quantité de la solution d'hydroxyde de sodium (4.1.4) correspondant à
l'action libre du corps gras, plus un excès de 0,5 %. Agiter énergiquement pendant 1 min, ajouter 50 ml d'eau, agiter
à nouveau et laisser reposer. Après décantation, éliminer la couche inférieure contenant les savons et les
éventuelles couches intermédiaires (mucilages et substances insolubles). Laver la solution d'hexane ou d'éther de
pétrole de l'huile neutralisée avec des quantités successives de 25 ml ou 30 ml d'une solution de propanol-2 ou
d'éthanol (4.1.3) jusqu'à disparition de la coloration rosée de la phénolphtaléine.
Verser la solution dans le ballon de l'évaporateur rotatif (5.1.3) et éliminer la plus grande partie du solvant par
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distillation sous pression réduite. Sécher l'huile de 30 C à 40 C sous pression réduite à l'aide d'un courant d'azote
(4.1.7), jusqu'à élimination totale du solvant.
8.3 Purification de la prise d'essai sur alumine
Préparer une suspension de 15 g d'alumine activée (4.1.6) dans 50 ml d'hexane ou d'éther de pétrole (4.1.2), et
verser, en agitant dans une colonne en verre pour chromatographie (5.1.2). Régulariser la répartition de l'alumine et
laisser s'écouler le solvant de 1 mm à 2 mm au-dessus du niveau supérieur de l'absorbant. Verser soigneusement
dans la colonne une solution préparée par dissolution de 5 g de prise d'essai, neutralisée si nécessaire, dans 25 ml
d'hexane ou d'éther de pétrole (4.1.2), et recueillir la totalité du liquide sortant de la colonne dans un ballon de
100 ml (5.1.6).
o o
Éliminer la plus grande partie du solvant par distillation sous pression réduite, puis sécher l'huile de 30 C à 40 C à
l'aide d'un courant d'azote (4.1.7) jusqu'à élimination totale du solvant.
8.4 Hydrolyse des triglycérides
8.4.1 Peser dans un tube de centrifugeuse de 10 ml (5.2.2) environ 0,1 g de la prise d'essai purifiée (8.3). Si la
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prise d'essai est solide, mettre le tube bans un bain d'eau maintenu de 60 C à 65 C jusqu'à liquéfaction pendant
30 s au maximum. Si la prise d'essai n'est toujours pas liquide, continuer l'immersion pendant 10 s de plus.
Retirer le tube du bain et procéder directement et sans délai aux étapes de la procédure décrites de 8.4.2 à 8.4.5.
8.4.2 Ajouter à la prise d'essai liquéfiée, une quantité pesée au préalable de 20 mg de lipase (4.2.6) et ajouter 2 ml
de solution tampon (4.2.5). Agiter avec précaution et ajouter successivement 0,5 ml de solution de cholate de
sodium (4.2.3) et 0,2 ml de solution de chlorure de calcium (4.2.4).
o
Mettre en place le bouchon, agiter avec précaution et placer aussitôt le tube dans le bain d'eau à 40 C, en
continuant à agiter manuellement pendant 60 s – 2 s au total.
Les actions mentionnées ci-dessus doivent être exécutées en moins de 30 s, sauf pour ce qui concerne l'agitation
pendant 60 s – 2 s.
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8.4.3 Retirer le tube du bain et agiter énergiquement à 40 C pendant 120 s – 2 s à l'aide de l'agitateur (5.2.3).
8.4.4 Ajouter immédiatement 1 ml d'acide chlorhydrique (4.2.2) et approximativement 1 ml d'oxyde diéthylique
(4.2.1). Boucher et agiter énergiquement à l'aide de l'agitateur (5.2.3).
8.4.5 Centrifuger et transférer la phase organique dans un tube à essais, à l'aide de la seringue (5.2.5). Si la prise
d'essai était solide à la température ambiante, recommencer l'extrac
...
Questions, Comments and Discussion
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