Animal feeding stuffs — Determination of vitamin A content — Method using high-performance liquid chromatography

Aliments des animaux — Détermination de la teneur en vitamine A — Méthode par chromatographie liquide à haute performance

La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la teneur en vitamine A totale (rétinol) des aliments pour animaux d'élevage et animaux de compagnie par chromatographie liquide à haute performance. La teneur en vitamine A est la teneur en alcool de rétinyle tout-trans et cis-isomères déterminée par la méthode décrite dans la présente Norme internationale, exprimée en Unités internationales par kilogramme (Ul/kg).

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ISO 14565:2000 - Animal feeding stuffs -- Determination of vitamin A content -- Method using high-performance liquid chromatography
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ISO 14565:2000 - Aliments des animaux -- Détermination de la teneur en vitamine A -- Méthode par chromatographie liquide a haute performance
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Standards Content (Sample)

First edition
Animal feeding stuffs — Determination of
vitamin A content — Method using high-
performance liquid chromatography
Aliments des animaux — Détermination de la teneur en vitamine A —
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
Reference number
ISO 14565:2000(E)
ISO 2000

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ISO 14565:2000(E)
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ISO 14565:2000(E)
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committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 14565 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 10, Animal feeding stuffs.
Annex A of this International Standard is for information only.
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Animal feeding stuffs — Determination of vitamin A content —
Method using high-performance liquid chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the total vitamin A (retinol) content of animal
feeding stuffs and pet foods using high-performance liquid chromatography. The vitamin A content is the content of
all-trans-retinyl alcohol and cis-isomers determined by the method described in this International Standard, and is
expressed in International Units per kilogram (IU/kg).
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative documents referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods.
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Preparation of test samples.
3 Term and definition
For the purposes of this International Standard, the following term and definition apply.
vitamin A content
content of all-trans-retinyl alcohol and cis-isomers determined in accordance with this International Standard
NOTE The vitamin A content is expressed in International Units per kilogram (IU/kg); 1 IU of vitamin A is equal to 0,300 �g
of all-trans-retinol.
The sample is saponified with ethanolic potassium hydroxide solution and the vitamin A is extracted into light
petroleum. The light petroleum is removed by evaporation and the residue is dissolved in 2-propanol. The vitamin A
concentration in the 2-propanol extract is determined by reverse-phase liquid chromatography using conditions that
give a single peak for all retinol isomers.
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ISO 14565:2000(E)
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water, complying with at least grade 3 in accordance with ISO 3696.
5.2 Potassium hydroxide solution (KOH).
Dissolve 500 g of potassium hydroxide in water (4.1) and dilute to 1 litre.
5.3 Ethanol, w(C H OH) = 95 % (by volume), or equivalent industrial methylated spirit.
2 5
5.4 2-Propanol (C H OH).
3 7
5.5 Light petroleum, boiling range 40�Cto60�C.
The residue on evaporation shall be less than 20 mg/l.
5.6 Vitamin A standard substances
5.6.1 All-trans-retinyl acetate, vitamin A acetate (C H O ), 328.5 g/mol, with a purity of at least 90 %.
22 32 2
5.6.2 All-trans-retinol, vitamin A alcohol (C H O), 286,5 g/mol, with a purity of at least 90 %
20 30
5.7 Methanol,HPLC grade.
5.8 Mobile phase for liquid chromatography.
Mix together methanol (5.7) and water (4.1) in the proportions 770 + 30 (by volume).
If necessary, filter through a membrane filter (6.6).
5.9 Sodium sulfate (Na SO ), anhydrous.
2 4
5.10 Sodium ascorbate solution, � = 100 g/l.
5.11 Inert gas,e.g.nitrogen.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 High-performance liquid chromatograph, consisting of the following.
6.1.1 Pump, set to deliver a constant eluent volume flow rate of 1 ml/min.
6.1.2 HPLC injection device.
6.1.3 Column, length 250 mm, internal diameter 4,6 mm, packed with a stationary phase consisting of octadecyl
(C ) groups bonded to silica.
A column with at least 4 000 theoretical plates and a k� value of 0,6, both with respect to all-trans-retinol, has been
found to be satisfactory. The particle size shall be not smaller than 5�m and not greater than 10�m. Other
systems may be used provided that a satisfactory separation of vitamin A from other co-extractives is achieved.
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ISO 14565:2000(E)
6.1.4 Detector, allowing the measurement of ultraviolet radiation at 325 nm, and equipped with integrator/data-
handling system.
6.2 UV (or UV-Visible) spectrometer, capable of measuring absorbance at the wavelengths defined in 9.6,
equipped with quartz cells of 10 mm path length.
6.3 Boiling water bath.
6.4 Rotary vacuum evaporator, with water bath at 40�C.
6.5 Extraction apparatus (see Figure 1) consisting of the following:
� a cylinder of 1 litre capacity fitted with a ground glass neck and stopper;
� a ground glass joint, fitting the cylinder and equipped with an adjustable tube passing through the centre; and
� a side-arm.
The adjustable tube should have a U-shaped lower end and a jet at the opposite end so that the upper liquid layer
in the cylinder may be transferred to a separating funnel of 1 litre capacity.
Other extraction equipment such as conical flasks and separating funnels may be used in place of the apparatus
shown in Figure 1, provided that satisfactory recoveries of vitamin A are achieved.
6.6 Membrane filter, 0,45µm pore size, for filtration of mobile phase (5.8) and sample test solutions.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method is
given in ISO 6497 [4].
Store the sample in such a way that deterioration and change in its composition are prevented.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 6498.
Just prior to starting the analysis, grind a portion of the well-mixed laboratory sample so that it passes through a
sieve with 1 mm apertures. Mix thoroughly.
Homogenize canned pet foods. Mince semi-moist pet foods to pass through a plate with 4 mm apertures.
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ISO 14565:2000(E)
1 Cylinder, of capacity 1 litre, with ground-glass neck 5 Bottle, of capacity 1 litre, with ground-glass joint
2 Light petroleum layer 6 Side-arm
3 Aqueous layer + saponified feed 7 Adjustable tub
Figure 1 — Example of extraction apparatus
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ISO 14565:2000(E)
9 Procedure
9.1 General
Because of the sensitivity of vitamin A to UV radiation and air, perform all operations away from natural and strong
fluorescent light and as rapidly as is consistent with accurate working. Use amber glassware where possible.
Complete each assay within one working day. Carry out the saponification and extraction of the all-trans-retinyl
acetate standard and the feeding stuff samples at the same time.
9.2 Saponification
Weigh, to the nearest 0,1 g, approximately 50 g of the prepared test sample (see clause 8) into a 1 litre conical
Add 200 ml of ethanol (5.3). Swirl the flask contents to disperse the sample.
Add 2 ml of sodium ascorbate (5.10) and 50 ml of potassium hydroxide solution (5.2) and mix by swirling.
Fit a reflux condenser to the flask and immerse the flask in the boiling water bath (6.3).
Allow the contents of the flask to reflux for 60 min, swirling occasionally.
Remove and cool the flask to room temperature as rapidly as possible under a stream of cold water.
9.3 Extraction of vitamin A (retinol)
Transfer the contents of the flask to the extraction cylinder (see 6.5).
Rinse the flask with two 25 ml portions of ethanol or industrial methylated spirit (5.3) and transfer the rinsings to the
Repeat the rinsing of the flask with two 125 ml portions of light petroleum (5.5) and one 250 ml portion of water
(4.1), each time transferring the rinsings to the cylinder.
Stopper the cylinder and shake well for 1 min, taking care to release any pressure from time to time.
Cool the cylinder under a stream of cold water while waiting for the two liquid phases to separate, before removing
the stopper.
When the layers have separated, remove the stopper, wash the sides of the stopper with a few millilitres of light
petroleum (5.5) and insert the adjustable tube (see 6.5),

Première édition
Aliments des animaux — Détermination de
la teneur en vitamine A — Méthode par
chromatographie liquide à haute
Animal feeding stuffs — Determination of vitamin A content — Method
using high-performance liquid chromatography
Numéro de référence
ISO 14565:2000(F)
ISO 2000

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ISO 14565:2000(F)
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ISO 14565:2000(F)
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelleoudedroitsanalogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 14565 a étéélaboréepar le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 10, Aliments des animaux.
L'annexe A de la présente Norme internationale est donnée uniquement à titre d'information.
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Aliments des animaux — Détermination de la teneur en
vitamine A — Méthode par chromatographie liquide à haute
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la teneur en vitamine A totale (rétinol)
des aliments pour animaux d’élevage et animaux de compagnie par chromatographie liquide à haute performance.
La teneur en vitamine A est la teneur en alcool de rétinyle tout-trans et cis-isomères déterminée par la méthode
décrite dans la présente Norme internationale, expriméeen Unités internationales par kilogramme (UI/kg).
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai.
ISO 6498:1998, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai.
3 Terme et définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, le terme et la définition suivants s'appliquent.
teneur en vitamine A
teneur en alcool de rétinyle tout-trans et cis-isomères, déterminée selon la présente Norme internationale
NOTE La teneur en vitamine A est expriméeen Unités internationales par kilogramme (UI/kg); 1 UI de vitamine A est égale
à 0,300µgder étinol tout-trans.
L’échantillon est saponifié avec une solution d’hydroxyde de potassium éthanolique et la vitamine A est extraite
dans de l’éther de pétrole. L’éther de pétrole est éliminé par évaporation et le résidu dissous dans du propane-2-ol.
La concentration en vitamine A de l’extrait de propane-2-ol est déterminée par chromatographie liquide en phase
inverse dans des conditions donnant un seul pic pour tous les isomèresdelavitamineA.
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ISO 14565:2000(F)
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau,conformeaumoins à la qualité 3, selon l’ISO 3696.
5.2 Solution d’hydroxyde de potassium (KOH).
Dissoudre 500 g d’hydroxyde de potassium dans de l’eau (5.1) et diluer à 1litre.
5.3 Éthanol, w(C H OH) = 95 % (en volume), ou alcool dénaturé industriel équivalent.
2 5
5.4 Propane-2-ol (C H OH).
3 7
5.5 Éther de pétrole, ayant un point d’ébullition compris entre 40 °Cet60 °C.
Le résidu d’évaporation doit être inférieur à 20 mg/l.
5.6 Substances étalons de vitamine A
5.6.1 Acétate de rétinyle tout-trans,acétate de vitamine A (C H O ), 328,5 g/mol, ayant une pureté d’au
22 32 2
moins 90 %.
5.6.2 Rétinol tout-trans, alcool de vitamine A (C H O), 286,5 g/mol, ayant une pureté d’au moins 90 %.
20 30
5.7 Méthanol, qualité CLHP.
5.8 Éluant pour chromatographie liquide.
Mélanger le méthanol (5.7) et l’eau (5.1) en proportion 770 + 30 (en volume).
Si nécessaire, filtrer à travers une membrane de filtration (6.6).
5.9 Sulfate de sodium (Na SO ), anhydre.
2 4
5.10 Solution d’ascorbate de sodium, � = 100 g/l.
5.11 Gaz inerte, par exemple de l’azote.
6 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Chromatographe liquide à haute performance, se composant des éléments suivants.
6.1.1 Pompe,réglée pour fournir un débit constant de 1 ml/min.
6.1.2 Système d’injection CLHP.
6.1.3 Colonne, de 250 mm de longueur, 4,6 mm de diamètre interne, garnie d’une phase stationnaire se
composant de groupes octadécyles (C )greffés à la silice.
Une colonne avec au moins 4 000 plateaux théoriques et une valeur de k� de 0,6, tous deux par rapport au rétinol
tout-trans,a été jugée satisfaisante. Les dimensions des particules doivent être comprises entre 5µm et 10µm.
D’autres systèmes peuvent être utilisés à condition de permettre une séparation satisfaisante de la vitamine A des
autres coextraits.
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés

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ISO 14565:2000(F)
6.1.4 Détecteur, permettant de mesurer le rayonnement ultraviolet à 325 nm et équipé d’un intégrateur/système
de traitement des données.
6.2 Spectromètre UV (ou dans le visible), capable de mesurer l’absorbance aux longueurs d’ondes définies en
9.6, équipé de cellules en quartz ayant un parcours optique de 10 mm.
6.3 Bain-marie bouillant.
6.4 Évaporateur rotatif sous vide,avec baind’eau à 40 °C.
6.5 Appareil d’extraction (voir Figure 1) se composant des éléments suivants:
� éprouvette d’une capacité de 1 litre à col en verre rodé avec bouchon;
� joint en verre rodé, adaptéà l’éprouvette et équipé d’un tube réglable passant par le centre;
� branche latérale.
Il convient que l’extrémité inférieure du tube réglable soit en forme de U et que l’autre extrémité comporte un
gicleur pour permettre de transférer la phase liquide supérieuredel’éprouvette dans une ampoule à décanter de
L’appareillage présentéà la Figure 1 peut être remplacé par tout autre appareil d’extraction, tel que des fioles
coniques et des ampoules à décanter, à condition que la récupération de la vitamine A soit satisfaisante.
6.6 Membrane de filtration,de 0,45µm d ’ouverture de pores, pour la filtration de la phase mobile (5.8) et des
solutions d’échantillons pour essai.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiéedansla présente Norme internationale. Une méthode
d’échantillonnage recommandée figure dans l’ISO 6497 [4].
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif et n’ayant pas été endommagé ou
modifié pendant le transport ou le stockage.
Stocker l’échantillon de façon à empêcher toute détérioration ou modification de sa composition.
8Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 6498.
Juste avant de commencer l’analyse, broyer une prise d’essai de l’échantillon pour laboratoire bien mélangé de
manière qu’elle passe au travers d’un tamis de 1 mm d’ouverture de mailles. Mélanger soigneusement.
Homogénéiser les aliments en boîte pour animaux de compagnie. Hacher les aliments semi-humides au moyen
d’un hachoir ayant une grille munie d’ouvertures de 4 mm.
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ISO 14565:2000(F)
1 Éprouvette de capacité de 1 litre à col en verre rodé
2 Couche d’éther de pétrole
3 Couche aqueuse + aliment saponifié
4 Gicleur
5 Flacon, de capacité de 1 litre, avec joint en verre rodé
6 Branche latérale
7 Tube réglable
Figure 1 — Exemple d’appareil d’extraction
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ISO 14565:2000(F)
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Du fait de la sensibilité de la vitamine A aux rayons ultraviolets et à l’air, effectuer toutes les opérations à l’abri de la
lumière du jour ou d’une forte lumière artificielle et aussi rapidement que possible sans toutefois compromettre
l’exactitude des opérations. Utiliser de la verrerie ambrée chaque fois que possible. Terminer chaque essai dans la
journée. Effectuer simultanément la saponification et l’extraction de l’étalon d’acétate de rétinyle tout-trans et des
échantillons d’aliments.
9.2 Saponification
Peser, à 0,1 g près, 50 g environ d’échantillon pour essai préparé (voir article 8) et le transvaser dans une fiole
conique de 1 litre.
Ajouter 200 ml d’éthanol (5.3). Agiter le contenu de la fiole en tournant afin de disperser l’échantillon.
Ajouter 2 ml d’ascorbate de sodium (5.10) et 50 ml de solution d’hydroxyde de potassium (5.2) et mélanger en
Adapter un réfrigérant à reflux sur la fiole et immerger cette dernière dans le bain-marie bouillant (6.3).
Laisser bouillir à reflux le contenu de la fiole pendant 60 min en tournant de temps en temps.
Refroidir la fiole à température ambiante aussi rapidement que possible sous un courant d’eau froide.
9.3 Extraction de la vitamine A (rétinol)
Transvaser le contenu de la fiole dans l’éprouvette d’extraction (voir 6.5).
Rincer la fiole avec deux fractions de 25 ml d’éthanol ou d’alcool dénaturé industriel (5.3) et transvaser les rinçages
dans l’éprouvette.
Répéter le rinçage de la fiole avec deux fractions de 125 ml d’éther de pétrole (5.5) et une fraction de 250 ml d’eau
(5.1), en transvasant chaque fois les rinçages dans l’éprouvette.
Boucher l’éprouvette et bien l’agiter pendant 1 min, tout en libérant la pression de temps en temps.
Refroidir l’éprouvette sous un courant d’eaufroidetoutenattendantlaséparation des deux phases liquides avant
de retirer le bouchon.
Une fois les phases séparées, retirer le boucho

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