ISO 5815-1:2019
(Main)Water quality — Determination of biochemical oxygen demand after n days (BODn) — Part 1: Dilution and seeding method with allylthiourea addition
Water quality — Determination of biochemical oxygen demand after n days (BODn) — Part 1: Dilution and seeding method with allylthiourea addition
This document specifies the determination of the biochemical oxygen demand of waters by dilution and seeding with suppression of nitrification after 5 d or 7 d incubation time. It is applicable to all waters having biochemical oxygen demands usually between 1 mg/l and 6 000 mg/l. It applies particularly to waste waters but also suits for the analysis of natural waters. For biochemical oxygen demands greater than 6 000 mg/l of oxygen, the method is still applicable, but special care is needed taking into consideration the representativeness of subsampling for preparation of the dilution steps. The results obtained are the product of a combination of biochemical and chemical reactions in presence of living matter which behaves only with occasional reproducibility. The results do not have the rigorous and unambiguous character of those resulting from, for example, a single, well‑defined, chemical process. Nevertheless, the results provide an indication from which the quality of waters can be estimated.
Qualité de l'eau — Détermination de la demande biochimique en oxygène après n jours (DBOn) — Partie 1: Méthode par dilution et ensemencement avec apport d'allylthiourée
Le présent document spécifie la méthode de détermination de la demande biochimique en oxygène dans les eaux, par dilution et ensemencement, avec suppression de la nitrification après une durée d'incubation de 5 jours ou 7 jours. Cette méthode est applicable à tous les types d'eau dont la demande biochimique en oxygène se situe généralement entre 1 mg/l et 6 000 mg/l. Elle s'applique particulièrement aux eaux usées mais convient également à l'analyse des eaux naturelles. Pour des demandes biochimiques en oxygène de plus de 6 000 mg/l d'oxygène, la méthode est encore applicable, mais une attention particulière est nécessaire concernant la représentativité du sous-échantillonnage pour la préparation des étapes de dilution. Les résultats obtenus sont le produit d'une combinaison de réactions biochimiques et chimiques en présence de matière vivante dont le comportement et les caractéristiques ne sont qu'occasionnellement reproductibles. Les résultats ne possèdent pas le caractère exact et rigoureux de résultats issus par exemple d'un processus chimique unique bien défini. Les résultats fournissent cependant une indication qui permet d'estimer la qualité des eaux.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5815-1
Second edition
2019-07
Water quality — Determination of
biochemical oxygen demand after n
days (BOD ) —
n
Part 1:
Dilution and seeding method with
allylthiourea addition
Qualité de l'eau — Détermination de la demande biochimique en
oxygène après n jours (DBO ) —
n
Partie 1: Méthode par dilution et ensemencement avec apport
d'allylthiourée
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 6
7 Sampling and preservation . 6
8 Interferences . 7
8.1 General . 7
8.2 Presence of free and/or combined chlorine . 7
8.3 Presence of algae . 7
8.4 Presence of peroxides and peroxide compounds. 8
9 Procedure. 8
9.1 General . 8
9.2 Pretreatment . 8
9.2.1 Neutralization of the sample . 8
9.2.2 Homogenization . 9
9.3 Preparation of test solutions . 9
9.4 Calculation of dilutions . 9
9.4.1 Empirical determination of the dilutions . 9
9.4.2 Determination of dilutions via the factors R of the TOC, the permanganate
index or the COD .10
9.4.3 Calculation of dilution stages via the COD .11
9.5 Blank value determination .11
9.6 Determination of dissolved oxygen .11
9.6.1 Measurement of dissolved oxygen using iodometric method (in
accordance with ISO 5813) .11
9.6.2 Measurement of dissolved oxygen using probes (in accordance with
ISO 5814 or ISO 17289) .12
9.7 Control analysis .12
10 Calculation and indication of the results .13
10.1 Examination of test solutions for valid oxygen consumption during test .13
10.2 Calculation of biochemical oxygen demand after n days (BOD ) .13
n
10.3 Validity criteria .14
11 Test report .14
Annex A (normative) Influence of incubation periods and temperatures .15
Annex B (informative) Multitesting .16
Annex C (informative) Direct seeding of the analysis batches .19
Annex D (informative) Performance data .20
Bibliography .22
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World
Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL:
www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 5815-1:2003), which has been technically
revised. The main changes compared to the previous edition are as follows:
— change of working range: 1 mg/l instead of 3 mg/l as lower limit;
— changes in test procedure;
— in 5.2, option to check seeding water suitability in advance with a CGA control analysis batch;
— in 5.3.2, phosphate buffer solution pH-value: requirement for preparation of a new solution if the pH
value is out of the range pH 7 and pH 8;
— in 5.5, range for oxygen consumption of seeded dilution water 0,2 mg/l to 1,5 mg/l instead of upper
limit 1,5 mg/l;
— in 5.9, allowable range BOD of the CGA control solution changed to (198 ± 40) mg/l and BOD
5 7
(206 ± 40) mg/l;
— in 6.5, electrochemical probe option to measure the dissolved oxygen concentration added;
— in 8.4, interferences: subclause on presence of peroxides and peroxide compounds added;
— in 9.4, options to determinate the dilutions elaborated;
— in 9.7, control analysis: elaborated description of procedure;
— in 10.3, "approval of results/validity criteria” added;
— Annex A: title changed and “normative” instead of “informative”
— Annex C "Direct seeding of the analysis batches" added;
iv © ISO 2019 – All rights reserved
— new Annex D "Performance data" included.
A list of all parts in the ISO 5815 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
Introduction
The incubation time specified in this document is 5 d or 7 d. The latter corresponds to the practice in
several Nordic countries. Annex A describes an incubation time of (2 + 5) d.
ISO 5815-1 specifies the determination of the biochemical oxygen demand (BOD) of waters with an
expected BOD in the range 1 mg/l to 6 000 mg/l using the dilution method. A lower limit of working
range may result from validation data in the laboratory. For samples with an expected low BOD in the
range of 0,5 mg/l to 6 mg/l ISO 5815-2 provides the option of the determination of the (BOD) of waters
using undiluted samples.
vi © ISO 2019 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 5815-1:2019(E)
Water quality — Determination of biochemical oxygen
demand after n days (BOD ) —
n
Part 1:
Dilution and seeding method with allylthiourea addition
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies the determination of the biochemical oxygen demand of waters by dilution and
seeding with suppression of nitrification after 5 d or 7 d incubation time.
It is applicable to all waters having biochemical oxygen demands usually between 1 mg/l and
6 000 mg/l. It applies particularly to waste waters but also suits for the analysis of natural waters.
For biochemical oxygen demands greater than 6 000 mg/l of oxygen, the method is still applicable, but
special care is needed taking into consideration the representativeness of subsampling for preparation
of the dilution steps. The results obtained are the product of a combination of biochemical and chemical
reactions in presence of living matter which behaves only with occasional reproducibility. The results
do not have the rigorous and unambiguous character of those resulting from, for example, a single,
well-defined, chemical process. Nevertheless, the results provide an indication from which the quality
of waters can be estimated.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5667-3, Water quality — Preservation and handling of water samples
ISO 5813, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Iodometric method
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 6060, Water quality — Determination of the chemical oxygen demand
ISO 8245, Water quality — Guidelines for the determination of total organic carbon (TOC) and dissolved
organic carbon (DOC)
ISO 8467, Water quality — Determination of permanganate index
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
ISO 15705, Water quality — Determination of the chemical oxygen demand index (ST-COD) — Small-scale
sealed-tube method
ISO 17289, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Optical sensor method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
biochemical oxygen demand after n days
BOD
n
mass concentration of dissolved oxygen consumed under specified conditions by the biochemical
oxidation of organic and/or inorganic matter in water where n is the incubation time equal to 5 d or 7 d
Note 1 to entry: For the purposes of this document “biochemical oxidation” is taken to mean “biological oxidation”.
Note 2 to entry: n is either 5 or 7.
3.2
chemical oxygen demand
COD
mass concentration of oxygen equivalent to the amount of dichromate consumed by dissolved and
suspended matter when a water sample is treated with that oxidant under defined conditions
[SOURCE: ISO 6060:1989, 3]
3.3
total organic carbon
TOC
sum of organically bound carbon present in water, bonded to dissolved or suspended matter, including
cyanate, elemental carbon and thiocyanate
[SOURCE: ISO 8245:1999, 3.3]
3.4
permanganate index (of water)
mass concentration of oxygen equivalent to the amount of permanganate ion consumed when a water
sample is treated with that oxidant under defined conditions
[SOURCE: ISO 8467:1993, 3.1]
3.5
seeding water
water with adapted (aerobic) microorganisms via which the oxidation of the water contents occurs
Note 1 to entry: The seeding water is used for producing the seeded dilution water.
3.6
dilution water
water added to the test sample to prepare a series of defined dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.7
seeded dilution water
dilution water to which a definite amount of seeding water is added
2 © ISO 2019 – All rights reserved
3.8
free chlorine
chlorine present in the form of hypochlorous acid, hypochlorite ion or dissolved elemental chlorine
[SOURCE: ISO 7393-1:1985, 2.1]
3.9
combined chlorine
fraction of total chlorine present in the form of chloramines and organic chloramines
[SOURCE: ISO 7393-1:1985, 2.2]
3.10
nitrification
oxidation of ammonium salts by bacteria where usually the intermediate product is nitrite and the end
product nitrate
[SOURCE: ISO 11733:2004, 3.9]
4 Principle
The BOD , with inhibition of nitrification is determined, using the dilution method. A batch series with
n
different dilutions of a sample is prepared and examined. The dilution water is enriched with oxygen
and seeded with adapted aerobic microorganisms.
The sample is incubated at (20 ± 1) °C for a specified period (n), 5 d or 7 d, in the dark, in a completely
filled and stoppered bottle. The dissolved oxygen concentration is determined before and after
incubation. The mass of consumed oxygen per litre sample is calculated.
5 Reagents
Use only reagents with the degree of purity "for analysis".
5.1 Water, at least grade 3 in accordance with ISO 3696.
The water shall not contain more than 0,01 mg/l of copper, nor chlorine or chloramines.
5.2 Seeding water, which can be obtained in one of the following ways:
a) municipal waste water, decanted or coarsely filtered;
b) surface water containing municipal waste water;
c) settled effluent from a waste water treatment plant;
d) water taken downstream from the discharge of the water to be analysed, or water containing
microorganisms that are adapted to the water to be analysed;
e) commercially available seeding material.
Use seeding water with a COD of about 300 mg/l or a TOC of about 100 mg/l (see 5.5). If the COD or TOC
are higher, adapt to these concentrations with dilution water (5.4) before preparing the seeded dilution
water (5.5) or use a correspondingly changed volume of the seeding waters for seeding the dilution
water (5.4).
If the sample comes from a process that has been subjected to disinfection treatment (chlorination, UV,
ozone or other), use inoculum, even when there is no residual disinfectant present.
For commercially available seeding material consider respective application recommendations.
The selected seeding material can be checked in advance by running the procedure with a control
analysis (9.7) batch only to prove its suitability for the analysis of samples.
5.3 Salt solutions
5.3.1 General
The following solutions can be kept for at least six months in glass bottles in the dark at (5 ± 3) °C.
Discard the solutions at the first signs of precipitation or opaqueness.
5.3.2 Phosphate-buffer solution
Dissolve 8,50 g of potassium dihydrogen phosphate (KH PO ), 21,75 g of dipotassium hydrogen
2 4
phosphate (K HPO ), 33,4 g of disodium hydrogen phosphate-heptahydrate (Na HPO ⋅7H O) and 1,70 g
2 4 2 4 2
of ammonium chloride (NH Cl), in about 500 ml of water (5.1). Dilute with water (5.1) to 1 000 ml and
mix. Measure the pH value. If the pH value is outside the range pH 7 to pH 8, prepare a new solution.
5.3.3 Magnesium sulfate heptahydrate solution, ρ = 22,5 g/l.
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ⋅7H O) in water (5.1). Dilute with water (5.1)
4 2
to 1 000 ml and mix.
5.3.4 Calcium chloride solution, ρ = 27,5 g/l.
Dissolve 27,5 g of anhydrous calcium chloride (CaCl ) (or an equivalent amount, if the hydrate is used
(for example 36,4 g CaCl ⋅2H O) in water (5.1), dilute with water (5.1) to 1 000 ml and mix.
2 2
5.3.5 Iron (III)-chloride-hexahydrate solution, ρ = 0,25 g/l.
Dissolve 0,25 g of iron (III)-chloride-hexahydrate (FeCl ⋅6H O), in water (5.1). Dilute with water (5.1) to
3 2
1 000 ml and mix.
5.4 Dilution water
Determine the total volume of dilution water required for the actual test. Pour about half the required
volume of water (5.1) into the feed vessel (6.3) for the dilution water and add 1 ml of each of the salt
solutions (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 and 5.3.5) for each litre of the total volume. Then fill to the required total
volume with water (5.1) and mix by stirring, aeration or shaking. Bring the dilution water obtained in
this way to a temperature of (20 ± 2) °C, keep at this temperature and aerate slightly by mixing. If, for
example, specially adapted seeding water or seeding material is necessary, the procedure according to
Annex C can be followed.
EXAMPLE If 20 l of dilution water are required, prepare 10 l of water (5.1). Stirring continuously, add 20 ml
of each of the salt solutions individually and fill up with water (5.1) to 20 l.
5.5 Seeded dilution water
The preparation of a seeded dilution water is needed when the test solutions are prepared according to
9.3 The mass concentration of oxygen consumed over 5 d (or 7 d) at (20 ± 1) °C by the seeded dilution
water with the addition of allylthiourea (ATU) solution to inhibit nitrification [blank value (see 9.5)],
shall be between 0,2 mg/l and 1,5 mg/l.
The volume increase of the dilution water by seeding water should be as low as possible.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
The amount of the seeding water (5.2) needed to attain a hypothetic COD of 0,6 mg/l to 3,0 mg/l,
corresponding to the aimed oxygen consumption in the blank values (9.5), is calculated with
Formula (1):
COD ⋅V
target dilutionwater
V = (1)
seedingwater
COD
seedingwater
where
V is the volume of the seeding water (5.2) to be added to the dilution water (5.4) in
seeding water
litres, l;
COD is the hypothetic COD (0,6 mg/l O to 3 mg/l O ) in the seeded dilution water (5.5)
target 2 2
in milligrams per litre of oxygen, mg/l O ;
COD is the COD of the seeding water (5.2) in milligrams per litre of oxygen, mg/l O ;
seeding water 2
V is the calculated amount of the dilution water to be seeded (5.4) in litres, l.
dilution water
For direct seeding of test batches or automated systems which use a direct seeding, see instructions in
Annex C.
Add the seeding water (5.2) to the dilution water (5.4) and mix by stirring or shaking. Determine the
oxygen content as specified in ISO 5813, ISO 17289 or ISO 5814. Aerate the seeded dilution water up to
an oxygen content of preferably a minimum 8 mg/l. The water shall not be supersaturated with oxygen
by aeration: let it stand about 1 h in an unstopped container before use. Keep the seeded dilution water
at (20 ± 2) °C. The so prepared seeded dilution water can be used immediately for the preparation of
the analysis batches.
Throw away the residue of the dilution water at the end of the working day, unless the laboratory
experience reveals via the complied-with control analysis (9.7) with the control solution (5.9), and the
blank value determination (9.5) that the water is acceptable for a longer time.
5.6 Hydrochloric acid (HCl) or sulfuric acid (H SO ) solution, for example c(HCl) ≈ 0,5 mol/l or
2 4
c(H SO ) ≈ 0,25 mol/l.
2 4
5.7 Sodium hydroxide (NaOH) solution, for example c(NaOH) = 0,5 mol/l, ρ ≈ 20 g/l.
5.8 Sodium sulfite (Na SO ) solution, for example ρ(Na SO ) = 50 g/l.
2 3 2 3
5.9 Glucose-glutamic acid (GGA), control solution.
Dry about 200 mg to 300 mg of anhydrous D-glucose (C H O ) and 200 mg to 300 mg of anhydrous
6 12 6
L-glutamic acid (C H NO ) at (105 ± 5) °C for 1 h. Weigh (150 ± 1) mg of each substance, dissolve in
5 9 4
water (5.1), dilute with water to 1 000 ml, and mix. The theoretical oxygen demand of this solution is
307 mg/l of oxygen for BOD (the empirical BOD is (198 ± 40) mg/l of oxygen and the BOD (based on
5 5 7
conversion factor BOD /BOD = 1,04 from Table D.3 and previous empirical BOD ) is (206 ± 40) mg/l of
7 5 5
oxygen).
Prepare the solution immediately before use and discard any remaining solution at the end of the
working day. The solution may also be frozen in small amounts. The frozen solution can be kept for a
maximum of three months. Use the thawed solution immediately after thawing.
5.10 Allylthiourea (ATU) solution, ρ = 1,0 g/l.
Dissolve 200 mg of allylthiourea (C H N S) in water (5.1), dilute with water (5.1) to 200 ml and mix.
4 8 2
Store the solution at (5 ± 3) °C. The solution is stable for at least two weeks.
WARNING — The reagent is toxic and shall therefore be handled according to the safety data sheet.
The nitrification inhibition is not attained in all cases by addition of 2 ml of the ATU-solution (ρ = 1,0 g/l)
per litre of analysis batch. The addition of a significantly higher volume than 2 ml of this ATU-solution
can disturb the titration according to ISO 5813 (see 9.6.1).
6 Apparatus
Usual laboratory equipment, and in particular the following.
6.1 General
Plastic and glass vessels shall be carefully cleaned and, in particular, made free of absorbed toxic and
biodegradable compounds and shall be protected from contamination.
6.2 Incubation bottles, BOD-bottles (Karlsruhe type) with a content between 100 ml and 300 ml
or conical shoulder bottles with stoppers and a suitable funnel, or other suitable, bubble-free closing
bottles. For the use of automatic systems, it is important to use incubation bottles with a definite volume,
as the incubation bottles serve as dilution vessels.
6.3 Feed vessel for the seeded and non-seeded dilution water, made from glass or plastic.
Take measures to ensure that the vessel is kept clean and free from microorganism growths, and
protected from light.
6.4 Tempering cabinet, room or incubator, capable of being maintained at (20 ± 1) °C and darkened.
6.5 Equipment for determining dissolved oxygen concentration, as specified in ISO 5813
(iodometric method), or ISO 5814 (electrochemical probe method) using an oxygen probe or ISO 17289
(optical sensor method) using optical oxygen measurement.
6.6 Cooling and freezing device, for transport and storage of the samples.
6.7 Dilution vessel, mixing vessel preferably made from glass, for example volumetric flask or
graduated measuring cylinder, with sufficient volume capacity for the dilution batch and the possibility
of a thorough mixing.
6.8 Aeration equipment, bottle of compressed air or a compressor. The air quality shall be such that
the aeration does not lead to any contamination, especially by the addition of organic matter, oxidizing or
reducing materials, or metals. If contamination is suspected, filter and wash the air.
6.9 pH-measuring equipment, which fulfils the requirements for the determination of pH, as
specified in ISO 10523.
6.10 Stirrer, to ensure that the sample is homogeneous for the extraction of partial samples and no air
is taken in.
6.11 Glass fibre filter GF 6.
7 Sampling and preservation
Closable vessels made from glass or plastic are suitable for sampling. The volume should be large
enough to ensure that a proper dilution series can be derived. Fill the sampling vessels completely, close
6 © ISO 2019 – All rights reserved
them and cool to (5 ± 3) °C as soon as possible. Store the samples in the dark to prevent algal growth
and cool at (5 ± 3) °C until processing at latest the day after the date of sampling.
If samples cannot be analysed in between the day after sampling freeze the samples as soon as possible
after sampling and store samples at ≤−18 °C for up to one month, or up to six months if BOD is >50 mg/l,
in a suitable vessel in the dark or in dark coloured bottles as specified in ISO 5667-3. Make sure
that the bottles do not cause excessive blank values (9.5). Since completely filled sample containers
are transported, the volume reduction up to a volume which allows expansion caused by freezing
(prevention of breakage) takes place in the laboratory after homogenization of the sample.
Thaw the sample at maximum (20 ± 2) °C, but not for more than 16 h, as otherwise the onset of bacterial
processes can falsify the results. The sample should therefore be frozen in portions, each of which does
not exceed a volume of one litre. The thawing of the samples through any means of heating equipment,
for example microwave or heating plate in which (a part of) the sample reaches a temperature of more
than 22 °C is not allowed and leads to false results. The temperature of a heated water bath shall not
exceed 22 °C. Complete thawing of a sample before use is essential, as the freezing process may lead
to the concentration of certain components in the inner part of the sample which freezes last. A once
thawed sample shall not be frozen again.
8 Interferences
8.1 General
Substances that are toxic to microorganisms, for example bactericides, free chlorine etc., inhibit the
biochemical oxidation and lead to reduced findings. Increased results can occur due to the presence of
nitrifying microorganisms. The presence of algae can lead to an overestimation of BOD and disturb the
determination.
8.2 Presence of free and/or combined chlorine
Remove free and/or combined chlorine in the sample by adding the required volume of sodium sulfite
solution (5.8). Take care to avoid adding an excess: perform the determination of the free and combined
[3] [4]
chlorine concentration as specified in ISO 7393-1 or ISO 7393-2 and calculate the volume of the
sodium sulfite solution according to Formula (2).
17, 8××V ρ
p 2
V = (2)
ρ
where
V is the volume of the sodium sulfite solution (5.8) in millilitres, ml;
V is the sample volume to be treated in millilitres, ml;
p
ρ is the measured free chlorine in the sample in grams per litre, g/l;
ρ is the concentration of sodium sulfite solution in grams per litre, g/l.
8.3 Presence of algae
In the case of samples containing algae, consider filtration after sampling in the field or directly
after arrival at the laboratory to avoid producing unusually high results. Use glass fibre filters (6.11).
Filtering can change BOD results radically and it shall only be performed if deemed necessary in the
evaluation of the quality of the water or if the analysis from an algae-free sample is required. Indicate
any filtration in the test report (see Clause 11).
8.4 Presence of peroxides and peroxide compounds
NOTE Peroxides and peroxide compounds can be found in waste water of the chip industry or large
laundries, etc.
Peroxides and peroxide compounds create reduced findings; hence peroxides shall be eliminated from
samples to be examined.
The following methods can be applied for indication if peroxides are suspected:
— Proof with iodide starch paper. Iodide and filter paper containing starch is coloured blue in the
presence of peroxide, but it reacts with chlorine as well. Peroxide-test strips are commercially
available for this method.
— Proof by using oxygen content measurement (9.6.2). An oversaturation of the dissolved oxygen
concentration in the sample can indicate peroxides and peroxide compounds.
If peroxides have been detected, various methods of destroying peroxides can be applied:
— Peroxides can be expelled by shaking or stirring the sample intensively in an open vessel. The
presence of peroxides shall be tested using peroxide test strips or measurement of dissolved oxygen
concentration from time to time, but not for more than a 2 h time period. The expulsion of the
peroxides is finished when the dissolved oxygen concentration no longer decreases within a period
of 30 min or the test strips no longer indicate any peroxides.
— Some peroxide compounds cannot be eliminated with these methods. The peroxide compounds can
then be destroyed with a sodium sulfite solution (5.8). Use an aliquot of the sample to determine the
volume of sodium sulfite solution (5.8) needed to destroy the peroxides. Avoid an excess and test
the spontaneous oxygen consumption. The test for complete destruction can be carried out with
peroxide test strips. Based on these results calculate the amount of sodium sulfite solution needed
to remove peroxides and peroxide compounds in the sample volume required for the test. Add the
equivalent to the sample aliquot that is used for the BOD determination.
It shall be noted that this treatment of the sample can change it, hence document the sample treatment
for the elimination of peroxides in the test report.
9 Procedure
9.1 General
If the presence of substances that are toxic to microorganisms is suspected, Annex B with the testing of
several different dilutions of the sample should be applied.
The number of bottles to be prepared depends on the technique to measure the dissolved oxygen
content and the number of replicates desired.
The direct seeding of the analysis batches is described in Annex C.
9.2 Pretreatment
Pre-treatment is carried out for samples within at latest the day after sampling or for frozen samples
after complete thawing of the sample.
9.2.1 Neutralization of the sample
Neutralize the sample or the diluted samples (for example in automatic systems) with hydrochloric
acid (5.6) or sodium hydroxide solution (5.7) if the pH-value is not between 6 and 8. Choose the
concentration of the hydrochloric acid (5.6) or the sodium hydroxide (5.7) solutions to restrict the
8 © ISO 2019 – All rights reserved
volume added to not more than 5 % of total volume. Indicate potential precipitation resulting hereby in
the test report.
NOTE If the whole sample meets pH requirements, so will any dilution.
9.2.2 Homogenization
For sub-sampling the fresh or thawed sample shall be thoroughly mixed before distribution. An even
distribution of all soluble and particulate components should be ensured (for example by gentle
agitation or vigorous shaking). If the sample contains large particles, which complicate the withdrawal
of partial samples of equal quality, homogenization by crushing the particles with for example a
dispersing device is recommended.
9.3 Preparation of test solutions
Temper the sample to a temperature of (20 ± 2) °C. Assure homogeneity of the sample during preparation
of the dilutions, for example by gentle agitation or vigorous shaking either manually or with a stirrer
without the inclusion of air until all analysis batches are produced.
Carry out the test with preferably two replicates per dilution. Depending on the purpose of testing
and quality assurance requirements for selected samples a testing of only one replicate per dilution is
acceptable. Report the number of dilutions (see 9.4) and the number of replicates per dilution tested for
the sample in the test report [Clause 11 d)].
The following description of the procedure takes into account at least two replicates per dilution and
several dilutions.
Calculate the volumes of sample and seeded dilution water needed to prepare the test solutions for
the selected number of dilutions and replicates considering 9.4 for the selection of dilutions. If the
iodometric method (9.6.1) is used, a second series of bottles with replicates is needed to determine the
concentration of dissolved oxygen at time zero.
Place a known volume of the sample (or pretreated sample) each in the dilution vessels (6.7), add 2 ml
of allylthiourea solution (5.10) per litre of diluted sample and fill to the mark with seeded dilution
water (5.5). If the dilution factor to be used is greater than 100, carry out serial dilutions in two or
more steps. When automatic analysis systems are applied, add a definite volume of the sample (or the
pre-treated sample) into the incubation bottle. The addition of 2 ml allylthiourea solution (5.10) per
litre batch and the seeded dilution water (5.5) occur fully automatically through the system.
9.4 Calculation of dilutions
9.4.1 Empirical determination of the dilutions
As the correct dilution degree of the sample which gives a measurable BOD in at least one of the
n
dilutions cannot be precisely attained, several different dilutions varying according to the dilution
factor (as reciprocal value of sample volume to total volume of test batch) and including the dilution
corresponding to the expected BOD (see Table 1 and Annex B) are prepared. Various options for
n
the determination of dilutions factors and dilution series are described in 9.4.2 to 9.4.3. If sufficient
information on the oxygen consumption of the sample is available (for example known, reproducible,
stable composition of the sample type under investigation), the testing of only one dilution is acceptable,
as far as the test results for this dilution comply with the validity criteria (10.3). If the presence of
substances that are toxic is suspected (for example strong chemical odour), dilutions are indispensable
and the preparation of dilutions over a broader range of concentrations is recommended.
Table 1 — Examples of typical dilution series (3 dilution stages each) for determination of BOD
a
Expected BOD Possible sample volume in ml/l Dilution factor
n
n = 5 d (for example as respective dilution series)
mg/l oxygen ml/l
b
1 to 6 250, 500, 750 or 200, 400, 600 4 to 1,33
b
4 to 12 200, 400, 600 or 200, 300, 400 5 to 1,67
10 to 30 200, 400, 600 or 50, 100, 150 20 to 1,67
20 to 60 100, 200, 300 or 40, 60, 80 25 to 3,33
40 to 120 40, 80, 120 or 20, 30, 40 50 to 8,33
100 to 300 30, 40, 50 or 5, 10, 15 200 to 20
200 to 600 10, 20, 30 or 3, 6, 9 333 to 33,3
400 to 1 200 4, 8, 12 or 1, 2, 3 1 000 to 83,3
c
1 000 to 3 000 2, 4, 6 or 0,5; 1,0; 1,5 2 000 to 167
2 000 to 6 000 1, 2, 3 or 0,3; 0,6; 0,9 3 333 to 333
a
Applied sample volume in relation to the total volume of the analysis batch.
b
Recommendation for samples from sewage treatment processes with good biological treatment.
c
For this preferably prepare dilutions of for example 1:10. (Data including preliminary dilution).
9.4.2 Determination of dilutions via the factors R of the TOC, the permanganate index or the COD
The determination of the total organic carbon (TOC) (according to ISO 8245), the permanganate index
(according to ISO 8467) or the chemical oxygen demand (COD) (according to ISO 6060 or ISO 15705)
in a representative aliquot of the sample can provide valuable decision aids for a dilution series in this
respect.
Table 2 shows typical intervals for R, the ratio of BOD to TOC, permanganate index or COD, for some
n
sample types.
Table 2 — Typical values for ratio R
Total organic carbon Permanganate-index Chemical oxygen
demand
BOD /TOC BOD /Permanganate- BOD /COD
n n n
index
Untreated waste water 1,2 to 2,8 1,2 to 1,5 0,35 to 0,65
Biologically treated waste water 0,3 to 1,0 0,5 to 1,2 0,10 to 0,35
Select from experience appropriate R-values from Table 2 and calculate the expected BODn values
according to Formula (3):
BOD =⋅Ry (3)
n(expected)
where
y is the measured TOC-value or permanganate-index or COD-value in milligrams per litre, mg/l;
R is the respective dimensionless ratio from Table 2
Use the lower and upper values of the ratios R from Table 2 respectively to calculate the expected BOD .
n
Based on these calculated expected BOD concentrations, seek out possible volumes of sample per litre
n
test batch and the respective dilution factors from Table 1. Select the third dilution in relation to the
two calculated dilutions.
EXAMPLE Untreated waste water, R is from 1,2 to 2,8 and the measured TOC ( y) is 100 mg/l.
10 © ISO 2019 – All rights reserved
Expected BOD = 1,2 × 100 mg/l = 120 mg/l.
n
Expected BOD = 2,8 × 100 mg/l = 280 mg/l.
n
As the expected BOD is between 120 mg/l and 280 mg/l, a dilution series with 30 ml/l, 40 ml/l and
n
50 ml/l is appropriate.
9.4.3 Calculation of dilution stages via the COD
For samples with a COD >60 mg/l preferably use following Formula (4). Calculate the lowest dilution
stage F (i.e. the stage with the highest sample volume content) via the COD according to Formula (4):
F = (4)
COD
where
F is the sample volume in millilitres per litre, ml/l, of total batch volume;
COD is the numerical value of the chemical oxygen demand in milligrams per litre, mg/l.
Half F to determine the highest dilution stage with the lowest sample volume (lowest sample volume =
F/2). The third dilution stage is calculated as mean value of both calculated dilution stages.
EXAMPLE The COD is 250 mg/l O .
F ==40
The lowest dilution stage is 40 ml sample volume per litre total batch volume. If F = 40 ml/l is divided
in two, the highest dilution stage with 20 ml/l sample volume is determined. The mean value of both
sample volumes is 30 ml/l sample volume and 30 ml/l is the average dilution stage. The dilution series
to be aimed for should include these concentrations.
9.5 Blank value determination
Carry out a blank test in parallel with the determination, using the seeded dilution water (5.5) including
2 ml of ATU solution (5.10) per litre of analysis batch.
If the BOD of the blank solutions exceeds 1,5 mg/l O , possible causes, for example sources of
contamination shall be sought.
If the analysis batches are directly seeded, use the procedure described in Annex C.
9.6 Determination of dissolved oxygen
9.6.1 Measurement of dissolved oxygen using iodometric method (in accordance with
ISO 5813)
Fill two series of incubation bottles (6.2) with one or more replicates for each dilution stage (9.4) with
the diluted test solutions (9.3), and at least two bottles with the blank solution (9.5) allowing them to
overflow slightly.
During filling, precautions shall be taken to prevent changing the oxygen content of the solutions.
Allow any air bubbles adhering to the walls to escape. Stopper the bottles, taking care to avoid trapping
air bubbles.
Divide the bottles into two series, each containing at least two bottles of each dilution and at least two
bottles of blank solution (see 9.5).
Put the first series of bottles with dilu
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 5815-1
Deuxième édition
2019-07
Qualité de l'eau — Détermination de
la demande biochimique en oxygène
après n jours (DBO ) —
n
Partie 1:
Méthode par dilution et
ensemencement avec apport
d'allylthiourée
Water quality — Determination of biochemical oxygen demand after
n days (BOD ) —
n
Part 1: Dilution and seeding method with allylthiourea addition
Numéro de référence
©
ISO 2019
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CH-1214 Vernier, Genève
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Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 6
7 Échantillonnage et conservation . 7
8 Interférences . 7
8.1 Généralités . 7
8.2 Présence de chlore libre et/ou de chlore combiné . 7
8.3 Présence d'algues . 8
8.4 Présence de peroxydes et de composés de peroxyde . 8
9 Mode opératoire. 9
9.1 Généralités . 9
9.2 Prétraitement . 9
9.2.1 Neutralisation de l'échantillon . 9
9.2.2 Homogénéisation . 9
9.3 Préparation des solutions d'essai . 9
9.4 Calcul des dilutions .10
9.4.1 Détermination empirique des dilutions .10
9.4.2 Détermination des dilutions grâce aux facteurs R du COT, de l'indice
permanganate ou de la DCO .11
9.4.3 Calcul des niveaux de dilution à l'aide de la DCO .11
9.5 Détermination des valeurs de blanc .12
9.6 Détermination de l'oxygène dissous .12
9.6.1 Mesurage de l'oxygène dissous à l'aide de la méthode iodométrique
(conformément à l'ISO 5813) .12
9.6.2 Mesurage de l'oxygène dissous à l'aide de sondes (conformément à
l'ISO 5814 ou à l'ISO 17289) .13
9.7 Analyse de contrôle .13
10 Calcul et critères de validation des résultats .14
10.1 Examen des solutions d'essai pour la validation de la consommation d'oxygène
durant l'essai.14
10.2 Calcul de la demande biochimique en oxygène après n jours (DBO ) .14
n
10.3 Critères de validité .15
11 Rapport d'essai .15
Annexe A (normative) Influence des périodes d'incubation et des températures .16
Annexe B (informative) Déterminations multiples .17
Annexe C (informative) Ensemencement direct des solutions d'essai .20
Annexe D (informative) Données de performance .21
Bibliographie .24
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 5815-1:2003), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
Les principales modifications par rapport à l'édition précédente sont les suivantes:
— modification du domaine de travail: 1 mg/l au lieu de 3 mg/l comme limite inférieure;
— changements dans le mode opératoire des essais;
— en 5.2, possibilité de vérifier au préalable l'adéquation de l'eau d'ensemencement à l'aide d'une série
d'analyse de contrôle AGG;
— en 5.3.2, valeur du pH de la solution tampon de phosphate: exigence concernant la préparation d'une
nouvelle solution si la valeur du pH se situe hors de la plage comprise entre pH 7 et pH 8;
— en 5.5, plage de consommation d'oxygène de l'eau de dilution ensemencée comprise entre 0,2 mg/l
et 1,5 mg/l au lieu de limite supérieure de 1,5 mg/l;
— en 5.9, remplacement de la plage admissible dans la solution de contrôle AGG par (198 ± 40) mg/l
pour la DBO , et par (206 ± 40) mg/l pour la DBO ;
5 7
— en 6.5, ajout de la possibilité de mesurer la concentration en oxygène dissous à l'aide d'une sonde
électrochimique;
— en 8.4, interférences: ajout d'un paragraphe concernant la présence de peroxydes et de composés de
peroxyde;
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
— en 9.4, possibilités pour déterminer les dilutions effectuées;
— en 9.7, analyse de contrôle: description détaillée de la procédure;
— en 10.3, ajout de «critères de validité/approbation des résultats»;
— à l'Annexe A: modification du titre et «normative» au lieu de «informative»;
— à l'Annexe C: ajout de «Ensemencement direct des solutions d'essai»;
— ajout d'une nouvelle Annexe D «Données de performance».
Une liste de toutes les parties de la série ISO 5815 se trouve sur le site web de l'ISO.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse www .iso .org/members .html.
Introduction
La durée d'incubation spécifiée dans le présent document est de 5 jours ou 7 jours. La durée d'incubation
de 7 jours correspond à la pratique dans plusieurs pays nordiques. L'Annexe A décrit une durée
d'incubation de (2 + 5) jours.
L'ISO 5815-1 spécifie la méthode de détermination par dilution de la demande biochimique en
oxygène (DBO) dans les eaux avec une DBO attendue comprise entre 1 mg/l et 6 000 mg/l. Une
limite plus basse du domaine de travail peut résulter des données de validation du laboratoire. Pour
les échantillons présentant une DBO attendue faible, comprise entre 0,5 mg/l et 6 mg/l, l'ISO 5815-2
permet de déterminer la DBO dans l'eau à l'aide d'échantillons non dilués.
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 5815-1:2019(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la demande
biochimique en oxygène après n jours (DBO ) —
n
Partie 1:
Méthode par dilution et ensemencement avec apport
d'allylthiourée
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais effectués conformément au présent
document soient réalisés par du personnel ayant reçu une qualification appropriée.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie la méthode de détermination de la demande biochimique en oxygène
dans les eaux, par dilution et ensemencement, avec suppression de la nitrification après une durée
d'incubation de 5 jours ou 7 jours.
Cette méthode est applicable à tous les types d'eau dont la demande biochimique en oxygène se
situe généralement entre 1 mg/l et 6 000 mg/l. Elle s'applique particulièrement aux eaux usées mais
convient également à l'analyse des eaux naturelles. Pour des demandes biochimiques en oxygène de
plus de 6 000 mg/l d'oxygène, la méthode est encore applicable, mais une attention particulière est
nécessaire concernant la représentativité du sous-échantillonnage pour la préparation des étapes
de dilution. Les résultats obtenus sont le produit d'une combinaison de réactions biochimiques et
chimiques en présence de matière vivante dont le comportement et les caractéristiques ne sont
qu'occasionnellement reproductibles. Les résultats ne possèdent pas le caractère exact et rigoureux
de résultats issus par exemple d'un processus chimique unique bien défini. Les résultats fournissent
cependant une indication qui permet d'estimer la qualité des eaux.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 5667-3, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Conservation et manipulation des
échantillons d'eau
ISO 5813, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode iodométrique
ISO 5814, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 6060, Qualité de l'eau — Détermination de la demande chimique en oxygène
ISO 8245, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour le dosage du carbone organique total (COT) et du
carbone organique dissous (COD)
ISO 8467, Qualité de l'eau — Détermination de l'indice de permanganate
ISO 10523, Qualité de l'eau — Détermination du pH
ISO 15705, Qualité de l'eau — Détermination de l'indice de demande chimique en oxygène (ST-DCO) —
Méthode à petite échelle en tube fermé
ISO 17289, Qualité de l'eau — Dosage de l'oxygène dissous — Méthode optique à la sonde
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
demande biochimique en oxygène après n jours
DBO
n
concentration en masse d'oxygène dissous consommé dans des conditions spécifiées par l'oxydation
biochimique de matières organiques et/ou inorganiques dans l'eau. n est la durée d'incubation, égale
à 5 jours ou 7 jours
Note 1 à l'article: Pour les besoins du présent document, «oxydation biochimique» a le même sens que «oxydation
biologique».
Note 2 à l'article: n a pour valeur soit 5 soit 7.
3.2
demande chimique en oxygène
DCO
concentration en masse d'oxygène équivalente à la quantité de dichromate consommée par les matières
dissoutes et en suspension lorsqu'on traite un échantillon d'eau avec cet oxydant dans des conditions
définies
[SOURCE: ISO 6060:1989, 3]
3.3
carbone organique total
COT
somme du carbone organique présent dans l'eau, sous forme dissoute ou lié aux matières en suspension,
y compris les cyanates, le carbone élémentaire et les thiocyanates
[SOURCE: ISO 8245:1999, 3.3, modifiée]
3.4
indice permanganate (d'une eau)
concentration en masse d'oxygène équivalente à la quantité d'ions permanganate consommée quand un
échantillon d'eau est traité par cet oxydant dans des conditions définies
[SOURCE: ISO 8467:1993, 3.1, modifiée]
3.5
eau d'ensemencement
eau contenant des micro-organismes (aérobies) adaptés permettant l'oxydation des matières contenues
dans l'eau
Note 1 à l'article: L'eau d'ensemencement est utilisée pour produire l'eau de dilution ensemencée.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
3.6
eau de dilution
eau ajoutée à l'échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.7
eau de dilution ensemencée
eau de dilution à laquelle une quantité définie d'eau d'ensemencement a été ajoutée
3.8
chlore libre
chlore présent sous la forme d'acide hypochloreux, d'ion hypochlorite ou de chlore élémentaire dissous
[SOURCE: ISO 7393-1:1985, 2.1]
3.9
chlore combiné
fraction du chlore total présente sous la forme de chloramines et de chloramines organiques
[SOURCE: ISO 7393-1:1985, 2.2]
3.10
nitrification
oxydation des sels d'ammonium par des bactéries, au cours de laquelle le produit intermédiaire est
généralement un nitrite et le produit final un nitrate
[SOURCE: ISO 11733:2004, 3.9]
4 Principe
La détermination de la DBO avec inhibition de la nitrification est effectuée à l'aide de la méthode par
n
dilution. Une série de préparations composée de différentes dilutions d'un échantillon est préparée et
soumise à essais. L'eau de dilution est enrichie en oxygène et ensemencée avec des micro-organismes
aérobies adaptés.
L'échantillon est incubé à (20 ± 1) °C pendant une durée spécifiée (n) de 5 jours ou 7 jours, dans l'obscurité,
dans un flacon entièrement rempli et fermé. La concentration en oxygène dissous est déterminée avant
et après incubation. La masse d'oxygène consommé par litre d'échantillon est calculée.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs ayant un degré de pureté correspondant à la qualité «pour analyse».
5.1 Eau, au moins de qualité 3 selon l'ISO 3696.
L'eau ne doit pas contenir plus de 0,01 mg/l de cuivre et doit être exempte de chlore et de chloramines.
5.2 Eau d'ensemencement, qui peut être obtenue de l'une des manières suivantes:
a) eau résiduaire urbaine, décantée ou grossièrement filtrée;
b) eau de surface contenant de l'eau résiduaire urbaine;
c) effluent décanté provenant d'une station de traitement d'eaux usées;
d) eau prélevée en aval du déversement de l'eau à analyser, ou eau contenant des micro-organismes
adaptés à l'eau à analyser;
e) matériau d'ensemencement disponible dans le commerce.
Utiliser de l'eau d'ensemencement ayant une DCO d'environ 300 mg/l ou un COT d'environ 100 mg/l
(voir 5.5). Si la DCO ou le COT sont plus élevés, s'adapter à ces concentrations avec de l'eau de dilution (5.4)
avant de préparer l'eau de dilution ensemencée (5.5) ou utiliser un volume d'eau d'ensemencement
modifié en conséquence pour ensemencer l'eau de dilution (5.4).
Si l'échantillon est issu d'un processus incluant un traitement de désinfection (chloration, UV, ozone ou
autre), utiliser l'inoculum, même s'il n'y a pas de désinfectant résiduel présent.
Pour un matériau d'ensemencement disponible dans le commerce, prendre en considération les
recommandations d'application correspondantes.
Il est possible de contrôler au préalable le matériau d'ensemencement choisi en réalisant une analyse de
contrôle (9.7) afin de prouver qu'il convient à l'analyse des échantillons.
5.3 Solutions salines
5.3.1 Généralités
Les solutions suivantes peuvent être conservées pendant au moins six mois dans des flacons en verre,
dans l'obscurité, à (5 ± 3) °C. Jeter les solutions dès les premiers signes de précipitation ou d'opacité.
5.3.2 Solution tampon de phosphate
Dissoudre 8,50 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ), 21,75 g d'hydrogénophosphate
2 4
de dipotassium (K HPO ), 33,40 g d'hydrogénophosphate de disodium heptahydraté (Na HPO ⋅7H O)
2 4 2 4 2
et 1,70 g de chlorure d'ammonium (NH Cl) dans environ 500 ml d'eau (5.1). Diluer à 1 000 ml avec de
l'eau (5.1) et mélanger. Mesurer la valeur du pH. Si la valeur du pH se situe hors de la plage comprise
entre pH 7 et pH 8, préparer une nouvelle solution.
5.3.3 Solution de sulfate de magnésium heptahydraté, ρ = 22,5 g/l.
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ⋅7H O) dans de l'eau (5.1). Diluer
4 2
à 1 000 ml avec de l'eau (5.1) et mélanger.
5.3.4 Solution de chlorure de calcium, ρ = 27,5 g/l.
Dissoudre 27,5 g de chlorure de calcium anhydre (CaCl ) (ou une quantité équivalente si un sel hydraté
est utilisé, par exemple 36,4 g de CaCl ⋅2H O) dans de l'eau (5.1). Diluer à 1 000 ml avec de l'eau (5.1) et
2 2
mélanger.
5.3.5 Solution de chlorure de fer(III) hexahydraté, ρ = 0,25 g/l.
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl ⋅6H O) dans de l'eau (5.1). Diluer à 1 000 ml
3 2
avec de l'eau (5.1) et mélanger.
5.4 Eau de dilution
Déterminer le volume total d'eau de dilution nécessaire pour l'essai réel. Verser environ la moitié du
volume d'eau (5.1) requis dans le réservoir (6.3) pour eau de dilution et ajouter 1 ml de chaque solution
saline (5.3.2, 5.3.3, 5.3.4 et 5.3.5) pour chaque litre du volume total. Remplir d'eau (5.1) jusqu'au volume
total nécessaire et mélanger en agitant, en aérant ou en secouant. Porter l'eau de dilution ainsi obtenue
à une température de (20 ± 2) °C, la maintenir à cette température et l'aérer légèrement en mélangeant.
Si, par exemple, une eau d'ensemencement ou un matériau d'ensemencement spécialement adapté
s'avère nécessaire, il est possible de suivre la procédure décrite à l'Annexe C.
EXEMPLE Si 20 l d'eau de dilution sont nécessaires, préparer 10 l d'eau (5.1). Tout en agitant de façon
continue, ajouter 20 ml de chaque solution saline et remplir d'eau (5.1) jusqu'à 20 l.
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5.5 Eau de dilution ensemencée
La préparation d'une eau de dilution ensemencée est nécessaire lorsque les solutions d'essai sont
préparées conformément à 9.3. La concentration en masse d'oxygène consommé sur une période
de 5 jours (ou 7 jours), à une température de (20 ± 1) °C, par l'eau de dilution ensemencée, avec l'ajout
d'une solution d'allylthiourée (ATU) pour inhiber la nitrification [valeur du blanc (voir 9.5)], doit être
comprise entre 0,2 mg/l et 1,5 mg/l.
Il convient que l'augmentation du volume d'eau de dilution dû à l'apport d'eau d'ensemencement soit
aussi faible que possible.
La quantité d'eau d'ensemencement (5.2) nécessaire pour atteindre une DCO hypothétique de 0,6 mg/l
à 3,0 mg/l, correspondant à la consommation d'oxygène ciblée dans les valeurs de blanc (9.5), est
calculée à l'aide de la Formule (1):
DCO ⋅V
cible eau de dilution
V = (1)
eau d'ensemencement
DCO
eau d'enseemencement
où
V est le volume d'eau d'ensemencement (5.2) à ajouter à l'eau de dilution (5.4),
eau d'ensemencement
en litres (l);
DCO est la DCO hypothétique (comprise entre 0,6 mg/l d'O et 3 mg/l d'O ) dans l'eau
cible 2 2
de dilution ensemencée (5.5), en milligrammes par litre d'oxygène (mg/l d'O );
DCO est la DCO de l'eau d'ensemencement (5.2), en milligrammes par litre d'oxy-
eau d'ensemencement
gène (mg/l d'O );
V est la quantité calculée d'eau de dilution à ensemencer (5.4), en litres (l).
eau de dilution
Pour l'ensemencement direct des solutions d'essai ou les systèmes automatisés qui utilisent un
ensemencement direct, voir les instructions à l'Annexe C.
Ajouter l'eau d'ensemencement (5.2) à l'eau de dilution (5.4) et mélanger en agitant ou en secouant.
Déterminer la teneur en oxygène comme spécifié dans l'ISO 5813, l'ISO 17289 ou l'ISO 5814. Aérer l'eau
de dilution ensemencée jusqu'à atteindre, de préférence, une teneur en oxygène d'au moins 8 mg/l.
L'eau ne doit pas être sursaturée en oxygène lors de l'aération: la laisser reposer environ 1 h dans un
récipient ouvert avant utilisation. Maintenir l'eau de dilution ensemencée à (20 ± 2) °C. L'eau de dilution
ensemencée ainsi préparée peut être utilisée immédiatement pour la préparation des solutions d'essai.
Jeter ce qui reste d'eau de dilution à la fin de la journée de travail, sauf si l'expérience du laboratoire
montre que l'eau peut être utilisée pendant une période plus longue, à travers le respect des critères
fixés pour l'analyse de contrôle (9.7) avec la solution de contrôle (5.9) et la détermination des valeurs de
blanc (9.5).
5.6 Solution d'acide chlorhydrique (HCl) ou d'acide sulfurique (H SO ), par exemple c(HCl) ≈
2 4
0,5 mol/l ou c(H SO ) ≈ 0,25 mol/l.
2 4
5.7 Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), par exemple c(NaOH) = 0,5 mol/l, ρ ≈ 20 g/l.
5.8 Solution de sulfite de sodium (Na SO ), par exemple ρ(Na SO ) = 50 g/l.
2 3 2 3
5.9 Acide glutamique-glucose (AGG), solution de contrôle.
Sécher environ 200 mg à 300 mg de D-glucose anhydre (C H O ) et 200 mg à 300 mg
6 12 6
d'acide L-glutamique anhydre (C H NO ) pendant 1 h à (105 ± 5) °C. Peser (150 ± 1) mg de chacune des
5 9 4
substances et les dissoudre dans de l'eau (5.1). Diluer à 1 000 ml avec de l'eau et mélanger. La demande
théorique en oxygène de cette solution est de 307 mg/l d'oxygène pour la DBO (la DBO empirique
5 5
est de (198 ± 40) mg/l d'oxygène et la DBO , basée sur le facteur de conversion DBO /DBO = 1,04 du
7 7 5
Tableau D.3 et la DBO empirique précédente, est de (206 ± 40) mg/l d'oxygène).
Préparer cette solution juste avant utilisation et jeter la solution restante à la fin de la journée de travail.
La solution peut également être congelée en petites quantités. La solution congelée peut être conservée
pendant un maximum de trois mois. Utiliser la solution décongelée aussitôt après décongélation.
5.10 Solution d'allylthiourée (ATU), ρ = 1,0 g/l.
Dissoudre 200 mg d'allylthiourée (C H N S) dans de l'eau (5.1). Diluer à 200 ml avec de l'eau (5.1) et
4 8 2
mélanger. Conserver la solution à (5 ± 3) °C. La solution est stable pendant au moins deux semaines.
AVERTISSEMENT — Ce réactif est toxique et doit donc être manipulé conformément à la fiche de
données de sécurité.
L'ajout de 2 ml de solution d'ATU (ρ = 1,0 g/l) par litre de solution d'essai ne permet pas d'inhiber la
nitrification dans tous les cas. L'ajout d'un volume nettement supérieur à 2 ml de solution d'ATU peut
perturber le titrage, selon l'ISO 5813 (voir 9.6.1).
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Généralités
Les récipients en plastique et en verre doivent être soigneusement nettoyés, notamment être
débarrassés des composés toxiques et biodégradables absorbés, et doivent être protégés contre la
contamination.
6.2 Flacons d'incubation, flacons DBO (de type Karlsruhe) d'une contenance comprise entre 100 ml
et 300 ml, flacons à col conique avec bouchon et un entonnoir adapté, ou autres flacons appropriés à
fermeture hermétique, sans bulles d'air. Lors de l'utilisation de systèmes automatiques, il est important
d'employer des flacons d'incubation d'un volume défini, car les flacons d'incubation font office de
récipients de dilution.
6.3 Réservoir pour eau de dilution ensemencée et non ensemencée, en verre ou en plastique.
Prendre des mesures pour faire en sorte que le réservoir soit toujours propre, exempt de proliférations
de micro-organismes et tenu à l'abri de la lumière.
6.4 Enceinte thermique, salle ou incubateur, pouvant être maintenu à (20 ± 1) °C et sans lumière.
6.5 Appareil pour la détermination de la concentration en oxygène dissous, tel que spécifié dans
l'ISO 5813 (méthode iodométrique), l'ISO 5814 (méthode électrochimique à la sonde) avec sonde à
oxygène ou l'ISO 17289 (méthode optique à la sonde) avec sonde de mesure optique de l'oxygène.
6.6 Dispositif de réfrigération et de congélation, pour le transport et la conservation des
échantillons.
6.7 Récipient de dilution, récipient pour mélange, de préférence en verre (par exemple fiole jaugée ou
éprouvette), d'une capacité volumique suffisante pour la série de dilution et pour permettre un mélange
suffisant.
6.8 Équipement pour l'aération, bouteille d'air sous pression ou compresseur. La qualité de l'air
doit être telle que l'aération n'entraîne aucune contamination, notamment par l'ajout de matières
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organiques, de substances oxydantes ou réductrices, ou de métaux. Si une contamination est suspectée,
filtrer et laver l'air.
6.9 Équipement de mesure du pH, satisfaisant aux exigences de détermination du pH, tel que spécifié
dans l'ISO 10523.
6.10 Agitateur, permettant d'assurer l'homogénéité de l'échantillon lors du sous-échantillonnage ainsi
que l'absence d'air.
6.11 Filtre en fibre de verre GF 6.
7 Échantillonnage et conservation
Les récipients en verre ou en plastique pouvant être fermés conviennent à l'échantillonnage. Il convient
que le volume soit suffisant pour permettre de préparer une série de dilutions convenable. Remplir
complètement les récipients d'échantillonnage, les fermer et les refroidir à (5 ± 3) °C le plus tôt possible.
Conserver les échantillons dans l'obscurité afin d'éviter la croissance d'algues et les refroidir à (5 ± 3) °C
jusqu'à leur traitement, au plus tard le jour suivant la date de l'échantillonnage.
Si les échantillons ne peuvent être analysés avant le lendemain de l'échantillonnage, congeler les
échantillons le plus tôt possible après l'échantillonnage et les conserver à une température ≤ −18 °C
pendant un mois maximal, ou pendant six mois maximum si la DBO est > 50 mg/l, dans un récipient
approprié dans l'obscurité, ou dans des flacons ambrés comme spécifié dans l'ISO 5667-3. Vérifier
que les flacons ne génèrent pas de valeurs de blanc excessives (9.5). Étant donné que les échantillons
sont transportés dans des flacons complètement remplis, la réduction de volume jusqu'à un niveau
permettant l'expansion due à la congélation (prévention de la casse des flacons) se fait en laboratoire,
après homogénéisation de l'échantillon.
Décongeler l'échantillon à une température maximale de (20 ± 2) °C, sur une période n'excédant pas
16 h, sinon la survenue de processus bactériens pourrait fausser les résultats. Il convient donc de
congeler les échantillons en plusieurs portions qui n'excèdent pas un volume d'un litre. La décongélation
des échantillons à l'aide d'un appareil de chauffage quelconque, comme par exemple un micro-ondes
ou une plaque chauffante dans lesquels (une partie de) l'échantillon atteint une température de plus
de 22 °C, n'est pas autorisée et entraîne des résultats erronés. La température d'un bain-marie ne
doit pas excéder 22 °C. La décongélation complète d'un échantillon avant utilisation est essentielle,
car le processus de congélation peut avoir concentré certains composants dans la partie centrale de
l'échantillon, qui s'est solidifiée en dernier. Un échantillon décongelé ne doit plus être recongelé.
8 Interférences
8.1 Généralités
Les substances toxiques pour les micro-organismes, comme par exemple les bactéricides ou le chlore
libre, inhibent l'oxydation biochimique et induisent des résultats minorés. À l'inverse, la présence de
micro-organismes nitrifiants peut se traduire par des résultats majorés. La présence d'algues peut
amener à surestimer la DBO et perturber la détermination.
8.2 Présence de chlore libre et/ou de chlore combiné
Éliminer le chlore libre et/ou combiné présent dans l'échantillon en ajoutant le volume nécessaire de
solution de sulfite de sodium (5.8). Éviter les ajouts en excès: déterminer la concentration en chlore
[3] [4]
libre et en chlore combiné comme spécifié dans l'ISO 7393-1 ou l'ISO 7393-2 , et calculer le volume
de solution de sulfite de sodium selon la Formule (2).
17, 8××V ρ
p 2
V = (2)
ρ
où
V est le volume de solution de sulfite de sodium (5.8), en millilitres (ml);
V est le volume d'échantillon à traiter, en millilitres (ml);
p
ρ est le chlore libre mesuré dans l'échantillon, en grammes par litre (g/l);
ρ est la concentration de la solution de sulfite de sodium, en grammes par litre (g/l).
8.3 Présence d'algues
Dans le cas d'échantillons contenant des algues, envisager une filtration après l'échantillonnage sur le
terrain ou directement après l'arrivée au laboratoire, pour éviter des résultats anormalement élevés.
Utiliser des filtres en fibre de verre (6.11). La filtration peut entraîner un changement radical des
valeurs de la DBO et ne doit donc être réalisée que lorsque cela semble nécessaire pour l'évaluation de
la qualité de l'eau ou lorsque l'analyse d'un échantillon sans algues est exigée. Indiquer toute filtration
dans le rapport d'essai (voir Article 11).
8.4 Présence de peroxydes et de composés de peroxyde
NOTE Les peroxydes et composés de peroxyde peuvent se trouver dans les eaux usées de l'industrie
électronique, des laveries industrielles, etc.
Les peroxydes et composés de peroxyde génèrent des résultats minorés; c'est pourquoi ils doivent être
éliminés des échantillons à examiner.
Les méthodes suivantes peuvent être appliquées pour savoir s'il y a lieu de suspecter la présence de
peroxydes:
— vérification avec du papier iodo-amidonné. L'iodure et le papier filtre enduit d'amidon se colorent
en bleu en présence de peroxyde, mais ils réagissent également avec le chlore. Des bandelettes de
détection du peroxyde sont disponibles dans le commerce pour cette méthode;
— vérification par mesurage de la teneur en oxygène (9.6.2). Une sursaturation de la concentration
en oxygène dissous dans l'échantillon peut révéler la présence de peroxydes et de composés de
peroxyde.
Si des peroxydes ont été détectés, différentes méthodes permettent de les éliminer:
— il est possible d'éliminer les peroxydes en secouant ou en agitant vigoureusement l'échantillon dans
un récipient ouvert. Il faut vérifier la présence de peroxydes en utilisant des bandelettes de détection
du peroxyde ou en mesurant la concentration en oxygène dissous régulièrement, sans excéder une
durée de 2 h. L'élimination des peroxydes est terminée lorsque la concentration en oxygène dissous
ne diminue plus sur une période de 30 min ou que les bandelettes indicatrices ne détectent plus de
peroxyde;
— certains composés de peroxyde ne peuvent pas être éliminés par le biais de ces méthodes. Ils
peuvent alors être détruits à l'aide d'une solution de sulfite de sodium (5.8). Utiliser une aliquote
de l'échantillon pour déterminer le volume de solution de sulfite de sodium (5.8) nécessaire pour
supprimer les peroxydes. Éviter les quantités excessives et vérifier la consommation spontanée
d'oxygène. L'essai d'élimination complète des peroxydes peut être réalisé à l'aide de bandelettes
de détection du peroxyde. Sur la base de ces résultats, calculer la quantité de solution de sulfite de
8 © ISO 2019 – Tous droits réservés
sodium nécessaire pour éliminer les peroxydes et composés de peroxyde du volume d'échantillon
nécessaire pour l'essai. Ajouter l'équivalent de l'aliquote d'échantillon utilisée pour la détermination
de la DBO.
Étant donné que le traitement en vue de l'élimination des peroxydes peut modifier l'échantillon, il doit
être documenté dans le rapport d'essai.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Si la présence de substances toxiques pour les micro-organismes est suspectée, il convient d'appliquer
l'Annexe B où plusieurs dilutions différentes de l'échantillon sont prises en compte dans les essais.
Le nombre de flacons à préparer dépend de la technique utilisée pour mesurer la teneur en oxygène
dissous et du nombre de réplicats souhaités.
L'ensemencement direct des solutions d'essai est décrit à l'Annexe C.
9.2 Prétraitement
Le prétraitement est effectué sur les échantillons au plus tard le lendemain de l'échantillonnage, et sur
les échantillons congelés, après décongélation complète.
9.2.1 Neutralisation de l'échantillon
Neutraliser l'échantillon ou les échantillons dilués (dans les systèmes automatiques par exemple)
avec une solution d'acide chlorhydrique (5.6) ou une solution d'hydroxyde de sodium (5.7) si la valeur
du pH ne se situe pas entre 6 et 8. Choisir la concentration de la solution d'acide chlorhydrique (5.6)
ou d'hydroxyde de sodium (5.7) de manière à limiter le volume ajouté à 5 % au plus du volume total.
Indiquer dans le rapport d'essai les précipités qui pourraient se former.
NOTE Si la totalité de l'échantillon satisfait aux exigences de pH, il en sera de même pour toute dilution.
9.2.2 Homogénéisation
Pour le sous-échantillonnage, l'échantillon brut ou décongelé doit être soigneusement mélangé avant
répartition. Il convient d'assurer une répartition uniforme de tous les composés solubles et particulaires
(par exemple par une agitation lente ou un secouage énergique). Si l'échantillon contient de grosses
particules, ce qui complique le prélèvement d'échantillons partiels de qualité égale, l'homogénéisation
par broyage des particules à l'aide, par exemple, d'un dispositif de dispersion est recommandée.
9.3 Préparation des solutions d'essai
Porter l'échantillon à une température de (20 ± 2) °C. Assurer l'homogénéité de l'échantillon pendant la
préparation des dilutions, par exemple par une agitation lente ou un secouage énergique, manuellement
ou à l'aide d'un agitateur, en veillant à ne pas inclure d'air, jusqu'à ce que toutes les solutions d'essai
soient préparées.
Effectuer l'essai avec de préférence deux réplicats par dilution. Un essai sur un seul réplicat par dilution
est autorisé en fonction de l'objectif de l'essai et des exigences d'assurance qualité concernant les
échantillons choisis. Indiquer dans le rapport d'essai le nombre de dilutions (voir 9.4) et le nombre de
réplicats par dilution soumise à essai pour l'échantillon [Article 11 d)].
La procédure décrite ci-dessous tient compte d'au moins deux réplicats par dilution et plusieurs
dilutions.
Calculer les volumes d'échantillon et d'eau de dilution ensemencée nécessaires à la préparation des
solutions d'essai pour le nombre choisi de dilutions et de réplicats, en tenant compte du 9.4 pour le choix
des dilutions. Si la méthode iodométrique (9.6.1) est utilisée, une deuxième série de flacons contenant
des réplicats est nécessaire pour déterminer la concentration en oxygène dissous au temps zéro.
Verser un volume connu de l'échantillon (ou de l'échantillon prétraité) dans chaque récipient de
dilution (6.7), ajouter 2 ml de solution d'allylthiourée (5.10) par litre d'échantillon dilué et remplir
jusqu'au trait avec de l'eau de dilution ensemencée (5.5). Si le facteur de dilution à utiliser est supérieur
à 100, procéder à une dilution en série en deux étapes ou plus. En cas d'utilisation de systèmes d'analyse
automatiques, ajouter un volume défini d'échantillon (ou d'échantillon prétraité) dans le flacon
d'incubation. Les 2 ml de solution d'allylthiourée (5.10) par litre et l'eau de dilution ensemencée (5.5)
sont ajoutés automatiquement par le système.
9.4 Calcul des dilutions
9.4.1 Détermination empirique des dilutions
Comme le degré de dilution correct de l'échantillon qui donne une DBO mesurable dans au moins l'une
n
des dilutions ne peut être obtenu avec précision, plusieurs dilutions différentes variant selon le facteur
de dilution (valeur inverse du volume d'échantillon par rapport au volume total de l'essai) et incluant
la dilution correspondant à la DBO attendue (voir Tableau 1 et Annexe B) sont préparées. Différentes
n
options de détermination des facteurs de dilution et des séries de dilutions sont décrites en 9.4.2 et 9.4.3.
S'il y a suffisamment d'informations disponibles sur la consommation d'oxygène de l'échantillon (par
exemple composition connue, reproductible et stable du type d'échantillon étudié), un essai sur une
seule dilution est acceptable, dans la mesure où les résultats d'essai obtenus pour cette dilution sont
conformes aux critères de validité (10.3). Si la présence de substances toxiques est suspectée (par
exemple du fait d'une forte odeur chimique), des dilutions sont indispensables et leur préparation sur
une gamme plus vaste de concentrations est recommandée.
Tableau 1 — Exemples de séries de dilutions type (avec 3 niveaux de dilution chacune) pour la
détermination de la DBO
a
DBO attendue Volume possible d'échantillon Facteur de dilution
n
n = 5 jours (par exemple comme série de dilutions correspondante)
mg/l d'oxygène ml/l
b
1 à 6 250, 500, 750 ou 200, 400, 600 4 à 1,33
b
4 à 12 200, 400, 600 ou 200, 300, 400 5 à 1,67
10 à 30 200, 400, 600 ou 50, 100, 150 20 à 1,67
20 à 60 100, 200, 300 ou 40, 60, 80 25 à 3,33
40 à 120 40, 80, 120 ou 20, 30, 40 50 à 8,33
100 à 300 30, 40, 50 ou 5, 10, 15 200 à 20
200 à 600 10, 20, 30 ou 3, 6, 9 333 à 33,3
400 à 1 200 4, 8, 12 ou 1, 2, 3 1 000 à 83,3
c
1 000 à 3 000 2, 4, 6 ou 0,5; 1,0; 1,5 2 000 à 167
2 000 à 6 000 1, 2, 3 ou 0,3; 0,6; 0,9 3 333 à 333
a
Volume d'échantillo
...
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