ISO 8199:1988
(Main)Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
Water quality — General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
Presents guidance for carrying out manipulations which are common to each technique for the microbiological examination of water, particularly the preparation of samples, culture media and apparatur. It also describes the various enumeration methods available and the criteria for the choice of a particular technique.
Qualité de l'eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture
Kakovost vode - Splošno navodilo za štetje mikroorganizmov v gojišču
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
ISO
INTERNATIONAL STANDARD
8199
First edition
1988-06-15
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXP,YHAPOAHAfl OPTAHM3A~MR I-IO CTAH~APTM3A~MM
Water quality - General guide to the enumeration
of micro-organisms by culture
Guide gh&al pour Ie dhnombrement des micro-organismes Sur milieu de
Qual.26 de l’eau -
culture
Reference number
ISO 8199: 1988 (E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8199: 1988 (EI
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national Standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through ISO technical committees. Esch member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take patt in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the ISO Council. They are approved in accordance with ISO procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard ISO 8199 was prepared Technical Committee
ISO/TC 147,
bY
Water quality.
Annex A is for information only.
0 International Organkation for Standardkation, 1988
Printed in Switzerland
ii
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ISO 8199: 1988 (E)
Introduction
Techniques for the isolation and enumeration of micro-organisms, based on their
ability to grow on specified culture media, are an important and widely used means of
assessing the microbiological quality of water. The purpose of this guide is to gather in
a Single document the information common to the various enumeration techniques so
as to avoid repetition of technical details in individual Standards and to facilitate the
choice of the technique most suitable for a particular Problem.
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This page intentionally lefi blank
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ISO 8199 : 1988 (E)
INTERNATIONAL STANDARD
General guide to the enumeration
Water quality -
of micro-organisms by culture
4 Safety and hygiene in the laboratory
1 Scope
As well as general and statutory considerations for safety in the
This International Standard presents guidance for carrying out
Iaboratory, particular care and a high Standard of personal
manipulations which are common to each technique for the
hygiene are essential in microbiological work because
microbiological examination of water, particularly the prepara-
pathogenic organisms may always be encountered. In addition,
tion of samples, culture media and apparatus. lt also describes
media not necessarily designed for pathogens may support
the various enumeration methods available and the criteria for
their growth so that great care is needed in the handling and
the choice of a particular technique.
disposal of all cultures. Sound technique is the basis of safe
microbiological procedures and it is important that all in-
dividuals concerned with microbiological work should have
received adequate training. lt is also important that the
2 Normative references
necessary laboratory equipment and facilities should conform
to accepted Codes of safety and good laboratory practice.
The following Standards contain provisions, which, through
reference in this text, constitute provisions of this International
Standard. At the time of publication, the editions indicated
Certain precautions are essential in the laboratory not only to
were valid. All Standards are subject to revision, and Parties to
prevent contamination of samples and culture media but also to
agreements based on this International Standard are encour-
avoid infection hazards to personnel, namely :
aged to investigate the possibility of applying the most recent
editions of the Standards listed below. Members of IEC and ISO
-
strictly observe personal hygienic precautions, keep
maintain registers of currently valid International Standards.
nails short, and use hair and beard protection if necessary;
ISO 3534: 1977, Statistics - Vocabulary and Symbols.
-
wash hands with soap and warm water both before and
after microbiological work as well as after use of the toilet;
ISO 3696: 1987, Water for analytical laboratory use -
Specification and test methods.
-
always wear protective clothing in the Iaboratory;
ISO 5667-2: 1982, Water quality - Sampling - Part 2:
-
sterilize all cultures by autoclaving, and sterilize or
General guide to sampling techniques.
disinfect associated apparatus and materials before disposal
or re-use;
ISO 5667-3 : 1985, Water quality - Sampling - Part 3:
Recommendations for the preservation and handling of
- do not eat, drink or smoke in the laboratory;
samples.
-
report any accident, spillage or unusual occurrence to
ISO 6887 : 1983, Microbiology - General guidance for the senior personnel ;
prepara tion o f dilu tions for microbiological examina tion.
-
if in doubt, ask for advice.
3 Principle
5 Diluents and culture media
The general principle of these techniques consists of in-
oculating a known volume of a water Sample into a culture
5.1 General
medium (solid or liquid). lt is assumed that on incubation each
micro-organism present multiplies giving either a colony visible
Constituents of uniform quality and analytical grade chemicals
directly on the solid medium, or changes in appearance in the
should be used for the preparation of media. Alternatively,
liquid medium. The choice of a particular method depends not
dehydrated complete media may be used. The manufacturer’s
only on the nature of the micro-organisms sought, but also on
instructions should be strictly followed.
the nature of the water and the reasons for the examination.
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ISO 8199: 1988 (EI
Prepara tion
The water used should be glass-distilled or demineralized and
free from substances that might inhibit growth of micro-
organisms under the test conditions. lt should comply with the
The constituents should be dissolved in the water and the solu-
requirements of ISO 3696, Grade 3.
tion made up to 1 000 ml.
5.1 .l Sterilization
5.2.4 Phosphate buffer Solution
Diluents and culture media should be dispensed in Containers
suitable for sterilization by autoclaving. For most purposes, a
Composition
temperature of 121 OC * 1 OC for 15 min is adequate.
However, a different time and temperature may sometimes be
Potassium dihydrogenorthophosphate (KH2P04) 42,5 mg
required and details are given in each individual Standard.
Magnesium chloride (MgCI,) (see note) 190 mg
Alternatively, with thermolabile substances sterilization may be
effected by filtration.
Water 1 OOOml
5.2 Diluents
Prepara tion
One of the following diluents should be used.
a) Phosphate Solution
5.2.1 Peptone diluent
To prepare the Solution 34 g of potassium dihydrogen-
Composition
orthophosphate should be dissolved in 500 ml of distilled
water. The pH should be adjusted to a value of 7,2 + 0,5
Peptone
Log
with 1 mol/1 sodium hydroxide Solution and the Solution
to 1000 ml
Water
made up to 1 000 ml with distilled water.
Prepara tion
NOTE - Alternatively, an equivalent amount of magnesium sulfate
(MgS04.7H20) may be used.
The peptone should be dissolved in approximately 950 ml of
water. The pH should be adjusted by adding sodium hydroxide
[c(NaOH) = 1 mol/11 or hydrochloric acid
Solution
b) Magnesium chloride Solution
[c(HCI) = 1 mol/11 so that after sterilization the pH will be
7,0 + 0,l. The Solution should be made up to 1 000 ml with
To prepare the Solution 38 g of magnesium chloride should
water, distributed and sterilized.
be dissolved in 1 000 ml of distilled water.
5.2.2 Peptone Saline solution
Final Solution
Composition
Peptone Log
For use, 1,25 ml of Phosphate Solution a) and 5,0 ml of
magnesium chloride Solution b) should be added to 1000 ml of
Sodium chloride
9,5 9
distilled water. The Solution should be dispensed in convenient
to 1 000 ml
Water
volumes and sterilized by autoclaving at 121 OC + 1 OC for
15 min.
Preparation
The constituents should be dissolved in the water and
5.2.5 Distilled water
the pH adjusted by adding sodium hydroxide Solution
= 1 mol/11 or hydrochloric acid [c(HCI) = 1 mol/11
[c(NaOH)
Distilled water of suitable grade should be distributed and
so that after sterilization it will be 7,0 & 0,l. The Solution
sterilized (sec 5.1).
should be made up to 1 000 ml with water, distributed and
sterilized.
5.3 Culture media
5.2.3 Ringer’s Solution - quarter-strength
In general most media after sterilization in sealed Containers
Composition
may be stored satisfactorily for several months at room
temperature provided they are kept in the dark and remain
Sodium chloride 2125 9
sealed. Media dispensed aseptically may be stored at between
Potassium chloride 0,105 g
4 OC and 10 OC for up to 1 month; before use, they should be
Calcium chloride (anhydrous) inspected carefully for contamination, excessive evaporation,
Cl2 9
or other evidente of deterioration. Most reagents are best kept
Sodium hydrogen carbonate 0,05 g
at 4OC. Culture media supplied pre-poured should be used in
to 1 000 ml
Water accordance with the manufacturer’s instructions.
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ISO 8199: 1988 (El
Sterilization of apparatus and glassware
7.3 Preparation of test Sample
Apparatus and glassware not supplied sterile should be steril-
Before examination, the Sample should be mixed thoroughly by
the following methods :
ized by one of
vigorous agitation to achieve uniform distribution of micro-
organisms and, depending on the nature of the water and the
at 160 OC * 2 OC for 1 h (or 170 OC IL 2 OC
a) in an oven,
bacterial content anticipated, any dilutions necessary made at
for 40 min);
this Stage.
b) in an autoclave, at 121 OC & 1 OC for a minimum of
For ten-fold dilutions, 90 ml or 9 ml of the diluent should be
20 min.
measured out into sterile dilution bottles or tubes. Alterna-
tively, volumes of diluent, pre-sterilized in screwcapped
If membrane filters are not obtained sterile, they should be
bottles, should be used. One or more ten-fold dilutions should
sterilized before use according to the manufacturer’s instruc-
be made by transferring one volume of water Sample to nine
tions or, in their absence, by autoclaving at 115 OC + 1 OC for
volumes of diluent. With a fresh pipette or by mechanical
10 min or, for vegetative organisms, disinfected by boiling
means, the Solution should be mixed thoroughly and one
gently in distilled water for 10 min.
volume of this dilution transferred to another nine volumes of
diluent. These Steps should be repeated as often as required.
Sufficient of each dilution for all the tests to be carried out on
the Sample should be prepared. For dilutions other than ten-
7 Samples
fold, the volume of diluent to volume of Sample should be
adjusted accordingly.
7.1 Sampling
For general guidance on the preparation of ten-fold dilutions,
For guidance on sampling techniques, refer to ISO 5667-2. refer to ISO 6887; this guidance tan also be applied to making
dilutions with a dilution factor other than 10.
The Prime objective is to obtain a Sample which is represen-
tative, as far as possible, of the water to be examined. To
achieve this, certain precautions are necessary which are com-
8 Enumeration after inoculation of test
mon to all sampling procedures for bacteriological exami-
portions of the Sample in (or on) solid media
nation :
a) for re-use, sampling bottles should be able to withstand
8.1 Principle
repeated sterilization without producing or releasing
substances likely to inhibit or promote bacterial growth;
A test Portion of the water Sample is inoculated by mixing with
or spreading on the surface of a specified solid culture medium
sampling bottles should contain an agent to neutralize
b)
so that on incubation, micro-organisms form colonies either on
any residual disinfectant in the water and should be sterile.
or in the medium.
The neutralizing agent should not affect the viability or
growth of the organisms sought. For chlorine, 0,l ml of a
For practical purposes each colony is considered to have
1,8 % (mlm) sterile Solution of sodium thiosulfate
originated from a Single micro-organism or a clump of micro-
(Na2S203.5H20) should be added before sterilization to
organisms present in the Sample at the moment of inoculation.
each bottle for each 100 ml of capacity;
Taking into account the volume of the test Portion and the
number of colonies formed, the result tan therefore be ex-
c) scrupulous care should be taken to avoid accidental
pressed as a number of colony-forming units in a given volume
contamination of the Sample during collection and subse-
of the Sample, e.g. 1 ml or 100 ml.
quent handling;
d) the Sample should be examined as soon as possi ble
8.2 Procedures
after collection, prefera within 6 h;
blY
8.2.1 General
e) every Sample bottle should be clearly identifiable, and
should be accompanied by sufficient information concern-
Three main p #rocedu res may be for the inoculation of solid
ing the nature of the Sample and the reasons for the ex-
media
amination requested.
a) The Sample is mixed with the medium which has
7.2 Preservation and handling
previously been melted and cooled to a temperature close to
that of solidification; after incubation the colonies which
For guidance on preservation and handling of samples, refer to
develop within and on the surface of the medium are
ISO 5667-3.
counted.
In general, samples should be transported to the laboratory for
b) The Sample is spread over the dry surface of an agar
examination as soon as possible. If there is likely to be a delay,
medium and after incubation, colonies which develop on its
the samples should be placed in a cool insulated Container.
surface are counted.
3
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ISO 8199: 1988 (EI
c) The Sample is passed through a membrane filter, which Sample, should be 0,l ml to 0,5 ml. The dilution should be
retains the micro-organisms sought; the membrane is then
Chosen so that the expected number of colonies formed lies
placed on an agar medium or on an absorbent pad im- between about 25 and 300.
pregnated with broth. On incubation, colonies form on the
surface of the membrane. Alternatively, for certain
8.2.4.2 Inoculation
organisms, such as anaerobes, the membrane may be
placed face downwards in a Petri dish and overlaid with
Plates, each containing about 15 ml of culture medium, should
molten agar medium.
be prepared and marked; the surface of the medium should be
dried before use. The test Portion should be pipetted on to the
8.2.2 Choice of technique surface of the medium and spread over the surface with a
sterile glass rod or mechanical device. After absorption of the
The choice of technique depends on several factors including
inoculum, incubation should be carried out in accordance with
the physical and Chemical characteristics of the water (sec
8.2.6.
10.2.2) as well as the nature of the micro-organisms sought
(see 10.2.11, their probable concentration, and the test preci-
8.2.5 Membrane filtration method
sion required. Indications are given in 8.2.3.1, 8.2.4.1, and
8.2.5.1 of the volumes of water samples which tan be used for
8.2.5.1 Test Portion
each method and the limits of detection are discussed in 10.1.3.
In addition the precision of the methods is discussed in 10.1.2.
The maximum volume of the test Portion depends on the
The requirements of regulations may also influence the choice
filterability of the water Sample and on the membranes used.
of technique to be used by indicating, for example, the preci-
This technique is suitable for waters which contain little par-
sion desired or whether the presence or absence of an
ticulate matter in Suspension, for example drinking water. With
organism in a specified test volume will be sufficient.
membranes of mean pore diameter 0,45 Pm, it may be possible
to filter several litres of such water through a Single membrane,
8.2.3 Pour plate method
and so achieve a high level of test sensitivity; for some
organisms, however, filtration through a membrane with a
8.2.3.1 Test Portion
mean pore diameter of 022 pm may be necessary. A test
volume of the Sample or a dilution of it should be Chosen to
The volume of the test Portion of the Sample, or of a dilution of
yield less than about 100 colonies on a membrane of 47 mm or
the Sample, tan vary between 0,l ml and 5 ml depending on the
50 mm in diameter.
size of the Petri dish and the volume of culture medium used.
The dilution should be Chosen so that the expected number of
8.2.5.2 Filtration
colonies formed on plates of diameter 90/100 mm is between
about 25 and 300.
The sterile filtration apparatus should be connected to a Source
of vacuum. A sterile membrane should be placed, grid-side up-
8.2.3.2 Inoculation
wards, on the porous disc of the filter base, only the outer part
of the membrane filter being grasped with flat-ended sterile
The medium required should be melted in boiling water or
forceps. The sterile funnel should be positioned securely on the
steam, placed in a water bath at 45 OC + 1 OC and with sterile
filter base. With the vacuum stopcock turned off, one of the
precautions any additional ingredients necessary added at this
following should be poured or pipetted into the funnel:
Stage.
a) a known volume ilutio n of it, care-
of the Sample, or d
fully mixed;
The Petri dishes required should be prepared and marked, any
dilutions necessary made in accordance with 7.3 and, after
b) the contents of a flask or bottle containing the test por-
thorough mixing, the test portions distributed into the dishes.
tion and sufficient diluent to bring the total volume to at
least 20 ml to 30 ml;
Esch tube of melted medium should be removed in turn from
c) at least 20 ml of diluent, to which the test Portion,
the water bath, the outside of the tube dried and the neck
measured with a pipette, is added directly and mixed with
flamed. The medium should be added to the test portion in
the pipette.
each Petri dish without delay and mixed carefully so as to ob-
tain a uniform distribution of micro-organisms. The plates
The stopcock should be opened and a vacuum of about 70 kPa
should be left to cool on a horizontal surface and then they
applied to filter the water slowly through the membrane. The
should be incubated in accordance with 8.2.6. Generally 15 ml
stopcock should be closed as soon as the Sample has been
of medium is used for a test Portion of 1 ml or 2 ml; for larger
filtered.
test portions, the composition of the medium should be
adjusted accordingly.
8.2.5.3 Transfer of membrane
8.2.4 Spread plate method
The funnel should then be removed and the membrane
transferred with sterile forceps to one of the following, ensur-
8.2.4.1 Test portion
ing that no air bubbles are trapped between the membrane and
the medium :
For a Petr ,i dish of ’ between 90 mm and 100 mm diameter the
volume of the test portion of the Sample, or of a dilution of the
a) an agar medium in a Petri dish;
4
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ISO 8199: 1988 (EI
8.3.1
b) a sterile absorbent pad previously saturated with a Colonies to be counted
liquid medium in a Petri dish. To avoid any confluent
growth, any excess medium should be poured off,
For “total” counts on a non-selective medium, all the colonies
preferably before placing the membrane on the pad;
should be counted. With selective and differential media, only
those colonies which show the characteristic appearance of the
c) a Petri dish, or onto a little agar medium in a Petri dish;
organism sought should be counted. lt is unusual for such
then the membrane should be overlaid with a molten agar
counts to comprise organisms belonging only to one taxonomic
medium (45 OC).
group, but in practice this discrepancy may be accepted and
the results expressed as presumptive. For more precise
For different volumes of the same Sample, the funnel may be
characterization, confirmatory tests are necessary.
re-used without disinfection provided that the smallest volumes
are filtered first. To filter another Sample, either a separate
lt may be impracticable, however, if there are numerous col-
sterile apparatus should be used or for vegetative organisms
onies, to tonfirm the identity of a sufficient number of them to
the funnel disinfected, for example by immersion in boiling
yield a precise result. In such instances, as many colonies as
water for at least 1 min; alternatively, the manufacturer’s in-
possible should be examined from a given area of the plate or
structions for disinfection should be followed. During the filtra-
membrane.
tion of a series of samples the filter base need not be
disinfected unless it is contaminated or a membrane is damag-
ed.
8.4 Calculation of results
The filtration of known polluted samples should not be alter-
Since each colony is assumed to have arisen from one micro-
nated with those of treated water samples through the same
organism or from a Single aggregate of micro-organisms, the
apparatus. First all the samples of chlorinated water and those
result is expressed as the number of colony-forming units in a
expected to give negative results should be filtered, followed by
specified reference volume of the Sample (generally 100 ml or
those known to be polluted. Alternatively, a separate mem-
1 ml) according to the following equation:
brane filtration apparatus tan be reserved for all chlorinated
samples and another for polluted samples.
N
c, =
VS
bq v, F,) + bz2 v2 4) + . . . + (IQ Vi Fi)
8.2.6 Incubation
where
The inoculated plates should be inverted and placed either in an
C, is the number of colony-forming units in the reference
incubator or in a water-tight Container in a water bath. Plates
volume VS of the Sample;
containing membranes on absorbent pads should always be
placed in an air- or water-tight Container to prevent desiccation
N is the sum of all colonies counted in plates or on mem-
of the medium.
branes derived from dilutions Fl, F2, . . . Fi;
The duration and temperature of incubation should be Chosen
nlf ?22 mmm IZi is the number of plates counted for dilution Fl,
after reference to a Standard method as they depend on the
F2 mmm Fi;
micro-organism, or groups of micro-organisms, sought.
v,, v2 . . . is the test volume used with dilution Fl, F2 . . .
Incubation may be carried out in two stages. vi
Fi;
Pre-incubation of variable duration, for example 2 h to 4 h at a
lower temperature, tan be used to permit resuscitation of F,, F2 . . . Fi is the dilution used for the test pot-tion VI, V2
. . . Vi (F = 1 for an undiluted Sample, F = 0,l for a ten-fold
stressed organisms, followed by a longer period of incubation
dilution, etc.) ;
at the usual temperature for the organism sought. The Change
may be effected either by transfer to another incubator or water
VS is the reference volume Chosen to express the concen-
bath, or by using apparatus in which the temperature is
tration of the micro-organisms in the Sample.
automatically changed alter a given period. Ideally, all the
plates should be placed in the incubator or water bath at the
NOTE - The final count thus obtained is the weighted average of the
same time.
counts from each plate.
Alternatively, the membranes may be incubated for a limited
period (e.g. 2 h or 4 h) on a resuscitation medium and then An example of the calculation for the pour or spread plate
transferred to another medium, which is usually selective, for method is as follows:
further incubation.
If the volume applied of the test Solution (Vi) is 1 ml, and the
following counts are obtained at the respective dilutions:
8.3 Enumeration
Dilution Counts
After incubation, the plates or membranes should be examined
10-2 74 and 104 colonies
immediately. If this is not possible, they may be kept at be-
tween 4 OC and 5 OC for short periods provided that this does
10-3 9 and 15 colonies
not affect the appearance of the colonies.
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ISO 8199: 1988 (EI
lt is assumed that on incubation each tube which received one
then
or more organism(s) in the inoculum will show growth with or
without a characteristic Change produced in the medium. Pro-
74 + 104 + 9 + 15
Cs =
VS
vided some of the tubes give negative results, the most pro-
(2 x 1 x 0,Ol) + (2 x 1 x 0,001)
bable number (MPN) of organisms in a specified volume of the
Sample tan be estimated from the number and distribution of
202
tubes showing a positive reaction.
- VS
= 0,022
A choice should be made from among the various MPN “in-
oculation Systems” (9.3.2) available according to the expected
= 9182 VS
numbers of organisms in the Sample under investigation,
regulatory requirements, the precision needed and any other
and if VS is per ml,
practical considerations. The precision depends on the number
of tubes inoculated with the same volume; it increases as a
then C, = 9,18 x 10Vml
function of the Square root of the number of tubes used, i.e.
the number of tubes has to be quadrupled to double the preci-
lt is desirable to report the results of such colony counts
sion. In practice, with the Systems usually used, this precision
together with the 95 % confidence limits, which may be de-
is always Iow. On the other hand, with these Systems, sensitiv-
rived by application of the following formula :
ity, which depends on the total volume examined, is generally
sufficient for practical purposes.
C+2f2&Ti
where C is the colony count or sum of colony counts.
9.3 Procedure
The choice of the actual MPN enumeration procedure depends
For example if 100 colonies are present on a membrane, then
on similar factors to those mentioned in 8.2.2 and the following
the actual number of the particular organism in 100 ml of the
guidance is given on the procedure most applicable.
water Sample is likely to lie between 82 and 122. However, for
low counts of less than about 20 colonies, this approximate for-
9.3.1 Test Portion
mula becomes inaccurate, as do all others; reference should
then be made to Poisson tables.
Addition of the test Portion should not Change the composition
of the medium such that significant interference occurs to the
growth of the micro-organisms sought. Test Portion volumes
9 Enumeration by inoculation in liquid media
of less than, or equal to, 1 ml are normally added to single-
strength media. Test portions of between 1 ml and 50 ml are
9.1 Principle
normally added to equal volumes of double-strength media,
provided that the Sample does not contain excess inorganic
Test portions of the water Sample are inoculated into liquid
salts, or toxic substances which could affect bacterial growth.
medium designed to ensure the growth of a particular micro-
For volumes greater than 50 ml, more concentrated media tan
organism or group of micro-organisms. As growth occurs
be used. For special purposes, sterile dehydrated media tan be
throughout a liquid medium, the most probable number of the
dissolved in the cold (or at 30 “C) in the Sample to be analysed.
micro-organisms present in the original Sample tan be
This method is similar in principle to that described in clause 8
estimated only by the statistical procedures described below. In
and has similar disadvantages in the presence of high concen-
practice the results obtained are always imprecise and the
trations of inorganic salts or toxic substances.
precision tan be improved only by increasing the number of
samples or test portions of the Sample examined.
The disadvantages of the presence of high concentrations of
minerals or toxic substances tan be overcome by separating
9.2 Applications the micro-organisms from the water Sample. This may be car-
ried out by membrane filtration as described in 8.2.5 or, if the
water is turbid, by addition to the Sample of a filter-aid such as
9.2.1 Test for presence or absence of a micro-organism
diatomaceous earth or a Suspension of aluminium Oxide. These
filter aids settle out, carrying micro-organisms with them;
After inoculation and incubation of a Single test portion of the
Separation is then completed by centrifugation or filtration. The
Sample in a tube of liquid medium and the demonstration or
membranes, diatomaceous earth, or aluminium Oxide are then
otherwise of the growth of a given micro-organism in it, the
only conclusion which tan be drawn is the presence, or placed in the liquid culture medium.
absence, of the micro-organism in this test volume.
9.3.2 Choice of inoculation System
This method tan be used to check conformity with regulations
Different inoculation Systems are available. In the usual “sym-
expressed in terms such as : “absence of . . . [designation of the
metrical” Systems, the same number of replicate tubes are used
micro-organisml in . . . ml” but does not permit the concen-
as a set for each dilution, the ratio of the volumes between the
tration of the micro-organism to be quantified.
dilutions generally being 1 to 10 as shown, for example, in the
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 8199:1997
01-september-1997
.DNRYRVWYRGH6SORãQRQDYRGLOR]DãWHWMHPLNURRUJDQL]PRYYJRMLãþX
Water quality -- General guide to the enumeration of micro-organisms by culture
Qualité de l'eau -- Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 8199:1988
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 8199:1997 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 8199:1997
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SIST ISO 8199:1997
ISO
INTERNATIONAL STANDARD
8199
First edition
1988-06-15
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXP,YHAPOAHAfl OPTAHM3A~MR I-IO CTAH~APTM3A~MM
Water quality - General guide to the enumeration
of micro-organisms by culture
Guide gh&al pour Ie dhnombrement des micro-organismes Sur milieu de
Qual.26 de l’eau -
culture
Reference number
ISO 8199: 1988 (E)
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SIST ISO 8199:1997
ISO 8199: 1988 (EI
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national Standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through ISO technical committees. Esch member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take patt in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the ISO Council. They are approved in accordance with ISO procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard ISO 8199 was prepared Technical Committee
ISO/TC 147,
bY
Water quality.
Annex A is for information only.
0 International Organkation for Standardkation, 1988
Printed in Switzerland
ii
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SIST ISO 8199:1997
ISO 8199: 1988 (E)
Introduction
Techniques for the isolation and enumeration of micro-organisms, based on their
ability to grow on specified culture media, are an important and widely used means of
assessing the microbiological quality of water. The purpose of this guide is to gather in
a Single document the information common to the various enumeration techniques so
as to avoid repetition of technical details in individual Standards and to facilitate the
choice of the technique most suitable for a particular Problem.
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SIST ISO 8199:1997
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SIST ISO 8199:1997
ISO 8199 : 1988 (E)
INTERNATIONAL STANDARD
General guide to the enumeration
Water quality -
of micro-organisms by culture
4 Safety and hygiene in the laboratory
1 Scope
As well as general and statutory considerations for safety in the
This International Standard presents guidance for carrying out
Iaboratory, particular care and a high Standard of personal
manipulations which are common to each technique for the
hygiene are essential in microbiological work because
microbiological examination of water, particularly the prepara-
pathogenic organisms may always be encountered. In addition,
tion of samples, culture media and apparatus. lt also describes
media not necessarily designed for pathogens may support
the various enumeration methods available and the criteria for
their growth so that great care is needed in the handling and
the choice of a particular technique.
disposal of all cultures. Sound technique is the basis of safe
microbiological procedures and it is important that all in-
dividuals concerned with microbiological work should have
received adequate training. lt is also important that the
2 Normative references
necessary laboratory equipment and facilities should conform
to accepted Codes of safety and good laboratory practice.
The following Standards contain provisions, which, through
reference in this text, constitute provisions of this International
Standard. At the time of publication, the editions indicated
Certain precautions are essential in the laboratory not only to
were valid. All Standards are subject to revision, and Parties to
prevent contamination of samples and culture media but also to
agreements based on this International Standard are encour-
avoid infection hazards to personnel, namely :
aged to investigate the possibility of applying the most recent
editions of the Standards listed below. Members of IEC and ISO
-
strictly observe personal hygienic precautions, keep
maintain registers of currently valid International Standards.
nails short, and use hair and beard protection if necessary;
ISO 3534: 1977, Statistics - Vocabulary and Symbols.
-
wash hands with soap and warm water both before and
after microbiological work as well as after use of the toilet;
ISO 3696: 1987, Water for analytical laboratory use -
Specification and test methods.
-
always wear protective clothing in the Iaboratory;
ISO 5667-2: 1982, Water quality - Sampling - Part 2:
-
sterilize all cultures by autoclaving, and sterilize or
General guide to sampling techniques.
disinfect associated apparatus and materials before disposal
or re-use;
ISO 5667-3 : 1985, Water quality - Sampling - Part 3:
Recommendations for the preservation and handling of
- do not eat, drink or smoke in the laboratory;
samples.
-
report any accident, spillage or unusual occurrence to
ISO 6887 : 1983, Microbiology - General guidance for the senior personnel ;
prepara tion o f dilu tions for microbiological examina tion.
-
if in doubt, ask for advice.
3 Principle
5 Diluents and culture media
The general principle of these techniques consists of in-
oculating a known volume of a water Sample into a culture
5.1 General
medium (solid or liquid). lt is assumed that on incubation each
micro-organism present multiplies giving either a colony visible
Constituents of uniform quality and analytical grade chemicals
directly on the solid medium, or changes in appearance in the
should be used for the preparation of media. Alternatively,
liquid medium. The choice of a particular method depends not
dehydrated complete media may be used. The manufacturer’s
only on the nature of the micro-organisms sought, but also on
instructions should be strictly followed.
the nature of the water and the reasons for the examination.
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ISO 8199: 1988 (EI
Prepara tion
The water used should be glass-distilled or demineralized and
free from substances that might inhibit growth of micro-
organisms under the test conditions. lt should comply with the
The constituents should be dissolved in the water and the solu-
requirements of ISO 3696, Grade 3.
tion made up to 1 000 ml.
5.1 .l Sterilization
5.2.4 Phosphate buffer Solution
Diluents and culture media should be dispensed in Containers
suitable for sterilization by autoclaving. For most purposes, a
Composition
temperature of 121 OC * 1 OC for 15 min is adequate.
However, a different time and temperature may sometimes be
Potassium dihydrogenorthophosphate (KH2P04) 42,5 mg
required and details are given in each individual Standard.
Magnesium chloride (MgCI,) (see note) 190 mg
Alternatively, with thermolabile substances sterilization may be
effected by filtration.
Water 1 OOOml
5.2 Diluents
Prepara tion
One of the following diluents should be used.
a) Phosphate Solution
5.2.1 Peptone diluent
To prepare the Solution 34 g of potassium dihydrogen-
Composition
orthophosphate should be dissolved in 500 ml of distilled
water. The pH should be adjusted to a value of 7,2 + 0,5
Peptone
Log
with 1 mol/1 sodium hydroxide Solution and the Solution
to 1000 ml
Water
made up to 1 000 ml with distilled water.
Prepara tion
NOTE - Alternatively, an equivalent amount of magnesium sulfate
(MgS04.7H20) may be used.
The peptone should be dissolved in approximately 950 ml of
water. The pH should be adjusted by adding sodium hydroxide
[c(NaOH) = 1 mol/11 or hydrochloric acid
Solution
b) Magnesium chloride Solution
[c(HCI) = 1 mol/11 so that after sterilization the pH will be
7,0 + 0,l. The Solution should be made up to 1 000 ml with
To prepare the Solution 38 g of magnesium chloride should
water, distributed and sterilized.
be dissolved in 1 000 ml of distilled water.
5.2.2 Peptone Saline solution
Final Solution
Composition
Peptone Log
For use, 1,25 ml of Phosphate Solution a) and 5,0 ml of
magnesium chloride Solution b) should be added to 1000 ml of
Sodium chloride
9,5 9
distilled water. The Solution should be dispensed in convenient
to 1 000 ml
Water
volumes and sterilized by autoclaving at 121 OC + 1 OC for
15 min.
Preparation
The constituents should be dissolved in the water and
5.2.5 Distilled water
the pH adjusted by adding sodium hydroxide Solution
= 1 mol/11 or hydrochloric acid [c(HCI) = 1 mol/11
[c(NaOH)
Distilled water of suitable grade should be distributed and
so that after sterilization it will be 7,0 & 0,l. The Solution
sterilized (sec 5.1).
should be made up to 1 000 ml with water, distributed and
sterilized.
5.3 Culture media
5.2.3 Ringer’s Solution - quarter-strength
In general most media after sterilization in sealed Containers
Composition
may be stored satisfactorily for several months at room
temperature provided they are kept in the dark and remain
Sodium chloride 2125 9
sealed. Media dispensed aseptically may be stored at between
Potassium chloride 0,105 g
4 OC and 10 OC for up to 1 month; before use, they should be
Calcium chloride (anhydrous) inspected carefully for contamination, excessive evaporation,
Cl2 9
or other evidente of deterioration. Most reagents are best kept
Sodium hydrogen carbonate 0,05 g
at 4OC. Culture media supplied pre-poured should be used in
to 1 000 ml
Water accordance with the manufacturer’s instructions.
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SIST ISO 8199:1997
ISO 8199: 1988 (El
Sterilization of apparatus and glassware
7.3 Preparation of test Sample
Apparatus and glassware not supplied sterile should be steril-
Before examination, the Sample should be mixed thoroughly by
the following methods :
ized by one of
vigorous agitation to achieve uniform distribution of micro-
organisms and, depending on the nature of the water and the
at 160 OC * 2 OC for 1 h (or 170 OC IL 2 OC
a) in an oven,
bacterial content anticipated, any dilutions necessary made at
for 40 min);
this Stage.
b) in an autoclave, at 121 OC & 1 OC for a minimum of
For ten-fold dilutions, 90 ml or 9 ml of the diluent should be
20 min.
measured out into sterile dilution bottles or tubes. Alterna-
tively, volumes of diluent, pre-sterilized in screwcapped
If membrane filters are not obtained sterile, they should be
bottles, should be used. One or more ten-fold dilutions should
sterilized before use according to the manufacturer’s instruc-
be made by transferring one volume of water Sample to nine
tions or, in their absence, by autoclaving at 115 OC + 1 OC for
volumes of diluent. With a fresh pipette or by mechanical
10 min or, for vegetative organisms, disinfected by boiling
means, the Solution should be mixed thoroughly and one
gently in distilled water for 10 min.
volume of this dilution transferred to another nine volumes of
diluent. These Steps should be repeated as often as required.
Sufficient of each dilution for all the tests to be carried out on
the Sample should be prepared. For dilutions other than ten-
7 Samples
fold, the volume of diluent to volume of Sample should be
adjusted accordingly.
7.1 Sampling
For general guidance on the preparation of ten-fold dilutions,
For guidance on sampling techniques, refer to ISO 5667-2. refer to ISO 6887; this guidance tan also be applied to making
dilutions with a dilution factor other than 10.
The Prime objective is to obtain a Sample which is represen-
tative, as far as possible, of the water to be examined. To
achieve this, certain precautions are necessary which are com-
8 Enumeration after inoculation of test
mon to all sampling procedures for bacteriological exami-
portions of the Sample in (or on) solid media
nation :
a) for re-use, sampling bottles should be able to withstand
8.1 Principle
repeated sterilization without producing or releasing
substances likely to inhibit or promote bacterial growth;
A test Portion of the water Sample is inoculated by mixing with
or spreading on the surface of a specified solid culture medium
sampling bottles should contain an agent to neutralize
b)
so that on incubation, micro-organisms form colonies either on
any residual disinfectant in the water and should be sterile.
or in the medium.
The neutralizing agent should not affect the viability or
growth of the organisms sought. For chlorine, 0,l ml of a
For practical purposes each colony is considered to have
1,8 % (mlm) sterile Solution of sodium thiosulfate
originated from a Single micro-organism or a clump of micro-
(Na2S203.5H20) should be added before sterilization to
organisms present in the Sample at the moment of inoculation.
each bottle for each 100 ml of capacity;
Taking into account the volume of the test Portion and the
number of colonies formed, the result tan therefore be ex-
c) scrupulous care should be taken to avoid accidental
pressed as a number of colony-forming units in a given volume
contamination of the Sample during collection and subse-
of the Sample, e.g. 1 ml or 100 ml.
quent handling;
d) the Sample should be examined as soon as possi ble
8.2 Procedures
after collection, prefera within 6 h;
blY
8.2.1 General
e) every Sample bottle should be clearly identifiable, and
should be accompanied by sufficient information concern-
Three main p #rocedu res may be for the inoculation of solid
ing the nature of the Sample and the reasons for the ex-
media
amination requested.
a) The Sample is mixed with the medium which has
7.2 Preservation and handling
previously been melted and cooled to a temperature close to
that of solidification; after incubation the colonies which
For guidance on preservation and handling of samples, refer to
develop within and on the surface of the medium are
ISO 5667-3.
counted.
In general, samples should be transported to the laboratory for
b) The Sample is spread over the dry surface of an agar
examination as soon as possible. If there is likely to be a delay,
medium and after incubation, colonies which develop on its
the samples should be placed in a cool insulated Container.
surface are counted.
3
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ISO 8199: 1988 (EI
c) The Sample is passed through a membrane filter, which Sample, should be 0,l ml to 0,5 ml. The dilution should be
retains the micro-organisms sought; the membrane is then
Chosen so that the expected number of colonies formed lies
placed on an agar medium or on an absorbent pad im- between about 25 and 300.
pregnated with broth. On incubation, colonies form on the
surface of the membrane. Alternatively, for certain
8.2.4.2 Inoculation
organisms, such as anaerobes, the membrane may be
placed face downwards in a Petri dish and overlaid with
Plates, each containing about 15 ml of culture medium, should
molten agar medium.
be prepared and marked; the surface of the medium should be
dried before use. The test Portion should be pipetted on to the
8.2.2 Choice of technique surface of the medium and spread over the surface with a
sterile glass rod or mechanical device. After absorption of the
The choice of technique depends on several factors including
inoculum, incubation should be carried out in accordance with
the physical and Chemical characteristics of the water (sec
8.2.6.
10.2.2) as well as the nature of the micro-organisms sought
(see 10.2.11, their probable concentration, and the test preci-
8.2.5 Membrane filtration method
sion required. Indications are given in 8.2.3.1, 8.2.4.1, and
8.2.5.1 of the volumes of water samples which tan be used for
8.2.5.1 Test Portion
each method and the limits of detection are discussed in 10.1.3.
In addition the precision of the methods is discussed in 10.1.2.
The maximum volume of the test Portion depends on the
The requirements of regulations may also influence the choice
filterability of the water Sample and on the membranes used.
of technique to be used by indicating, for example, the preci-
This technique is suitable for waters which contain little par-
sion desired or whether the presence or absence of an
ticulate matter in Suspension, for example drinking water. With
organism in a specified test volume will be sufficient.
membranes of mean pore diameter 0,45 Pm, it may be possible
to filter several litres of such water through a Single membrane,
8.2.3 Pour plate method
and so achieve a high level of test sensitivity; for some
organisms, however, filtration through a membrane with a
8.2.3.1 Test Portion
mean pore diameter of 022 pm may be necessary. A test
volume of the Sample or a dilution of it should be Chosen to
The volume of the test Portion of the Sample, or of a dilution of
yield less than about 100 colonies on a membrane of 47 mm or
the Sample, tan vary between 0,l ml and 5 ml depending on the
50 mm in diameter.
size of the Petri dish and the volume of culture medium used.
The dilution should be Chosen so that the expected number of
8.2.5.2 Filtration
colonies formed on plates of diameter 90/100 mm is between
about 25 and 300.
The sterile filtration apparatus should be connected to a Source
of vacuum. A sterile membrane should be placed, grid-side up-
8.2.3.2 Inoculation
wards, on the porous disc of the filter base, only the outer part
of the membrane filter being grasped with flat-ended sterile
The medium required should be melted in boiling water or
forceps. The sterile funnel should be positioned securely on the
steam, placed in a water bath at 45 OC + 1 OC and with sterile
filter base. With the vacuum stopcock turned off, one of the
precautions any additional ingredients necessary added at this
following should be poured or pipetted into the funnel:
Stage.
a) a known volume ilutio n of it, care-
of the Sample, or d
fully mixed;
The Petri dishes required should be prepared and marked, any
dilutions necessary made in accordance with 7.3 and, after
b) the contents of a flask or bottle containing the test por-
thorough mixing, the test portions distributed into the dishes.
tion and sufficient diluent to bring the total volume to at
least 20 ml to 30 ml;
Esch tube of melted medium should be removed in turn from
c) at least 20 ml of diluent, to which the test Portion,
the water bath, the outside of the tube dried and the neck
measured with a pipette, is added directly and mixed with
flamed. The medium should be added to the test portion in
the pipette.
each Petri dish without delay and mixed carefully so as to ob-
tain a uniform distribution of micro-organisms. The plates
The stopcock should be opened and a vacuum of about 70 kPa
should be left to cool on a horizontal surface and then they
applied to filter the water slowly through the membrane. The
should be incubated in accordance with 8.2.6. Generally 15 ml
stopcock should be closed as soon as the Sample has been
of medium is used for a test Portion of 1 ml or 2 ml; for larger
filtered.
test portions, the composition of the medium should be
adjusted accordingly.
8.2.5.3 Transfer of membrane
8.2.4 Spread plate method
The funnel should then be removed and the membrane
transferred with sterile forceps to one of the following, ensur-
8.2.4.1 Test portion
ing that no air bubbles are trapped between the membrane and
the medium :
For a Petr ,i dish of ’ between 90 mm and 100 mm diameter the
volume of the test portion of the Sample, or of a dilution of the
a) an agar medium in a Petri dish;
4
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ISO 8199: 1988 (EI
8.3.1
b) a sterile absorbent pad previously saturated with a Colonies to be counted
liquid medium in a Petri dish. To avoid any confluent
growth, any excess medium should be poured off,
For “total” counts on a non-selective medium, all the colonies
preferably before placing the membrane on the pad;
should be counted. With selective and differential media, only
those colonies which show the characteristic appearance of the
c) a Petri dish, or onto a little agar medium in a Petri dish;
organism sought should be counted. lt is unusual for such
then the membrane should be overlaid with a molten agar
counts to comprise organisms belonging only to one taxonomic
medium (45 OC).
group, but in practice this discrepancy may be accepted and
the results expressed as presumptive. For more precise
For different volumes of the same Sample, the funnel may be
characterization, confirmatory tests are necessary.
re-used without disinfection provided that the smallest volumes
are filtered first. To filter another Sample, either a separate
lt may be impracticable, however, if there are numerous col-
sterile apparatus should be used or for vegetative organisms
onies, to tonfirm the identity of a sufficient number of them to
the funnel disinfected, for example by immersion in boiling
yield a precise result. In such instances, as many colonies as
water for at least 1 min; alternatively, the manufacturer’s in-
possible should be examined from a given area of the plate or
structions for disinfection should be followed. During the filtra-
membrane.
tion of a series of samples the filter base need not be
disinfected unless it is contaminated or a membrane is damag-
ed.
8.4 Calculation of results
The filtration of known polluted samples should not be alter-
Since each colony is assumed to have arisen from one micro-
nated with those of treated water samples through the same
organism or from a Single aggregate of micro-organisms, the
apparatus. First all the samples of chlorinated water and those
result is expressed as the number of colony-forming units in a
expected to give negative results should be filtered, followed by
specified reference volume of the Sample (generally 100 ml or
those known to be polluted. Alternatively, a separate mem-
1 ml) according to the following equation:
brane filtration apparatus tan be reserved for all chlorinated
samples and another for polluted samples.
N
c, =
VS
bq v, F,) + bz2 v2 4) + . . . + (IQ Vi Fi)
8.2.6 Incubation
where
The inoculated plates should be inverted and placed either in an
C, is the number of colony-forming units in the reference
incubator or in a water-tight Container in a water bath. Plates
volume VS of the Sample;
containing membranes on absorbent pads should always be
placed in an air- or water-tight Container to prevent desiccation
N is the sum of all colonies counted in plates or on mem-
of the medium.
branes derived from dilutions Fl, F2, . . . Fi;
The duration and temperature of incubation should be Chosen
nlf ?22 mmm IZi is the number of plates counted for dilution Fl,
after reference to a Standard method as they depend on the
F2 mmm Fi;
micro-organism, or groups of micro-organisms, sought.
v,, v2 . . . is the test volume used with dilution Fl, F2 . . .
Incubation may be carried out in two stages. vi
Fi;
Pre-incubation of variable duration, for example 2 h to 4 h at a
lower temperature, tan be used to permit resuscitation of F,, F2 . . . Fi is the dilution used for the test pot-tion VI, V2
. . . Vi (F = 1 for an undiluted Sample, F = 0,l for a ten-fold
stressed organisms, followed by a longer period of incubation
dilution, etc.) ;
at the usual temperature for the organism sought. The Change
may be effected either by transfer to another incubator or water
VS is the reference volume Chosen to express the concen-
bath, or by using apparatus in which the temperature is
tration of the micro-organisms in the Sample.
automatically changed alter a given period. Ideally, all the
plates should be placed in the incubator or water bath at the
NOTE - The final count thus obtained is the weighted average of the
same time.
counts from each plate.
Alternatively, the membranes may be incubated for a limited
period (e.g. 2 h or 4 h) on a resuscitation medium and then An example of the calculation for the pour or spread plate
transferred to another medium, which is usually selective, for method is as follows:
further incubation.
If the volume applied of the test Solution (Vi) is 1 ml, and the
following counts are obtained at the respective dilutions:
8.3 Enumeration
Dilution Counts
After incubation, the plates or membranes should be examined
10-2 74 and 104 colonies
immediately. If this is not possible, they may be kept at be-
tween 4 OC and 5 OC for short periods provided that this does
10-3 9 and 15 colonies
not affect the appearance of the colonies.
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SIST ISO 8199:1997
ISO 8199: 1988 (EI
lt is assumed that on incubation each tube which received one
then
or more organism(s) in the inoculum will show growth with or
without a characteristic Change produced in the medium. Pro-
74 + 104 + 9 + 15
Cs =
VS
vided some of the tubes give negative results, the most pro-
(2 x 1 x 0,Ol) + (2 x 1 x 0,001)
bable number (MPN) of organisms in a specified volume of the
Sample tan be estimated from the number and distribution of
202
tubes showing a positive reaction.
- VS
= 0,022
A choice should be made from among the various MPN “in-
oculation Systems” (9.3.2) available according to the expected
= 9182 VS
numbers of organisms in the Sample under investigation,
regulatory requirements, the precision needed and any other
and if VS is per ml,
practical considerations. The precision depends on the number
of tubes inoculated with the same volume; it increases as a
then C, = 9,18 x 10Vml
function of the Square root of the number of tubes used, i.e.
the number of tubes has to be quadrupled to double the preci-
lt is desirable to report the results of such colony counts
sion. In practice, with the Systems usually used, this precision
together with the 95 % confidence limits, which may be de-
is always Iow. On the other hand, with these Systems, sensitiv-
rived by application of the following formula :
ity, which depends on the total volume examined, is generally
sufficient for practical purposes.
C+2f2&Ti
where C is the colony count or sum of colony counts.
9.3 Procedure
The choice of the actual MPN enumeration procedure depends
For example if 100 colonies are present on a membrane, then
on similar factors to those mentioned in 8.2.2 and the following
the actual number of the particular organism in 100 ml of the
guidance is given on the procedure most applicable.
water Sample is likely to lie between 82 and 122. However, for
low counts of less than about 20 colonies, this approximate for-
9.3.1 Test Portion
mula becomes inaccurate, as do all others; reference should
then be made to Poisson tables.
Addition of the test Portion should not Change the composition
of the medium such that significant interference occurs to the
growth of the micro-organisms sought. Test Portion volumes
9 Enumeration by inoculation in liquid media
of less than, or equal to, 1 ml are normally added to single-
strength media. Test portions of between 1 ml and 50 ml are
9.1 Principle
normally added to equal volumes of double-strength media,
provided that the Sample does not contain excess inorganic
Test portions of the water Sample are inoculated into liquid
salts, or toxic substances which could affect bacterial growth.
medium designed to ensure the growth of a particular micro-
For volumes greater than 50 ml, more concentrated media tan
organism or group of micro-organisms. As growth occurs
be used. For special purposes, sterile dehydrated media tan be
throughout a liquid medium, the most probable number of the
dissolved in the cold (or at 30 “C) in the Sample to be analysed.
micro-organisms present in the original Sample tan be
This method is similar in principle to that described in clause 8
estimated only by the statistical procedures described below. In
and has similar disadvantages in the presence of high concen-
practice the results obtained are always imprecise and the
trations of inorganic salts or toxic substances.
precision tan be improved only by increasing the number of
samples or test portions of the Sample examined.
The disadvantages of the presence of high concentrations of
minerals or toxic substances tan be overcome by separating
9.2 Applications the micro-organisms from the water Sample. This may be car-
ried out by membrane filtration as described in 8.2.5 or, if the
water is turbid, by addition to the Sample of a filter-aid such as
9.2.1 Test for presence or absence of a micro-organism
diatomaceous earth or a Suspension of aluminium Oxide. These
filter aids settle out, carrying micro-organisms with them;
After inoculation and incubation of a Single test portion of the
Separation is then completed by centrifu
...
ISO
NORME INTERNATIONALE
8199
Première édition
1988-06-H
I
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXflYHAPOJJHAR OPf-AHM3A~Mfl fl0 CTAHflAPTM3A~MM
Qualité de l’eau - Guide général pour le
dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture
Water quality - General guide to the enumeration of micro-organisms b y culture
Numéro de référence
ISO 8199: 1988 (F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de I’ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO col-
labore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 8199 a été élaborée par le comité tech nique ISO/TC 147,
Qualité de l’eau.
L’annexe A est donnée uniquement à titre d’information.
0 Organisation internationale de normalisation, 1988
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
Introduction
Les techniques d’isolement et de dénombrement des micro-organismes, basées sur
leur capacité à croître sur des milieux de culture spécifiés, sont un moyen important et
largement utilisé pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau. Le but du présent
guide est de réunir en un seul document les informations communes aux diverses tech-
niques de dénombrement pour éviter la répétition des détails techniques dans chaque
norme et pour faciliter le choix de la technique la plus appropriée à un problème donné.
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
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ISO 8199 : 1988 (FI
NORME INTERNATIONALE
- Guide général pour le
Qualité de l’eau
dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture
gements d’apparence dans un milieu liquide. Le choix de telle
1 Domaine d’application
ou telle méthode ne dépend pas seulement de la nature des
micro-organismes recherchés, mais également de la nature de
La présente Norme internationale présente des directives con-
l’eau et des raisons à l’origine de l’examen.
cernant des manipulations communes à chaque technique
d’examen microbiologique de l’eau, en particulier la préparation
des échantillons, les milieux de culture et l’appareillage. Elle
décrit également les diverses méthodes de dénombrement pos-
4 S&urit6 et hygiene en laboratoire
sibles et les critères de choix d’une technique particuliére.
Outre les directives générales et légales concernant la sécurité
en laboratoire, une attention particulière ainsi qu’une hygiéne
personnelle tres stricte sont requises pendant les travaux de
2 Références normatives
microbiologie, en raison des risques toujours existants de con-
tact avec des micro-organismes pathogènes. De plus, des
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par
milieux qui ne sont pas nécessairement conçus pour les agents
suite de la référence qui en est faite, constituent des disposi-
pathogènes peuvent néanmoins favoriser leur croissance, de
tions valables pour la présente Norme internationale. Au
sorte que la manipulation et l’élimination de toutes les cultures
moment de la publication de cette norme, les éditions indiquées
requierent la plus grande attention. Une technique scrupuleuse
etaient en vigueur. Toute norme est sujette à revision et les par-
est la base de méthodes microbiologiques sûres et il est impor-
ties prenantes des accords fondes sur cette Norme internatio-
tant que toute personne concernée par les travaux de microbio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les édi-
logie reçoive une formation appropriée. II est également impor-
tions les plus récentes des normes indiquées ci-aprés. Les
tant que les installations et le matériel de laboratoire nécessaires
membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des normes
soient conformes aux règles de securite et aux bonnes prati-
internationales en vigueur à un moment donné.
ques de laboratoire.
ISO 3534: 1977, Statistique - Vocabulaire et symboles. Certaines précautions sont essentielles en laboratoire, non seu-
lement pour eviter la contamination des échantillons et des
milieux de culture, mais également pour eviter les risques
ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire à usage analytique -
d’infection du personnel de laboratoire notamment
Spécifïcations et methodes d’essai.
-
observer scrupuleusement les précautions d’hygiène
ISO 5667-2 : 1902, Oualite de l’eau - Échantillonnage -
personnelle, couper court les ongles et porter des protec-
Partie 2: Guide genéral sur les techniques d’échantillonnage.
tions pour les cheveux et la barbe, si nécessaire;
ISO 5667-3 : 1905, Qualite de l’eau - Échantillonnage -
-
se laver les mains à l’eau chaude et au savon avant et
Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation
après les travaux microbiologiques, ainsi qu’après chaque
des echan tillons.
passage aux toilettes;
ISO 6887 : 1983, Microbiologie - Directives genérales pour la
- porter des vêtements de protection au laboratoire;
préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
-
stériliser toutes les cultures à l’autoclave et stériliser et
désinfecter les appareils et matériels entrés en contact avec
elles avant de les jeter ou de les réutiliser;
3 Principe
-
ne pas manger, boire ou fumer dans le laboratoire;
Le principe général de ces techniques consiste a ensemencer
-
une quantité connue d’échantillon d’eau sur un milieu de cul-
signaler tout accident, liquide répandu ou événement
ture (solide ou liquide). On suppose que pendant l’incubation inhabituel, à un responsable;
chaque micro-organisme présent se multiplie pour donner soit
une colonie visible directement sur milieu solide, soit des chan-
- dans le doute, demander conseil.
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60 8199: 1988 (FI
5 Diluants et milieux de culture ou une solution d’acide chlorhydrique [c(HCI) = 1 mol/ll, de
sorte qu’aprés stérilisation il soit de 7,0 + 0,l. Compléter avec
de l’eau à 1 000 ml, répartir et stériliser.
5.1 GRnéralith
5.2.3 Solution de Ringer - quart de concentration
Les composants entrant dans la préparation des milieux de cul-
Composition
ture doivent être de même qualite et les produits chimiques de
qualité analytique reconnue. II est également possible d’utiliser
Chlorure de sodium
2,25 g
des milieux complets déshydratés. Les instructions du fabricant
Chlorure de potassium 0,105 g
doivent être suivies scrupuleusement.
Chlorure de calcium (anhydre)
0,12 g
L’eau utilisée doit être de l’eau distillee sur verre ou déminérali-
Carbonate de sodium
0,05 g
sée et exempte de substances susceptibles d’inhiber la crois-
Eau, quantité suffisante pour 1 OOOml
sance de micro-organismes dans les conditions de l’essai. Elle
doit être conforme aux spécifications de I’ISO 3696, degré 3.
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau et compléter à 1 000 ml.
5.1 .l Stérilisation
Solution tampon de phosphate
Les diluants et les milieux de culture doivent être répartis dans
Composition
des récipients supportant la stérilisation en autoclave. Dans la
plupart des cas, une température de 121 OC + 1 OC durant
Dihydrogénoorthophosphate de potassium ( KH2P04) 42,5 mg
15 min est appropriée. Toutefois, une durée et une température
Chlorure de magnésium (MgCl2) (voir note) 190 mg
différentes peuvent parfois s”avérer nécessaires et les détails
seront alors donnés dans chaque norme.
Eau 1 OOOml
La stérilisation par filtration est également possible pour les Préparation
substances thermolabiles.
a) Solution de phosphate
Dissoudre 34 g de phosphate dans 500 ml d’eau distillée.
5.2 Diluants
Ajuster le pH à 7,2 If: 0,5 avec une solution d’hydroxyde de
sodium à 1 mol/1 et compléter avec de l’eau distillée à
Un des diluants suivants devrait être utilisé.
1000 ml.
NOTE - Alternativement, une quantité équivalente de sulfate de
5.2.1 Eau peptonbe
magnésium (MgS04.7H20) peut être utilisée.
Composition
b) Solution de chlorure de magnésium
Peptone
l,Og Dissoudre 38 g de chlorure de magnésium dans 1 000 ml
d’eau distillée.
Eau, quantité suffisante pour 1 OOOml
Solution finale
Préparation
Pour l’utilisation, ajouter 1,25 ml de solution de phosphate a) et
5,0 ml de solution de chlorure de magnésium b) à 1 000 ml.
Répartir en quantités suffisantes et stériliser en autoclave à
121 OC + 1 OC durant 15 min.
[C(H~I) = 1 mol/ll, de sorte qu’après stérilisation le pH soit de
5.2.5 Eau distillée
7,0 - + 0,l. Compléter avec de l’eau à 1 000 ml, répartir et sté-
. . .
rlliser.
Répartir et stériliser l’eau distillée d’une qualité appropriée
(voir 5.1).
5.2.2 Solution peptonbe saline
5.3 Milieux de culture
Composition
En général, aprés stérilisation en récipients hermétiques, les
Peptone
LOg milieux de culture peuvent être conservés dans des conditions
satisfaisantes pendant plusieurs mois à température ambiante,
Chlorure de sodium
3,5 g à condition d’être tenus à I’obscurite et maintenus hermétique-
ment fermés. Les milieux répartis sterilement peuvent être con-
Eau, quantité suffisante pour 1 OOOml
serves entre 4 OC et 10 OC pendant 1 mois maximum; avant
l’utilisation, ils doivent être examinés avec soin afin de détecter
Préparation
toute contamination, évaporation excessive ou tout autre signe
de détérioration. La plupart des réactifs se conservent mieux à
Dissoudre les composants dans l’eau et ajuster le pH en ajou-
4 OC. Les milieux de culture fournis préconditionnés doivent
tant une solution d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/11
être utilisés selon les instructions du fabricant.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
7.3 Prbparation de la prise d’essai
6 Stérilisation des appareils et de la verrerie
Les appareils et la verrerie qui ne sont pas fournis stériles doi-
Avant l’examen, bien mélanger l’échantillon en agitant vigou-
selon l’une des méthodes suivantes :
vent être stér ilisés
reusement pour obtenir une répartition uniforme des micro-
organismes et, selon la nature de l’eau et la teneur en batteries
a) dans un four, à 160 OC + 2 OC durant 1 h (ou
attendue, faire toutes les dilutions nécessaires a ce stade.
170 OC rt 2 OC durant 40 min);
Pour les dilutions décimales, mesurer 90 ml ou 9 ml de diluant
b) dans un autoclave, à 121 OC + 1 OC durant 20 min
et transvaser dans des flacons ou des tubes de dilution stériles.
minimum.
II est possible également d’utiliser des quantités de diluant préa-
lablement stérilisé dans des flacons à bouchons a vis. Procéder
Lorsque les membranes filtrantes ne sont pas stériles, elles doi-
à une ou plusieurs dilutions decimales en ajoutant un volume
vent être stérilisées, avant utilisation, selon les instructions du
d’eau d’échantillon a neuf volumes de diluant. A l’aide d’une
fabricant, ou en leur absence, en autoclave à 115 OC + 1 OC
autre pipette ou par un moyen mécanique, bien mélanger et
durant 10 min ou désinfectées, pour les organismes végetatifs,
prélever un volume de cette dilution pour l’ajouter a neuf autres
dans de l’eau distillee douce, portée à ébullition durant 10 min.
volumes de diluant. Répéter ces opérations autant de fois qu’il
est nécessaire. Préparer une quantité suffisante de chaque dilu-
tion pour tous les essais à effectuer avec le même echantillon.
7 Échantillons
Pour les dilutions autres que les dilutions décimales, ajuster le
volume de diluant en fonction du volume d’échantillon.
7.1 Échantillonnage
Pour les directives générales concernant la préparation des dilu-
Pour les directives sur les techniques d’échantillonnage, se
tions décimales, se reporter à I’ISO 6887; ces directives peu-
reporter à I’ISO 5667-2.
vent également s’appliquer a la préparation de dilutions avec un
facteur autre que le facteur 10.
Le premier objectif est d’obtenir un échantillon aussi représen-
tatif que possible de l’eau a examiner. Dans ce but, certaines
précautions communes à toutes les méthodes d’échantillon-
8 Dénombrement après ensemencement des
nage pour les examens microbiologiques sont nécessaires :
prises d’essai de l’échantillon sur (ou dans) un
milieu solide
a) pour être réutilisables, les flacons d’échantillonnage
doivent pouvoir resister à des sterilisations répétées sans
produire ni dégager de substances susceptibles d’inhiber ou
8.1 Principe
de favoriser la croissance bactérienne;
Une prise d’essai de l’échantillon d’eau est mélangée ou étalée
b) les flacons d’échantillonnage doivent contenir un agent
à la surface d’un milieu de culture solide spécifié de sorte
qui neutralise tout désinfectant restant dans l’eau et doivent
qu’après incubation, des micro-organismes forment des colo-
être stériles. L’agent neutralisant ne doit pas affecter la via-
nies dans ou sur le milieu.
bilité ou la croissance des organismes recherchés. Pour le
chlore, 0,l ml d’une solution stérile de thiosulfate de sodium
Pour des raisons pratiques, on considére que chaque colonie
(Na2Sz03’5HzO) à 1,8 % (mlm) doit, avant stérilisation,
provient d’un seul micro-organisme ou d’un amas de micro-
être ajouté dans chaque bouteille de capacité 100 ml;
organismes présents dans l’échantillon au moment de I’ense-
mencement. En tenant compte du volume de prise d’essai et du
c) il convient d’être très attentif pour éviter toute contami-
nombre de colonies formées, le resultat peut donc être exprimé
nation accidentelle de l’echantillon durant le prélèvement et
comme le nombre d’unités génératrices de colonies dans un
la manipulation ultérieure;
volume donné de l’échantillon, par exemple 1 ml ou 100 ml.
d) l’échantillon doit être examiné dès possible aprés le
prélèvement, de préférence dans les 6 8.2 Méthodes
e) toute bouteille d’échantillonnage doit être clairement
8.2.1 Gén6ralit6s
identifiable et doit être accompagnée d’informations suffi-
santes concernant la nature de l’échantillon et les raisons
Trois méthodes fondamentales peuvent être utilisees pour
pour lesquelles l’examen est demandé.
l’ensemencement sur milieu solide.
72 . Conservation et manipulation
a) L’échantillon est mélangé au milieu qui a été préalable-
ment fondu et refroidi à une température proche de la tem-
Pour les directives concernant la conservation et la manipula-
pérature de solidification; aprés incubation, les colonies qui
tion des échantillons, se reporter à ISO 5667-3.
se développent à la surface et a l’intérieur du milieu sont
dénombrées.
En règle générale, les échantillons doivent être transportes au
laboratoire pour examen dans les meilleurs delais. Dans le cas
b) L’échantillon est étalé à la surface d’un milieu gélosé
où un retard est envisagé, les echantillons devraient être placés
sans trace d’humidité et après incubation, les colonies qui
dans un conteneur frais isole.
se développent a la surface sont dénombrées.
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ISO 8199: 1988 (FI
dilution de l’échantillon, devrait être 0,l ml à 0,5 ml. La dilution
c) L’échantillon passe à travers une membrane qui retient
les micro-organismes recherchés; la membrane est alors devrait être choisie de sorte que le nombre présumé de colonies
formées soit compris entre 25 et 300, environ.
placée sur un milieu gélosé ou sur un tampon absorbant
imprégné de bouillon de culture. Durant l’incubation, des
colonies se forment à la surface de la membrane. Pour cer-
8.2.4.2 Ensemencement
tains organismes, comme les anaérobies, la membrane peut
également être placée, face en-dessous, dans une boîte de
Préparer et marquer des boîtes contenant chacune environ
Petri et recouverte de milieu gélosé fondu.
15 ml de milieu de culture; la surface du milieu doit être séchée
avant utilisation. Transférer à l’aide d’une pipette la prise
d’essai sur la surface du milieu et l’étaler sur toute la surface à
Choix de la technique
8.2.2
l’aide d’une baguette de verre stérile ou de tout autre instru-
Le choix de la technique dépend de plusieurs facteurs, notam- ment. Après absorption de I’inoculum, incuber conformément
ment des caractéristiques physiques et chimiques de l’eau (voir à 8.2.6.
10.2.2), ainsi que de la nature des micro-organismes recherchés
(voir lO.Z.l), de leur concentration probable et de la précision
requise pour l’essai. Les indications concernant les quantités
8.2.5 Méthode par filtration sur membrane
d’échantillon d’eau qui peuvent être utilisées pour chaque
méthode sont données en 8.2.3.1, 8.2.4.1 et 8.2.5.1 et les limi-
8.2.5.1 Prise d’essai
tes de détection sont mentionnées en 10.1.3. De plus, la préci-
sion des méthodes est traitée en 10.1.2. Les spécifications
La quantité maximale de prise d’essai dépend de la filtrabilité de
réglementaires peuvent également influer sur le choix de la
l’échantillon d’eau et des membranes utilisées. Cette technique
technique à utiliser en indiquant, par exemple, la précision sou-
convient aux eaux contenant peu de matières particulaires en
haitée ou si la détermination de la présence ou de l’absence
suspension, par exemple l’eau potable. Avec des membranes
d’un organisme dans une quantité spécifiée pour essai est suffi-
dont les pores ont un diamètre moyen de 0,45 pm, il est possi-
sante.
ble de filtrer plusieurs litres d’eau de ce type à travers une même
membrane et d’obtenir ainsi une très grande sensibilité pour
8.2.3 Méthode par incorporation l’essai; cependant, pour certains organismes, une filtration à
travers une membrane d’un diamètre moyen de pore de
8.2.3.1 Prise d’essai 022 pm peut être nécessaire. Choisir une quantité pour un
essai d’échantillon, ou d’une dilution de celui-ci de facon à
La quantité de prise d’essai de l’échantillon, ou d’une dilution
obtenir moins de 100 colonies sur une membrane de 47 mm ou
de l’échantillon, peut varier entre 0,l ml et 5 ml, selon la dimen-
50 mm de diamètre.
sion de la boîte de Petri et la quantité de milieu de culture utili-
sée. La dilution doit être choisie de sorte que le nombre pré-
8.2.5.2 Filtration
sumé de colonies formées sur les boîtes de 90 à 100 mm de dia-
mètre soit compris entre 25 et 300.
Relier l’appareillage de filtration stérile à une source de vide.
Placer une membrane stérile, côté quadrillé vers le haut, sur le
8.2.3.2 Ensemencement
disque poreux de la base du filtre en ne saisissant que le bord
Faire régénérer le milieu nécessaire à l’eau bouillante ou à la
extérieur de la membrane à l’aide d’une pince à mors plat sté-
vapeur. Le placer dans un bain d’eau à 45 OC + 1 OC et ajouter, rile. Bien placer l’entonnoir stérile sur la base du filtre. L’arrivée
dans des conditions stériles, tous les composants nécessaires à
d’air étant fermée, verser ou transférer à l’aide d’une pipette
ce stade. soit :
Préparer et marquer les boîtes de Petri utiles, effectuer toutes
a) un volume connu d’échantillon, ou d’une dilution de
les dilutions nécessaires conformément à 7.3 et, après avoir
celui-ci, soigneusement mélangé;
vigoureusement mélangé, répartir les prises d’essai dans les
boîtes.
b) le contenu d’un flacon contenant la prise d’essai et une
quantité suffisante de diluant pour obtenir un volume total
Retirer l’un après l’autre du bain d’eau les tubes de milieu
d’au moins 20 ml à 30 ml;
fondu, sécher l’extérieur du tube et flamber le col. Ajouter
immédiatement le milieu à la prise d’essai dans chaque boîte de
c) au moins 20 ml de diluant, auquel on ajoute directement
Petri et mélanger soigneusement afin d’obtenir une répartition
la prise d’essai mesurée et mélangée à l’aide d’une pipette.
homogène des micro-organismes. Laisser refroidir les boîtes
sur une surface horizontale, puis les faire incuber conformé-
Ouvrir le robinet et faire un vide d’environ 70 kPa pour filtrer
ment à 8.2.6. En règle générale, on utilise 15 ml de milieu pour
lentement l’eau à travers la membrane. Refermer le robinet aus-
une prise d’essai de 1 ml ou 2 ml; pour des prises d’essai plus
sitôt que l’échantillon a été filtré.
importantes, la composition du milieu doit être ajustée en con-
séquence.
8.2.5.3 Transfert de la membrane
Méthode par étalement
8.2.4
Retirer l’entonnoir et transférer la membrane à l’aide d’une
pince stérile, en s’assurant qu’il n’y a pas d’air emprisonné entre
8.2.4.1 Prise d’essai
la membrane et le milieu, sur l’un des milieux suivants:
Pour une boîte de Petri de diamètre compris entre 90 mm et
100 mm, la quantité de prise d’essai d’échantillon, ou d’une
a) un milieu gélosé dans une boîte de Petri;
---------------------- Page: 8 ----------------------
b) un tampon absorbant stérile préalablement saturé avec 8.3.1 Comptage des colonies
un milieu liquide dans une boîte de Petri. Pour éviter toute
croissance envahissante, éliminer I’excés de milieu avant ou Pour le comptage ((total)) sur milieu non sélectif, toutes les
aprés le transfert de la membrane sur le coussinet; colonies doivent être comptées. Avec des milieux sélectifs et
différenciés, ne compter que les colonies qui montrent l’aspect
c) une boîte de Petri, ou un peu de milieu gélosé dans une
caractéristique de l’organisme recherché. Lors de ces compta-
boîte de Petri; recouvrir ensuite la membrane de milieu
ges, il est rare de compter des organismes n’appartenant qu’à
gélosé fondu (45 OC).
un seul groupe taxinomique mais, en pratique, cette divergence
peut être acceptée et le résultat exprimé comme résultat pré-
Pour différentes quantités d’un même échantillon, l’entonnoir
sumé. Pour une caractérisation plus précise, des examens de
peut être réutilisé sans être désinfecté dans la mesure où les
confirmation sont nécessaires.
quantités les moins importantes sont filtrées les premières.
Pour filtrer un autre échantillon, utiliser un autre appareillage
Toutefois, si les colonies sont très nombreuses il peut ne pas
stérile, ou désinfecter l’entonnoir pour les organismes végéta-
être possible d’en déterminer un nombre suffisant pour obtenir
tifs, en le plongeant dans l’eau bouillante durant au moins
un résultat précis. Dans ce cas, il faudrait dénombrer le plus
1 min, par exemple. II est possible également de suivre les ins-
grand nombre de colonies possible provenant d’une zone don-
tructions du fabricant concernant la désinfection. Durant la fil-
née de la boîte ou de la membrane.
tration d’une série d’échantillons, il n’est pas nécessaire de
désinfecter la base du filtre, sauf en cas de contamination ou de
détérioration de la membrane.
8.4 Calcul des rhultats
Ne pas alterner la filtration avec le même appareil d’échantillons
reconnus pollués et d’echantillons d’eau traitée. Filtrer tout
Étant donné que chaque colonie est supposée provenir d’un
d’abord tous les échantillons d’eau chlorée et ceux dont on
seul micro-organisme ou d’un seul amas de micro-organismes,
attend un résultat négatif, puis ceux qui sont présumés pollués.
le résultat est exprimé par le nombre d’unités génératrices de
II est possible également de réserver un appareillage de filtration
colonie dans la quantité de référence spécifiée d’échantillon
sur membrane pour tous les echantillons chlorés et un autre
(généralement 100 ml ou 1 ml) selon l’équation suivante :
pour les échantillons pollués.
N
c, =
Vs
8.2.6 Incubation
(n, v, F,) + (n* v* F*I + l m* + (ni ViFil
Retourner les boîtes ensemencées et les placer dans un incuba-
où
teur ou dans un récipient étanche dans un bain d’eau. Les boî-
tes contenant des membranes sur tampons imbibés doivent
C, est le nombre d’unités génératrices de colonie dans
le
être placées dans un récipient étanche à l’air ou à l’eau pour évi-
volume de référence Vs d’échantillon;
ter toute dessiccation du milieu.
N est la somme de toutes les colonies comptées dans les
La durée et la température d’incubation doivent être choisies en
boîtes ou membranes provenan t des dilu
se reportant à une méthode normalisée puisqu’elles dépendent tions FI, F2, . . .
Fi;
du micro-organisme, ou des groupes de micro-organismes
recherchés. nl, n2 . . . ni sont les nombres de boîtes comptées pour les
dilutions FI, F2 . . . Fi;
L’incubation peut être effectuée en deux étapes.
v,, v2 . . . Vi sont les volumes d’essai utilisés pour les dilu-
Une pré-incubation d’une durée variable, 2 à 4 h par exemple, à
tions FI, F2 . . . Fi;
une température moins élevée pour permettre la revivification
des organismes en état de choc, suivie d’une période plus lon-
F,, F2 . . . Fi sont les dilutions utilisées pour les prises
gue d’incubation à la température appropriée à l’organisme
d’essai VI, V’ . . . Vi (F = 1 pour un échantillon non dilué,
recherche. Le changement peut être effectué soit en transfé-
F = 0,l pour une dilution décimale, etc.) ;
rant les cultures dans un autre incubateur ou un autre bain
d’eau, soit en utilisant un appareillage qui règle automatique-
Vs est la quantité de référence choisie pour exprimer
la
ment la température après une période donnée. L’idéal serait
concentration de l’échantillon en micro-organismes.
que toutes les boîtes soient placées dans l’incubateur ou le bain
d’eau en même temps.
NOTE - Le comptage total ainsi obtenu est la moyenne pondérée des
comptages effectués sur chaque boîte.
II est possible également de faire incuber les membranes durant
une période limitée (2 h ou 4 h), par exemple) sur milieu de revi-
Ce qui suit est un exemple de calcul pour les méthodes
Par
vification, puis de les transférer sur un autre milieu, générale-
incorporation ou par étalement
ment sélectif, pour poursuivre l’incubation.
Si le volume de solution d’essai utilisé Vi est 1 ml, et si les
comptages su ivants sont obtenus avec les dilutions respectives
8.3 Dhombrement
Après incubation, les boîtes de Petri ou les membranes doivent Dilution
Dénombrement
être examinées immédiatement. Si ceci n’est pas possible, elles
doivent être conservées entre 4 OC et 5 OC durant de courtes 10-z 74 et 104 colonies
périodes, à condition que ceci ne modifie pas l’apparence des
colonies. 10-3 9 et 15 colonies
5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
74 + 104 + 9 + 15 On suppose que, pendant l’incubation, chaque tube ayant reçu
alors, Cs =
KS
un ou plusieurs organisme(s) avec I’inoculum présentera une
(2 x 1 x 0,Ol) + (2 x 1 x 0,001)
croissance qui va provoquer ou non des modifications caracté-
ristiques dans le milieu. Compte tenu que certains tubes sont
202
négatifs, le nombre le plus probable de micro-organismes dans
- vs
= 0,022
une quantité spécifiée d’echantillon peut être estimé à partir du
nombre et de la répartition des tubes positifs.
= 9182 vs
II convient de choisir entre les différents systémes d’ensemen-
et si Vs est 1 ml, alors
cement NPP (9.3.2) en fonction du nombre présumé d’organis-
cs = 9,18 x IOVml
mes dans l’échantillon étudié, des spécifications réglementai-
res, de la précision requise et de toute autre considération prati-
II est souhaitable de rendre compte des résultats d’un tel comp-
que. La précision dépend du nombre de tubes ensemencés:
tage avec des limites de confiance de 95 %, qui peuvent être
elle croît comme une fonction de la racine carrée du nombre de
obtenues en appliquant la formule suivante:
tubes utilisés; par exemple, le nombre de tubes doit être qua-
druplé pour doubler la précision. En pratique, avec les systémes
utilisés habituellement, la précision est toujours faible. D’autre
où C est le nombre de colonies comptées ou la somme des part, avec ces systèmes, la sensibilité qui dépend de la quantité
colonies comptées. totale examinée est, en pratique, généralement suffisante.
Par exemple, si l’on dénombre 100 colonies sur une membrane,
9.3 Mode opératoire
le nombre réel d’organismes donné dans 100 ml d’échantillon
d’eau est vraisemblablement compris entre 82 et 122. Toute-
Le choix de la méthode NPP dépend de facteurs similaires à
fois, pour les nombres plus faibles, inférieurs à 20 colonies envi-
ceux mentionnes en 8.2.2 et les indications suivantes concer-
ron, cette formule par approximation devient inexacte, comme
nent la méthode applicable à la plupart des cas.
toutes les autres; il convient alors de se reporter aux tables de
Poisson.
9.3.1 Prise d’essai
9 Dénombrement
Le fait d’ajouter la prise d’essai ne doit pas modifier la composi-
tion du milieu au point de perturber de façon notable la crois-
9.1 Principe sance des micro-organismes recherchés. Des quantités de prise
d’essai inférieures ou égales à 1 ml sont normalement ajoutées
Les prises d’essai de I’echantillon d’eau sont incorporées dans
à des milieux simple concentration. Des prises d’essai compri-
un milieu liquide conçu pour permettre la croissance d’un
ses entre 1 ml et 50 ml sont normalement ajoutées a des volu-
micro-organisme particulier ou d’un groupe de micro-
mes égaux de milieu double concentration, à condition que
organismes. Si la croissance se produit dans un milieu liquide,
l’échantillon ne contienne pas de sels organiques en excès ou
...
ISO
NORME INTERNATIONALE
8199
Première édition
1988-06-H
I
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXflYHAPOJJHAR OPf-AHM3A~Mfl fl0 CTAHflAPTM3A~MM
Qualité de l’eau - Guide général pour le
dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture
Water quality - General guide to the enumeration of micro-organisms b y culture
Numéro de référence
ISO 8199: 1988 (F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de I’ISO.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO col-
labore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 8199 a été élaborée par le comité tech nique ISO/TC 147,
Qualité de l’eau.
L’annexe A est donnée uniquement à titre d’information.
0 Organisation internationale de normalisation, 1988
Imprimé en Suisse
---------------------- Page: 2 ----------------------
Introduction
Les techniques d’isolement et de dénombrement des micro-organismes, basées sur
leur capacité à croître sur des milieux de culture spécifiés, sont un moyen important et
largement utilisé pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau. Le but du présent
guide est de réunir en un seul document les informations communes aux diverses tech-
niques de dénombrement pour éviter la répétition des détails techniques dans chaque
norme et pour faciliter le choix de la technique la plus appropriée à un problème donné.
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 8199 : 1988 (FI
NORME INTERNATIONALE
- Guide général pour le
Qualité de l’eau
dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture
gements d’apparence dans un milieu liquide. Le choix de telle
1 Domaine d’application
ou telle méthode ne dépend pas seulement de la nature des
micro-organismes recherchés, mais également de la nature de
La présente Norme internationale présente des directives con-
l’eau et des raisons à l’origine de l’examen.
cernant des manipulations communes à chaque technique
d’examen microbiologique de l’eau, en particulier la préparation
des échantillons, les milieux de culture et l’appareillage. Elle
décrit également les diverses méthodes de dénombrement pos-
4 S&urit6 et hygiene en laboratoire
sibles et les critères de choix d’une technique particuliére.
Outre les directives générales et légales concernant la sécurité
en laboratoire, une attention particulière ainsi qu’une hygiéne
personnelle tres stricte sont requises pendant les travaux de
2 Références normatives
microbiologie, en raison des risques toujours existants de con-
tact avec des micro-organismes pathogènes. De plus, des
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par
milieux qui ne sont pas nécessairement conçus pour les agents
suite de la référence qui en est faite, constituent des disposi-
pathogènes peuvent néanmoins favoriser leur croissance, de
tions valables pour la présente Norme internationale. Au
sorte que la manipulation et l’élimination de toutes les cultures
moment de la publication de cette norme, les éditions indiquées
requierent la plus grande attention. Une technique scrupuleuse
etaient en vigueur. Toute norme est sujette à revision et les par-
est la base de méthodes microbiologiques sûres et il est impor-
ties prenantes des accords fondes sur cette Norme internatio-
tant que toute personne concernée par les travaux de microbio-
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les édi-
logie reçoive une formation appropriée. II est également impor-
tions les plus récentes des normes indiquées ci-aprés. Les
tant que les installations et le matériel de laboratoire nécessaires
membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des normes
soient conformes aux règles de securite et aux bonnes prati-
internationales en vigueur à un moment donné.
ques de laboratoire.
ISO 3534: 1977, Statistique - Vocabulaire et symboles. Certaines précautions sont essentielles en laboratoire, non seu-
lement pour eviter la contamination des échantillons et des
milieux de culture, mais également pour eviter les risques
ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire à usage analytique -
d’infection du personnel de laboratoire notamment
Spécifïcations et methodes d’essai.
-
observer scrupuleusement les précautions d’hygiène
ISO 5667-2 : 1902, Oualite de l’eau - Échantillonnage -
personnelle, couper court les ongles et porter des protec-
Partie 2: Guide genéral sur les techniques d’échantillonnage.
tions pour les cheveux et la barbe, si nécessaire;
ISO 5667-3 : 1905, Qualite de l’eau - Échantillonnage -
-
se laver les mains à l’eau chaude et au savon avant et
Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation
après les travaux microbiologiques, ainsi qu’après chaque
des echan tillons.
passage aux toilettes;
ISO 6887 : 1983, Microbiologie - Directives genérales pour la
- porter des vêtements de protection au laboratoire;
préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
-
stériliser toutes les cultures à l’autoclave et stériliser et
désinfecter les appareils et matériels entrés en contact avec
elles avant de les jeter ou de les réutiliser;
3 Principe
-
ne pas manger, boire ou fumer dans le laboratoire;
Le principe général de ces techniques consiste a ensemencer
-
une quantité connue d’échantillon d’eau sur un milieu de cul-
signaler tout accident, liquide répandu ou événement
ture (solide ou liquide). On suppose que pendant l’incubation inhabituel, à un responsable;
chaque micro-organisme présent se multiplie pour donner soit
une colonie visible directement sur milieu solide, soit des chan-
- dans le doute, demander conseil.
---------------------- Page: 5 ----------------------
60 8199: 1988 (FI
5 Diluants et milieux de culture ou une solution d’acide chlorhydrique [c(HCI) = 1 mol/ll, de
sorte qu’aprés stérilisation il soit de 7,0 + 0,l. Compléter avec
de l’eau à 1 000 ml, répartir et stériliser.
5.1 GRnéralith
5.2.3 Solution de Ringer - quart de concentration
Les composants entrant dans la préparation des milieux de cul-
Composition
ture doivent être de même qualite et les produits chimiques de
qualité analytique reconnue. II est également possible d’utiliser
Chlorure de sodium
2,25 g
des milieux complets déshydratés. Les instructions du fabricant
Chlorure de potassium 0,105 g
doivent être suivies scrupuleusement.
Chlorure de calcium (anhydre)
0,12 g
L’eau utilisée doit être de l’eau distillee sur verre ou déminérali-
Carbonate de sodium
0,05 g
sée et exempte de substances susceptibles d’inhiber la crois-
Eau, quantité suffisante pour 1 OOOml
sance de micro-organismes dans les conditions de l’essai. Elle
doit être conforme aux spécifications de I’ISO 3696, degré 3.
Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau et compléter à 1 000 ml.
5.1 .l Stérilisation
Solution tampon de phosphate
Les diluants et les milieux de culture doivent être répartis dans
Composition
des récipients supportant la stérilisation en autoclave. Dans la
plupart des cas, une température de 121 OC + 1 OC durant
Dihydrogénoorthophosphate de potassium ( KH2P04) 42,5 mg
15 min est appropriée. Toutefois, une durée et une température
Chlorure de magnésium (MgCl2) (voir note) 190 mg
différentes peuvent parfois s”avérer nécessaires et les détails
seront alors donnés dans chaque norme.
Eau 1 OOOml
La stérilisation par filtration est également possible pour les Préparation
substances thermolabiles.
a) Solution de phosphate
Dissoudre 34 g de phosphate dans 500 ml d’eau distillée.
5.2 Diluants
Ajuster le pH à 7,2 If: 0,5 avec une solution d’hydroxyde de
sodium à 1 mol/1 et compléter avec de l’eau distillée à
Un des diluants suivants devrait être utilisé.
1000 ml.
NOTE - Alternativement, une quantité équivalente de sulfate de
5.2.1 Eau peptonbe
magnésium (MgS04.7H20) peut être utilisée.
Composition
b) Solution de chlorure de magnésium
Peptone
l,Og Dissoudre 38 g de chlorure de magnésium dans 1 000 ml
d’eau distillée.
Eau, quantité suffisante pour 1 OOOml
Solution finale
Préparation
Pour l’utilisation, ajouter 1,25 ml de solution de phosphate a) et
5,0 ml de solution de chlorure de magnésium b) à 1 000 ml.
Répartir en quantités suffisantes et stériliser en autoclave à
121 OC + 1 OC durant 15 min.
[C(H~I) = 1 mol/ll, de sorte qu’après stérilisation le pH soit de
5.2.5 Eau distillée
7,0 - + 0,l. Compléter avec de l’eau à 1 000 ml, répartir et sté-
. . .
rlliser.
Répartir et stériliser l’eau distillée d’une qualité appropriée
(voir 5.1).
5.2.2 Solution peptonbe saline
5.3 Milieux de culture
Composition
En général, aprés stérilisation en récipients hermétiques, les
Peptone
LOg milieux de culture peuvent être conservés dans des conditions
satisfaisantes pendant plusieurs mois à température ambiante,
Chlorure de sodium
3,5 g à condition d’être tenus à I’obscurite et maintenus hermétique-
ment fermés. Les milieux répartis sterilement peuvent être con-
Eau, quantité suffisante pour 1 OOOml
serves entre 4 OC et 10 OC pendant 1 mois maximum; avant
l’utilisation, ils doivent être examinés avec soin afin de détecter
Préparation
toute contamination, évaporation excessive ou tout autre signe
de détérioration. La plupart des réactifs se conservent mieux à
Dissoudre les composants dans l’eau et ajuster le pH en ajou-
4 OC. Les milieux de culture fournis préconditionnés doivent
tant une solution d’hydroxyde de sodium [c(NaOH) = 1 mol/11
être utilisés selon les instructions du fabricant.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
7.3 Prbparation de la prise d’essai
6 Stérilisation des appareils et de la verrerie
Les appareils et la verrerie qui ne sont pas fournis stériles doi-
Avant l’examen, bien mélanger l’échantillon en agitant vigou-
selon l’une des méthodes suivantes :
vent être stér ilisés
reusement pour obtenir une répartition uniforme des micro-
organismes et, selon la nature de l’eau et la teneur en batteries
a) dans un four, à 160 OC + 2 OC durant 1 h (ou
attendue, faire toutes les dilutions nécessaires a ce stade.
170 OC rt 2 OC durant 40 min);
Pour les dilutions décimales, mesurer 90 ml ou 9 ml de diluant
b) dans un autoclave, à 121 OC + 1 OC durant 20 min
et transvaser dans des flacons ou des tubes de dilution stériles.
minimum.
II est possible également d’utiliser des quantités de diluant préa-
lablement stérilisé dans des flacons à bouchons a vis. Procéder
Lorsque les membranes filtrantes ne sont pas stériles, elles doi-
à une ou plusieurs dilutions decimales en ajoutant un volume
vent être stérilisées, avant utilisation, selon les instructions du
d’eau d’échantillon a neuf volumes de diluant. A l’aide d’une
fabricant, ou en leur absence, en autoclave à 115 OC + 1 OC
autre pipette ou par un moyen mécanique, bien mélanger et
durant 10 min ou désinfectées, pour les organismes végetatifs,
prélever un volume de cette dilution pour l’ajouter a neuf autres
dans de l’eau distillee douce, portée à ébullition durant 10 min.
volumes de diluant. Répéter ces opérations autant de fois qu’il
est nécessaire. Préparer une quantité suffisante de chaque dilu-
tion pour tous les essais à effectuer avec le même echantillon.
7 Échantillons
Pour les dilutions autres que les dilutions décimales, ajuster le
volume de diluant en fonction du volume d’échantillon.
7.1 Échantillonnage
Pour les directives générales concernant la préparation des dilu-
Pour les directives sur les techniques d’échantillonnage, se
tions décimales, se reporter à I’ISO 6887; ces directives peu-
reporter à I’ISO 5667-2.
vent également s’appliquer a la préparation de dilutions avec un
facteur autre que le facteur 10.
Le premier objectif est d’obtenir un échantillon aussi représen-
tatif que possible de l’eau a examiner. Dans ce but, certaines
précautions communes à toutes les méthodes d’échantillon-
8 Dénombrement après ensemencement des
nage pour les examens microbiologiques sont nécessaires :
prises d’essai de l’échantillon sur (ou dans) un
milieu solide
a) pour être réutilisables, les flacons d’échantillonnage
doivent pouvoir resister à des sterilisations répétées sans
produire ni dégager de substances susceptibles d’inhiber ou
8.1 Principe
de favoriser la croissance bactérienne;
Une prise d’essai de l’échantillon d’eau est mélangée ou étalée
b) les flacons d’échantillonnage doivent contenir un agent
à la surface d’un milieu de culture solide spécifié de sorte
qui neutralise tout désinfectant restant dans l’eau et doivent
qu’après incubation, des micro-organismes forment des colo-
être stériles. L’agent neutralisant ne doit pas affecter la via-
nies dans ou sur le milieu.
bilité ou la croissance des organismes recherchés. Pour le
chlore, 0,l ml d’une solution stérile de thiosulfate de sodium
Pour des raisons pratiques, on considére que chaque colonie
(Na2Sz03’5HzO) à 1,8 % (mlm) doit, avant stérilisation,
provient d’un seul micro-organisme ou d’un amas de micro-
être ajouté dans chaque bouteille de capacité 100 ml;
organismes présents dans l’échantillon au moment de I’ense-
mencement. En tenant compte du volume de prise d’essai et du
c) il convient d’être très attentif pour éviter toute contami-
nombre de colonies formées, le resultat peut donc être exprimé
nation accidentelle de l’echantillon durant le prélèvement et
comme le nombre d’unités génératrices de colonies dans un
la manipulation ultérieure;
volume donné de l’échantillon, par exemple 1 ml ou 100 ml.
d) l’échantillon doit être examiné dès possible aprés le
prélèvement, de préférence dans les 6 8.2 Méthodes
e) toute bouteille d’échantillonnage doit être clairement
8.2.1 Gén6ralit6s
identifiable et doit être accompagnée d’informations suffi-
santes concernant la nature de l’échantillon et les raisons
Trois méthodes fondamentales peuvent être utilisees pour
pour lesquelles l’examen est demandé.
l’ensemencement sur milieu solide.
72 . Conservation et manipulation
a) L’échantillon est mélangé au milieu qui a été préalable-
ment fondu et refroidi à une température proche de la tem-
Pour les directives concernant la conservation et la manipula-
pérature de solidification; aprés incubation, les colonies qui
tion des échantillons, se reporter à ISO 5667-3.
se développent à la surface et a l’intérieur du milieu sont
dénombrées.
En règle générale, les échantillons doivent être transportes au
laboratoire pour examen dans les meilleurs delais. Dans le cas
b) L’échantillon est étalé à la surface d’un milieu gélosé
où un retard est envisagé, les echantillons devraient être placés
sans trace d’humidité et après incubation, les colonies qui
dans un conteneur frais isole.
se développent a la surface sont dénombrées.
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
dilution de l’échantillon, devrait être 0,l ml à 0,5 ml. La dilution
c) L’échantillon passe à travers une membrane qui retient
les micro-organismes recherchés; la membrane est alors devrait être choisie de sorte que le nombre présumé de colonies
formées soit compris entre 25 et 300, environ.
placée sur un milieu gélosé ou sur un tampon absorbant
imprégné de bouillon de culture. Durant l’incubation, des
colonies se forment à la surface de la membrane. Pour cer-
8.2.4.2 Ensemencement
tains organismes, comme les anaérobies, la membrane peut
également être placée, face en-dessous, dans une boîte de
Préparer et marquer des boîtes contenant chacune environ
Petri et recouverte de milieu gélosé fondu.
15 ml de milieu de culture; la surface du milieu doit être séchée
avant utilisation. Transférer à l’aide d’une pipette la prise
d’essai sur la surface du milieu et l’étaler sur toute la surface à
Choix de la technique
8.2.2
l’aide d’une baguette de verre stérile ou de tout autre instru-
Le choix de la technique dépend de plusieurs facteurs, notam- ment. Après absorption de I’inoculum, incuber conformément
ment des caractéristiques physiques et chimiques de l’eau (voir à 8.2.6.
10.2.2), ainsi que de la nature des micro-organismes recherchés
(voir lO.Z.l), de leur concentration probable et de la précision
requise pour l’essai. Les indications concernant les quantités
8.2.5 Méthode par filtration sur membrane
d’échantillon d’eau qui peuvent être utilisées pour chaque
méthode sont données en 8.2.3.1, 8.2.4.1 et 8.2.5.1 et les limi-
8.2.5.1 Prise d’essai
tes de détection sont mentionnées en 10.1.3. De plus, la préci-
sion des méthodes est traitée en 10.1.2. Les spécifications
La quantité maximale de prise d’essai dépend de la filtrabilité de
réglementaires peuvent également influer sur le choix de la
l’échantillon d’eau et des membranes utilisées. Cette technique
technique à utiliser en indiquant, par exemple, la précision sou-
convient aux eaux contenant peu de matières particulaires en
haitée ou si la détermination de la présence ou de l’absence
suspension, par exemple l’eau potable. Avec des membranes
d’un organisme dans une quantité spécifiée pour essai est suffi-
dont les pores ont un diamètre moyen de 0,45 pm, il est possi-
sante.
ble de filtrer plusieurs litres d’eau de ce type à travers une même
membrane et d’obtenir ainsi une très grande sensibilité pour
8.2.3 Méthode par incorporation l’essai; cependant, pour certains organismes, une filtration à
travers une membrane d’un diamètre moyen de pore de
8.2.3.1 Prise d’essai 022 pm peut être nécessaire. Choisir une quantité pour un
essai d’échantillon, ou d’une dilution de celui-ci de facon à
La quantité de prise d’essai de l’échantillon, ou d’une dilution
obtenir moins de 100 colonies sur une membrane de 47 mm ou
de l’échantillon, peut varier entre 0,l ml et 5 ml, selon la dimen-
50 mm de diamètre.
sion de la boîte de Petri et la quantité de milieu de culture utili-
sée. La dilution doit être choisie de sorte que le nombre pré-
8.2.5.2 Filtration
sumé de colonies formées sur les boîtes de 90 à 100 mm de dia-
mètre soit compris entre 25 et 300.
Relier l’appareillage de filtration stérile à une source de vide.
Placer une membrane stérile, côté quadrillé vers le haut, sur le
8.2.3.2 Ensemencement
disque poreux de la base du filtre en ne saisissant que le bord
Faire régénérer le milieu nécessaire à l’eau bouillante ou à la
extérieur de la membrane à l’aide d’une pince à mors plat sté-
vapeur. Le placer dans un bain d’eau à 45 OC + 1 OC et ajouter, rile. Bien placer l’entonnoir stérile sur la base du filtre. L’arrivée
dans des conditions stériles, tous les composants nécessaires à
d’air étant fermée, verser ou transférer à l’aide d’une pipette
ce stade. soit :
Préparer et marquer les boîtes de Petri utiles, effectuer toutes
a) un volume connu d’échantillon, ou d’une dilution de
les dilutions nécessaires conformément à 7.3 et, après avoir
celui-ci, soigneusement mélangé;
vigoureusement mélangé, répartir les prises d’essai dans les
boîtes.
b) le contenu d’un flacon contenant la prise d’essai et une
quantité suffisante de diluant pour obtenir un volume total
Retirer l’un après l’autre du bain d’eau les tubes de milieu
d’au moins 20 ml à 30 ml;
fondu, sécher l’extérieur du tube et flamber le col. Ajouter
immédiatement le milieu à la prise d’essai dans chaque boîte de
c) au moins 20 ml de diluant, auquel on ajoute directement
Petri et mélanger soigneusement afin d’obtenir une répartition
la prise d’essai mesurée et mélangée à l’aide d’une pipette.
homogène des micro-organismes. Laisser refroidir les boîtes
sur une surface horizontale, puis les faire incuber conformé-
Ouvrir le robinet et faire un vide d’environ 70 kPa pour filtrer
ment à 8.2.6. En règle générale, on utilise 15 ml de milieu pour
lentement l’eau à travers la membrane. Refermer le robinet aus-
une prise d’essai de 1 ml ou 2 ml; pour des prises d’essai plus
sitôt que l’échantillon a été filtré.
importantes, la composition du milieu doit être ajustée en con-
séquence.
8.2.5.3 Transfert de la membrane
Méthode par étalement
8.2.4
Retirer l’entonnoir et transférer la membrane à l’aide d’une
pince stérile, en s’assurant qu’il n’y a pas d’air emprisonné entre
8.2.4.1 Prise d’essai
la membrane et le milieu, sur l’un des milieux suivants:
Pour une boîte de Petri de diamètre compris entre 90 mm et
100 mm, la quantité de prise d’essai d’échantillon, ou d’une
a) un milieu gélosé dans une boîte de Petri;
---------------------- Page: 8 ----------------------
b) un tampon absorbant stérile préalablement saturé avec 8.3.1 Comptage des colonies
un milieu liquide dans une boîte de Petri. Pour éviter toute
croissance envahissante, éliminer I’excés de milieu avant ou Pour le comptage ((total)) sur milieu non sélectif, toutes les
aprés le transfert de la membrane sur le coussinet; colonies doivent être comptées. Avec des milieux sélectifs et
différenciés, ne compter que les colonies qui montrent l’aspect
c) une boîte de Petri, ou un peu de milieu gélosé dans une
caractéristique de l’organisme recherché. Lors de ces compta-
boîte de Petri; recouvrir ensuite la membrane de milieu
ges, il est rare de compter des organismes n’appartenant qu’à
gélosé fondu (45 OC).
un seul groupe taxinomique mais, en pratique, cette divergence
peut être acceptée et le résultat exprimé comme résultat pré-
Pour différentes quantités d’un même échantillon, l’entonnoir
sumé. Pour une caractérisation plus précise, des examens de
peut être réutilisé sans être désinfecté dans la mesure où les
confirmation sont nécessaires.
quantités les moins importantes sont filtrées les premières.
Pour filtrer un autre échantillon, utiliser un autre appareillage
Toutefois, si les colonies sont très nombreuses il peut ne pas
stérile, ou désinfecter l’entonnoir pour les organismes végéta-
être possible d’en déterminer un nombre suffisant pour obtenir
tifs, en le plongeant dans l’eau bouillante durant au moins
un résultat précis. Dans ce cas, il faudrait dénombrer le plus
1 min, par exemple. II est possible également de suivre les ins-
grand nombre de colonies possible provenant d’une zone don-
tructions du fabricant concernant la désinfection. Durant la fil-
née de la boîte ou de la membrane.
tration d’une série d’échantillons, il n’est pas nécessaire de
désinfecter la base du filtre, sauf en cas de contamination ou de
détérioration de la membrane.
8.4 Calcul des rhultats
Ne pas alterner la filtration avec le même appareil d’échantillons
reconnus pollués et d’echantillons d’eau traitée. Filtrer tout
Étant donné que chaque colonie est supposée provenir d’un
d’abord tous les échantillons d’eau chlorée et ceux dont on
seul micro-organisme ou d’un seul amas de micro-organismes,
attend un résultat négatif, puis ceux qui sont présumés pollués.
le résultat est exprimé par le nombre d’unités génératrices de
II est possible également de réserver un appareillage de filtration
colonie dans la quantité de référence spécifiée d’échantillon
sur membrane pour tous les echantillons chlorés et un autre
(généralement 100 ml ou 1 ml) selon l’équation suivante :
pour les échantillons pollués.
N
c, =
Vs
8.2.6 Incubation
(n, v, F,) + (n* v* F*I + l m* + (ni ViFil
Retourner les boîtes ensemencées et les placer dans un incuba-
où
teur ou dans un récipient étanche dans un bain d’eau. Les boî-
tes contenant des membranes sur tampons imbibés doivent
C, est le nombre d’unités génératrices de colonie dans
le
être placées dans un récipient étanche à l’air ou à l’eau pour évi-
volume de référence Vs d’échantillon;
ter toute dessiccation du milieu.
N est la somme de toutes les colonies comptées dans les
La durée et la température d’incubation doivent être choisies en
boîtes ou membranes provenan t des dilu
se reportant à une méthode normalisée puisqu’elles dépendent tions FI, F2, . . .
Fi;
du micro-organisme, ou des groupes de micro-organismes
recherchés. nl, n2 . . . ni sont les nombres de boîtes comptées pour les
dilutions FI, F2 . . . Fi;
L’incubation peut être effectuée en deux étapes.
v,, v2 . . . Vi sont les volumes d’essai utilisés pour les dilu-
Une pré-incubation d’une durée variable, 2 à 4 h par exemple, à
tions FI, F2 . . . Fi;
une température moins élevée pour permettre la revivification
des organismes en état de choc, suivie d’une période plus lon-
F,, F2 . . . Fi sont les dilutions utilisées pour les prises
gue d’incubation à la température appropriée à l’organisme
d’essai VI, V’ . . . Vi (F = 1 pour un échantillon non dilué,
recherche. Le changement peut être effectué soit en transfé-
F = 0,l pour une dilution décimale, etc.) ;
rant les cultures dans un autre incubateur ou un autre bain
d’eau, soit en utilisant un appareillage qui règle automatique-
Vs est la quantité de référence choisie pour exprimer
la
ment la température après une période donnée. L’idéal serait
concentration de l’échantillon en micro-organismes.
que toutes les boîtes soient placées dans l’incubateur ou le bain
d’eau en même temps.
NOTE - Le comptage total ainsi obtenu est la moyenne pondérée des
comptages effectués sur chaque boîte.
II est possible également de faire incuber les membranes durant
une période limitée (2 h ou 4 h), par exemple) sur milieu de revi-
Ce qui suit est un exemple de calcul pour les méthodes
Par
vification, puis de les transférer sur un autre milieu, générale-
incorporation ou par étalement
ment sélectif, pour poursuivre l’incubation.
Si le volume de solution d’essai utilisé Vi est 1 ml, et si les
comptages su ivants sont obtenus avec les dilutions respectives
8.3 Dhombrement
Après incubation, les boîtes de Petri ou les membranes doivent Dilution
Dénombrement
être examinées immédiatement. Si ceci n’est pas possible, elles
doivent être conservées entre 4 OC et 5 OC durant de courtes 10-z 74 et 104 colonies
périodes, à condition que ceci ne modifie pas l’apparence des
colonies. 10-3 9 et 15 colonies
5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 8199: 1988 (FI
74 + 104 + 9 + 15 On suppose que, pendant l’incubation, chaque tube ayant reçu
alors, Cs =
KS
un ou plusieurs organisme(s) avec I’inoculum présentera une
(2 x 1 x 0,Ol) + (2 x 1 x 0,001)
croissance qui va provoquer ou non des modifications caracté-
ristiques dans le milieu. Compte tenu que certains tubes sont
202
négatifs, le nombre le plus probable de micro-organismes dans
- vs
= 0,022
une quantité spécifiée d’echantillon peut être estimé à partir du
nombre et de la répartition des tubes positifs.
= 9182 vs
II convient de choisir entre les différents systémes d’ensemen-
et si Vs est 1 ml, alors
cement NPP (9.3.2) en fonction du nombre présumé d’organis-
cs = 9,18 x IOVml
mes dans l’échantillon étudié, des spécifications réglementai-
res, de la précision requise et de toute autre considération prati-
II est souhaitable de rendre compte des résultats d’un tel comp-
que. La précision dépend du nombre de tubes ensemencés:
tage avec des limites de confiance de 95 %, qui peuvent être
elle croît comme une fonction de la racine carrée du nombre de
obtenues en appliquant la formule suivante:
tubes utilisés; par exemple, le nombre de tubes doit être qua-
druplé pour doubler la précision. En pratique, avec les systémes
utilisés habituellement, la précision est toujours faible. D’autre
où C est le nombre de colonies comptées ou la somme des part, avec ces systèmes, la sensibilité qui dépend de la quantité
colonies comptées. totale examinée est, en pratique, généralement suffisante.
Par exemple, si l’on dénombre 100 colonies sur une membrane,
9.3 Mode opératoire
le nombre réel d’organismes donné dans 100 ml d’échantillon
d’eau est vraisemblablement compris entre 82 et 122. Toute-
Le choix de la méthode NPP dépend de facteurs similaires à
fois, pour les nombres plus faibles, inférieurs à 20 colonies envi-
ceux mentionnes en 8.2.2 et les indications suivantes concer-
ron, cette formule par approximation devient inexacte, comme
nent la méthode applicable à la plupart des cas.
toutes les autres; il convient alors de se reporter aux tables de
Poisson.
9.3.1 Prise d’essai
9 Dénombrement
Le fait d’ajouter la prise d’essai ne doit pas modifier la composi-
tion du milieu au point de perturber de façon notable la crois-
9.1 Principe sance des micro-organismes recherchés. Des quantités de prise
d’essai inférieures ou égales à 1 ml sont normalement ajoutées
Les prises d’essai de I’echantillon d’eau sont incorporées dans
à des milieux simple concentration. Des prises d’essai compri-
un milieu liquide conçu pour permettre la croissance d’un
ses entre 1 ml et 50 ml sont normalement ajoutées a des volu-
micro-organisme particulier ou d’un groupe de micro-
mes égaux de milieu double concentration, à condition que
organismes. Si la croissance se produit dans un milieu liquide,
l’échantillon ne contienne pas de sels organiques en excès ou
...
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