ISO 10273:2003
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
ISO 10273:2003 specifies a horizontal method for the detection of Yersinia enterocolitica presumed to be pathogenic to human subjects. It is applicable to products intended for human consumption and the feeding of animals, and environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de Yersinia enterocolitica présumées pathogènes
L'ISO 10273:2003 spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Yersinia enterocolitica présumées pathogènes chez l'homme. Elle est applicable aux produits pour l'alimentation humaine et animale, ainsi qu'aux échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10273
Second edition
2003-06-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection of presumptive pathogenic
Yersinia enterocolitica
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche de
Yersinia enterocolitica présumées pathogènes
Reference number
ISO 10273:2003(E)
©
ISO 2003
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ISO 10273:2003(E)
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle . 2
4.1 General. 2
4.2 Enrichment in selective liquid media. 2
4.3 Plating out and identification. 2
4.4 Confirmation. 2
5 Reagents and media . 2
6 Apparatus and glassware. 4
7 Sampling . 5
8 Preparation of test sample. 5
9 Procedure (see Annex A). 5
9.1 Test portion and initial suspension . 5
9.2 Enrichment. 6
9.3 Plating out and identification. 6
9.4 Confirmation. 6
10 Test report. 12
Annex A (normative) Diagram of procedure. 13
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents . 14
Annex C (informative) Biochemical characteristics at 30 °C of Yersinia pseudotuberculosis,
Yersinia enterocolitica and biochemically related species . 29
Annex D (informative) Biovars (biotyping) of Yersinia enterocolitica . 30
Bibliography . 31
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ISO 10273:2003(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10273 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 10273:1994), Subclause 9.4 of which has been
technically revised.
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ISO 10273:2003(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt will be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is
hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard
so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for
well-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10273:2003(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection of presumptive pathogenic Yersinia
enterocolitica
WARNING — The use of this standard may involve hazardous materials, operations and equipment. It
is the responsibility of the user of this standard to establish appropriate safety and health practices
and to determine the applicability of regulatory limitations prior the use.
1 Scope
This International Standard specifies a horizontal method for the detection of Yersinia enterocolitica presumed
to be pathogenic to human subjects. This International Standard is applicable to
products intended for human consumption and the feeding of animals, and
environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations,
and Amd.1:2001
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examination
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
psychrotrophic bacteria forming characteristic colonies on solid selective media and having the biochemical
properties meeting the pathogenicity criteria described when the test is carried out in accordance with this
International Standard
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ISO 10273:2003(E)
3.2
detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
determination of the presence or absence of these bacteria in a predetermined quantity of product, when the
test is carried out in accordance with this International Standard
4 Principle
4.1 General
Presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica are detected by the following three successive stages.
4.2 Enrichment in selective liquid media
The test portion is inoculated into two enrichment media
peptone, sorbitol and bile salts (PSB) broth, and
irgasan, ticarcillin and potassium chlorate (ITC) broth.
The ITC broth is incubated at 25 °C for 48 h and the PSB broth for 3 to 5 days.
NOTE Enrichment in ITC broth has been proposed (see reference [1]) for the isolation of Yersinia enterocolitica
biovar 4/serovar O:3 but not for biovar 1B serovar O:8, biovar 2/serovar O:9 (see reference [2]), or biovar 2 serovar
O:5,27. Isolation of Yersinia enterocolitica biovar 2/serovar O:9 needs the use of an ITC medium without chlorate and
which contains 80 % of the original concentration of magnesium chloride and malachite green (see reference [3]).
4.3 Plating out and identification
Using the cultures obtained in 4.2, surface plating of the following two solid selective culture media is carried
out:
agar with cefsulodin, irgasan and novobiocin (CIN) (see reference [7]);
Salmonella/Shigella agar, with sodium desoxycholate and calcium chloride (SSDC).
The media are incubated at 30 °C, then examined after 24 h and, if necessary, after 48 h depending on the
medium, to check if any characteristic colonies of Yersinia enterocolitica are present.
4.4 Confirmation
On plated-out colonies, tests for presumptive Yersinia enterocolitica are carried out, followed by biochemical
confirmation tests, biotyping tests, tests to establish pathogenic criteria, and possibly serological tests.
5 Reagents and media
For current laboratory practice, see ISO 7218.
See ISO/TS 11133-1 for specific requirements about quality assurance and performance of media.
NOTE ISO/TS 11133-2 on practical guidelines on performance testing of culture media is under preparation.
In view of the large number of culture media and reagents and for the clarity of the text, their compositions are
given in Annex B, which also includes details of dispensing, storage, etc.
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5.1 Enrichment media
5.1.1 Peptone, sorbitol and bile salts (PSB) broth
See B.1.
5.1.2 Irgasan, ticarcillin and potassium chlorate (ITC) broth
See B.2.
5.2 Plating out media
5.2.1 Cefsulodin, Irgasan and novobiocin (CIN) agar (see reference [7])
See B.3.
5.2.2 Salmonella/Shigella agar, with sodium desoxycholate and calcium chloride (SSDC)
See B.4.
5.2.3 Nutrient agar
See B.5.
5.3 Identification media and reagents
5.3.1 Urea indole medium
See B.6.
5.3.2 Reagent for indole detection
See B.7.
5.3.3 Kligler’s agar
See B.8.
5.3.4 Reagent for detection of oxidase
See B.9.
5.3.5 Decarboxylation media
5.3.5.1 Lysine decarboxylation medium
See B.10.
5.3.5.2 Ornithine decarboxylation medium
See B.11.
5.3.6 Media for fermentation of carbohydrates (sucrose, rhamnose, trehalose and xylose)
See B.12.
5.3.7 Simmons’ citrate medium
See B.13.
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5.3.8 Tween-esterase medium
See B.14.
5.3.9 Bile and aesculin agar
See B.15.
5.3.10 Casein soya agar
See B.16.
5.3.11 Casein soya agar, for detection of pyrazinamidase.
See B.17.
5.3.12 Ammonium iron(II) sulfate solution, for detection of pyrazinamidase.
See B.18.
5.3.13 Casein-soya agar, with magnesium and oxalate.
See B.19.
5.4 Saline solution
See B.20.
5.5 Potassium hydroxide in saline solution
See B.21.
5.6 Veal infusion broth
See B.22.
5.7 Sterile glycerol
See B.23.
6 Apparatus and glassware
Disposable apparatus is an acceptable alternative to reusable glassware, if it has suitable specifications.
Usual microbiology laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave)
See ISO 7218.
6.2 Incubators, capable of operating at 22 °C ± 1 °C, 25 °C ± 1 °C, 30 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C.
6.3 Drying cabinet or oven, with ventilation by convection, capable of operating between 37 °C ± 1 °C and
50 °C ± 1 °C.
6.4 Water baths or incubators, capable of operating between 22 °C ± 1 °C, 24 °C ± 2 °C and 25 °C ± 1 °C,
preferably with a suitable agitation device.
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6.5 Water bath, capable of operating at 44 °C to 47 °C.
6.6 Test tubes, of dimensions 18 mm × 180 mm, 9 mm × 180 mm, and 12 mm × 50 mm.
6.7 Bottles and/or flasks, of suitable capacity.
6.8 Petri dishes, made of glass or plastics, of diameter 90 mm to 100 mm.
6.9 Total-delivery pipettes, of nominal capacities 10 ml and 1 ml, with large opening and 0,1 ml
graduations.
6.10 Rubber teats, or other microbiologically safe pipetting systems.
6.11 Loop, of approximately 3 mm diameter, straight wires of platinum/iridium and/or nickel/chromium,
glass rods and Pasteur pipettes.
Sterile plastic disposable loops or needles may be used. Nickel chromium is not suitable for the oxidase test
(see 9.4.3.5).
6.12 pH-meter, accurate to within ± 0,1 pH units at 25 °C.
6.13 Lighting, appropriate for oblique illumination.
6.14 Magnifying glass or stereomicroscope.
6.15 Peristaltic blender.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Freezing of samples before analysis is not recommended, despite Yersinia spp. being recovered from frozen
products.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. If there is no specific International
Standard dealing with sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come
to an agreement on this subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the product
concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the parties
concerned come to an agreement on this subject.
9 Procedure (see Annex A)
9.1 Test portion and initial suspension
9.1.1 See the relevant part of ISO 6887, or ISO 8261, or any specific International Standard appropriate to
the product concerned.
9.1.2 In general, for preparing the initial suspension, place a quantity (x) of the test portion (of known mass
or volume) in a known volume of the PSB broth (B.1), to give a 1/10 dilution (by mass/volume or
volume/volume). Homogenize the suspension using a peristaltic blender (6.15) for 2 min.
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ISO 10273:2003(E)
9.1.3 Prepare the second initial suspension in the same way with the ITC broth (B.2), so as to obtain a test
portion/enrichment medium dilution of 1/100 (mass/volume or volume/volume).
9.2 Enrichment
Incubate the two initial suspensions (9.1.2 and 9.1.3) as follows:
a) PSB medium at 22 °C to 25 °C for 48 h to 72 h with agitation, or for 5 days without agitation;
b) ITC medium at 25 °C for 48 h.
9.3 Plating out and identification
9.3.1 After incubation of the enrichment media (9.2), proceed as follows.
9.3.2 Using the PSB culture (9.2), inoculate, by means of a loop (6.11), the surface of a CIN agar plate
(B.3) to obtain well-separated colonies.
9.3.3 Using a sterile pipette (6.9), transfer 0,5 ml of the PSB culture (9.2) into 4,5 ml of potassium hydroxide
solution (B.21) and mix (see reference [5]). After 20 s ± 5 s, immediately inoculate, by means of a loop (6.11),
the surface of a CIN agar plate (B.3) to obtain well-separated colonies.
9.3.4 Using the ITC culture (9.2), inoculate, by means of a loop (6.11), the surface of an SSDC agar plate
(B.4) to obtain well-separated colonies.
9.3.5 Invert the dishes (9.3.2 to 9.3.4) and place them in the incubator (6.2) set at 30 °C.
9.3.6 After incubation for 24 h, examine the dishes with a magnifying glass (6.14) preferably equipped with
an obliquely transmitted light (6.13) in order to detect the presence of characteristic colonies of Yersinia
enterocolitica as follows.
a) On CIN agar, characteristic colonies of Yersinia enterocolitica are small (u 1 mm) and smooth with a red
centre and translucent rim and, when examined with obliquely transmitted light (6.13), are non-iridescent
and finely granular.
b) On SSDC agar, characteristic colonies of Yersinia enterocolitica are small (u 1 mm) and grey with an
indistinct rim, non-iridescent and very finely granular when examined with obliquely transmitted light.
NOTE Obliquely transmitted light helps to distinguish characteristic colonies of Yersinia enterocolitica from very
similar colonies of Pseudomonas.
9.3.7 If the development of colonies is slow, if coloration is weak, or if there are no characteristic colonies,
continue incubation of the plates for up to 48 h, then re-examine them.
9.4 Confirmation
9.4.1 General
Miniaturized biochemical identification kits, currently available commercially and permitting the identification of
Yersinia enterocolitica, may be used. Some miniaturized biochemical identification kits do not identify with
accuracy Yersinia species such as Yersinia mollaretii and Yersinia bercovieri (previous biovars of Yersinia
enterocolitica 3A and 3B) and Yersinia intermedia which are identified as Yersinia enterocolitica. In this last
case, the Mucate test shall be performed to discriminate between these species. An improvement of the
discriminatory powers of these miniaturized biochemical identification kits has been proposed (see references
[6] and [7]).
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ISO 10273:2003(E)
9.4.2 Selection of colonies for confirmation
9.4.2.1 For confirmation, take from each dish of each selective medium (see 9.3.2 to 9.3.4), five colonies
considered to be characteristic or suspect.
If on one dish there are fewer than five characteristic or suspect colonies, take for confirmation all the
characteristic or suspect colonies.
Streak the selected colonies onto the surface of nutrient agar plates (B.5), in a manner which will allow well-
isolated colonies to develop.
Incubate the inoculated plates at 30 °C for 24 h.
Examine the incubated plates for purity of culture. If mixed cultures are present, subculture each individual
colony type onto further nutrient agar plates and incubate as above.
Use pure cultures for the biochemical confirmations and pathogenicity tests.
9.4.2.2 Plasmids that determine traits related to the pathogenicity of Yersinia can be spontaneously lost
during culture above 30 °C or with lengthy culture and passage below 30 °C in the laboratory.
Therefore preserve these as a frozen culture by immediately subculturing each pure culture into veal infusion
broth (B.22).
Incubate at 22 °C to 25 °C for 24 h to 48 h.
Add 10 % sterile glycerol (B.23), mix well and freeze, preferably at −70 °C.
9.4.3 Presumptive tests
9.4.3.1 General
By means of a wire (6.10), inoculate the media specified in 9.4.3.2 to 9.4.3.4 and perform the detection of
oxidase as described in 9.4.3.5 with each of the cultures obtained from the colonies selected in 9.4.2.
9.4.3.2 Detection of urease
Use a heavy inoculum to inoculate the broth just below the surface of the urease/indole medium (B.6).
Incubate at 30 °C for 24 h, preferably in a water bath.
Pink-violet or red-pink colours indicate a positive urease reaction. Yersinia enterocolitica mostly gives positive
urease reaction within 1 min to 5 min. Recording of the speed of a positive reaction can be of diagnostic value.
An orange-yellow colour indicates a negative urease reaction. Possible false negative reactions can occur if
the medium is not inoculated with sufficient microorganisms.
9.4.3.3 Detection of indole
Add 0,1 ml to 0,2 ml of the reagent (B.7) to the tubes (9.4.3.2) for the detection of indole.
A red ring at the surface of the culture indicates a positive reaction in 15 min.
9.4.3.4 Kligler’s agar
Stab the butt to the bottom of the agar and streak over the slant surface (B.7.2).
Incubate at 30 °C for 24 h to 48 h.
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ISO 10273:2003(E)
Interpret the changes in the medium as follows.
a) Butt
yellow: glucose positive (fermentation of glucose);
red or unchanged: glucose negative (no fermentation of glucose);
black: formation of hydrogen sulfide;
bubbles or cracks: gas formation from glucose.
b) Slant surface
yellow: lactose positive (utilization of lactose);
red or unchanged: lactose negative (no utilization of lactose).
9.4.3.5 Detection of oxidase
Using the glass rod or platinum/iridium loop (6.11), take a portion of each characteristic colony chosen (9.4.2)
and streak onto a filter paper lightly moistened (one drop) with the oxidase reagent (B.9) or onto a
commercially available disc. Do not use a nickel/chromium loop or wire (see 6.11).
Consider the test to be negative when the colour of the filter paper has not changed to mauve, violet or deep
blue within 10 s.
9.4.4 Biochemical confirmation test
9.4.4.1 Selection of colonies and procedure
9.4.4.1.1 Continue the identification of colonies having the following characteristics:
detection of urease: positive;
detection of indole: positive or negative;
fermentation of glucose: positive;
formation of gas from the glucose: negative;
fermentation of lactose: negative;
formation of H S: negative;
2
detection of oxidase: negative.
NOTE 1 Urease-negative strains have been reported but none is known to be pathogenic.
NOTE 2 For the formation of gas from glucose, a few bubbles may be produced. Although Yersinia is usually
considered to ferment carbohydrates without gas production, some strains of Yersinia enterocolitica (such as Yersinia
enterocolitica biovar 3) may produce one or two bubbles (weak gas production).
NOTE 3 Some strains of Yersinia enterocolitica that are lactose-positive have been isolated, particularly from dairy
products. In the current state of knowledge, they are generally non-pathogenic.
9.4.4.1.2 Using a loop or a wire (6.10), inoculate the media specified in 9.4.4.2 to 9.4.4.5 with each of the
cultures obtained from the colonies isolated (9.4.2) on nutrient agar and selected in 9.4.4.1.1.
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9.4.4.2 Lysine decarboxylation medium
Inoculate just below the surface of the liquid medium (B.10). If the tubes are not full of medium and airtight,
®
cover the surface with molten (heated then just cooled so that it remains still liquid) Vaseline oil or sterile
liquid paraffin.
Incubate at 30 °C for 24 h.
A violet colour after incubation indicates a positive reaction.
A yellow colour indicates a negative reaction.
9.4.4.3 Ornithine decarboxylation medium
Inoculate just below the surface of the liquid medium (B.11). If the tubes are not full of medium and airtight,
®
cover the surface with molten (heated then just cooled so that it remains still liquid) Vaseline oil or sterile
liquid paraffin.
Incubate at 30 °C for 24 h.
A violet colour after incubation indicates a positive reaction.
A yellow colour indicates a negative reaction.
9.4.4.4 Media for the fermentation of sucrose, rhamnose, trehalose and xylose
Inoculate each medium (B.12) just below the surface of the liquid.
Incubate at 30 °C for 24 h.
A yellow colour after incubation indicates a positive reaction.
A red colour indicates a negative reaction.
9.4.4.5 Simmons’ medium for the hydrolysis of citrate
Streak the slant surface of the agar (B.13). Do not close the caps of the tubes tightly so that air can enter and
aerobic growth conditions prevail.
Incubate at 30 °C for 24 h.
The reaction is positive if the medium turns blue.
9.4.4.6 Tween-esterase test
Streak the agar (B.14) slope surface.
Incubate at 25 °C for 5 days and examine at intervals.
The reaction is positive if an opaque zone of precipitate due to calcium oleate microcrystals appears.
9.4.5 Presumptive pathogenicity tests (see reference [8])
9.4.5.1 Selection of colonies and procedure
9.4.5.1.1 Use only colonies that have the following characteristics:
detection of lysine decarboxylase: negative;
detection of ornithine decarboxylase: positive;
© ISO 2003 — All rights reserved 9
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ISO 10273:2003(E)
fermentation of rhamnose: negative;
fermentation of sucrose: positive;
hydrolysis of citrate: negative
NOTE 1 Rare strains of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica that are sucrose-negative have been isolated
from pork.
NOTE 2 Yersinia enterocolitica biovars 4 and 5 have been reported to be ornithine decarboxylase negative.
9.4.5.1.2 Using a loop or wire (6.11), inoculate the media specified in 9.4.5.2 to 9.4.5.4 with each of the
pure cultures on nutrient agar from the selected colonies (9.4.5.1).
9.4.5.2 Medium for fermentation of aesculin
Streak the slant surface (B.15) of the agar.
Incubate at 30 °C for 24 h.
A black halo around the colonies indicates a positive reaction.
NOTE This test for fermentation of aesculin is equivalent to the test for fermentation of salicin.
9.4.5.3 Medium for detection of pyrazinamidase
Inoculate a large area of the slant surface (B.17) of the medium.
Incubate at 30 °C for 48 h.
Add 1 ml of 1 % ammonium iron(III) sulfate solution (B.18).
The appearance after 15 min of a pinkish-brown colour indicates a positive reaction.
9.4.5.4 Test of calcium requirements at 37 °C
9.4.5.4.1 The test of calcium requirements at 37 °C may be replaced by sodium acetate utilization.
NOTE 1 Tests incubated at 37 °C can cause this characteristic to be lost because genes encoded for this character are
carried on a plasmid.
9.4.5.4.2 For each pure culture isolated on nutrient agar (9.4.5.1), suspend a small portion of a colony in
sodium chloride solution (B.20) to obtain a suspension of approximately 1 000 bacteria per millilitre.
Inoculate 0,1 ml of each suspension by spreading onto
two plates of casein-soya agar (B.16) (reference dishes), and
two plates of casein-soya agar with magnesium and oxalate (B.19).
Incubate one dish of each medium at 25 °C for 48 h and the other at 37 °C for 48 h.
9.4.5.4.3 The reaction is regarded as pos
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10273
Deuxième édition
2003-06-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche de Yersinia
enterocolitica présumées pathogènes
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
Numéro de référence
ISO 10273:2003(F)
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ISO 2003
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ISO 10273:2003(F)
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
4.1 Généralités. 2
4.2 Enrichissement en milieux sélectifs liquides. 2
4.3 Isolement et identification. 2
4.4 Confirmation. 2
5 Réactifs et milieux de culture . 2
6 Appareillage et verrerie . 4
7 Échantillonnage . 5
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 5
9 Mode opératoire (voir Annexe A) . 6
9.1 Prise d'essai et suspension mère . 6
9.2 Enrichissement . 6
9.3 Isolement et identification. 6
9.4 Confirmation. 7
10 Rapport d'essai . 13
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire. 14
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs. 15
Annexe C (informative) Caractéristiques biochimiques, à 30 °C, des Yersinia pseudotuberculosis,
des Yersinia enterocolitica et d'autres espèces biochimiques apparentées . 31
Annexe D (informative) Schéma de biotypage de Yersinia enterocolitica . 32
Bibliographie . 33
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10273 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 10273:1994), dont le Paragraphe 9.4 a
fait l'objet d'une révision technique.
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ISO 10273:2003(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode horizontale
ne soit pas applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes,
spécifiques à ces produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons
techniques justifiées. Néanmoins, il convient que tous les efforts soient faits pour appliquer cette méthode
horizontale chaque fois que possible.
Lors du prochain réexamen périodique de la présente Norme internationale, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale
aura été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il peut
déjà exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent
pas avec la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait
souhaitable de les aligner avec les prescriptions de la présente Norme internationale et de ne conserver que
les seules divergences justifiées indispensables pour des raisons techniques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 10273:2003(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche de Yersinia enterocolitica présumées pathogènes
ATTENTION — L'application de la présente Norme internationale peut impliquer l'utilisation de
matériels et d'équipements dangereux, ainsi que le recours à des opérations dangereuses. Il est de la
responsabilité de l'utilisateur de mettre en œuvre les pratiques appropriées de sécurité et de santé.
L'utilisateur doit également déterminer les limitations d'ordre réglementaires.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale pour la recherche des Yersinia
enterocolitica présumées pathogènes chez l'homme. La présente Norme internationale est applicable aux
produits pour l'alimentation humaine et animale, et aux
échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques, ainsi que
Amd.1:2001
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Yersinia enterocolitica présumées pathogènes
bactéries psychrotrophes formant des colonies caractéristiques sur des milieux solides sélectifs, possédant
des propriétés biochimiques répondant aux critères de pathogénicité décrits lorsque l'essai est réalisé
conformément à la présente Norme internationale
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3.2
recherche de Yersinia enterocolitica présumées pathogènes
détermination de la présence ou de l'absence de ces bactéries dans une quantité déterminée de produit
lorsque l'essai est réalisé conformément à la présente Norme internationale
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Yersinia enterocolitica présumées pathogènes nécessite les trois étapes successives
suivantes.
4.2 Enrichissement en milieux sélectifs liquides
Ensemencement de la prise d'essai dans les deux milieux d'enrichissement suivants:
bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliaires (PSB);
bouillon à l'Irgasan, à la ticarcilline et au chlorate de potassium (ITC).
Incubation à 25 °C pendant 48 h pour le bouillon ITC et pendant 3 jours à 5 jours pour le bouillon PSB.
NOTE L'enrichissement en bouillon ITC a été proposé par Wauters (voir la référence [1]) pour isoler les Yersinia
enterocolitica biotype 4/sérotype O:3 et non le biotype 1B/sérotype O:8, le biotype 2/sérotype O:9 (voir la référence [2]) et
le biotype 2/sérotype O:5,27. L'isolement des Yersinia enterocolitica biotype 2/sérotype O:9 requiert l'utilisation d'un milieu
ITC exempt de chlorate et contenant 80 % de la concentration originale en chlorure de magnésium et en vert malachite
(voir la référence [3]).
4.3 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.2, isolement sur les deux milieux de culture solides sélectifs suivants:
gélose à la cefsulodine, à l'Irgasan et à la novobiocine (CIN) (voir la référence [7]);
gélose Salmonella/Shigella, au désoxycholate de sodium et au chlorure de calcium (SSDC).
Incubation à 30 °C, puis examen après 24 h et, si nécessaire, après 48 h, selon le milieu utilisé, pour vérifier
la présence éventuelle de colonies caractéristiques de Yersinia enterocolitica.
4.4 Confirmation
Sur des colonies isolées, recherche des colonies susceptibles d'être des Yersinia enterocolitica préalablement
isolées et confirmation au moyen d'essais biochimiques, d'essais de biotypage, d'essais visant à rechercher
des critères de pathogénicité et, éventuellement, d'essais sérologiques.
5 Réactifs et milieux de culture
Voir l'ISO 7218 pour les pratiques courantes de laboratoire.
Voir l'ISO/TS 11133-1 pour des exigences spécifiques en matière d'assurance de la qualité et de performance
des milieux de culture.
NOTE L'ISO/TS 11133-2, traitant des lignes directrices relatives aux essais de performance des milieux de culture,
est en préparation.
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ISO 10273:2003(F)
Du fait de la grande diversité de milieux de culture et de réactifs, et par souci d'une lisibilité plus aisée du texte
de la présente Norme internationale, leur composition est donnée dans l'Annexe B, laquelle détaille
également leurs conditions de répartition, de stockage, etc.
5.1 Milieux d'enrichissement
5.1.1 Bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliaires (PSB).
Voir Article B.1.
5.1.2 Bouillon à l'Irgasan, à la ticarcilline et au chlorate de potassium (ITC).
Voir Article B.2.
5.2 Milieu d'isolement
5.2.1 Gélose à la cefsulodine, à l'Irgasan et à la novobiocine (CIN) (voir la référence [7]).
Voir Article B.3.
5.2.2 Gélose Salmonella/Shigella, au désoxycholate de sodium et au chlorure de calcium (SSDC).
Voir Article B.4.
5.2.3 Gélose nutritive.
Voir Article B.5.
5.3 Milieux d'identification et réactifs
5.3.1 Milieu urée-indole.
Voir Article B.6.
5.3.2 Réactif pour la recherche de l'indole.
Voir Article B.7.
5.3.3 Gélose de Kligler.
Voir Article B.8.
5.3.4 Réactif pour la recherche de l'oxydase.
Voir Article B.9.
5.3.5 Milieux de décarboxylation
5.3.5.1 Milieu de décarboxylation de la lysine.
Voir Article B.10.
5.3.5.2 Milieu de décarboxylation de l'ornithine.
Voir Article B.11.
5.3.6 Milieux de fermentation des glucides (saccharose, rhamnose, tréhalose et xylose).
Voir Article B.12.
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5.3.7 Milieu au citrate de Simmons.
Voir Article B.13.
5.3.8 Milieu Tween-estérase.
Voir Article B.14.
5.3.9 Gélose à la bile et à l'esculine.
Voir Article B.15.
5.3.10 Gélose trypto-caséine-soja.
Voir Article B.16.
5.3.11 Gélose trypto-caséine-soja, pour la recherche de pyrazinamidase.
Voir Article B.17.
5.3.12 Solution de sulfate de fer(II) ammoniacal, pour la recherche de la pyrazinamidase.
Voir Article B.18.
5.3.13 Gélose trypto-caséine-soja au magnésium et à l'oxalate.
Voir Article B.19.
5.4 Solution saline.
Voir Article B.20.
5.5 Solution d'hydroxyde de potassium en solution saline.
Voir Article B.21.
5.6 Bouillon à l'infusion de veau.
Voir Article B.22.
5.7 Glycérol sterile.
Voir Article B.23.
6 Appareillage et verrerie
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable si les spécifications sont
similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareil pour stérilisation en chaleur sèche (four) ou appareil pour stérilisation en chaleur
humide (autoclave).
Voir l'ISO 7218.
6.2 Étuves, réglables respectivement à 22 °C ± 1 °C, à 25 °C ± 1 °C, à 30 °C ± 1 °C et à 37 °C ± 1 °C.
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6.3 Enceinte de séchage ou four, avec ventilation par convection et pouvant être réglé(e) à une
température comprise entre 37 °C ± 1 °C et 50 °C ± 1 °C.
6.4 Bains d'eau ou étuves, réglables respectivement à 22 °C ± 1 °C, à 24 °C ± 2 °C et à 25 °C ± 1 °C, de
préférence équipé(e)s d'un agitateur adapté.
6.5 Bain d'eau, pouvant être réglé à une température comprise entre 44 °C et 47 °C.
6.6 Tubes à essai, de dimensions respectivement 18 mm × 180 mm, 9 mm × 180 mm et 12 mm × 50 mm.
6.7 Flacons et/ou fioles, de capacités appropriées.
6.8 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plastique, de diamètre compris entre 90 mm et 100 mm.
6.9 Pipettes graduées à écoulement total, de capacités nominales de 10 ml et de 1 ml, à large ouverture
et graduées en 0,1 ml.
6.10 Poires en caoutchouc, ou tout autre système microbiologiquement sûr, pouvant s'adapter aux
pipettes graduées.
6.11 Anse bouclée, de diamètre d'environ 3 mm, fils droits en platine iridié et/ou en nickel/chrome,
baguettes en verre et pipettes Pasteur.
Il est possible d'utiliser des anses bouclées et des fils droits en matière plastique, stériles et à usage unique.
La composition en nickel/chrome n'est pas appropriée pour l'essai de recherche de l'oxydase (voir 9.4.3.5).
6.12 pH-mètre, permettant de lire à ± 0,1 unité pH près, à une température de 25 °C.
6.13 Éclairage, approprié pour une transillumination oblique.
6.14 Loupe ou stéréomicroscope.
6.15 Homogénéisateur péristaltique.
7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon vraiment représentatif, non endommagé ni modifié
lors du transport ou de l'entreposage.
Il est déconseillé de congeler les échantillons avant de les analyser, bien que des Yersinia spp. aient été
retrouvées dans des produits congelés.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. S'il
n'existe aucune Norme internationale spécifique pour l'échantillonnage du produit concerné, il convient que
les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique au produit concerné. S'il
n'existe pas de Norme internationale spécifique, il convient que les parties concernées se mettent d'accord à
ce sujet.
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9 Mode opératoire (voir Annexe A)
9.1 Prise d'essai et suspension mère
9.1.1 Voir la partie pertinente de l'ISO 6887, ou voir l'ISO 8261 ou toute autre Norme internationale
spécifique au produit à examiner.
9.1.2 En règle générale, pour préparer la suspension mère, ajouter une quantité (x) de prise d'essai [de
masse ou de volume connu(e)] à un volume connu de bouillon PSB (B.1) de manière à obtenir une dilution au
dixième (rapport masse/volume ou volume/volume). Homogénéiser la suspension à l'aide d'un
homogénéisateur péristaltique (6.15) pendant 2 min.
9.1.3 Préparer de la même manière une seconde suspension mère à l'aide du bouillon ITC (B.2) de
manière à obtenir une dilution au centième (rapport masse/volume ou volume/volume).
9.2 Enrichissement
Incuber les deux suspensions mères (9.1.2 et 9.1.3) comme suit:
a) bouillon PSB: à une température comprise entre 22 °C et 25 °C pendant une durée de 48 h à 72 h avec
agitation, ou pendant 5 jours sans agitation;
b) bouillon ITC: à 25 °C pendant 48 h.
9.3 Isolement et identification
9.3.1 Après incubation des milieux d'enrichissement (9.2), procéder comme suit.
9.3.2 En utilisant le milieu de culture PSB (9.2), ensemencer, à l'aide d'une anse (6.11), la surface d'une
boîte de gélose CIN (B.3) afin d'obtenir des colonies bien séparées.
9.3.3 À l'aide d'une pipette stérile (6.9), transférer 0,5 ml du milieu de culture PSB (9.2) dans 4,5 ml de
solution d'hydroxyde de potassium (B.21) puis mélanger (voir la référence [5]). Au bout de 20 s ± 5 s,
ensemencer immédiatement, à l'aide d'une anse (6.11), la surface d'une boîte de gélose CIN (B.3) afin
d'obtenir des colonies bien séparées.
9.3.4 En utilisant le milieu de culture ITC (9.2), ensemencer, à l'aide d'une anse (6.11), la surface d'une
boîte de gélose SSDC (B.4) afin d'obtenir des colonies bien séparées.
9.3.5 Retourner les boîtes (9.3.2 à 9.3.4) et les placer dans l'étuve (6.2) réglée à 30 °C.
9.3.6 Après 24 h d'incubation, examiner les boîtes à la loupe (6.14), de préférence équipée d'un éclairage
de transillumination oblique (6.13), afin de rechercher la présence de colonies caractéristiques de Yersinia
enterocolitica de la manière suivante.
a) Sur une gélose CIN, les colonies caractéristiques de Yersinia enterocolitica sont petites (u 1 mm) et
lisses, avec un centre rouge et un bord translucide; lorsqu'elles sont examinées en transillumination
oblique (6.13), elles sont finement granuleuses et non irisées.
b) Sur une gélose SSDC, les colonies caractéristiques de Yersinia enterocolitica sont petites (u 1 mm) et de
couleur grise avec un bord indiscernable; lorsqu'elles sont examinées en transillumination oblique, elles
sont non irisées et très finement granuleuses.
NOTE La transillumination oblique permet de distinguer les colonies caractéristiques de Yersinia enterocolitica des
colonies très similaires de Pseudomonas.
9.3.7 Si le développement des colonies est lent, si la coloration est faible ou si aucune colonie
caractéristique n'est observée, prolonger l'incubation des boîtes jusqu'à 48 h, puis les réexaminer.
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9.4 Confirmation
9.4.1 Généralités
Des kits d'identification biochimique miniaturisés, actuellement disponibles dans le commerce et permettant
d'identifier les Yersinia enterocolitica, peuvent être utilisés. Certains kits n'identifient pas avec précision les
différentes espèces de Yersinia telles que les Yersinia mollaretii et les Yersinia bercovieri (anciens biotypes
des Yersinia enterocolitica 3A et 3B) ainsi que les Yersinia intermedia qui sont identifiées comme des colonies
de Yersinia enterocolitica. Dans ce dernier cas, l'essai de Mucate doit être réalisé afin de bien distinguer ces
différentes espèces. Certains auteurs proposent une amélioration des pouvoirs de discrimination des tests
d'identification biochimique miniaturisés (voir les références [6] et [7]).
9.4.2 Sélection des colonies en vue de la confirmation
9.4.2.1 Pour les essais de confirmation, sélectionner dans chaque boîte de milieu sélectif (9.3.2 à 9.3.4)
cinq colonies caractéristiques ou suspectes.
Si dans l'une des boîtes, il y a moins de cinq colonies, retenir toutes les colonies caractéristiques ou
suspectes.
Ensemencer les colonies sélectionnées sur la surface des boîtes de gélose nutritive (B.5) de manière à
permettre le développement de colonies bien séparées.
Incuber les boîtes ensemencées à 30 °C pendant 24 h.
Après incubation, examiner la pureté de la culture des boîtes. Si des cultures mixtes sont présentes, repiquer
chaque type de colonie dans d'autres boîtes de gélose nutritive et incuber conformément aux instructions ci-
avant.
Pour les essais de confirmation biochimique et de pathogénicité, utiliser uniquement des cultures pures.
9.4.2.2 Les plasmides qui déterminent une partie des facteurs de pathogénicité de Yersinia peuvent être
perdus spontanément au cours de cultures réalisées au-dessus de 30 °C ou au cours de cultures très longues
avec passage en laboratoire au-dessous de 30 °C.
Par conséquent, préparer ces plasmides à une conservation sous forme de culture congelée en commençant
par repiquer immédiatement chaque culture pure dans un bouillon à infusion de veau (B.22).
Incuber pendant 24 h à 48 h à une température comprise entre 22 °C et 25 °C.
Ajouter 10 % de glycérol stérile (B.23), bien mélanger et congeler, si possible à −70 °C.
9.4.3 Essais présomptifs
9.4.3.1 Généralités
À l'aide d'un fil droit (6.11), inoculer les milieux spécifiés en 9.4.3.2 à 9.4.3.4 et rechercher l'oxydase
conformément aux instructions données en 9.4.3.5 avec chacune des cultures obtenues à partir des colonies
sélectionnées en 9.4.2.
9.4.3.2 Recherche de l'uréase
Utiliser un inoculum important pour ensemencer le bouillon juste au-dessous de la surface du milieu urée-
indole (B.6).
Incuber à 30 °C pendant 24 h, de préférence dans un bain d'eau.
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Une couleur rose violacé ou rouge rosé indique une réaction uréase positive. La plupart du temps, les
Yersinia enterocolitica donnent une réaction uréase positive au bout de 1 min à 5 min. L'enregistrement de la
vitesse d'une réaction positive peut avoir une valeur pour le diagnostic.
Une couleur jaune orangé indique une réaction uréase négative. D'éventuelles réactions faussement
négatives peuvent se produire si le milieu n'a pas été ensemencé avec un nombre suffisant de micro-
organismes.
9.4.3.3 Recherche de l'indole
Ajouter de 0,1 ml à 0,2 ml de réactif (B.7) aux tubes (9.4.3.2) pour la recherche de l'indole.
Un anneau rouge apparaissant dans les 15 min à la surface de la culture indique une réaction positive.
9.4.3.4 Gélose de Kligler
Ensemencer le culot de la gélose par piqûre profonde et la pente du milieu par une strie (voir B.8.2).
Incuber à 30 °C pendant 24 h à 48 h.
Interpréter les réactions du milieu comme suit.
a) Culot
jaune: glucose positif (fermentation du glucose);
rouge ou inchangé: glucose négatif (pas de fermentation du glucose);
noir: formation de sulfure d'hydrogène;
bulles ou fissures: formation de gaz à partir du glucose.
b) Pente de la gélose
jaune: lactose positif (utilisation du lactose);
rouge ou inchangée: lactose négatif (pas d'utilisation du lactose).
9.4.3.5 Recherche de l'oxydase
À l'aide de la baguette en verre ou de l'anse bouclée en platine iridié (6.11), prélever une fraction de chaque
colonie caractéristique sélectionnée (9.4.2) et la déposer en stries sur un papier-filtre légèrement humidifié
(une goutte) de réactif pour la recherche de l'oxydase (B.9) ou sur un disque disponible dans le commerce.
Ne pas utiliser d'anse bouclée ou de fil en nickel/chrome (voir 6.11).
Considérer l'essai comme négatif si le papier-filtre ne devient ni mauve, ni violet, ni bleu intense dans les 10 s.
9.4.4 Essais de confirmation biochimique
9.4.4.1 Sélection des colonies et mode opératoire
9.4.4.1.1 Poursuivre l'identification des colonies présentant les caractéristiques suivantes:
recherche de l'uréase: positive;
recherche de l'indole: positive ou négative;
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fermentation du glucose: positive;
formation de gaz à partir du glucose: négative;
fermentation du lactose: négative;
formation de sulfure d'hydrogène: négative;
recherche de l'oxydase: négative.
NOTE 1 Des souches uréase négatives ont été signalées mais aucun caractère pathogène ne leur est connu.
NOTE 2 Lors de la formation de gaz à partir du glucose, quelques bulles peuvent se former. Bien que les Yersinia
soient habituellement considérées comme des bactéries fermentant des glucides sans production de gaz, certaines
souches de Yersinia enterocolitica (telles que les Yersinia enterocolitica biotype 3) peuvent entraîner la formation d'une ou
deux bulles (faible production de gaz).
NOTE 3 Certaines souches de Yersinia enterocolitica lactose positives ont été isolées, en particulier dans des produits
laitiers. Dans l'état actuel des connaissances, elles sont généralement non pathogènes.
9.4.4.1.2 À l'aide d'une anse bouclée ou d'un fil droit (6.11), ensemencer les milieux spécifiés en 9.4.4.2 à
9.4.4.5 avec les cultures obtenues à partir des colonies séparées (9.4.2) sur gélose nutritive et sélectionnées
en 9.4.4.1.1.
9.4.4.2 Milieu pour la recherche de la décarboxylation de la lysine
Ensemencer le milieu liquide (B.10) juste au-dessous de la surface. Si les tubes ne sont pas complètement
®
remplis de milieu ni fermés hermétiquement, couvrir la surface avec de la Vaseline fondue (chauffée puis
refroidie juste assez pour rester liquide) ou avec de la paraffine liquide stérile.
Incuber à 30 °C pendant 24 h.
Une couleur violette après incubation indique une réaction positive.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
9.4.4.3 Milieu pour la recherche de la décarboxylation de l'ornithine
Ensemencer le milieu liquide (B.11) juste au-dessous de la surface. Si les tubes ne sont pas complètement
®
remplis de milieu ni fermés herm
...
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