ISO 11731-2:2004

Water quality — Detection and enumeration of Legionella — Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts

ISO 11731-2:2004 describes a monitoring method for the isolation and enumeration of Legionella organisms in water intended for human use (e.g. hot and cold water, water used for washing), for human consumption and for treated bathing waters (e.g. swimming pools). It is especially suitable for waters with prospected low numbers of Legionella. As the growth of Legionella may be inhibited by overgrowth of other bacterial colonies on the membrane the method is only suitable for waters containing low bacterial.

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Legionella — Partie 2: Méthode par filtration directe sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries

L'ISO 11731:2004 décrit une méthode de contrôle pour l'isolation et le dénombrement des Legionella dans l'eau destinée à des usages (par exemple eau chaude ou froide, eau utilisée pour le lavage), dans l'eau destinée à la consommation humaine et dans les eaux de baignade traitées (par exemple eaux de piscines). Cette méthode s'applique en particulier aux eaux à faible teneur en Legionella. La croissance des Legionella peut être inhibée par la croissance excessive d'autres colonies bactériennes sur la membrane; par conséquent, la méthode n'est applicable qu'aux eaux à faible teneur en bactéries.

Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila legionel - 2. del: Metoda neposredne membranske filtracije za vode z majhnim številom bakterij

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 25-Apr-2004
• Withdrawal Date: 25-Apr-2004
• ICS: 07.100.20 - Microbiology of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 4 - Microbiological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 4 - Microbiological methods
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 12-May-2017
• Ref Project: SIST ISO 11731-2:2007 - Water quality -- Detection and enumeration of Legionella -- Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts

Relations

• Revised: ISO 11731:2017 - Water quality — Enumeration of Legionella
• Effective Date: 31-Mar-2012
• Consolidated By: ISO 21091:2013 - Health informatics — Directory services for healthcare providers, subjects of care and other entities
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11731-2
First edition
2004-05-01
Water quality — Detection and
enumeration of Legionella —
Part 2:
Direct membrane filtration method for
waters with low bacterial counts
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Legionella —
Partie 2: Méthode par filtration directe sur membrane pour les eaux à
faible teneur en bactéries
Reference number
ISO 11731-2:2004(E)
ISO 2004
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11731-2:2004(E)
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© ISO 2004

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ISO copyright office
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Published in Switzerland
ii © ISO 2004 – All rights reserved
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ISO 11731-2:2004(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

1 Scope...................................................................................................................................................... 1

2 Normative references ........................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

4 Safety...................................................................................................................................................... 2

5 Principle ................................................................................................................................................. 2

6 Culture media and reagents................................................................................................................. 2

7 Apparatus .............................................................................................................................................. 6

8 Sampling ................................................................................................................................................ 7

9 Procedure .............................................................................................................................................. 7

10 Expression of results............................................................................................................................ 9

11 Test report ............................................................................................................................................. 9

© ISO 2004 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11731-2:2004(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 11731-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

ISO 11731 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration

of Legionella:
 Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts
The general method will be the subject of a future Part 1 of ISO 11731.
iv © ISO 2004 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11731-2:2004(E)
Water quality — Detection and enumeration of Legionella —
Part 2:
Direct membrane filtration method for waters with low bacterial
counts

WARNING — Persons using this part of ISO 11731 should be familiar with normal laboratory practice.

This part of ISO 11731 does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with

its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to

ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope

This part of ISO 11731 describes a monitoring method for the isolation and enumeration of Legionella

organisms in water intended for human use (e.g. hot and cold water, water used for washing), for human

consumption and for treated bathing waters (e.g. swimming pools). It is especially suitable for waters expected

to contain low numbers of Legionella. As the growth of Legionella may be inhibited by overgrowth of other

bacterial colonies on the membrane, the method is only suitable for waters containing low bacterial counts.

2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced

document (including any amendments) applies.

ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 8199:— , Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture

ISO 11731:1998, Water quality — Detection and enumeration of Legionella
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Legionella

genus of Gram-negative bacteria normally capable of growth in no less than 2 days on buffered charcoal

yeast extract agar containing L-cysteine and iron(III), and forming colonies, often white, purple to blue or lime

green in colour

NOTE Some species fluoresce under long wavelength UV light. The colonies have a ground-glass appearance when

viewed with a low power stereomicroscope. Growth does not occur in the absence of L-cysteine with the exception of

L. oakridgensis and L. spiritensis. L. oakridgensis and L. spiritensis require L-cysteine and iron for primary isolation but can

grow weakly in the absence of added L-cysteine thereafter.
1) To be published. (Revision of ISO 8199:1988)
© ISO 2004 – All rights reserved 1
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ISO 11731-2:2004(E)
4 Safety

The reagents used in this part of ISO 11731 should be subject to assessment in accordance with control

substances hazardous to health.

Legionella species can be handled safely by experienced microbiologists on the open bench in a conventional

microbiology laboratory conforming to containment level 2. Infection is caused by inhalation of the organism

and it is advisable therefore to assess all techniques for their ability to produce aerosols. If in any doubt, carry

out the work in a safety cabinet.
5 Principle
5.1 General

Bacteria, including Legionella organisms, in the water sample are concentrated by membrane filtration. After

filtration, the filter is treated with acid buffer added directly into the funnel to reduce the growth of non-

Legionella organisms. The filter is subsequently transferred onto a plate of agar medium selective for

Legionella and incubated. Samples expected to contain sufficient numbers of Legionella need not be

subjected to concentration prior to culture (9.1).
5.2 Enumeration

After incubation, morphologically characteristic colonies which form on the selective medium are regarded as

presumptive Legionella.
5.3 Confirmation

Presumptive colonies are confirmed as Legionella organisms by subculture to demonstrate their growth

requirement for L-cysteine and iron. Further biochemical and serological tests are needed for species

identification. Species identification may not be considered necessary for routine monitoring but is

indispensable in outbreak situations.

NOTE L. pneumophila serogroup 1 is the causative agent of most legionellosis cases and is therefore considered the

most “critical” type of Legionella to be found in the water system. Since increasing numbers of cases of legionellosis

caused by other serogroups of L. pneumophila and other Legionella species are being described, even the presence of

other Legionella species in water is considered a potential risk.
6 Culture media and reagents
6.1 General

Use chemicals of analytical grade in the preparation of media and reagents unless otherwise stated.

Alternatively, use commercially available dehydrated media and reagents. Prepare the media according to the

manufacturer's instruction and add freshly prepared (or thaw the stored material at room temperature prior to

use) selective agents or growth supplements at the concentrations recommended. Prepare media using glass

distilled water or water of equivalent quality complying with ISO 3696:1987, Grade 3. Other grades of

chemicals may be used providing they can be shown to produce the same results.
2 © ISO 2004 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11731-2:2004(E)
6.2 Culture media
6.2.1 Buffered charcoal yeast extract agar medium (BCYE)
6.2.1.1 Composition
Yeast extract (bacteriological grade) 10,0 g
Agar 12,0g
Activated charcoal 2,0 g
1,0 g
α-Ketoglutarate, monopotassium salt
ACES buffer
(N-2-acetamido-2-aminoethane sulfonic acid) 10,0 g
Potassium hydroxide (KOH) (pellets) 2,8 g
L-cysteine hydrochloride monohydrate 0,4 g
Iron(III) pyrophosphate [Fe (P O )] 0,25g
4 2 7 3
Distilled water 1 000 ml

NOTE Check manufacturer's recommendations for concentration of agar to be added to provide adequate gelling

strength.
6.2.1.2 Preparation
6.2.1.2.1 Cysteine and iron solutions

Prepare fresh solutions of L-cysteine hydrochloride and iron(III) pyrophosphate by adding the 0,4 g and 0,25 g

respectively to 10 ml volumes of distilled water. Decontaminate each solution by filtration through a cellulose

ester membrane filter with an average pore size of 0,2 µm. Store in clean, sterile containers at (−20 ± 5) °C for

no more than 3 months.
6.2.1.2.2 ACES buffer

Add the ACES granules to 500 ml of distilled water and dissolve by standing in a water bath at 45 °C to 50 °C.

To a separate 480 ml of distilled water, add all the potassium hydroxide pellets and dissolve with gentle

shaking. To prepare the ACES buffer mix the two solutions.

NOTE ACES buffer can cause denaturation of the yeast extract if the following sequence is not followed.

6.2.1.2.3 Final medium

Add sequentially to the 980 ml of ACES buffer, the charcoal yeast extract and α-ketoglutarate. Prepare a

0,1 mol/l solution of potassium hydroxide (KOH) by dissolving 5,6 g in 1 l of distilled water. Prepare a

0,1 mol/l solution of sulfuric acid (H SO ) by carefully adding 5,3 ml of H SO (ρ = 1,84, of 95 % to 98 %

2 4 2 4

purity) to 1 l of distilled water. Use the solutions of 0,1 mol/l potassium hydroxide or 0,1 mol sulfuric acid as

appropriate to adjust the pH to 6,8 ± 0,2. Add the agar, mix and autoclave at (121 ± 3) °C for (15 ± 1) min

(6.2.4). After autoclaving allow to cool to (50 ± 2) °C in a water bath.

Add the L-cysteine and the iron(III) pyrophosphate solutions aseptically, mix well between additions.

© ISO 2004 – All rights reserved 3
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ISO 11731-2:2004(E)

Dispense in 20 ml volumes into Petri dishes of 90 mm to 100 mm diameter. Petri dishes of 60 mm may also

be used for incubating the membranes (see 9.1 and 9.2). The pH of the final medium is 6,8 ± 0,2 at 25 °C.

Allow excess moisture on the plates to dry and store at (5 ± 3) °C in airtight containers in the dark for up to

4 weeks.
6.2.2 Buffered charcoal yeast extract medium without L-cysteine (BCYE-Cys)

Prepare this medium in an identical manner to BCYE (6.2.1) but omit the L-cysteine.

6.2.3 Selective medium: buffered charcoal yeast extract medium with selective supplements (GVPC

medium)

NOTE This medium is identical to BCYE except that three antibiotic supplements and glycine are added to the BCYE

medium.
6.2.3.1 Selective supplements
The final concentrations in the GVPC medium shall be:
Ammonium-free glycine 3 g/l
Polymyxin B sulfate 80 000 IU/l
Vancomycin hydrochloride 0,001 g/l
Cycloheximide 0,08 g/l
Natamycin may be used instead of cycloheximide.
6.2.3.2 Preparation of antibiotic supplements

Add the appropriate amount (usually 200 mg) of polymyxin B sulfate to 100 ml of distilled water to achieve a

concentration of 14 545 IU/ml. Mix and decontaminate by membrane filtration as described in 6.2.1.2.

Dispense 5,5 ml volumes into sterile containers and store at (−20 ± 5) °C. For use, thaw at room temperature.

Add 20 mg of vancomycin hydrochloride to 20 ml of distilled water, mix and decontaminate by membrane

filtration (6.2.1.2). Dispense in 1 ml volumes in sterile containers and store at (−20 ± 5) °C. For use, thaw at

room temperature.

Add 2 g of cycloheximide to 100 ml of distilled water and decontaminate by membrane filtration as described

in 6.2.1.2. Dispense in 4 ml volumes in sterile containers and store at (−20 ± 5) °C. For use, thaw at room

temperature.
Antibiotic supplements may be stored for up to 6 months when frozen.

WARNING — Cycloheximide is hepatotoxic. Wear gloves and dust mask when handling this chemical

in the powder form.
6.2.3.3 Preparation of GVPC medium

Follow the instructions for preparation of BCYE medium given in 6.2.1.2 but add 3 g of ammonium free glycine

after the addi
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 11731-2:2007
01-februar-2007
Kakovost vode - Ugotavljanje prisotnosti in števila legionel - 2. del: Metoda
neposredne membranske filtracije za vode z majhnim številom bakterij

Water quality -- Detection and enumeration of Legionella -- Part 2: Direct membrane

filtration method for waters with low bacterial counts

Qualité de l'eau -- Recherche et dénombrement des Legionella -- Partie 2: Méthode par

filtration directe sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 11731-2:2004
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 11731-2:2007 en

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

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SIST ISO 11731-2:2007
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INTERNATIONAL ISO
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First edition
2004-05-01
Water quality — Detection and
enumeration of Legionella —
Part 2:
Direct membrane filtration method for
waters with low bacterial counts
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Legionella —
Partie 2: Méthode par filtration directe sur membrane pour les eaux à
faible teneur en bactéries
Reference number
ISO 11731-2:2004(E)
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Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

1 Scope...................................................................................................................................................... 1

2 Normative references ........................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

4 Safety...................................................................................................................................................... 2

5 Principle ................................................................................................................................................. 2

6 Culture media and reagents................................................................................................................. 2

7 Apparatus .............................................................................................................................................. 6

8 Sampling ................................................................................................................................................ 7

9 Procedure .............................................................................................................................................. 7

10 Expression of results............................................................................................................................ 9

11 Test report ............................................................................................................................................. 9

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SIST ISO 11731-2:2007
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Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

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International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 11731-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

ISO 11731 consists of the following parts, under the general title Water quality — Detection and enumeration

of Legionella:
 Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts
The general method will be the subject of a future Part 1 of ISO 11731.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11731-2:2004(E)
Water quality — Detection and enumeration of Legionella —
Part 2:
Direct membrane filtration method for waters with low bacterial
counts

WARNING — Persons using this part of ISO 11731 should be familiar with normal laboratory practice.

This part of ISO 11731 does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with

its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to

ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope

This part of ISO 11731 describes a monitoring method for the isolation and enumeration of Legionella

organisms in water intended for human use (e.g. hot and cold water, water used for washing), for human

consumption and for treated bathing waters (e.g. swimming pools). It is especially suitable for waters expected

to contain low numbers of Legionella. As the growth of Legionella may be inhibited by overgrowth of other

bacterial colonies on the membrane, the method is only suitable for waters containing low bacterial counts.

2 Normative references

The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated

references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced

document (including any amendments) applies.

ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 8199:— , Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture

ISO 11731:1998, Water quality — Detection and enumeration of Legionella
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Legionella

genus of Gram-negative bacteria normally capable of growth in no less than 2 days on buffered charcoal

yeast extract agar containing L-cysteine and iron(III), and forming colonies, often white, purple to blue or lime

green in colour

NOTE Some species fluoresce under long wavelength UV light. The colonies have a ground-glass appearance when

viewed with a low power stereomicroscope. Growth does not occur in the absence of L-cysteine with the exception of

L. oakridgensis and L. spiritensis. L. oakridgensis and L. spiritensis require L-cysteine and iron for primary isolation but can

grow weakly in the absence of added L-cysteine thereafter.
1) To be published. (Revision of ISO 8199:1988)
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4 Safety

The reagents used in this part of ISO 11731 should be subject to assessment in accordance with control

substances hazardous to health.

Legionella species can be handled safely by experienced microbiologists on the open bench in a conventional

microbiology laboratory conforming to containment level 2. Infection is caused by inhalation of the organism

and it is advisable therefore to assess all techniques for their ability to produce aerosols. If in any doubt, carry

out the work in a safety cabinet.
5 Principle
5.1 General

Bacteria, including Legionella organisms, in the water sample are concentrated by membrane filtration. After

filtration, the filter is treated with acid buffer added directly into the funnel to reduce the growth of non-

Legionella organisms. The filter is subsequently transferred onto a plate of agar medium selective for

Legionella and incubated. Samples expected to contain sufficient numbers of Legionella need not be

subjected to concentration prior to culture (9.1).
5.2 Enumeration

After incubation, morphologically characteristic colonies which form on the selective medium are regarded as

presumptive Legionella.
5.3 Confirmation

Presumptive colonies are confirmed as Legionella organisms by subculture to demonstrate their growth

requirement for L-cysteine and iron. Further biochemical and serological tests are needed for species

identification. Species identification may not be considered necessary for routine monitoring but is

indispensable in outbreak situations.

NOTE L. pneumophila serogroup 1 is the causative agent of most legionellosis cases and is therefore considered the

most “critical” type of Legionella to be found in the water system. Since increasing numbers of cases of legionellosis

caused by other serogroups of L. pneumophila and other Legionella species are being described, even the presence of

other Legionella species in water is considered a potential risk.
6 Culture media and reagents
6.1 General

Use chemicals of analytical grade in the preparation of media and reagents unless otherwise stated.

Alternatively, use commercially available dehydrated media and reagents. Prepare the media according to the

manufacturer's instruction and add freshly prepared (or thaw the stored material at room temperature prior to

use) selective agents or growth supplements at the concentrations recommended. Prepare media using glass

distilled water or water of equivalent quality complying with ISO 3696:1987, Grade 3. Other grades of

chemicals may be used providing they can be shown to produce the same results.
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ISO 11731-2:2004(E)
6.2 Culture media
6.2.1 Buffered charcoal yeast extract agar medium (BCYE)
6.2.1.1 Composition
Yeast extract (bacteriological grade) 10,0 g
Agar 12,0g
Activated charcoal 2,0 g
1,0 g
α-Ketoglutarate, monopotassium salt
ACES buffer
(N-2-acetamido-2-aminoethane sulfonic acid) 10,0 g
Potassium hydroxide (KOH) (pellets) 2,8 g
L-cysteine hydrochloride monohydrate 0,4 g
Iron(III) pyrophosphate [Fe (P O )] 0,25g
4 2 7 3
Distilled water 1 000 ml

NOTE Check manufacturer's recommendations for concentration of agar to be added to provide adequate gelling

strength.
6.2.1.2 Preparation
6.2.1.2.1 Cysteine and iron solutions

Prepare fresh solutions of L-cysteine hydrochloride and iron(III) pyrophosphate by adding the 0,4 g and 0,25 g

respectively to 10 ml volumes of distilled water. Decontaminate each solution by filtration through a cellulose

ester membrane filter with an average pore size of 0,2 µm. Store in clean, sterile containers at (−20 ± 5) °C for

no more than 3 months.
6.2.1.2.2 ACES buffer

Add the ACES granules to 500 ml of distilled water and dissolve by standing in a water bath at 45 °C to 50 °C.

To a separate 480 ml of distilled water, add all the potassium hydroxide pellets and dissolve with gentle

shaking. To prepare the ACES buffer mix the two solutions.

NOTE ACES buffer can cause denaturation of the yeast extract if the following sequence is not followed.

6.2.1.2.3 Final medium

Add sequentially to the 980 ml of ACES buffer, the charcoal yeast extract and α-ketoglutarate. Prepare a

0,1 mol/l solution of potassium hydroxide (KOH) by dissolving 5,6 g in 1 l of distilled water. Prepare a

0,1 mol/l solution of sulfuric acid (H SO ) by carefully adding 5,3 ml of H SO (ρ = 1,84, of 95 % to 98 %

2 4 2 4

purity) to 1 l of distilled water. Use the solutions of 0,1 mol/l potassium hydroxide or 0,1 mol sulfuric acid as

appropriate to adjust the pH to 6,8 ± 0,2. Add the agar, mix and autoclave at (121 ± 3) °C for (15 ± 1) min

(6.2.4). After autoclaving allow to cool to (50 ± 2) °C in a water bath.

Add the L-cysteine and the iron(III) pyrophosphate solutions aseptically, mix well between additions.

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SIST ISO 11731-2:2007
ISO 11731-2:2004(E)

Dispense in 20 ml volumes into Petri dishes of 90 mm to 100 mm diameter. Petri dishes of 60 mm may also

be used for incubating the membranes (see 9.1 and 9.2). The pH of the final medium is 6,8 ± 0,2 at 25 °C.

Allow excess moisture on the plates to dry and store at (5 ± 3) °C in airtight containers in the dark for up to

4 weeks.
6.2.2 Buffered charcoal yeast extract medium without L-cysteine (BCYE-Cys)

Prepare this medium in an identical manner to BCYE (6.2.1) but omit the L-cysteine.

6.2.3 Selective medium: buffered charcoal yeast extract medium with selective supplements (GVPC

medium)

NOTE This medium is identical to BCYE except that three antibiotic supplements and glycine are added to the BCYE

medium.
6.2.3.1 Selective supplements
The final concentrations in the GVPC medium shall be:
Ammonium-free glycine 3 g/l
Polymyxin B sulfate 80 000 IU/l
Vancomycin hydrochloride 0,001 g/l
Cycloheximide 0,08 g/l
Natamycin may be used instead of cycloheximide.
6.2.3.2 Preparation of antibiotic supplements

Add the appropriate amount (usually 200 mg) of polymyxin B sulfate to 100 ml of distilled water to achieve a

concentration of 14 545 IU/ml. Mix and decontaminate by membrane filtration as described in 6.2.1.2.

Dispense 5,5 ml volumes into sterile containers and store at (−20 ± 5) °C. For use, thaw at room temperature.

Add 20 mg of vancomycin hydrochloride to 20 ml of distilled water, mix and decontaminate by membrane

filtration (6.2.1.2). Dispense in 1 ml volumes in sterile containers and store at (−20 ± 5) °C. For use, thaw at

room temperature.
Add 2 g of cycloh
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11731-2
Première édition
2004-05-01
Qualité de l'eau — Recherche et
dénombrement des Legionella —
Partie 2:
Méthode par filtration directe sur
membrane pour les eaux à faible teneur
en bactéries
Water quality — Detection and enumeration of Legionella —
Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial
counts
Numéro de référence
ISO 11731-2:2004(F)
ISO 2004
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ISO 11731-2:2004(F)
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Web www.iso.org
Version française parue en 2007
Publié en Suisse
ii © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 11731-2:2004(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Références normatives ........................................................................................................................ 1

3 Termes et définitions............................................................................................................................ 2

4 Sécurité.................................................................................................................................................. 2

5 Principe.................................................................................................................................................. 2

6 Milieux de culture et réactifs ............................................................................................................... 3

7 Appareillage .......................................................................................................................................... 6

8 Échantillonnage .................................................................................................................................... 7

9 Mode opératoire .................................................................................................................................... 8

10 Expression des résultats ................................................................................................................... 10

11 Rapport d'essai ................................................................................................................................... 10

© ISO 2004 – Tous droits réservés iii
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ISO 11731-2:2004(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 11731-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4,

Méthodes microbiologiques.

L'ISO 11731 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l'eau — Recherche

et dénombrement des Legionella:

⎯ Partie 2: Méthode par filtration directe sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries

La méthode générale fera l'objet d'une future Partie 1 de l'ISO 11731.
iv © ISO 2004 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 11731-2:2004(F)
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des
Legionella —
Partie 2:
Méthode par filtration directe sur membrane pour les eaux
à faible teneur en bactéries

AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente partie de l'ISO 11731 connaisse bien

les pratiques courantes de laboratoire. La présente partie de l'ISO 11731 n'a pas pour but de traiter

tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à ses

utilisateurs d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité et de s'assurer de

la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 11731 décrit une méthode de contrôle pour la recherche et le dénombrement des

Legionella dans l'eau destinée à un usage humain (par exemple eau chaude ou froide, eau utilisée pour le

lavage), dans l'eau destinée à la consommation humaine et dans les eaux de baignade traitées (par exemple

eaux de piscines). Cette méthode s'applique en particulier aux eaux à faible teneur en Legionella. La

croissance des Legionella peut être inhibée par la croissance excessive d'autres colonies bactériennes sur la

membrane; par conséquent, la méthode n'est applicable qu'aux eaux à faible teneur en bactéries.

2 Références normatives

Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les

références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du

document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).

ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai

ISO 8199:— Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes

sur milieu de culture
ISO 11731:1998, Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Legionella

1) Publiée depuis la parution de la version anglaise du présent document. (Révision de l'ISO 8199:1988)

© ISO 2004 – Tous droits réservés 1
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ISO 11731-2:2004(F)
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
Legionella

bactéries à Gram négatif normalement capables de se multiplier en 2 jours au minimum sur une gélose

tamponnée contenant de l'extrait de levure et du charbon actif ainsi que de la L-cystéine et du fer(III), et

formant des colonies, d'une couleur souvent blanche, pourpre à bleue, ou vert jaune

NOTE Certaines espèces sont fluorescentes sous une lumière UV de grande longueur d'onde. Les colonies ont une

apparence de verre fritté lorsqu'elles sont observées avec une loupe de faible puissance. La croissance n'a pas lieu en

l'absence de L-cystéine à l'exception des espèces L. oakridgensis et L. spiritensis. Les espèces L. oakridgensis

et L. spiritensis exigent de la L-cystéine et du fer pour l'isolement primaire, mais elles peuvent présenter un léger

développement en l'absence de L-cystéine par la suite.
4 Sécurité

Il convient que les réactifs utilisés dans la présente partie de l'ISO 11731 soient évalués conformément au

contrôle des substances présentant un risque pour la santé.

Les Legionella peuvent être manipulées en toute sécurité par des microbiologistes avertis, sur une paillasse

découverte dans un laboratoire de microbiologie traditionnel conforme à un confinement de niveau 2. Une

infection pouvant être causée par l'inhalation de ces bactéries, il est recommandé d'évaluer toutes les

méthodes du point de vue de leur aptitude à former des aérosols. En cas de doute, les travaux doivent être

effectués sous une hotte de sécurité.
5 Principe
5.1 Généralités

Les bactéries, y compris les Legionella, contenues dans un échantillon d'eau sont concentrées par filtration

sur membrane. Après filtration, le filtre est traité avec un tampon acide placé directement dans l'entonnoir,

pour réduire la croissance des micro-organismes autres que les Legionella. Le filtre est ensuite transféré sur

une boîte contenant du milieu gélosé sélectif des Legionella, et incubé. Il n'est pas nécessaire, avant la mise

en culture, de concentrer les échantillons supposés contenir un nombre suffisant de Legionella (9.1).

5.2 Dénombrement

Après incubation, les colonies de morphologie caractéristique qui se forment sur le milieu sélectif sont

considérées comme des Legionella présumées.
5.3 Confirmation

Les colonies présumées sont confirmées comme étant des Legionella par repiquage pour mettre en évidence

leur besoin en L-cystéine et en fer. Pour l'identification des espèces, il est nécessaire d'effectuer des essais

biochimiques et sérologiques supplémentaires. L'identification des espèces n'est pas nécessaire pour la

surveillance de routine, mais elle est indispensable en cas d'épidémie.

NOTE L. pneumophila de sérogroupe 1 est responsable de la plupart des cas de légionellose. Il est donc considéré

comme le type le plus dangereux de Legionella éventuellement présente dans un réseau d'eau. Cependant, comme un

nombre de plus en plus important de cas de légionelloses dues à d'autres sérogroupes de L. pneumophila et à d'autres

espèces de Legionella a été décrit, la présence d'autres espèces de Legionella dans l'eau est également considérée

comme un risque potentiel.
2 © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 11731-2:2004(F)
6 Milieux de culture et réactifs
6.1 Généralités

Sauf spécification contraire, utiliser des produits chimiques de qualité analytique pour la préparation des

milieux et des réactifs. Il est également possible d'utiliser des milieux et des réactifs déshydratés disponibles

dans le commerce. Préparer les milieux conformément aux instructions du fabricant et ajouter les agents

sélectifs ou suppléments de croissance fraîchement préparés aux concentrations recommandées (ou faire

décongeler les ingrédients conservés à température ambiante avant utilisation). Préparer les milieux en

utilisant de l'eau distillée dans un appareillage en verre ou une eau de qualité équivalente conforme à

l'ISO 3696:1987, Qualité 3. L'utilisation de produits chimiques d'autres qualités est possible, sous réserve qu'il

soit démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
6.2 Milieux de culture

6.2.1 Milieu gélosé tamponné contenant de l'extrait de levure et du charbon actif (BCYE)

6.2.1.1 Composition
Extrait de levure (qualité bactériologique) 10,0 g
Agar 12,0 g
Charbon actif 2,0 g
α-Cétoglutarate, sel monopotassique 1,0 g
Tampon ACES
(acide N-2-acétamido-2-aminoéthane sulfonique) 10,0 g
Hydroxyde de potassium (KOH) (pastilles) 2,8 g
Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté 0,4 g
Pyrophosphate de fer(III) [Fe (P O )] 0,25 g
4 2 7 3
Eau distillée 1 000 ml

NOTE Vérifier les recommandations du fabricant concernant la concentration en gélose à ajouter pour obtenir un

pouvoir gélifiant adéquat.
6.2.1.2 Préparation
6.2.1.2.1 Solution de cystéine et de fer

Préparer des solutions fraîches de chlorhydrate de L-cystéine et de pyrophosphate de fer(III) en ajoutant

respectivement 0,4 g et 0,25 g de ces produits dans 10 ml en volume d'eau distillée. Stériliser chaque solution

par filtration sur membrane filtrante en ester de cellulose, de porosité moyenne 0,2 µm. Conserver les

solutions dans des récipients stériles propres à une température de (−20 ± 5) °C durant 3 mois au maximum.

© ISO 2004 – Tous droits réservés 3
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ISO 11731-2:2004(F)
6.2.1.2.2 Tampon ACES

Ajouter les granules d'ACES à 500 ml d'eau distillée et les dissoudre en plaçant le tout dans un bain d'eau

entre 45 °C et 50 °C. Ajouter en outre à 480 ml d'eau distillée toutes les pastilles d'hydroxyde de potassium et

les dissoudre en agitant doucement. Pour la préparation du tampon ACES, mélanger les deux solutions.

NOTE Le tampon ACES peut provoquer la dénaturation de l'extrait de levure si l'étape suivante n'est pas suivie.

6.2.1.2.3 Milieu final

Ajouter successivement aux 980 ml de tampon ACES le charbon, l'extrait de levure et l'α-cétoglutarate.

Préparer une solution d'hydroxyde de potassium (KOH) à 0,1 mol/l en dissolvant 5,6 g dans 1 l d'eau distillée.

Préparer une solution d'acide sulfurique (H SO ) à 0,1 mol/l en ajoutant avec précaution 5,3 ml de H SO

2 4 2 4

(ρ = 1,84 g/ml, teneur de 95 % à 98 %) à 1 l d'eau distillée. Utiliser selon le cas les solutions à 0,1 mol/l

d'hydroxyde de potassium ou à 0,1 mol/l d'acide sulfurique afin d'ajuster le pH à 6,9 ± 0,2. Ajouter la gélose,

mélanger et passer à l'autoclave à une température de (121 ± 3) °C pendant (15 ± 1) min (6.2.4). Après

passage à l'autoclave, laisser refroidir jusqu'à (50 ± 2) °C dans un bain d'eau.

Ajouter dans des conditions d'asepsie la solution de L-cystéine et la solution de pyrophosphate de fer(III),

mélanger soigneusement entre les ajouts.

Répartir par volumes de 20 ml dans des boîtes de Petri de 90 mm à 100 mm de diamètre. Pour l'incubation

des membranes (voir 9.1 et 9.2), il est également possible d'utiliser les boîtes de Petri de 60 mm de diamètre.

Le pH du milieu final est de 6,9 ± 0,4 à 25 °C. Laisser sécher l'excès d'humidité dans les boîtes et conserver à

(5 ± 3) °C dans des récipients hermétiques, dans l'obscurité, pendant 4 semaines au maximum.

6.2.2 Milieu gélosé tamponné contenant de l'extrait de levure et du charbon actif (BCYE) sans

L-cystéine (BCYE-Cys)

Préparer ce milieu en opérant de la même façon que pour le BCYE (6.2.1), mais sans ajouter de L-cystéine.

6.2.3 Milieu sélectif: milieu gélosé tamponné contenant de l'extrait de levure et du charbon actif avec

suppléments sélectifs [milieu glycine, vancomycine, polymyxine et cycloheximide (GVPC)]

NOTE Ce milieu est identique au BCYE, excepté l'ajout de trois antibiotiques et de glycine au milieu BCYE.

6.2.3.1 Suppléments sélectifs
Les concentrations finales dans le milieu GVPC doivent être:
Glycine, exempte d'ammonium 3 g/l
Sulfate de polymyxine B 80 000 UI/l
Chlorohydrate de vancomycine 0,001 g/l
Cycloheximide 0,08 g/l
La natamycine peut être utilisée au lieu du cycloheximide.
6.2.3.2 Préparation de suppléments antibiotiques

Ajouter la quantité appropriée (en général 200 mg) de sulfate de polymyxine B à 100 ml d'eau distillée pour

obtenir une concentration de 14 545 UI/ml. Mélanger et stériliser par filtration sur membrane, comme décrit

en 6.2.1.2. Répartir par volumes de 5,5 ml dans des récipients stériles et conserver à (−20 ± 5) °C. Avant

utilisation, décongeler à température ambiante.
4 © ISO 2004 – Tous droits réservés
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ISO 11731-2:2004(F)

Ajouter 20 mg de chlorhydrate de vancomycine à 20 ml d'eau distillée, mélanger et stériliser par filtration sur

membrane (voir 6.2.1.2). Répartir par volumes de 1 ml dans des récipients stériles et conserver à (−20 ± 5) °C.

Avant utilisation, décongeler à température ambiante.

Ajouter 2 g de cycloheximide à 100 ml d'eau distillée et stériliser par filtration sur membrane, comme décrit

en 6.2.1.2. Répartir par volumes de 4 ml dans des récipients stériles et conserver à (−20 ± 5) °C. Avant

utilisation, décongeler à température ambiante.

Les suppléments antibiotiques peuvent être conservés congelés pendant une période maximale de 6 mois.

AVERTISSEMENT — Le cycloheximide est hépatotoxique. Des gants et un masque sont nécessaires

lors de sa manipulation sous forme de poudre.
6.2.3.3 Préparation du milieu GVPC

Suivre les instructions données en 6.2.1.2 pour la préparation du milieu BCYE, en ajoutant 3 g de glycine

exempte d'ammonium, après l'ajout de l'α-cétoglutarate et ajuster ensuit
...