ISO 21160:2018

Cigarettes — Determination of selected carbonyls in the mainstream smoke of cigarettes — Method using high performance liquid chromatography

This document specifies a method for the determination of selected carbonyls (formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, propionaldehyde, crotonaldehyde, 2-butanone and n-butyraldehyde) as their 2,4-dinitrophenylhydrazones in mainstream smoke using reversed phase HPLC-UV/DAD. This method is applicable to cigarettes with nicotine-free dry particulate matter (NFDPM) yields between 1 mg/cigarette and 15 mg/cigarette using reversed phase HPLC-UV/DAD.

Cigarettes — Dosage de carbonyles sélectionnés dans le courant principal de la fumée de cigarette — Méthode par chromatographie liquide haute performance

Le présent document spécifie une méthode de dosage de carbonyles sélectionnés (formaldéhyde, acétaldéhyde, acétone, acroléine, propionaldéhyde, crotonaldéhyde, 2-butanone et n-butyraldéhyde) sous la forme de leurs 2,4-dinitrophénylhydrazones dans la fumée principale par CLHP-UV/DAD en phase inverse. Cette méthode est applicable aux cigarettes dont les rendements en matière particulaire anhydre et exempte de nicotine (MPAEN) sont compris entre 1 mg/cigarette et 15 mg/cigarette par CLHP-UV/DAD en phase inverse.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 04-Nov-2018
• ICS: 65.160 - Tobacco, tobacco products and related equipment
• Technical Committee: ISO/TC 126 - Tobacco and tobacco products
• Drafting Committee: ISO/TC 126 - Tobacco and tobacco products
• Current Stage: 9092 - International Standard to be revised
• Start Date: 23-Sep-2025
• Completion Date: 07-Dec-2025

Relations

• Consolidated By: ISO 21043-4:2025 - Forensic sciences — Part 4: Interpretation
• Effective Date: 17-Dec-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21160
First edition
2018-11
Cigarettes — Determination of
selected carbonyls in the mainstream
smoke of cigarettes — Method
using high performance liquid
chromatography
Cigarettes — Dosage de carbonyles sélectionnés dans le courant
principal de la fumée de cigarette — Méthode par chromatographie
liquide haute performance
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Apparatus . 2
6 Reagents . 3
7 Preparation . 4
7.1 Preparation of glassware. 4
7.2 Preparation of solutions . 4
7.3 Preparation of standards. 4
7.3.1 HPLC calibration standards and working solutions . 4
7.3.2 Carbonyl working standards . 5
8 Sampling . 5
9 Tobacco product preparation . 5
10 Sample generation — Smoking of cigarettes . 5
10.1 General . 5
10.2 Smoking machine setup . 5
10.3 Smoking . 6
10.3.1 General. 6
10.3.2 Linear smoking . 6
10.3.3 Rotary smoking . 7
11 Sample analysis . 7
11.1 Preparation of mainstream smoke extract solution . 7
11.2 Reversed phase high performance liquid chromatography . 7
11.2.1 Chromatographic conditions . 7
11.2.2 Mobile phase reagents . 7
11.2.3 HPLC separation conditions . 8
11.3 Calculation . 8
11.3.1 Calibration curve . 8
11.3.2 Sample quantification . . 8
12 Repeatability and reproducibility . 9
12.1 General . 9
12.2 Results from the 2012 collaborative study . 9
13 Test report .12
Annex A (informative) Recrystallization of 2,4-dinitrophenylhydrazine .13
Annex B (normative) Example of calibration standards preparation .14
Annex C (informative) HPLC chromatogram of a typical combined carbonyl calibration
standard .15
Annex D (informative) HPLC chromatogram of carbonyls in DNPH extract of mainstream
cigarette smoke .16
Bibliography .17
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 126, Tobacco and tobacco products.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
At the outset of this work, discussions in the CORESTA (www .coresta .org) Special Analytes Sub-Group
(since 2017 the Sub-Group changed its name to Smoke Analytes) determined that most laboratories used
a method involving derivatization of carbonyls with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) because they
considered it the most suitable. This was chosen as the basis of the CORESTA Recommended Method
(CRM). The CRM comprised smoke collection in impinger traps, derivatization of carbonyls with DNPH
followed by their determination using reversed phase High Performance Liquid Chromatography with
Ultra Violet or Diode Array Detection (HPLC-UV or HPLC-DAD).
Initial joint experiments and ongoing discussions addressed some methodological aspects that needed
to be evaluated before the drafting of a CRM. This method was produced through a collaborative study
[1]
undertaken in 2010 involving 15 laboratories from 11 countries using the ISO 3308 smoking regime .
Further data are provided for the same selected carbonyl compounds from 10 samples with different
[2]
tar yields from the collaborative study in 2012, which involved 19 laboratories from 11 countries .
This method includes recommendations about some of the critical steps that should be controlled to
provide data as robust and consistent as the repeatability and reproducibility data provided in the ISO
[3],[4]
document. Statistical evaluations were carried out according to ISO 5725-1 and ISO 5725-2 .
No machine smoking regime can represent all human smoking behaviour.
— It is recommended that cigarettes also be tested under conditions of a different intensity of machine
smoking than those specified in this document.
— Machine smoking testing is useful to characterize cigarette emissions for design and regulatory
purposes, but communication of machine measurements to smokers can result in misunderstandings
about differences in exposure and risk across brands.
— Smoke emission data from machine measurements may be used as inputs for product hazard
assessment, but they are not intended to be nor are they valid as measures of human exposure or
risks. Communicating differences between products in machine measurements as differences in
exposure or risk is a misuse of testing using ISO standards.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21160:2018(E)
Cigarettes — Determination of selected carbonyls in the
mainstream smoke of cigarettes — Method using high
performance liquid chromatography
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and
equipment. This document does not purport to address all the safety problems associated with
its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and
health practices, and determine the applicability of any other restrictions prior to use.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of selected carbonyls (formaldehyde,
acetaldehyde, acetone, acrolein, propionaldehyde, crotonaldehyde, 2-butanone and n-butyraldehyde) as
their 2,4-dinitrophenylhydrazones in mainstream smoke using reversed phase HPLC-UV/DAD.
This method is applicable to cigarettes with nicotine-free dry particulate matter (NFDPM) yields
between 1 mg/cigarette and 15 mg/cigarette using reversed phase HPLC-UV/DAD.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3308, Routine analytical cigarette-smoking machine — Definitions and standard conditions
ISO 3402, Tobacco and tobacco products — Atmosphere for conditioning and testing
ISO 4387, Cigarettes — Determination of total and nicotine-free dry particulate matter using a routine
analytical smoking machine
ISO 8243, Cigarettes — Sampling
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
4 Principle
Cigarettes are smoked on a standard smoking machine as specified in ISO 3308 that has been fitted
with impingers, but without a glass fibre filter pad as described in ISO 3308 (Cambridge filter pad; CFP,
for example of equivalent product) and the filter pad holder, under the ISO 3308 smoking regime.
The carbonyls in mainstream tobacco smoke are trapped by passing each puff through an impinger
device containing an acidified solution of 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) in 1:1 acetonitrile: water.
An aliquot of the smoke extract is then syringe-filtered and diluted with 1 % tris-(hydroxymethyl)-
aminomethane in aqueous acetonitrile.
The samples are subjected to analysis using reversed phase HPLC-UV or HPLC-DAD.
5 Apparatus
The usual laboratory apparatus for use in preparation of samples, solutions and standards and, in
particular, the following.
5.1 Equipment for conditioning of tobacco products.
5.2 Equipment for butt length marking.
5.3 Equipment for smoking of tobacco products, complying with ISO 3308.
5.4 Impingers for trapping mainstream smoke.
5.5 Erlenmeyer flasks, of capacities 150 ml, with ground glass stoppers, (or equivalent for combining
impinger solutions).
5.6 Polyvinylchloride (PVC) tubing, suitable for connection of the trapping system.
5.7 Analytical balance, capable of measuring to four decimal places.
5.8 Amber glass volumetric flasks, of capacities 10 ml, 25 ml, 200 ml, 1 l and 2 l.
5.9 Glass micropipettes, of capacities 50 µl, 100 µl, 150 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 800 µl, 1 000 µl and
2 000 µl.
5.10 Volumetric pipettes, of capacities 1 ml, 2 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml and 20 ml.
5.11 Glass graduated measuring cylinders, of capacities 25 ml, 50 ml and 100 ml.
5.12 Dispenser, capable of delivering 35 ml.
5.13 Hot plate/stirrer.
5.14 Syringe filter, 0,45 µm PVDF or equivalent.
5.15 Disposable syringes, 5 ml.
5.16 Disposable glass Pasteur pipettes.
5.17 Rubber bulbs.
5.18 Autosampler vials, caps and PTFE faced septa.
5.19 HPLC system, consisting of:
— tertiary gradient pump;
— auto-sampler with appropriate sampling loop;
— UV and/or DAD detector;
2 © ISO 2018 – All rights reserved

— data collection system;
— LC column: 250 mm × 4 mm, 100 Å, Reversed Phase (RP) 18e (5 µm), or equivalent;
— disposable guard column: 4 mm × 4 mm RP 18e (5 µm), or equivalent;
— vacuum filter;
— amber glass bottles 1 l and 4 l;
— desiccator;
— degasser (optional).
6 Reagents
6.1 Acetonitrile, MeCN, HPLC grade.
6.2 Isopropanol, IPA, HPLC grade.
6.3 Ethyl acetate, HPLC grade.
6.4 Tetrahydrofuran, THF, HPLC grade.
6.5 Ethanol, HPLC grade.
6.6 Phosphoric acid, 85 %.
6.7 Deionized water, resistivity > 18,0 MΩ.cm at 25 °C.
6.8 Formaldehyde-DNPH, min. 99 %.
6.9 Acetaldehyde-DNPH, min. 99 %.
6.10 Acetone-DNPH, min. 99 %.
6.11 Acrolein-DNPH, min. 99 %.
6.12 Propionaldehyde-DNPH, min. 98 %.
6.13 Crotonaldehyde-DNPH, min. 99 %.
6.14 2-Butanone-DNPH, min. 98 %; methyl ethyl ketone-DNPH derivative.
6.15 n-Butyraldehyde-DNPH, min. 99 %.
1)
6.16 Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, ACS reagent grade .
6.17 2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH).
1) A reagent that meets the requirements of the American Chemical Society (ACS) Committee on Analytical
Reagents.
6.18 Helium, (UHP), if necessary for sparging of HPLC system mobile phase or equivalent degassing
system.
7 Preparation
7.1 Preparation of glassware
Glassware shall be cleaned and dried in such a manner as to ensure that contamination from glassware
does not occur.
All possible sources of contamination shall be removed from the work area (e.g. acetone solvent wash
bottles).
7.2 Preparation of solutions
7.2.1 DNPH solution (using phosphoric acid)
Add approximately 150 ml deionized water to a 200 ml volumetric flask, then carefully add 28 ml of
85 % phosphoric acid and mix the solution.
Make up the solution to volume with deionized water.
Weigh approximately 6,8 g (24,0 mmol should be achieved) of DNPH (approximately 30 % water) into a
2 l amber volumetric flask and add 1 l of acetonitrile. Dissolve DNPH by alternately gently swirling the
flask. Make sure there are no crystals remaining.
WARNING — Do not sonicate as a precipitation of DNPH may occur.
If using re-crystallized DNPH, weigh 4,8 g to achieve the same molarity (see Annex A).
After the DNPH is dissolved, add 58 ml of the diluted phosphoric acid solution while gently mixing.
Dilute to volume with deionized water. The colour of the solution will become bright orange upon
addition of the deionized water.
The addition of acid or water will cool the solution and may initiate the precipitation of the DNPH. Add
the acid or water slowly. Gentle swirling may be required to maintain the solution at room temperature
and to prevent the precipitation of DNPH. If crystals appear, do not sonicate.
Store the solution in a 4 l amber bottle at room temperature in the dark to prevent or significantly reduce
the chances of DNPH precipitation. T
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21160
Première édition
2018-11
Cigarettes — Dosage de carbonyles
sélectionnés dans le courant principal
de la fumée de cigarette — Méthode
par chromatographie liquide haute
performance
Cigarettes — Determination of selected carbonyls in the mainstream
smoke of cigarettes — Method using high performance liquid
chromatography
Numéro de référence
©
ISO 2018
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Appareillage . 2
6 Réactifs . 3
7 Préparation . 4
7.1 Préparation de la verrerie . 4
7.2 Préparation des solutions . 4
7.3 Préparation des étalons . 5
7.3.1 Solutions de travail et solutions d’étalonnage pour CLHP . 5
7.3.2 Solutions de travail de mélange de carbonyles . 5
8 Échantillonnage . 5
9 Préparation des produits du tabac . 5
10 Production d’échantillons — Fumage de cigarettes . 5
10.1 Généralités . 5
10.2 Montage de la machine à fumer . 6
10.3 Fumage . 7
10.3.1 Généralités . 7
10.3.2 Fumage linéaire . 7
10.3.3 Fumage rotatif . 7
11 Analyse de l’échantillon . 7
11.1 Préparation de la solution de l’extrait de fumée du courant principal . 7
11.2 Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse . 8
11.2.1 Conditions chromatographiques . 8
11.2.2 Réactifs pour la phase mobile . 8
11.2.3 Conditions de séparation par CLHP . 8
11.3 Calcul . 9
11.3.1 Courbe d’étalonnage . 9
11.3.2 Quantification des échantillons. 9
12 Répétabilité et reproductibilité .10
12.1 Généralités .10
12.2 Résultats de l’essai interlaboratoires de 2012 .10
13 Rapport d’essai .13
Annexe A (informative) Recristallisation de la 2,4-dinitrophénylhydrazine .14
Annexe B (normative) Exemple de préparation de solutions d’étalonnage .15
Annexe C (informative) Chromatogramme CLHP type d’une solution d’étalonnage d’un
mélange de carbonyles .16
Annexe D (informative) Chromatogramme CLHP d’un extrait de carbonyles de DNPH du
courant principal de fumée de cigarette .17
Bibliographie .18
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 126, Tabac et produits du tabac.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés

Introduction
Au début de ce travail, les discussions au sein du sous-groupe Analytes spéciaux du CORESTA (www
.coresta .org) ont déterminé que la plupart des laboratoires utilisaient une méthode impliquant
la dérivation des carbonyles avec de la 2,4-dinitrophénylhydrazine (DNPH), car ils estimaient
qu’il s’agissait de la méthode la plus appropriée. Celle-ci a été choisie comme base de la méthode
recommandée par le CORESTA (CRM). La CRM consistait à recueillir la fumée dans des barboteurs, à
dériver les carbonyles avec de la DNPH puis à les doser par chromatographie liquide haute performance
en phase inverse couplée à une détection UV ou à barrette de diodes (CLHP-UV ou CLHP-DAD).
Les premières expériences communes et les discussions engagées ont permis de résoudre certains
aspects méthodologiques qui devaient être évalués avant de rédiger un projet de CRM. Cette méthode a
été mise au point dans le cadre d’un essai interlaboratoires effectué en 2010 impliquant 15 laboratoires
[1]
de 11 pays différents, en utilisant le régime de fumage de l’ISO 3308. D’autres données sont fournies
pour les mêmes composés carbonyles sélectionnés à partir de 10 échantillons ayant différents
rendements en goudrons d’après un essai interlaboratoires réalisé en 2012 impliquant 19 laboratoires
[2]
de 11 pays différents .
Cette méthode comprend des recommandations sur certaines des étapes critiques qu’il convient de
contrôler afin de produire des données aussi fiables et cohérentes que les données de répétabilité et
de reproductibilité fournies dans l’ISO document. Des évaluations statistiques ont été effectuées
[3][4]
conformément à l’ISO 5725-1 et à l’ISO 5725-2 .
Aucun régime de fumage mécanique ne peut reproduire parfaitement le comportement des fumeurs.
— Il est recommandé que les cigarettes soient également soumises à essai dans des conditions
d’intensité de fumage mécanique différentes de celles spécifiées dans le présent document.
— L’essai de fumage mécanique permet de caractériser les émissions des cigarettes pour des besoins
de conception et de réglementation. Cependant, communiquer aux fumeurs les résultats des
mesurages mécaniques peut susciter des malentendus sur les niveaux d’exposition et de risques
selon les marques.
— Les données concernant l’émission de fumées obtenues à partir des mesurages mécaniques
peuvent être utilisées comme données de base pour l’évaluation des dangers du produit, mais
elles ne constituent pas des mesures valables de l’exposition des individus ou des risques, et ce
n’est pas leur but. C’est faire un usage impropre des essais réalisés conformément aux normes ISO
que de communiquer que les différences des mesurages mécaniques entre différents produits
correspondent à des différences de niveaux d’exposition ou de risque.
NORME INTERNATIONALE ISO 21160:2018(F)
Cigarettes — Dosage de carbonyles sélectionnés dans le
courant principal de la fumée de cigarette — Méthode par
chromatographie liquide haute performance
AVERTISSEMENT — Le présent document peut impliquer l’utilisation de produits dangereux
et la mise en œuvre de modes opératoires et d’appareillage à caractère dangereux. Le présent
document n’est pas destiné à traiter de tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation.
Il incombe à l’utilisateur du présent document d’établir, avant de l’utiliser, des pratiques de
sécurité et de santé appropriées et de déterminer l’applicabilité de toute autre restriction.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de dosage de carbonyles sélectionnés (formaldéhyde,
acétaldéhyde, acétone, acroléine, propionaldéhyde, crotonaldéhyde, 2-butanone et n-butyraldéhyde)
sous la forme de leurs 2,4-dinitrophénylhydrazones dans la fumée principale par CLHP-UV/DAD en
phase inverse.
Cette méthode est applicable aux cigarettes dont les rendements en matière particulaire anhydre et
exempte de nicotine (MPAEN) sont compris entre 1 mg/cigarette et 15 mg/cigarette par CLHP-UV/DAD
en phase inverse.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3308, Machine à fumer analytique de routine pour cigarettes — Définitions et conditions normalisées
ISO 3402, Tabac et produits du tabac — Atmosphère de conditionnement et d'essai
ISO 4387, Cigarettes — Détermination de la matière particulaire totale et de la matière particulaire
anhydre et exempte de nicotine au moyen d'une machine à fumer analytique de routine
ISO 8243, Cigarettes — Échantillonnage
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
4 Principe
Fumage de cigarettes sur une machine à fumer standard comme spécifiée dans l’ISO 3308 équipée
de barboteurs, mais sans le disque filtrant en fibre de verre décrit dans l’ISO 3308 (disque filtrant
Cambridge; CFP, comme exemple de produit équivalent) et le porte-disque filtrant, dans le cadre du
régime de fumage de l’ISO 3308.
Les carbonyles présents dans la fumée principale de cigarette sont piégés en faisant passer chaque
bouffée à travers un barboteur contenant une solution acidifiée de 2,4-dinitrophénylhydrazine (DNPH)
dans un mélange acétonitrile: eau 1:1.
Une partie aliquote de l’extrait de fumée est ensuite filtrée à l’aide d’une seringue et diluée avec 1 % de
tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane dans de l’acétonitrile aqueux.
Les échantillons sont soumis à une analyse par CLHP-UV ou CLHP-DAD.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire utilisé pour préparer les échantillons, les solutions et les étalons et, en
particulier, le matériel suivant.
5.1 Équipement de conditionnement des produits du tabac.
5.2 Équipement de marquage de la longueur de mégot.
5.3 Machine à fumer des produits du tabac, conforme à l’ISO 3308.
5.4 Barboteurs pour piéger la fumée principale.
5.5 Fioles Erlenmeyer, de 150 ml, avec bouchons en verre rodé (ou un récipient équivalent pour
mélanger les solutions des barboteurs).
5.6 Tube en polychlorure de vinyle (PVC), pour raccorder le système de piégeage.
5.7 Balance analytique, précise à quatre décimales.
5.8 Fioles jaugées en verre ambré, de 10 ml, 25 ml, 200 ml, 1 l et 2 l.
5.9 Micropipettes en verre, de 50 µl, 100 µl, 150 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 800 µl, 1 000 µl et 2 000 µl.
5.10 Pipettes volumétriques, de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml et 20 ml.
5.11 Éprouvettes graduées en verre, de 25 ml, 50 ml et 100 ml.
5.12 Distributeur, capable de distribuer 35 ml.
5.13 Plaque chauffante/Agitateur.
5.14 Filtre pour seringue, 0,45 µm, en PVDF, ou équivalent.
5.15 Seringues jetables, de 5 ml.
5.16 Pipettes Pasteur en verre, jetables.
5.17 Poires en caoutchouc.
5.18 Flacons pour échantillonneur automatique, bouchons et septums revêtus de PTFE.
2 © ISO 2018 – Tous droits réservés

5.19 Système CLHP, constitué de:
— pompe à gradient ternaire;
— échantillonneur automatique avec boucle d’échantillonnage appropriée;
— détecteur UV et/ou DAD;
— système de collecte de données;
— colonne CL: 250 mm × 4 mm, 100 Å, en phase inverse (PI) 18e (5 µm), ou équivalent;
— précolonne jetable: 4 mm × 4 mm RP 18e (5 µm), ou équivalent;
— système de filtration sous vide;
— flacons en verre ambré de 1 l et 4 l;
— dessiccateur;
— dégazeur (facultatif).
6 Réactifs
6.1 Acétonitrile, MeCN, de qualité CLHP.
6.2 Isopropanol, IPA, de qualité CLHP.
6.3 Acétate d’éthyle, de qualité CLHP.
6.4 Tétrahydrofurane, THF, de qualité CLHP.
6.5 Éthanol, de qualité CLHP.
6.6 Acide phosphorique, 85 %.
6.7 Eau déionisée, résistivité > 18,0 MΩ.cm à 25 °C.
6.8 Formaldéhyde-DNPH, minimum 99 %.
6.9 Acétaldehyde-DNPH, minimum 99 %.
6.10 Acétone-DNPH, minimum 99 %.
6.11 Acroléine-DNPH, minimum 99 %.
6.12 Propionaldéhyde-DNPH, minimum 98 %.
6.13 Crotonaldéhyde-DNPH, minimum 99 %.
6.14 2-Butanone-DNPH, minimum 98 %; dérivé de la méthyléthylcétone-DNPH.
6.15 n-Butyraldéhyde-DNPH, minimum 99 %.
1)
6.16 Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane, de qualité réactif ACS .
6.17 2,4-Dinitrophénylhydrazine (DNPH).
6.18 Hélium, (UHP), si nécessaire pour le barbotage dans la phase mobile du système CLHP, ou système
de dégazage équivalent.
7 Préparation
7.1 Préparation de la verrerie
La verrerie doit être nettoyée et séchée de façon à empêcher toute contamination par la verrerie.
Toutes les sources potentielles de contamination doivent être retirées de l’espace de travail (par
exemple, pissettes contenant du solvant acétone).
7.2 Préparation des solutions
7.2.1 Solution de DNPH (contenant de l’acide phosphorique)
Ajouter environ 150 ml d’eau déionisée dans une fiole jaugée de 200 ml puis ajouter soigneusement
28 ml d’acide phosphorique à 85 % et mélanger la solution.
Compléter au volume avec de l’eau déionisée.
Peser environ 6,8 g (il convient d’atteindre 24,0 mmol) de DNPH (à environ 30 % d’eau) dans une fiole
jaugée en verre ambré de 2 l et ajouter 1 l d’acétonitrile. Dissoudre la DNPH en remuant doucement la
fiole. S’assurer qu’il ne reste pas de cristaux.
AVERTISSEMENT — Ne pas passer aux ultrasons, en raison du risque de précipitation de la DNPH.
En cas d’utilisation de la DNPH recristallisée, peser 4,8 g pour atteindre la même molarité (voir
l’Annexe A).
Après dissolution de la DNPH, ajouter 58 ml de la solution d’acide phosphorique diluée tout en mélangeant
doucement. Compléter au volume avec de l’eau déionisée. La couleur de la solution deviendra orange
clair lors de l’ajout de l’eau déionisée.
L’ajout d’acide ou d’eau refroidira la solution et peut déclencher la précipitation de la DNPH. Ajouter
l’acide ou l’eau lentement. Une agitation modérée peut être requise pour maintenir la solution à
température ambiante et pour empêcher la précipitation de la DNPH. Ne pas passer aux ultrasons si des
cristaux apparaissent.
Conserver la solution dans un flacon en verre ambré de 4 l à température ambiante et à l’abri de la
lumière pour éviter ou réduire significativement les risques de précipitation de la DNPH. Si elle est bien
refermée, cette solution restera stable pendant une semaine.
7.2.2 Solution diluée de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane, 80:20 (fraction volumique),
MeCN: solution aqueuse à 1 %.
Dans une fiole jaugée de 1 l, dissoudre 2,00 g de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane dans 200 ml d’eau
déionisée. Compléter au volume avec de l’acétonitrile.
Conserver dans un flacon en verre ambré de 1 l muni d’un bouchon revêtu d’un joint en PTFE ou dans
un récipient équivalent à température ambiante.
1) Réactif répondant aux exigences du Comité de l’American Chemical Society (ACS) sur les réactifs analytiques.
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés

7.3 Préparation des étalons
7.3.1 Solutions de travail et solutio
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