Water quality -- Enumeration of Clostridium perfringens -- Method using membrane filtration

ISO 14189:2013 specifies a method for the enumeration of vegetative cells and spores of Clostridium perfringens by the membrane filtration method in samples of water intended for human consumption. However, the method can be applied to all types of water samples provided they do not contain particulate or colloidal matter that interferes with filtration.

Qualité de l'eau -- Dénombrement de Clostridium perfringens -- Méthode par filtration sur membrane

L'ISO 14189:2013 spécifie une méthode pour le dénombrement des cellules végétatives et des spores de Clostridium perfringens par filtration sur membrane dans des échantillons d'eau destinée ŕ la consommation humaine. Cette méthode peut toutefois s'appliquer ŕ tous les types d'échantillons d'eau, sous réserve qu'ils ne contiennent pas de matičre particulaire ou colloďdale interférant avec la filtration.

Kakovost vode - Ugotavljanje števila Clostridium perfringens - Metoda membranske filtracije

General Information

Status
Published
Publication Date
28-Oct-2013
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
01-Oct-2013
Completion Date
29-Oct-2013

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ISO 14189:2013 - Water quality -- Enumeration of Clostridium perfringens -- Method using membrane filtration
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ISO 14189:2014
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ISO 14189:2013 - Qualité de l'eau -- Dénombrement de Clostridium perfringens -- Méthode par filtration sur membrane
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14189
First edition
2013-11-01
Water quality — Enumeration of
Clostridium perfringens — Method
using membrane filtration
Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium perfringens —
Méthode de filtration sur membrane
Reference number
ISO 14189:2013(E)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 2

6 Culture media and reagents ...................................................................................................................................................................... 3

6.1 Basic materials ........................................................................................................................................................................................ 3

6.2 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 3

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

8.1 Transport and storage of the sample ................................................................................................................................... 3

8.2 Heat pre-treatment to select spores ..................................................................................................................................... 3

8.3 Sample dilution ....................................................................................................................................................................................... 3

8.4 Filtration ....................................................................................................................................................................................................... 4

8.5 Incubation and examination ....................................................................................................................................................... 4

8.6 Confirmation of Clostridium perfringens ..................................................................................................................... 4

9 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 5

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 5

11 Quality assurance ................................................................................................................................................................................................ 5

Annex A (normative) Composition and preparation of culture media and reagents ........................................7

Annex B (informative) Performance data ....................................................................................................................................................... 9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................12

© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers

to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
Introduction

Clostridium perfringens is widely recognized as a valuable indicator for faecal pollution. Within the

intestinal tract of animals and man, these Gram-positive bacteria form spores which are resistant to

heating compared with vegetative cells. C. perfringens in the intestine exists both as spores and vegetative

cells, spores are also found in environmental samples. The spores of C. perfringens survive in water for

months, much longer than vegetative faecal indicator bacteria and consequently their presence may

indicate remote or intermittent faecal pollution. Monitoring of C. perfringens has proven useful for the

assessment of the quality of water resources and to check the stages of water treatment to evaluate the

treatment-works performance. The spores are not always inactivated by routine disinfection procedures

(e.g. chlorination).
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 14189:2013(E)
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens —
Method using membrane filtration

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to

ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document

be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope

This International Standard specifies a method for the enumeration of vegetative cells and spores of

Clostridium perfringens by the membrane filtration method in samples of water intended for human

consumption. However, the method can be applied to all types of water samples provided they do not

contain particulate or colloidal matter that interferes with filtration.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture

ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production

of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in

the laboratory
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis

ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary

3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the

following apply:
3.1
presumptive Clostridium perfringens

bacteria which produce all shades of black or grey to yellow brown colonies on tryptose-sulfite-cycloserine

agar, even if the colour is faint, after anaerobic incubation at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h

Note 1 to entry: Unlike colonies growing directly on the agar medium, colonies on the membrane do not always

display a distinct blackening, so faint colonies are included in the count.
3.2
confirmed Clostridium perfringens

bacteria that produce characteristic colonies on tryptose-sulfite-cycloserine agar and possess the

enzyme acid phosphatase
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
4 Principle

A measured volume of the sample, or a dilution of it, is filtered through a membrane with a pore size of

0,45 µm sufficient to retain spores of clostridia. The membrane is incubated on a selective/differential

agar (tryptose-sulfite-cycloserine agar) anaerobically at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h. C. perfringens usually

produce black or grey to yellow brown colonies as a result of the reduction of sulfite to sulfide which

reacts with a ferric salt in the medium. Characteristic colonies are counted and confirmatory tests are

carried out. The result is calculated as the colony count per sample volume. If a count of spores alone is

required the sample is first pre-treated at (60 ± 2) °C to inactivate vegetative bacteria.

NOTE 1 The medium contains cycloserine as a selective agent to inhibit Bacillus species.

NOTE 2 Incubation at 44 °C increases the selectivity of the test for C. perfringens.

5 Apparatus and glassware

Except for disposable glassware or plastics ware which is delivered sterile, sterilize glassware as

specified in ISO 8199.
Usual microbiological equipment and particularly:
5.1 Membrane filtration apparatus, as specified in ISO 8199.
5.2 Sterile filter funnels

Use funnels either delivered sterile or sterilized as specified in ISO 8199. Alternatively flaming of funnels

made of metal prior to their use is acceptable.
NOTE For this method it is insufficient to disinfect funnels by boiling.
5.3 Sterile membrane filters, nominal pore size 0,45 µm.

The quality of membrane filters may vary from brand to brand or even from batch to batch. It is therefore

advisable to check the quality on a regular basis.
5.4 Incubators, capable of being maintained at (36 ± 2) °C and at (44 ± 1) °C.

5.5 Water bath (optional), capable of being maintained at (60 ± 2) °C equipped with a means of

circulating the water.
5.6 Autoclave, capable of being maintained at (121 ± 3) °C.
5.7 Sterile forceps
5.8 Anaerobic jars, or similar equipment.

5.9 Anaerobic gas generating system, to generate an atmosphere of approximately 90 % hydrogen

and 10 % carbon dioxide.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 14189:2013(E)
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials

For uniformity of results, in the preparation of media, use constituents of uniform quality and chemicals

of recognized analytical grade. For preparation of the media use glass-distilled water or deionized water

[1]
of equivalent purity, as specified for water grade 3 in ISO 3696 .

Alternatively, use commercially available dehydrated complete medium and reagents prepared and

used according to the manufacturer’s instructions.

Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to lead to the same results.

6.2 Culture media
See Annex A.
6.2.1 Tryptose sulfite cycloserine agar (TSC agar), References [6][11][12]
See A.1.
6.2.2 Blood agar or Columbia agar base or another suitable nutrient-rich agar
See A.2.
6.2.3 Acid phosphatase reagent
See A.3.
7 Sampling
Carry out sampling as specified in ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Transport and storage of the sample

Start examination as soon as possible after the collection of the sample preferably within the same

working day. Samples should be cooled during transport ideally at (5 ± 3) °C. The recommended maximum

sample storage time including transport is for vegetative bacteria 12 h and for spores 24 h. The sample

storage time including transport shall not exceed 18 h for vegetative bacteria and 72 h for spores.

8.2 Heat pre-treatment to select spores

If it is the intention to count only spores, mix the sample well and then heat it to (60 ± 2) °C in a water bath

for (15 ± 1) min. The volume heated should be greater than the volume to be analysed. The temperature

should be monitored by placing an appropriate thermometer in a reference bottle of the same size as the

sample bottle and containing the same volume of water at the same initial temperature as the sample

being treated. The time taken to reach (60 ± 2) °C shall not exceed 15 min and can be minimized by

ensuring the water in the water bath is circulated to maximize heat exchange.
8.3 Sample dilution

A test volume of sample or dilution of it - after heat treatment if required - should be chosen to yield,

if possible, between 10 and 80 colonies on a membrane 47 mm to 50 mm in diameter. Test volumes or

dilutions should be prepared as described in ISO 8199.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
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ISO 14189:2013(E)
8.4 Filtration
For a general description of the membrane filtration technique see ISO 8199.

Filter a measured volume of water. The volume should be appropriate to the water being examined. For

water intended for human consumption, it is usual to filter a volume of 100 ml. Record the volume filtered.

After filtration, place the membrane grid face upwards on a TSC agar plate ensuring that no air bubbles

are trapped under the filter.

NOTE Alternatively, a thin layer (about 5 ml to 10 ml related to a petri dish of 90 mm diameter) molten

TSC agar (equilibrated in a water bath at (45 ± 1) °C) as
...

SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 14189:2014
01-marec-2014
Kakovost vode - Ugotavljanje števila Clostridium perfringens - Metoda
membranske filtracije
Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane
filtration

Qualité de l'eau - Dénombrement de Clostridium perfringens - Méthode de filtration sur

membrane
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 14189:2013
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
SIST ISO 14189:2014 en,fr

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.

---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14189
First edition
2013-11-01
Water quality — Enumeration of
Clostridium perfringens — Method
using membrane filtration
Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium perfringens —
Méthode de filtration sur membrane
Reference number
ISO 14189:2013(E)
ISO 2013
---------------------- Page: 3 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
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© ISO 2013

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
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Fax + 41 22 749 09 47
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ISO 14189:2013(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 2

6 Culture media and reagents ...................................................................................................................................................................... 3

6.1 Basic materials ........................................................................................................................................................................................ 3

6.2 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 3

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

8.1 Transport and storage of the sample ................................................................................................................................... 3

8.2 Heat pre-treatment to select spores ..................................................................................................................................... 3

8.3 Sample dilution ....................................................................................................................................................................................... 3

8.4 Filtration ....................................................................................................................................................................................................... 4

8.5 Incubation and examination ....................................................................................................................................................... 4

8.6 Confirmation of Clostridium perfringens ..................................................................................................................... 4

9 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 5

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 5

11 Quality assurance ................................................................................................................................................................................................ 5

Annex A (normative) Composition and preparation of culture media and reagents ........................................7

Annex B (informative) Performance data ....................................................................................................................................................... 9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................12

© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 5 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers

to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
Introduction

Clostridium perfringens is widely recognized as a valuable indicator for faecal pollution. Within the

intestinal tract of animals and man, these Gram-positive bacteria form spores which are resistant to

heating compared with vegetative cells. C. perfringens in the intestine exists both as spores and vegetative

cells, spores are also found in environmental samples. The spores of C. perfringens survive in water for

months, much longer than vegetative faecal indicator bacteria and consequently their presence may

indicate remote or intermittent faecal pollution. Monitoring of C. perfringens has proven useful for the

assessment of the quality of water resources and to check the stages of water treatment to evaluate the

treatment-works performance. The spores are not always inactivated by routine disinfection procedures

(e.g. chlorination).
© ISO 2013 – All rights reserved v
---------------------- Page: 7 ----------------------
SIST ISO 14189:2014
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SIST ISO 14189:2014
INTERNATIONAL STANDARD ISO 14189:2013(E)
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens —
Method using membrane filtration

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to

ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document

be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope

This International Standard specifies a method for the enumeration of vegetative cells and spores of

Clostridium perfringens by the membrane filtration method in samples of water intended for human

consumption. However, the method can be applied to all types of water samples provided they do not

contain particulate or colloidal matter that interferes with filtration.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture

ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production

of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in

the laboratory
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis

ISO/IEC Guide 2:2004, Standardization and related activities — General vocabulary

3 Terms and definitions

For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO/IEC Guide 2 and the

following apply:
3.1
presumptive Clostridium perfringens

bacteria which produce all shades of black or grey to yellow brown colonies on tryptose-sulfite-cycloserine

agar, even if the colour is faint, after anaerobic incubation at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h

Note 1 to entry: Unlike colonies growing directly on the agar medium, colonies on the membrane do not always

display a distinct blackening, so faint colonies are included in the count.
3.2
confirmed Clostridium perfringens

bacteria that produce characteristic colonies on tryptose-sulfite-cycloserine agar and possess the

enzyme acid phosphatase
© ISO 2013 – All rights reserved 1
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SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
4 Principle

A measured volume of the sample, or a dilution of it, is filtered through a membrane with a pore size of

0,45 µm sufficient to retain spores of clostridia. The membrane is incubated on a selective/differential

agar (tryptose-sulfite-cycloserine agar) anaerobically at (44 ± 1) °C for (21 ± 3) h. C. perfringens usually

produce black or grey to yellow brown colonies as a result of the reduction of sulfite to sulfide which

reacts with a ferric salt in the medium. Characteristic colonies are counted and confirmatory tests are

carried out. The result is calculated as the colony count per sample volume. If a count of spores alone is

required the sample is first pre-treated at (60 ± 2) °C to inactivate vegetative bacteria.

NOTE 1 The medium contains cycloserine as a selective agent to inhibit Bacillus species.

NOTE 2 Incubation at 44 °C increases the selectivity of the test for C. perfringens.

5 Apparatus and glassware

Except for disposable glassware or plastics ware which is delivered sterile, sterilize glassware as

specified in ISO 8199.
Usual microbiological equipment and particularly:
5.1 Membrane filtration apparatus, as specified in ISO 8199.
5.2 Sterile filter funnels

Use funnels either delivered sterile or sterilized as specified in ISO 8199. Alternatively flaming of funnels

made of metal prior to their use is acceptable.
NOTE For this method it is insufficient to disinfect funnels by boiling.
5.3 Sterile membrane filters, nominal pore size 0,45 µm.

The quality of membrane filters may vary from brand to brand or even from batch to batch. It is therefore

advisable to check the quality on a regular basis.
5.4 Incubators, capable of being maintained at (36 ± 2) °C and at (44 ± 1) °C.

5.5 Water bath (optional), capable of being maintained at (60 ± 2) °C equipped with a means of

circulating the water.
5.6 Autoclave, capable of being maintained at (121 ± 3) °C.
5.7 Sterile forceps
5.8 Anaerobic jars, or similar equipment.

5.9 Anaerobic gas generating system, to generate an atmosphere of approximately 90 % hydrogen

and 10 % carbon dioxide.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 14189:2013(E)
6 Culture media and reagents
6.1 Basic materials

For uniformity of results, in the preparation of media, use constituents of uniform quality and chemicals

of recognized analytical grade. For preparation of the media use glass-distilled water or deionized water

[1]
of equivalent purity, as specified for water grade 3 in ISO 3696 .

Alternatively, use commercially available dehydrated complete medium and reagents prepared and

used according to the manufacturer’s instructions.

Other grades of chemicals may be used provided they can be shown to lead to the same results.

6.2 Culture media
See Annex A.
6.2.1 Tryptose sulfite cycloserine agar (TSC agar), References [6][11][12]
See A.1.
6.2.2 Blood agar or Columbia agar base or another suitable nutrient-rich agar
See A.2.
6.2.3 Acid phosphatase reagent
See A.3.
7 Sampling
Carry out sampling as specified in ISO 19458.
8 Procedure
8.1 Transport and storage of the sample

Start examination as soon as possible after the collection of the sample preferably within the same

working day. Samples should be cooled during transport ideally at (5 ± 3) °C. The recommended maximum

sample storage time including transport is for vegetative bacteria 12 h and for spores 24 h. The sample

storage time including transport shall not exceed 18 h for vegetative bacteria and 72 h for spores.

8.2 Heat pre-treatment to select spores

If it is the intention to count only spores, mix the sample well and then heat it to (60 ± 2) °C in a water bath

for (15 ± 1) min. The volume heated should be greater than the volume to be analysed. The temperature

should be monitored by placing an appropriate thermometer in a reference bottle of the same size as the

sample bottle and containing the same volume of water at the same initial temperature as the sample

being treated. The time taken to reach (60 ± 2) °C shall not exceed 15 min and can be minimized by

ensuring the water in the water bath is circulated to maximize heat exchange.
8.3 Sample dilution

A test volume of sample or dilution of it - after heat treatment if required - should be chosen to yield,

if possible, between 10 and 80 colonies on a membrane 47 mm to 50 mm in diameter. Test volumes or

dilutions should be prepared as described in ISO 8199.
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SIST ISO 14189:2014
ISO 14189:2013(E)
8.4 Filtration
For a general description of the membrane filtration te
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NORME ISO
INTERNATIONALE 14189
Première édition
2013-11-01
Qualité de l’eau — Dénombrement de
Clostridium perfringens — Méthode
par filtration sur membrane
Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method
using membrane filtration
Numéro de référence
ISO 14189:2013(F)
ISO 2013
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ISO 14189:2013(F)
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Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................................................................ 2

6 Milieux de culture et réactifs ................................................................................................................................................................... 3

6.1 Matériaux de base ................................................................................................................................................................................ 3

6.2 Milieux de culture ................................................................................................................................................................................. 3

6.2.1 Gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine (gélose TSC), Références [6][11][12] ................. 3

6.2.2 Gélose au sang ou base de gélose Columbia ou autre gélose adaptée riche

en nutriments ..................................................................................................................................................................... 3

6.2.3 Réactif de la phosphatase acide .......................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 3

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

8.1 Transport et stockage de l’échantillon ............................................................................................................................... 3

8.2 Prétraitement thermique pour la sélection des spores ....................................................................................... 3

8.3 Dilution de l’échantillon .................................................................................................................................................................. 4

8.4 Filtration ....................................................................................................................................................................................................... 4

8.5 Incubation et examen ........................................................................................................................................................................ 4

8.6 Confirmation de Clostridium perfringens .................................................................................................................... 4

8.6.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 4

8.6.2 Essai à la phosphatase acide .................................................................................................................................. 5

8.6.3 Interprétation ..................................................................................................................................................................... 5

9 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 5

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 5

11 Assurance de la qualité .................................................................................................................................................................................. 5

Annexe A (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs ........................7

Annexe B (informative) Données de performance ................................................................................................................................. 9

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................12

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Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation

de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation

mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien

suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 4, Méthodes microbiologiques.
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ISO 14189:2013(F)
Introduction

Les bactéries Clostridium perfringens sont largement reconnues comme étant un précieux indicateur

de pollution fécale. Dans le tractus intestinal des animaux et de l’homme, ces bactéries Gram positives

forment des spores qui, contrairement aux cellules végétatives, sont résistantes à la chaleur. Dans

les intestins, C. perfringens est présent sous forme de spores et de cellules végétatives, lesquelles se

retrouvent également dans les échantillons environnementaux. Les spores de C. perfringens survivent

dans l’eau pendant des mois, ce qui est nettement plus long que les bactéries végétatives indicatrices

d’une contamination fécale et, par conséquent, la présence de ces spores peut indiquer une pollution

fécale éloignée ou intermittente. La surveillance de C. perfringens s’est avérée utile pour évaluer

la qualité des ressources en eau et contrôler les phases du traitement de l’eau afin d’en évaluer les

performances. Les spores ne sont pas toujours inactivées par les modes opératoires de désinfection de

routine (chloration, par exemple).
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NORME INTERNATIONALE ISO 14189:2013(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement de Clostridium
perfringens — Méthode par filtration sur membrane

AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques

courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes de

sécurité potentiels associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir

les pratiques de sécurité et de santé appropriées et d’assurer la conformité aux réglementations

nationales.

IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent

document le soient par du personnel dûment qualifié.
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode pour le dénombrement des cellules végétatives

et des spores de Clostridium perfringens par filtration sur membrane dans des échantillons d’eau destinée

à la consommation humaine. Cette méthode peut toutefois s’appliquer à tous les types d’échantillons

d’eau, sous réserve qu’ils ne contiennent pas de matière particulaire ou colloïdale interférant avec la

filtration.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur

milieu de culture

ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Lignes directrices pour la préparation et la production des

milieux de culture — Partie 1: Lignes directrices générales d’assurance qualité pour la préparation des

milieux de culture en laboratoire
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
Guide ISO/IEC 2:2004, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans le Guide Guide ISO/IEC 2

ainsi que les suivants s’appliquent.
3.1
Clostridium perfringens présomptives

bactéries qui produisent toutes les nuances de colonies noires ou grises à jaunes-brunes sur la gélose

Tryptose-Sulfite-Cyclosérine, même si la coloration est légère, après incubation anaérobie à (44 ± 1) °C

pendant (21 ± 3) h

Note 1 à l’article: à l’Article Contrairement aux colonies qui se développent directement sur le milieu gélosé,

les colonies sur la membrane ne présentent pas toujours un noircissement distinct et, de ce fait, les colonies

légèrement colorées sont incluses dans le dénombrement.
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ISO 14189:2013(F)
3.2
Clostridium perfringens confirmées

bactéries qui produisent des colonies caractéristiques sur la gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine et

possèdent l’enzyme phosphatase acide
4 Principe

Un volume mesuré de l’échantillon, ou une dilution de ce dernier, est filtré à travers une membrane

ayant des pores de 0,45 µm, cette dimension étant suffisante pour retenir les spores de clostridia. La

membrane est incubée sur une gélose sélective/différentielle (gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine)

en anaérobiose à (44 ± 1) °C pendant (21 ± 3) h. Les C. perfringens produisent généralement des

colonies de couleur noire ou grise à jaune-brune suite à la réduction du sulfite en sulfure qui réagit

avec un sel ferrique présent dans le milieu. Les colonies caractéristiques sont dénombrées et des

essais de confirmation réalisés. Le résultat calculé est exprimé en unités formant colonie par volume

d’échantillon. Si seul un dénombrement de spores est requis, l’échantillon est d’abord soumis à un

prétraitement à (60 ± 2) °C afin d’inactiver les bactéries végétatives.

NOTE 1 Le milieu contient de la cyclosérine comme agent sélectif pour inhiber les espèces de Bacillus.

NOTE 2 L’incubation à 44 °C augmente la sélectivité de l’essai pour C. perfringens.

5 Appareillage et verrerie

Hormis la verrerie ou le matériel en plastique à usage unique qui est fourni stérile, stériliser la verrerie

tel que spécifié dans l’ISO 8199.
Utiliser un équipement de microbiologie courant et, en particulier:
5.1 Appareillage de filtration sur membrane, tel que spécifié dans l’ISO 8199.
5.2 Entonnoirs de filtration stériles

Utiliser des entonnoirs stériles à usage unique ou stérilisés conformément à l’ISO 8199. Alternativement,

flamber les entonnoirs métalliques avant de les utiliser.

NOTE Pour cette méthode, une désinfection des entonnoirs par ébullition n’est pas suffisante.

5.3 Membranes filtrantes stériles, ayant des pores de dimension nominale 0,45 µm.

La qualité des membranes filtrantes peut varier d’un fournisseur à l’autre, voire d’un lot à un autre. Il

est donc conseillé de vérifier régulièrement la qualité des membranes.
5.4 Étuves thermostatées, pouvant être maintenues à (36 ± 2) °C et (44 ± 1) °C.

5.5 Bain d’eau (facultatif), pouvant être maintenu à (60 ± 2) °C et équipé d’un système de

circulation d’eau.
5.6 Autoclave, pouvant être maintenu à (121 ± 3) °C.
5.7 Pince stérile
5.8 Jarres anaérobies, ou équipement similaire.
5.9 Système générateur de gaz anaérobie, pour produire une atmosphère contenant
approximativement 90 % d’hydrogène et 10 % de dioxyde de carbone.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 14189:2013(F)
6 Milieux de culture et réactifs
6.1 Matériaux de base

Pour l’uniformité des résultats, les constituants utilisés dans la préparation des milieux doivent être

de qualité uniforme et les produits chimiques de qualité analytique reconnue. Pour la préparation des

milieux, utiliser de l’eau distillée dans une verrerie ou de l’eau déionisée de pureté équivalente, tel que

[1]
spécifié dans l’ISO 3696 pour une eau de qualité 3.

Il est également possible d’utiliser un milieu complet déshydraté et des réactifs disponibles dans le

commerce, préparés et utilisés conformément aux instructions du fabricant.

D’autres qualités de produits chimiques peuvent être utilisées, sous réserve de démontrer qu’elles

conduisent aux mêmes résultats.
6.2 Milieux de culture
Voir Annexe A.
6.2.1 Gélose Tryptose-Sulfite-Cyclosérine (gélose TSC), Références [6][11][12]
Voir A.1.

6.2.2 Gélose au sang ou base de gélose Columbia ou autre gélose adaptée riche en nutriments

Voir A.2.
6.2.3 Réactif de la phosphatase acide
Voir A.3.
7 Échantillonnage
Procéder à l’échantillonnage tel que spécifié dans l’ISO 19458.
8 Mode opératoire
8.1 Transport et stockage de l’échantillon

Débuter l’examen dès que possible après le prélèvement de l’échantillon, de préférence le même jour. Il

convient de refroidir les échantillons pendant le transport, idéalement à (5 ± 3) °C. La durée de stockage

maximale recommandée pour l’échantillon, transport inclus, est de 12 h pour les bactéries végétatives

et de 24 h pour les spores. La durée de stockage de l’échantillon, transport inclus, ne doit pas dépasser

18 h pour les bactéries végétatives et 72 h pour les spores.
8.2 Prétraitement thermique pour la sélection des spores

Si seul un dénombrement de spores est souhaité, bien homogénéiser l’échantillon puis le chauffer à

(60 ± 2) °C dans un bain d’eau pendant (15 ± 1) min. Il convient que le volume chauffé soit supérieur

à celui à analyser. Il est recommandé de surveiller la température en plaçant un thermomètre adapté

dans un flacon de référence de taille identique au flacon d’échantillon et contenant le même volume

d’eau à la même température initiale que l’échantillon en cours de traitement. Le temps requis pour

atteindre (60 ± 2) °C ne doit pas dépasser 15 min et peut être réduit en assurant une circulation d’eau

dans le bain afin d’optimiser l’échange thermique.
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ISO 14189:2013(F)
8.3 Dilution de l’échantillon

Il convient de choisir un volume d’essai de l’échantillon ou une dilution de ce dernier - après le traitement

thermique si requis - de manière à obtenir, si possible, entre 10 et 80 colonies sur une membrane

de 47 mm à 50 mm de diamètre. Il est recommandé de préparer les volumes d’essai ou les dilutions

conformément à la description de l’ISO 8199.
8.4 Filtration

Pour obtenir une description générale de la méthode de filtration sur membrane, voir l’ISO 8199.

Filtrer un volume d’eau mesuré. Il convient d’adapter le volume au type d’eau en cours d’analyse. Pour les

eaux destinées à la consommation humaine, un volume de 100 m
...

Questions, Comments and Discussion

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