Milk and milk products -- Starter cultures, probiotics and fermented products -- Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry

ISO 19344:2015 specifies a standardized method for the quantification of active and/or total lactic acid bacteria and probiotic strains in starter cultures used in dairy products by means of flow cytometry. The method is also applicable to probiotics used in dairy products and to fermented milk products such as yogurts containing primarily lactic acid bacteria. This International Standard does not apply to taxonomical differentiation of bacteria. Due to its non-specificity, the method may quantify other bacteria than those within the scope of this International Standard, when present in the sample. This may lead to overestimation of the counts. The minimum bacterial cell concentration in the sample before applying this standardized method depends on the dilution rates used in the individual protocols. Typically 106 cells per gram or ml are considered within the minimum range.

Lait et produits laitiers -- Ferments lactiques, probiotiques et produits fermentés -- Quantification de bactéries lactiques par cytométrie en flux

L'ISO 19344:2015 spécifie une méthode normalisée permettant de quantifier les bactéries lactiques actives et/ou totales et les souches probiotiques dans les ferments lactiques utilisés dans les produits laitiers, au moyen de la cytométrie en flux. La méthode s'applique également aux probiotiques utilisés dans les produits laitiers et aux produits laitiers fermentés, tels que les yaourts, contenant essentiellement des bactéries lactiques. L'ISO 19344:2015 ne s'applique pas ŕ la différenciation taxonomique des bactéries. En raison de sa non-spécificité, la méthode peut quantifier d'autres bactéries que celles indiquées dans le domaine d'application de l'ISO 19344:2015, lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon. Cela peut conduire ŕ une surestimation des dénombrements. La concentration minimale de cellules bactériennes dans l'échantillon avant l'application de cette méthode normalisée dépend des taux de dilution utilisés dans chaque protocole. En général, on considčre que 106 cellules par gramme ou ml se situent dans la plage minimale.

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Publication Date
07-Dec-2015
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
24-Mar-2021
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ISO 19344:2015 - Milk and milk products -- Starter cultures, probiotics and fermented products -- Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry
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ISO 19344:2015 - Lait et produits laitiers -- Ferments lactiques, probiotiques et produits fermentés -- Quantification de bactéries lactiques par cytométrie en flux
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19344
IDF
232
First edition
2015-12-15
Milk and milk products — Starter
cultures, probiotics and fermented
products — Quantification of lactic
acid bacteria by flow cytometry
Lait et produits laitiers — Cultures, probiotiques et produits fermentés
— Quantification de bactéries lactiques par cytométrie en flux
Reference numbers
ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
ISO and IDF 2015
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© ISO and IDF 2015, Published in Switzerland

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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
Contents Page

Forewords .....................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Diluents and reagents ..................................................................................................................................................................................... 3

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 3

5.2 Peptone-salt solution ......................................................................................................................................................................... 3

5.3 Diluents and reagents for staining protocols ................................................................................................................ 3

5.3.1 Protocol A ............................................................................................................................................................................... 4

5.3.2 Protocol B ............................................................................................................................................................................... 4

5.3.3 Protocol C ............................................................................................................................................................................... 5

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 6

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 7

8 Preparation of test sample ......................................................................................................................................................................... 7

8.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 7

8.2 Freeze-dried cultures ........................................................................................................................................................................ 7

8.3 Frozen cultures ....................................................................................................................................................................................... 8

8.4 Fermented milk products .............................................................................................................................................................. 8

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 8

9.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 8

9.2 Staining .......................................................................................................................................................................................................... 8

9.2.1 Protocol A ............................................................................................................................................................................... 9

9.2.2 Protocol B ............................................................................................................................................................................... 9

9.2.3 Protocol C ............................................................................................................................................................................... 9

9.3 Flow cytometry analysis ..............................................................................................................................................................10

9.3.1 General...................................................................................................................................................................................10

9.3.2 Instruments and settings .......................................................................................................................................10

9.4 Gating ...........................................................................................................................................................................................................11

9.4.1 General...................................................................................................................................................................................11

9.4.2 Protocol A ............................................................................................................................................................................11

9.4.3 Protocol B ............................................................................................................................................................................13

9.4.4 Protocol C ............................................................................................................................................................................14

10 Calculation and expression of results ..........................................................................................................................................15

11 Critical factors affecting results .........................................................................................................................................................16

12 Precision ....................................................................................................................................................................................................................17

12.1 Interlaboratory test..........................................................................................................................................................................17

12.2 Repeatability ..........................................................................................................................................................................................18

12.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................18

13 Test report ................................................................................................................................................................................................................18

Annex A (informative) Diagram of staining protocols .....................................................................................................................19

Annex B (informative) Calculation example of the appropriate sample dilution ...............................................21

Annex C (informative) Interlaboratory test................................................................................................................................................22

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................25

© ISO and IDF 2015 – All rights reserved iii
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
Forewords

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk

and milk products and the International Dairy Federation (IDF). This document is being published

jointly by ISO and IDF.
iv © ISO and IDF 2015 – All rights reserved
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)

IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the

interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National

Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national

interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and

governments/food control authorities.

ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis

and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International

Standards using the logos and reference numbers of both organizations.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

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constitute an endorsement.

ISO 19344 | IDF 232 was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Dairy

Microorganisms and the ISO Technical Committee ISO/TC 34 on Food products, Subcommittee SC 5 on

Milk and milk products.

The work was carried out by the IDF/ISO Project Group on Quantification of Lactic Acid Bacteria by Flow

Cytometry of the Standing Committee on Analytical Methods for Dairy Microorganisms under the aegis of

its project leader, Sandra Casani (DK), Ph.D.
© ISO and IDF 2015 – All rights reserved v
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
Introduction

Quantification of lactic acid bacteria is an important factor in assessing the quality of starter cultures,

probiotics and fermented milk products. Examination of lactic acid bacteria in these products can be

done following different method principles, with plate count techniques being the most traditional and

widely used. Newer techniques include flow cytometry, which is able to determine cells as active and/or

total units. Advantages of the use of flow cytometry include low variation, differentiation between

active and total cells, and possibility of high analysis throughout. Furthermore, the quantification and

use of the fraction of active cells per total cells is a key feature and an important flow cytometry tool to

evaluate the fitness of a given cell population. This is of special relevance for certain applications such

as optimization of production process and stability assessment during shelf-life.

The International Organization for Standardization (ISO) and the International Dairy Federation

(IDF) draw attention to the fact that compliance with this document may involve the use of patents

concerning the staining of protocol C as described in this document.

Neither ISO nor IDF take position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.

The holder of these patent rights has ensured ISO and IDF that he/she is willing to negotiate licences

either free of charge or under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants

throughout the patented territory. In this respect, the statement of the holder of these patent rights is

registered with ISO. Information may be obtained from:
Chr. Hansen A/S
Boege Alle 10-12
2970 Hoersholm
Denmark

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject

of patent rights other than those identified above. Neither ISO nor IDF shall be held responsible for

identifying any or all such patent rights.

ISO (www.iso.org/patents) and IEC (http://patents.iec.ch) maintain online databases of patents

relevant to their standards. Users are encouraged to consult the databases for the most up-to-date

information concerning patents.
vi © ISO and IDF 2015 – All rights reserved
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ISO 19344:2015(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 232:2015(E)
Milk and milk products — Starter cultures, probiotics
and fermented products — Quantification of lactic acid
bacteria by flow cytometry

WARNING — The use of this International Standard may involve hazardous materials and

operations. This International Standard does not purport to address all the safety problems

associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to

establish safety and health practices and to determine the applicability of regulatory limitations

prior to use.
1 Scope

This International Standard specifies a standardized method for the quantification of active and/or

total lactic acid bacteria and probiotic strains in starter cultures used in dairy products by means of

flow cytometry. The method is also applicable to probiotics used in dairy products and to fermented

milk products such as yogurts containing primarily lactic acid bacteria.

This International Standard does not apply to taxonomical differentiation of bacteria. Due to its non-

specificity, the method may quantify other bacteria than those within the scope of this International

Standard, when present in the sample. This may lead to overestimation of the counts.

The minimum bacterial cell concentration in the sample before applying this standardized method

depends on the dilution rates used in the individual protocols. Typically 10 cells per gram or ml are

considered within the minimum range.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 6887-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial

suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the

preparation of the initial suspension and decimal dilutions

ISO 6887-5:2010, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial

suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the

preparation of milk and milk products

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations

ISO 7889 | IDF 117, Yogurt — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at

37 °C

ISO 15214, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of

mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 °C
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
3.1
lactic acid bacteria

gram-positive, non-motile, non-spore forming, catalase-negative, nitrate-reductase-negative and

cytochrome oxidase-negative bacterium that does not liquefy gelatine or produce indole

Note 1 to entry: Lactic acid bacteria have a fermentative metabolism which is mainly saccharolytic. Lactic acid is

the major end product from carbohydrate utilization.

EXAMPLE Lactic acid bacteria of importance for the dairy industry are: Streptococcus thermophilus,

Lactococcus lactis, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc and Lactobacillus.
3.2
probiotic strains

probiotic strains are live microorganisms which, when administered in adequate amounts, are intended

to confer a health benefit to the host

EXAMPLE Probiotic strains of importance are: Bifidobacterium animalis, Lactobacillus casei, Lactobacillus

paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum and

Propionibacterium freudenreichii.
Note 1 to entry: See Reference [1].
3.3
active fluorescent units
AFU

events counted in a gate specific for scatter/fluorescence characteristics of presumed live cells, i.e. cells

stained for the specific activity indicator used in the protocol
3.4
non-active fluorescent units
n-AFU

events counted in a gate specific for scatter/fluorescence characteristics of presumed dead cells, i.e.

cells damaged to an extend that they do not stain for the specific activity indicator used in the protocol

3.5
total fluorescent units
TFU
sum of AFU and n-AFU
3.6
% active fluorescent units
% AFU
percentage ratio of AFU to TFU
4 Principle
4.1 A test portion or sample is prepared, and diluted if necessary.

4.2 Initial suspensions, and/or dilutions if needed, are stained according to one of the following three

protocols, differing on the target of fluorescent cell staining, in order to discriminate active and total

fluorescent units:

a) dual staining targeting nucleic acid with the non-permeant red-fluorescent dye propidium iodide

(PI) and intracelullar enzyme activity based on cleavage of 5(6)-carboxyfluorescein diacetate

(cFDA) mixed isomers to green-fluorescent carboxyfluorescein by intracellular esterases;

2 © ISO and IDF 2015 – All rights reserved
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)

b) dual nucleic acid staining with PI and a cell-permeant green fluorescent dye, i.e. SYTO® 24 green

fluorescent cell-permeant nucleic acid stain;

c) single staining with the membrane-potential-sensitive cyanine dye 3,3’-diethyloxacarbocyanine

iodide (DiOC ). Wavelength of emitted light changes with metabolic activation of cells.

The choice of the staining protocol depends on the user’s preferences or possibilities.

4.3 The stained samples are analysed by means of a flow cytometer using a combination of light

scattering (LS) and detection of emitted fluorescent light. As cells pass into the flow cytometer, each cell

is counted and the fluorescence is recorded.

4.4 Gating is conducted to separate cells from noise and to differentiate AFUs and n-AFUs.

4.5 Calculation of the concentration in the original sample is a multiplication of AFUs (or TFUs) per

volume of analysed sample and the dilution factors employed in the sample preparation.

5 Diluents and reagents
5.1 General

Unless otherwise specified, use only reagents of recognized analytical grade, and distilled or deionized

water or water of equivalent purity, according to ISO 7218.

Prepare the initial suspension (common for all protocols) with the diluent as specified in 5.2.

The composition and the preparation of all the reagents used in each of the three staining protocols (A, B

and C) are specified in 5.3. An overview of the diluents and reagents per protocol is given in Table 1.

5.2 Peptone-salt solution

The composition and preparation of the peptone-salt solution is according to ISO 6887-5:2010, 5.2.1.

NOTE For the preparation of the initial suspension, and dilutions if needed, other diluents for general use

mentioned in ISO 6887-5:2010 can be used if they can be shown to lead to the same results.

5.3 Diluents and reagents for staining protocols

WARNING — Propidium iodide is a potential mutagen. Proper actions for deactivation should be

taken in case of spilling. Preparation and application of the dye solution shall be carried out in a

fume cupboard, using protective equipment and following good laboratory practices.

Table 1 — Reagents used per protocol
Reagent Protocol A Protocol B Protocol C
Diluent PBS (5.3.1.1) PBS (5.3.2.1) MRS or M17 broth
(5.3.3.1 or 5.3.3.2)
Dye solution cFDA (5.3.1.2) PI (5.3.2.2) Glucose solution (5.3.3.3.1)
PI (5.3.1.3) SYTO® 24 (5.3.2.3) DiOC (5.3.3.3.2)
Buffer solution (5.3.3.3.3)

1) SYTO® 24 green fluorescent cell-permeant nucleic acid stain is supplied by Life Technologies. This information

is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the

product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.

© ISO and IDF 2015 – All rights reserved 3
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
5.3.1 Protocol A
5.3.1.1 Phosphate-buffered saline (PBS)
5.3.1.1.1 Composition
— 9 g sodium chloride (NaCl)
— 795 mg sodium hydrogenphosphate heptahydrate (Na HPO ·7H O)
2 4 2
— 144 mg potassium dihydrogen phosphate (KH PO )
2 4
5.3.1.1.2 Preparation

Dissolve the components (see 5.3.1.1.1) in water. Add water to a final volume of 1 000 ml. Adjust the pH

with HCl to 7,4 ± 0,05, if necessary. Distribute the solution into aliquots and sterilize in an autoclave set

at 121 °C ± 1 °C (liquid cycle) for 15 min. The diluent can be stored at cooling temperature (3 °C ± 2 °C)

for up to 6 months.
5.3.1.2 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate (cFDA) mixed isomers solution
5.3.1.2.1 Composition
— 230 mg 5(6)-cFDA mixed isomers
— 100 ml dimethyl sulfoxide (DMSO)
5.3.1.2.2 Preparation

A 5 mmol/l solution is prepared by dissolving cFDA in DMSO at the amounts specified in 5.3.1.2.1. The

solution can be stored at −18 °C ± 2 °C, protected from light, for up to 6 months.

5.3.1.3 Propidium iodide (PI)
5.3.1.3.1 Composition
— 100 mg PI
— 100 ml ultrapure water
5.3.1.3.2 Preparation

Dissolve the PI in ultrapure water to a final concentration of 1,0 mg/ml, corresponding to approximately

1,5 mmol/l. This can be stored at 3 °C ± 2 °C, protected from light, for up to 6 months.

NOTE The concentration of the PI solution used is 0,1 % and the final concentration is 0,002 %. This is below

the potential toxicity level.
5.3.2 Protocol B
5.3.2.1 Phosphate-buffered saline (PBS)
See 5.3.1.1.
4 © ISO and IDF 2015 – All rights reserved
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
5.3.2.2 Propidium iodide (PI)

See 5.3.1.3 for the preparation of the PI solution. The PI solution shall be further diluted to 0,2 mmol/l

with water prior to use.

NOTE The concentration of the PI solution used is 0,01 % and the final concentration is 0,000 1 %. This is

below the potential toxicity level.
5.3.2.3 SYTO® 24 green fluorescent cell-permeant nucleic acid stain

The stain is a 5 mmol/l solution in DMSO. Store at −20 °C, protected from light, for up to 12 months. The

solution shall be diluted to 0,1 mmol/l with water before use.
5.3.3 Protocol C
5.3.3.1 MRS broth

The composition and the preparation are specified in ISO 15214 except for no addition of agar.

5.3.3.2 M17 broth

The composition and the preparation are specified in ISO 7889 except for no addition of agar.

5.3.3.3 Stain mixture

The stain mixture consists of 210 µl 50 % glucose solution (5.3.3.3.1), 210 µl 1,5 mmol/l DiOC (5.3.3.3.2)

and 50 ml buffer solution (5.3.3.3.3). The stain mixture is prepared the same day as it is used.

5.3.3.3.1 Glucose solution
5.3.3.3.1.1 Composition
— 50 g D(+)-glucose monohydrate
— 50 g water
5.3.3.3.1.2 Preparation

A 50 % glucose solution is prepared by dissolving the glucose in the water. This is aided by warming

the solution to below the boiling point. Avoid evaporation. The solution is autoclaved at 121 °C ± 1 °C for

15 min and can be stored unopened at 3 °C ± 2 °C for up to 3 months.
5.3.3.3.2 3,3’-diethyloxacarbocyanine iodide (DiOC )
5.3.3.3.2.1 Composition
— 69 mg 3,3’-DiOC , ≥ 98 %
— 100 ml dimethyl sulfoxide (DMSO)
5.3.3.3.2.2 Preparation

The DiOC staining is prepared as a 1,5 mmol/l solution by weighing DiOC into DMSO at the amounts

2 2

specified in 5.3.3.3.2.1. Dispense in, e.g., 1 ml tubes. Keep dark, as DiOC is unstable in light, at 5 °C ± 3 °C

for up to 12 months.
© ISO and IDF 2015 – All rights reserved 5
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ISO 19344:2015(E)
IDF 232:2015(E)
5.3.3.3.3 Buffer solution
5.3.3.3.3.1 Composition
— 7,6 g sodium chloride (NaCl; 130 mmol/l)
— 0,5 g sodium dihydrogenphosphate dihydrate (NaH PO ·H O; 3 mmol/l)
2 4 2
— 1,24 g sodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO ·2H O; 7 mmol/l)
2 4 2
— 1 000 ml water
5.3.3.3.3.2 Preparation

Weigh and dissolve the three salts in the water at the amounts specified in 5.3.3.3.3.1. Stirring is

applied until the salts are dissolved. Adjust pH to 6,5 ± 0,05 with 2,5 mol/l HCl. The solution shall then

be filtered through a 0,22 μm filter. The mixture can be kept at 3 °C ± 2 °C for up to one week. For longer

periods, up to 6 months, storage at −20 °C is recommended.
6 Apparatus

Usual laboratory equipment and, in particular, the equipment required for the preparation of test

samples and dilutions specified in ISO 6887-5, as well as the following, shall be used.

6.1 Water bath, capable of operating at 21 °C ± 1 °C.

6.2 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with readability to 0,1 mg.

6.3 pH-meter, with temperature compensation, accurate to ± 0,1 pH unit.
6.4 Incubator, heating block or equivalent, capable of operat
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 19344
FIL
232
Première édition
2015-12-15
Lait et produits laitiers — Ferments
lactiques, probiotiques et produits
fermentés — Quantification de
bactéries lactiques par cytométrie en
flux
Milk and milk products — Starter cultures, probiotics and fermented
products — Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry
Numéros de référence
ISO 19344:2015(F)
FIL 232:2015(F)
ISO et FIL 2015
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 19344:2015(F)
FIL 232:2015(F)
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© ISO et FIL 2015, Publié en Suisse

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ISO 19344:2015(F)
FIL 232:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Diluants et réactifs ............................................................................................................................................................................................. 3

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 3

5.2 Solution de peptone-sel ................................................................................................................................................................... 3

5.3 Diluants et réactifs pour les protocoles de coloration .......................................................................................... 3

5.3.1 Protocole A ............................................................................................................................................................................ 4

5.3.2 Protocole B ............................................................................................................................................................................ 5

5.3.3 Protocole C ............................................................................................................................................................................ 5

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 6

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 7

8 Préparation de l’échantillon pour essai ....................................................................................................................................... 7

8.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 7

8.2 Cultures lyophilisées .......................................................................................................................................................................... 7

8.3 Cultures congelées ............................................................................................................................................................................... 8

8.4 Produits laitiers fermentés ........................................................................................................................................................... 8

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 9

9.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 9

9.2 Coloration .................................................................................................................................................................................................... 9

9.2.1 Protocole A ............................................................................................................................................................................ 9

9.2.2 Protocole B ............................................................................................................................................................................ 9

9.2.3 Protocole C .........................................................................................................................................................................10

9.3 Analyse par cytométrie en flux ..............................................................................................................................................10

9.3.1 Généralités .........................................................................................................................................................................10

9.3.2 Instruments et réglages ..........................................................................................................................................11

9.4 Fenêtrage ..................................................................................................................................................................................................12

9.4.1 Généralités .........................................................................................................................................................................12

9.4.2 Protocole A .........................................................................................................................................................................12

9.4.3 Protocole B .........................................................................................................................................................................14

9.4.4 Protocole C .........................................................................................................................................................................15

10 Calcul et expression des résultats ...................................................................................................................................................16

11 Facteurs critiques affectant les résultats .................................................................................................................................18

12 Fidélité .........................................................................................................................................................................................................................19

12.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................19

12.2 Répétabilité .............................................................................................................................................................................................19

12.3 Reproductibilité ..................................................................................................................................................................................19

13 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................20

Annexe A (informative) Schéma des protocoles de coloration ...............................................................................................21

Annexe B (informative) Exemple de calcul de la dilution appropriée de l’échantillon ................................23

Annexe C (informative) Essai interlaboratoires ....................................................................................................................................24

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................27

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FIL 232:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de

brevets reçues (voir www.iso.org/patents).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos -

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Le présent document

est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
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FIL 232:2015(F)

La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente

les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont

organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de

groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des

acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des

universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.

L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes

d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient

conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux

organisations.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

L’ISO 19344 | FIL 232 a été élaborée par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse pour

les microorganismes du lait de la Fédération internationale du lait (FIL) et par le Comité technique

ISO/TC 34 Produits alimentaires, sous-comité SC 5 Lait et produits laitiers.

Les travaux ont été réalisés par le groupe de projet mixte ISO/FIL sur la Quantification des bactéries

lactiques par cytométrie en flux du Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse pour les

microorganismes du lait, sous la conduite de son chef de projet, Dr Sandra Casani (DK).

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FIL 232:2015(F)
Introduction

La quantification des bactéries lactiques est un facteur important dans l’évaluation de la qualité

des ferments lactiques, des probiotiques et des produits laitiers fermentés. Les bactéries lactiques

contenues dans ces produits peuvent être examinées selon différents principes méthodologiques, les

techniques de numération sur plaque étant les plus traditionnelles et les plus couramment utilisées.

Les techniques plus récentes comprennent la cytométrie en flux qui permet de déterminer les

cellules en tant qu’unités actives et/ou totales. Les avantages de la cytométrie en flux comprennent

une faible variation, une différenciation entre cellules actives et cellules totales et la possibilité d’une

vitesse d’analyse élevée. De plus, la quantification et l’utilisation de la fraction de cellules actives par

cellules totales est une caractéristique clé et un outil important de la cytométrie en flux pour évaluer

l’adéquation d’une population de cellules donnée. Ceci est particulièrement intéressant pour certaines

applications telles que l’optimisation du procédé de production et l’évaluation de la stabilité pendant la

durée de conservation.

L’Organisation internationale de normalisation (ISO) et la Fédération Internationale du Lait (FIL)

attirent l’attention sur le fait que la conformité au présent document peut impliquer l’utilisation de

brevets relatifs au protocole de coloration C décrit dans le présent document.

Ni l’ISO ni la FIL ne prennent position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application

de ces droits de propriété intellectuelle.

Les détenteurs de ces droits de propriété intellectuelle ont garanti à l’ISO et à la FIL qu’ils souhaitent

négocier des licences gratuites ou à des conditions raisonnables et non discriminatoires avec les

demandeurs sur tout le territoire couvert par les brevets. À cet égard, les déclarations des détenteurs

de ces droits de propriété intellectuelle sont enregistrées avec l’ISO. Il est possible d’obtenir des

informations auprès de:
Chr. Hansen A/S
Boege Alle 10-12
2970 Hoersholm
Denmark

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues autres que ceux identifiés ci-devant. Ni l’ISO ni

la FIL ne sauraient être tenues pour responsables de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et

averti de leur existence.

L’ISO (www.iso.org/brevets) et l’IEC (http://patents.iec.ch) tiennent à jour des bases de données

de brevets concernant leurs normes, pouvant être consultées en ligne. Les utilisateurs sont invités à

consulter les bases de données pour obtenir les informations les plus récentes sur les brevets.

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ISO 19344:2015(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 232:2015(F)
Lait et produits laitiers — Ferments lactiques, probiotiques
et produits fermentés — Quantification de bactéries
lactiques par cytométrie en flux

AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l’emploi

de produits et la mise en œuvre d’opérations à caractère dangereux. La présente Norme

internationale n’a pas pour objectif de traiter tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation.

Il est de la responsabilité de l’utilisateur de la présente Norme internationale d’établir, avant

de l’utiliser, les procédures d’hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer si certaines

restrictions réglementaires s’appliquent.
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode normalisée permettant de quantifier les

bactéries lactiques actives et/ou totales et les souches probiotiques dans les ferments lactiques utilisés

dans les produits laitiers, au moyen de la cytométrie en flux. La méthode s’applique également aux

probiotiques utilisés dans les produits laitiers et aux produits laitiers fermentés, tels que les yaourts,

contenant essentiellement des bactéries lactiques.

La présente Norme internationale ne s’applique pas à la différenciation taxonomique des bactéries.

En raison de sa non-spécificité, la méthode peut quantifier d’autres bactéries que celles indiquées

dans le domaine d’application de la présente Norme internationale, lorsqu’elles sont présentes dans

l’échantillon. Cela peut conduire à une surestimation des dénombrements.

La concentration minimale de cellules bactériennes dans l’échantillon avant l’application de cette

méthode normalisée dépend des taux de dilution utilisés dans chaque protocole. En général, on

considère que 10 cellules par gramme ou ml se situent dans la plage minimale.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 6887-1:1999, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des

dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de

la suspension mère et des dilutions décimales

ISO 6887-5:2010, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des

dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 5: Règles spécifiques pour la préparation

du lait et des produits laitiers
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

ISO 7889 | FIL 117, Yaourt — Dénombrement des micro-organismes caractéristiques — Technique de

comptage des colonies à 37 °C

ISO 15214, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries

lactiques mésophiles — Technique par comptage des colonies à 30 °C
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

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ISO 19344:2015(F)
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3.1
bactérie lactique

bactérie Gram-positive, non mobile, non sporogène, catalase-négative, nitrate-réductase-négative et

cytochrome-oxydase-négative, qui ne liquéfie pas la gélatine et ne produit pas d’indole

Note 1 à l’article: Une bactérie lactique présente un métabolisme fermentatif essentiellement saccharolytique.

L’acide lactique est le principal produit final résultant de l’utilisation de glucides.

EXEMPLE Les bactéries lactiques importantes pour l’industrie laitière sont: Streptococcus thermophilus,

Lactococcus lactis, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc et Lactobacillus.
3.2
souches probiotiques

microorganismes vivants qui, administrés en quantité suffisante, procurent un bénéfice pour la santé

de l’hôte

EXEMPLE Les souches probiotiques importantes sont: Bifidobacterium animalis, Lactobacillus casei,

Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus

plantarum et Propionibacterium freudenreichii.
Note 1 à l’article: Voir la Référence [1].
3.3
unités fluorescentes actives
UFA

événements dénombrés dans une fenêtre spécifique des caractéristiques de diffusion/fluorescence de

cellules supposées vivantes, c’est-à-dire de cellules colorées par l’indicateur d’activité spécifique utilisé

dans le protocole
3.4
unités fluorescentes non actives
n-UFA

événements dénombrés dans une fenêtre spécifique des caractéristiques de diffusion/fluorescence de

cellules supposées mortes, c’est-à-dire de cellules endommagées dans une mesure telle qu’elles ne sont

pas colorées par l’indicateur d’activité spécifique utilisé dans le protocole
3.5
unités fluorescentes totales
UFT
somme de UFA et n-UFA
3.6
% d’unités fluorescentes actives
% UFA
rapport en pourcentage de UFA à UFT
4 Principe

4.1 Une prise d’essai ou un échantillon pour essai est préparé(e) et dilué(e) si nécessaire.

4.2 Les suspensions initiales, et/ou dilutions si nécessaire, sont colorées conformément à l’un des trois

protocoles suivants, selon l’objet de la coloration des cellules fluorescentes, afin de différencier les unités

fluorescentes actives et totales:

a) double coloration ciblant les acides nucléiques par le colorant fluorescent rouge, non perméant,

iodure de propidium (PI), et l’activité enzymatique intracellulaire basée sur le clivage des isomères

mixtes de diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine (cFDA) en carboxyfluorescéine fluorescente verte

par les estérases intracellulaires;
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b) double coloration des acides nucléiques par PI et un colorant fluorescent vert perméant pour les

cellules, à savoir le colorant fluorescent vert pour acides nucléiques perméant pour les cellules

SYTO® 24 ;

c) coloration simple par le colorant cyanine sensible au potentiel de membrane, iodure de

3,3′-diéthyloxacarbocyanine (DiOC ). La longueur d’onde de la lumière émise varie avec l’activation

métabolique des cellules.

Le choix du protocole de coloration dépend des préférences ou possibilités de l’utilisateur.

4.3 Les échantillons colorés sont analysés à l’aide d’un cytomètre en flux utilisant une combinaison de

diffusion de la lumière et de détection de la lumière fluorescente émise. Lorsque les cellules passent dans

le cytomètre en flux, chaque cellule est comptée et la fluorescence est enregistrée.

4.4 Un fenêtrage est réalisé pour séparer les cellules du bruit et pour différencier les UFA des n-UFA.

4.5 Le calcul de la concentration dans l’échantillon initial consiste à multiplier les UFA (ou UFT) par

volume d’échantillon analysé et les facteurs de dilution employés lors de la préparation de l’échantillon.

5 Diluants et réactifs
5.1 Généralités

Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau

distillée ou déionisée ou de l’eau d’une pureté équivalente, conformément à l’ISO 7218.

Préparer la suspension initiale (commune à tous les protocoles) avec le diluant spécifié en 5.2.

La composition et la préparation de tous les réactifs employés dans chacun des trois protocoles de

coloration (A, B et C) sont spécifiées en 5.3. Une vue d’ensemble des diluants et des réactifs est donnée

dans le Tableau 1 pour chaque protocole.
5.2 Solution de peptone-sel

La composition et la préparation de la solution de peptone-sel sont conformes à l’ISO 6887-5:2010, 5.2.1.

NOTE Pour la préparation de la suspension initiale, et des dilutions si nécessaire, d’autres diluants d’usage

général mentionnés dans l’ISO 6887-5:2010 peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes

résultats.
5.3 Diluants et réactifs pour les protocoles de coloration

AVERTISSEMENT — L’iodure de propidium est un mutagène potentiel. En cas de déversement

accidentel, il convient de prendre les mesures de désactivation appropriées. La solution de

colorant doit être préparée et appliquée dans une sorbonne, en utilisant un équipement de

protection et en respectant les bonnes pratiques de laboratoire.

1) Le colorant fluorescent vert pour acides nucléiques perméant pour les cellules SYTO 24 est fourni par

Life Technologies. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait

constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés

s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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Tableau 1 — Réactifs utilisés pour chaque protocole
Réactif Protocole A Protocole B Protocole C
Diluant PBS (5.3.1.1) PBS (5.3.2.1) Bouillon MRS ou M17
(5.3.3.1 ou 5.3.3.2)
Solution de colorant cFDA (5.3.1.2) PI (5.3.2.2) Solution de glucose (5.3.3.3.1)
PI (5.3.1.3) SYTO® 24 (5.3.2.3) DiOC (5.3.3.3.2)
Solution tampon (5.3.3.3.3)
5.3.1 Protocole A
5.3.1.1 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
5.3.1.1.1 Composition
— 9 g de chlorure de sodium (NaCl)
— 795 mg d’hydrogénophosphate de sodium heptahydraté (Na HPO ·7H O)
2 4 2
— 144 mg de dihydrogénophosphate de potassium (KH PO )
2 4
5.3.1.1.2 Préparation

Dissoudre les composants (voir 5.3.1.1.1) dans de l’eau. Compléter avec de l’eau au volume final

de 1 000 ml. Ajuster le pH à 7,4 ± 0,05 avec du HCl, si nécessaire. Répartir la solution en aliquotes et

stériliser en autoclave à 121 °C ± 1 °C (cycle liquide) pendant 15 min. Le diluant peut être conservé à

une température de réfrigération de (3 °C ± 2 °C) pendant 6 mois au maximum.

5.3.1.2 Solution d’isomères mixtes de diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine (cFDA)

5.3.1.2.1 Composition
— 230 mg d’isomères mixtes de 5(6)-cFDA
— 100 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO)
5.3.1.2.2 Préparation

Une solution 5 mmol/l est préparée en dissolvant le cFDA dans du DMSO dans les quantités spécifiées

en 5.3.1.2.1. La solution peut être conservée pendant 6 mois au maximum à −18 °C ± 2 °C, à l’abri de la

lumière.
5.3.1.3 Iodure de propidium (PI)
5.3.1.3.1 Composition
— 100 mg de PI
— 100 ml d’eau ultrapure
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5.3.1.3.2 Préparation

Dissoudre le PI dans de l’eau ultrapure de manière à obtenir une concentration finale de 1,0 mg/ml,

correspondant approximativement à 1,5 mmol/l. La solution peut être conservée pendant 6 mois à

3 °C ± 2 °C, à l’abri de la lumière.

NOTE La concentration de la solution de PI utilisée est de 0,1 % et la concentration finale est de 0,002 %.

Cette valeur est inférieure au niveau de toxicité potentielle.
5.3.2 Protocole B
5.3.2.1 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Voir 5.3.1.1.
5.3.2.2 Iodure de propidium (PI)

Voir 5.3.1.3 pour la préparation de la solution de PI. Avant utilisation, la solution de PI doit être diluée à

0,2 mmol/l avec de l’eau.

NOTE La concentration de la solution de PI utilisée est de 0,01 % et la concentration finale est de 0,000 1 %.

Cette valeur est inférieure au niveau de toxicité potentielle.
5.3.2.3 Colorant fluorescent ver
...

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