ISO 19344:2015

Milk and milk products - Starter cultures, probiotics and fermented products - Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry

ISO 19344:2015 specifies a standardized method for the quantification of active and/or total lactic acid bacteria and probiotic strains in starter cultures used in dairy products by means of flow cytometry. The method is also applicable to probiotics used in dairy products and to fermented milk products such as yogurts containing primarily lactic acid bacteria. This International Standard does not apply to taxonomical differentiation of bacteria. Due to its non-specificity, the method may quantify other bacteria than those within the scope of this International Standard, when present in the sample. This may lead to overestimation of the counts. The minimum bacterial cell concentration in the sample before applying this standardized method depends on the dilution rates used in the individual protocols. Typically 106 cells per gram or ml are considered within the minimum range.

Lait et produits laitiers — Ferments lactiques, probiotiques et produits fermentés — Quantification de bactéries lactiques par cytométrie en flux

L'ISO 19344:2015 spécifie une méthode normalisée permettant de quantifier les bactéries lactiques actives et/ou totales et les souches probiotiques dans les ferments lactiques utilisés dans les produits laitiers, au moyen de la cytométrie en flux. La méthode s'applique également aux probiotiques utilisés dans les produits laitiers et aux produits laitiers fermentés, tels que les yaourts, contenant essentiellement des bactéries lactiques. L'ISO 19344:2015 ne s'applique pas à la différenciation taxonomique des bactéries. En raison de sa non-spécificité, la méthode peut quantifier d'autres bactéries que celles indiquées dans le domaine d'application de l'ISO 19344:2015, lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon. Cela peut conduire à une surestimation des dénombrements. La concentration minimale de cellules bactériennes dans l'échantillon avant l'application de cette méthode normalisée dépend des taux de dilution utilisés dans chaque protocole. En général, on considère que 106 cellules par gramme ou ml se situent dans la plage minimale.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 07-Dec-2015
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 24-Mar-2021
• Completion Date: 30-Oct-2025

Relations

• Consolidated By: ISO 10545-15:2021 - Ceramic tiles - Part 15: Determination of lead and cadmium given off by tiles
• Effective Date: 06-Jun-2022

Overview

ISO 19344:2015 (IDF 232:2015) specifies a standardized method to quantify lactic acid bacteria and probiotic strains in starter cultures, probiotics and fermented milk products (e.g., yogurts) using flow cytometry. The standard covers quantification of both active and total cells, describes sampling, sample preparation, staining protocols, instrument settings and result calculation, and includes guidance on precision and reporting.

Key technical topics and requirements

• Scope & limits
  • Applicable to starter cultures, probiotics used in dairy and fermented milk products containing primarily lactic acid bacteria.
  • Not intended for taxonomic differentiation; due to non-specificity the method may count other bacteria and potentially overestimate results.
  • Typical minimum pre-analysis concentration: around 10^6 cells per g or ml, depending on dilution strategy.
• Method components
  • Detailed procedures for sampling, preparation of test samples (including freeze-dried and frozen cultures), and appropriate diluents and reagents.
  • Multiple staining protocols (Protocol A, B, C) with diagrams and reagent guidance - note that Protocol C may involve patent rights (Chr. Hansen A/S).
  • Flow cytometry analysis: instrument settings, gating strategies for active vs total cells, and analysis workflows.
  • Calculation and expression of results, critical factors affecting results, and a precision assessment (repeatability, reproducibility, interlaboratory testing).
• Safety & compliance
  • Includes a warning about hazardous materials and recommends users establish appropriate safety and regulatory procedures.

Practical applications

• Rapid, high-throughput quantification of starter culture potency during production and QC.
• Measuring probiotic content and viability in dairy formulations and finished fermented products.
• Monitoring production optimization and shelf-life stability by tracking the fraction of active vs total cells.
• Supporting R&D and formulation work where cell fitness/viability is a key performance indicator.

Who should use this standard

• Dairy industry quality control and microbiology laboratories
• Starter culture and probiotic manufacturers
• Contract testing laboratories and regulatory bodies assessing product claims
• Research groups working on dairy fermentation, probiotic viability or process development

Related standards

• ISO 6887-1 and ISO 6887-5 (sample preparation and dilutions)
• ISO 7218 (general microbiological examination guidance)
• ISO 7889 / IDF 117 and ISO 15214 (colony-count techniques for yogurt and lactic acid bacteria)

Keywords: ISO 19344:2015, flow cytometry, lactic acid bacteria quantification, starter cultures, probiotics, fermented milk, dairy microbiology, active cell count, total cell count.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19344
IDF
First edition
2015-12-15
Milk and milk products — Starter
cultures, probiotics and fermented
products — Quantification of lactic
acid bacteria by flow cytometry
Lait et produits laitiers — Cultures, probiotiques et produits fermentés
— Quantification de bactéries lactiques par cytométrie en flux
Reference numbers
IDF 232:2015(E)
©
ISO and IDF 2015
IDF 232:2015(E)
© ISO and IDF 2015, Published in Switzerland
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
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IDF 232:2015(E)
Contents Page
Forewords .iv
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Diluents and reagents . 3
5.1 General . 3
5.2 Peptone-salt solution . 3
5.3 Diluents and reagents for staining protocols . 3
5.3.1 Protocol A . 4
5.3.2 Protocol B . 4
5.3.3 Protocol C . 5
6 Apparatus . 6
7 Sampling . 7
8 Preparation of test sample . 7
8.1 General . 7
8.2 Freeze-dried cultures . 7
8.3 Frozen cultures . 8
8.4 Fermented milk products . 8
9 Procedure. 8
9.1 General . 8
9.2 Staining . 8
9.2.1 Protocol A . 9
9.2.2 Protocol B . 9
9.2.3 Protocol C . 9
9.3 Flow cytometry analysis .10
9.3.1 General.10
9.3.2 Instruments and settings .10
9.4 Gating .11
9.4.1 General.11
9.4.2 Protocol A .11
9.4.3 Protocol B .13
9.4.4 Protocol C .14
10 Calculation and expression of results .15
11 Critical factors affecting results .16
12 Precision .17
12.1 Interlaboratory test.17
12.2 Repeatability .18
12.3 Reproducibility .18
13 Test report .18
Annex A (informative) Diagram of staining protocols .19
Annex B (informative) Calculation example of the appropriate sample dilution .21
Annex C (informative) Interlaboratory test.22
Bibliography .25
IDF 232:2015(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk
and milk products and the International Dairy Federation (IDF). This document is being published
jointly by ISO and IDF.
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IDF 232:2015(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
ISO 19344 | IDF 232 was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Dairy
Microorganisms and the ISO Technical Committee ISO/TC 34 on Food products, Subcommittee SC 5 on
Milk and milk products.
The work was carried out by the IDF/ISO Project Group on Quantification of Lactic Acid Bacteria by Flow
Cytometry of the Standing Committee on Analytical Methods for Dairy Microorganisms under the aegis of
its project leader, Sandra Casani (DK), Ph.D.
IDF 232:2015(E)
Introduction
Quantification of lactic acid bacteria is an important factor in assessing the quality of starter cultures,
probiotics and fermented milk products. Examination of lactic acid bacteria in these products can be
done following different method principles, with plate count techniques being the most traditional and
widely used. Newer techniques include flow cytometry, which is able to determine cells as active and/or
total units. Advantages of the use of flow cytometry include low variation, differentiation between
active and total cells, and possibility of high analysis throughout. Furthermore, the quantification and
use of the fraction of active cells per total cells is a key feature and an important flow cytometry tool to
evaluate the fitness of a given cell population. This is of special relevance for certain applications such
as optimization of production process and stability assessment during shelf-life.
The International Organization for Standardization (ISO) and the International Dairy Federation
(IDF) draw attention to the fact that compliance with this document may involve the use of patents
concerning the staining of protocol C as described in this document.
Neither ISO nor IDF take position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.
The holder of these patent rights has ensured ISO and IDF that he/she is willing to negotiate licences
either free of charge or under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants
throughout the patented territory. In this respect, the statement of the holder of these patent rights is
registered with ISO. Information may be obtained from:
Chr. Hansen A/S
Boege Alle 10-12
2970 Hoersholm
Denmark
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject
of patent rights other than those identified above. Neither ISO nor IDF shall be held responsible for
identifying any or all such patent rights.
ISO (www.iso.org/patents) and IEC (http://patents.iec.ch) maintain online databases of patents
relevant to their standards. Users are encouraged to consult the databases for the most up-to-date
information concerning patents.
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INTERNATIONAL STANDARD
IDF 232:2015(E)
Milk and milk products — Starter cultures, probiotics
and fermented products — Quantification of lactic acid
bacteria by flow cytometry
WARNING — The use of this International Standard may involve hazardous materials and
operations. This International Standard does not purport to address all the safety problems
associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to
establish safety and health practices and to determine the applicability of regulatory limitations
prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a standardized method for the quantification of active and/or
total lactic acid bacteria and probiotic strains in starter cultures used in dairy products by means of
flow cytometry. The method is also applicable to probiotics used in dairy products and to fermented
milk products such as yogurts containing primarily lactic acid bacteria.
This International Standard does not apply to taxonomical differentiation of bacteria. Due to its non-
specificity, the method may quantify other bacteria than those within the scope of this International
Standard, when present in the sample. This may lead to overestimation of the counts.
The minimum bacterial cell concentration in the sample before applying this standardized method
depends on the dilution rates used in the individual protocols. Typically 10 cells per gram or ml are
considered within the minimum range.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the
preparation of the initial suspension and decimal dilutions
ISO 6887-5:2010, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the
preparation of milk and milk products
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 7889 | IDF 117, Yogurt — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at
37 °C
ISO 15214, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of
mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 °C
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
IDF 232:2015(E)
3.1
lactic acid bacteria
gram-positive, non-motile, non-spore forming, catalase-negative, nitrate-reductase-negative and
cytochrome oxidase-negative bacterium that does not liquefy gelatine or produce indole
Note 1 to entry: Lactic acid bacteria have a fermentative metabolism which is mainly saccharolytic. Lactic acid is
the major end product from carbohydrate utilization.
EXAMPLE Lactic acid bacteria of importance for the dairy industry are: Streptococcus thermophilus,
Lactococcus lactis, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc and Lactobacillus.
3.2
probiotic strains
probiotic strains are live microorganisms which, when administered in adequate amounts, are intended
to confer a health benefit to the host
EXAMPLE Probiotic strains of importance are: Bifidobacterium animalis, Lactobacillus casei, Lactobacillus
paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum and
Propionibacterium freudenreichii.
Note 1 to entry: See Reference [1].
3.3
active fluorescent units
AFU
events counted in a gate specific for scatter/fluorescence characteristics of presumed live cells, i.e. cells
stained for the specific activity indicator used in the protocol
3.4
non-active fluorescent units
n-AFU
events counted in a gate specific for scatter/fluorescence characteristics of presumed dead cells, i.e.
cells damaged to an extend that they do not stain for the specific activity indicator used in the protocol
3.5
total fluorescent units
TFU
sum of AFU and n-AFU
3.6
% active fluorescent units
% AFU
percentage ratio of AFU to TFU
4 Principle
4.1 A test portion or sample is prepared, and diluted if necessary.
4.2 Initial suspensions, and/or dilutions if needed, are stained according to one of the following three
protocols, differing on the target of fluorescent cell staining, in order to discriminate active and total
fluorescent units:
a) dual staining targeting nucleic acid with the non-permeant red-fluorescent dye propidium iodide
(PI) and intracelullar enzyme activity based on cleavage of 5(6)-carboxyfluorescein diacetate
(cFDA) mixed isomers to green-fluorescent carboxyfluorescein by intracellular esterases;
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1)
b) dual nucleic acid staining with PI and a cell-permeant green fluorescent dye, i.e. SYTO® 24 green
fluorescent cell-permeant nucleic acid stain;
c) single staining with the membrane-potential-sensitive cyanine dye 3,3’-diethyloxacarbocyanine
iodide (DiOC ). Wavelength of emitted light changes with metabolic activation of cells.
The choice of the staining protocol depends on the user’s preferences or possibilities.
4.3 The stained samples are analysed by means of a flow cytometer using a combination of light
scattering (LS) and detection of emitted fluorescent light. As cells pass into the flow cytometer, each cell
is counted and the fluorescence is recorded.
4.4 Gating is conducted to separate cells from noise and to differentiate AFUs and n-AFUs.
4.5 Calculation of the concentration in the original sample is a multiplication of AFUs (or TFUs) per
volume of analysed sample and the dilution factors employed in the sample preparation.
5 Diluents and reagents
5.1 General
Unless otherwise specified, use only reagents of recognized analytical grade, and distilled or deionized
water or water of equivalent purity, according to ISO 7218.
Prepare the initial suspension (common for all protocols) with the diluent as specified in 5.2.
The composition and the preparation of all the reagents used in each of the three staining protocols (A, B
and C) are specified in 5.3. An overview of the diluents and reagents per protocol is given in Table 1.
5.2 Peptone-salt solution
The composition and preparation of the peptone-salt solution is according to ISO 6887-5:2010, 5.2.1.
NOTE For the preparation of the initial suspension, and dilutions if needed, other diluents for general use
mentioned in ISO 6887-5:2010 can be used if they can be shown to lead to the same results.
5.3 Diluents and reagents for staining protocols
WARNING — Propidium iodide is a potential mutagen. Proper actions for deactivation should be
taken in case of spilling. Preparation and application of the dye solution shall be carried out in a
fume cupboard, using protective equipment and following good laboratory practices.
Table 1 — Reagents used per protocol
Reagent Protocol A Protocol B Protocol C
Diluent PBS (5.3.1.1) PBS (5.3.2.1) MRS or M17 broth
(5.3.3.1 or 5.3.3.2)
Dye solution cFDA (5.3.1.2) PI (5.3.2.2) Glucose solution (5.3.3.3.1)
PI (5.3.1.3) SYTO® 24 (5.3.2.3) DiOC (5.3.3.3.2)
Buffer solution (5.3.3.3.3)
1) SYTO® 24 green fluorescent cell-permeant nucleic acid stain is supplied by Life Technologies. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
IDF 232:2015(E)
5.3.1 Protocol A
5.3.1.1 Phosphate-buffered saline (PBS)
5.3.1.1.1 Composition
— 9 g sodium chloride (NaCl)
— 795 mg sodium hydrogenphosphate heptahydrate (Na HPO ·7H O)
2 4 2
— 144 mg potassium dihydrogen phosphate (KH PO )
2 4
5.3.1.1.2 Preparation
Dissolve the components (see 5.3.1.1.1) in water. Add water to a final volume of 1 000 ml. Adjust the pH
with HCl to 7,4 ± 0,05, if necessary. Distribute the solution into aliquots and sterilize in an autoclave set
at 121 °C ± 1 °C (liquid cycle) for 15 min. The diluent can be stored at cooling temperature (3 °C ± 2 °C)
for up to 6 months.
5.3.1.2 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate (cFDA) mixed isomers solution
5.3.1.2.1 Composition
— 230 mg 5(6)-cFDA mixed isomers
— 100 ml dimethyl sulfoxide (DMSO)
5.3.1.2.2 Preparation
A 5 mmol/l solution is prepared by dissolving cFDA in DMSO at the amounts specified in 5.3.1.2.1. The
solution can be stored at −18 °C ± 2 °C, protected from light, for up to 6 months.
5.3.1.3 Propidium iodide (PI)
5.3.1.3.1 Composition
— 100 mg PI
— 100 ml ultrapure water
5.3.1.3.2 Preparation
Dissolve the PI in ultrapure water to a final concentration of 1,0 mg/ml, corresponding to approximately
1,5 mmol/l. This can be stored at 3 °C ± 2 °C, protected from light, for up to 6 months.
NOTE The concentration of the PI solution used is 0,1 % and the final concentration is 0,002 %. This is below
the potential toxicity level.
5.3.2 Protocol B
5.3.2.1 Phosphate-buffered saline (PBS)
See 5.3.1.1.
4 © ISO and IDF 2015 – All rights reserved

IDF 232:2015(E)
5.3.2.2 Propidium iodide (PI)
See 5.3.1.3 for the preparation of the PI solution. The PI solution shall be further diluted to 0,2 mmol/l
with water prior to use.
NOTE The concentration of the PI solution used is 0,01 % and the final concentration is 0,000 1 %. This is
below the potential toxicity level.
5.3.2.3 SYTO® 24 green fluorescent cell-permeant nucleic acid stain
The stain is a 5 mmol/l solution in DMSO. Store at −20 °C, protected from light, for up to 12 months. The
solution shall be diluted to 0,1 mmol/l with water before use.
5.3.3 Protocol C
5.3.3.1 MRS broth
The composition and the preparation are specified in ISO 15214 except for no addition of agar.
5.3.3.2 M17 broth
The composition and the preparation are specified in ISO 7889 except for no addition of agar.
5.3.3.3 Stain mixture
The stain mixture consists of 210 µl 50 % glucose solution (5.3.3.3.1), 210 µl 1,5 mmol/l DiOC (5.3.3.3.2)
and 50 ml buffer solution (5.3.3.3.3). The stain mixture is prepared the same day as it is used.
5.3.3.3.1 Glucose solution
5.3.3.3.1.1 Composition
— 50 g D(+)-glucose monohydrate
— 50 g water
5.3.3.3.1.2 Preparation
A 50 % glucose solution is prepared by dissolving the glucose in the water. This is aided by warming
the solution to below the boiling point. Avoid evaporation. The solution is autoclaved at 121 °C ± 1 °C for
15 min and can be stored unopened at 3 °C ± 2 °C for up to 3 months.
5.3.3.3.2 3,3’-diethyloxacarbocyanine iodide (DiOC )
5.3.3.3.2.1 Composition
— 69 mg 3,3’-DiOC , ≥ 98 %
— 100 ml dimethyl sulfoxide (DMSO)
5.3.3.3.2.2 Preparation
The DiOC staining is prepared as a 1,5 mmol/l solution by weighing DiOC into DMSO at the amounts
2 2
specified in 5.3.3.3.2.1. Dispense in, e.g., 1 ml tubes. Keep dark, as DiOC is unstable in light, at 5 °C ± 3 °C
for up to 12 months.
IDF 232:2015(E)
5.3.3.3.3 Buffer solution
5.3.3.3.3.1 Composition
— 7,6 g sodium chloride (NaCl; 130 mmol/l)
— 0,5 g sodium dihydrogenphosphate dihydrate (NaH PO ·H O; 3 mmol/l)
2 4 2
— 1,24 g sodium hydrogenphosphate dihydrate (Na HPO ·2H O; 7 mmol/l)
2 4 2
— 1 000 ml water
5.3.3.3.3.2 Preparation
Weigh and dissolve the three salts in the water at the amounts specified in 5.3.3.3.3.1. Stirring is
applied until the salts are dissolved. Adjust pH to 6,5 ± 0,05 with 2,5 mol/l HCl. The solution shall then
be filtered through a 0,22 μm filter. The mixture can be kept at 3 °C ± 2 °C for up to one week. For longer
periods, up to 6 months, storage at −20 °C is recommended.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the equipment required for the preparation of test
samples and dilutions specified in ISO 6887-5, as well as the following, shall be used.
6.1 Water bath, capable of operating at 21 °C ± 1 °C.
6.2 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with readability to 0,1 mg.
6.3 pH-meter, with temperature compensation, accurate to ± 0,1 pH unit.
6.4 Incubator, heating block or equivalent, capable of operating at the temperatures specified in
Table 2.
Table 2 — Incubation temperatures required per protocol
Protocol Incubation temperatures
A 30 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C
B 37 °C ± 1 °C
C 30 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C
6.5 Flasks, bottles and test tubes, of sufficient capacity to contain the required volumes and
leave adequate head-space for mixing. The capacity depends on the staining protocol and on the flow
cytometry equipment.
6.6 Pipettes, sterile, calibrated for bacteriological use, accurate to within 2 % of the volume being
pipetted.
6.7 Vortex mixer.
6.8 Filter, sterile, with membrane filters of a pore size 0,22 μm and 25 μm.
6.9 Flow cytometer, instrument capable of detecting and counting particles or cells when passing
individually in a directed flow through a beam of excitation light. The instrument must be equipped with
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a blue laser emitting at 488 nm and with light detectors (fluorescence emission and light scattering).
Further details on instrument properties and settings are given in 9.3.2.
6.10 Automated sample preparation unit, automated sample processor capable of handling liquids for
sample dilution, mixing, incubation and/or injection into the flow cytometer. This equipment is optional.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
[2]
method is given in ISO 707 | IDF 50 .
A representative sample is collected for analysis. Unless frozen, test samples shall be cooled after
sampling to between 3 °C ± 2 °C and kept at that temperature until testing or freezing. The age of the
samples at testing and freezing and the storage conditions may influence the counting result.
The sample shall not be damaged or changed during transportation or storage. The sample shall be
homogenous and representative of the batch of product to be tested.
Commercial starter cultures and commercial dairy products shall be stored prior to testing as
recommended by the manufacturer.
8 Preparation of test sample
8.1 General
General requirements are in accordance with ISO 6887-1:1999 and ISO 6887-5:2010.
The sample shall be handled for testing in accordance with good laboratory practices.
Initial suspensions and, if needed, further dilutions of the samples to be tested, i.e. freeze-dried
cultures, frozen cultures and fermented milk products containing cultures, are prepared as specified
in 8.2 to 8.4. The appropriate dilution required to be analysed by flow cytometry depends on the initial
concentration of cells in the sample, the staining protocol and the flow cytometry equipment.
8.2 Freeze-dried cultures
Prior to preparation of the initial suspension, allow the freeze-dried sample to acclimatize to room
temperature before opening the pouch or container. Alternatively, mix the content of the original
sample thoroughly, remove the needed test portion with a sterile spatula, and transfer it to a sterile
container or pour the needed test portion into a sterile container. Allow the sample to reach ambient
temperature of 20 °C to 25 °C.
Thoroughly mix the contents of the closed container/bag by repeatedly shaking and inverting it.
Prepare an initial suspension (between 10 and 100 fold) by weighing the test sample into a suitable
sterile vessel and then adding the required amount of diluent. Alternatively, weigh the test sample
directly into the bottle with the diluent. The diluent shall be peptone-salt solution (5.2). The
temperature of the diluent shall be the same as that of the test sample in order to avoid damaging the
microorganisms by sudden changes in temperature.
For rehydration, the initial suspension is left at ambient temperature of 20 °C to 25 °C for approximately
10 min, and no longer than 45 min, shaking occasionally or continuously (e.g. using a peristaltic
homogeniser), before further dilution.
Make sure that the sample is dissolved before proceeding immediately with further testing steps. If
needed, further dilutions are prepared by thoroughly mixing a specific amount of the initial suspension
with the appropriate volume of diluent (5.2).
IDF 232:2015(E)
As an alternative to manual sample preparation, an automated sample preparation module dedicated to
sample preparation, dilution and/or injection can be used.
8.3 Frozen cultures
Prior to initiating preparation of the initial suspension, the test sample shall be thawed. This can be
done by leaving the sample at an ambient temperature of 20 °C to 25 °C until the sample has just thawed.
Alternatively, place the sample in a water bath at 21 °C ± 1 °C and keep it in the water bath until the test
[3]
portion has just thawed, see ISO 26323 | IDF 213 . Samples shall be tested as soon as they have been
thawed. Mix the test sample carefully after thawing.
Prepare the initial suspension, and appropriate dilution(s) if needed, as stated in 8.2. The test sample is
measured by volume or weight. The unit of the reported final result shall reflect the choice of unit for
the preparation of the test sample.
8.4 Fermented milk products
Samples from fermented milk products, e.g. yogurts, are prepared as follows.
a) Add 90 ml ± 0,1 ml of peptone-salt solution (5.2) at an ambient temperature of 20 °C to 25 °C to a
sterile bottle.
b) Mix the sample (e.g. yogurt) either by inverting and shaking or by mixing it with a sterile spatula.
−1
c) Weigh 10 g ± 0,1 g of the sample and add it into the diluent in order to prepare dilution 10 . The
temperature of the diluent shall be the same as that of the test sample in order to avoid damaging
the microorganisms by sudden changes in temperature.
d) Shake the bottle slowly 10 times by inverting and shaking.
e) If needed, immediately prepare the serial dilution to obtain the adequate dilution for testing.
−4 −5
NOTE For a final dilution of 10 to 10 , there will be so little background interference in the flow cytometer
from yogurt matrices that no specific pre-treatment is needed. For yogurt samples containing particles, e.g. fruit
pieces or vanilla, the debris might be removed by filtering the final dilution through a 25 μm filter before staining.
9 Procedure
9.1 General
Following preparation of the test sample, testing includes the following steps:
— staining (9.2);
— flow cytometry analysis (9.3);
— gating (9.4);
— calculation of concentrations (Clause 10).
9.2 Staining
Initial suspensions, and/or dilutions from the test sample if needed, are processed and stained
depending on the chosen protocol as specified in 9.2.1, 9.2.2 and 9.2.3 prior to quantification by flow
cytometry. Diagrams for the three staining protocols are found in Annex A.
The individual staining protocols include dilution steps to achieve an appropriate cell concentration.
For further details on appropriate dilution see Clause 11 and for a calculation example see Annex B.
8 © ISO and IDF 2015 – All rights reserved

IDF 232:2015(E)
9.2.1 Protocol A
The staining principle is based on the enzymatic activity of cells. In active cells, the non-fluorescent
dye cFDA is cleaved by cellular esterase releasing the green fluorescent carboxyfluorescein (maximum
fluorescence emission at 520 nm). For a better separation of active and non-active or damaged cells,
a counterstaining with PI is performed with a fluorescence emission maximum at 620 nm (red
fluorescence).
The test sample (8.2, 8.3 or 8.4) is diluted appropriately in PBS (5.3.1.1). In the last dilution step, 870 µl
PBS and 100 µl sample are added to 10 µl cFDA (5.3.1.2; 5 mmol/l in DMSO).
The solution is mixed thoroughly using, e.g., a mechanical stirrer for 5 s and incubated 15 min in the
dark at 30 °C for mesophilic strains and 37 °C for thermophilic strains.
20 µl PI (5.3.1.3; 1,5 mmol/l in water) are added to the mixture above and the solution is mixed
thoroughly and incubated for 15 min in the dark at room temperature.
The mixture is then ready for flow cytometry analysis (9.3). Analyse the sample within 45 min after
adding the cFDA (see A.1).
9.2.2 Protocol B
The staining principle is based on a dual nucleic acid staining with cell permeant dye SYTO® 24
(fluorescence emission maximum at 515 nm) and cell impermeant dye PI (fluorescence emission
maximum at 620 nm). SYTO® 24 permeates the membrane of total cells and stains the nucleic acids
with green fluorescence. PI penetrates only bacteria with damaged membranes, causing a reduction
in SYTO® 24 green fluorescence when both dyes are present. Thus, live bacteria with intact cell
membranes fluoresce bright green (defined as active fluorescent cells), bacteria with slightly damaged
membranes exhibit both green and red fluorescence (defined as damaged cells) and bacteria with
broken membranes fluoresce red (defined as non-active fluorescent cells).
The test sample (8.2, 8.3 or 8.4) is diluted appropriately in PBS (5.3.2.1). In the last dilution step, 100 µl
of the sample is added to 880 µl of PBS (5.3.2.1) and mixed thoroughly.
10 µl PI (5.3.2.2; 0,2 mmol/l in water) and 10 µl SYTO® 24 (5.3.2.3; 0,1 mmol/l in water) are added to
the mixture. This is mixed thoroughly using, e.g., a mechanical stirrer for 5 s and incubated in the dark
for 15 min at 37 °C.
After the dual staining procedure, the sample shall be analysed by flow cytometry (9.3) immediately
(see A.2).
9.2.3 Protocol C
The staining principle is based on the membrane-potential-sensitive DiOC , which changes emission
wavelength when active cells build up membrane potential. In all cells, the DiOC binds to the membrane
with a green fluorescence emission maximum at 500 nm. When cells are activated, the maximum
fluorescence emission wavelength is red-shifted. The degree of the red-shift is strain dependent.
The test sample (8.2, 8.3 or 8.4) is diluted appropriately in MRS broth (5.3.3.1) for activation of the
metabolism. The exception to this general rule is Streptococcus thermophilus which activates better in
M17 broth (5.3.3.2).
The dilution for this protocol is divided into two steps. Firstly, the sample is diluted in MRS (or M17) to
activate the cells. To ensure optimal activation, the test sample shall be diluted at least 10 times and it
shall be incubated for 30 min at 30 °C for mesophilic and 37 °C for thermophilic strains. Secondly, the
sample is diluted 25 times into the stain mixture (5.3.3.3) to reach the appropriate dilution. This is
incubated at room temperature for 30 min.
The cells are then ready to be analysed by means of flow cytometry (9.3). Flow cytometry testing shall
be completed within 30 min after the end of staining (see A.3).
IDF 232:2015(E)
9.3 Flow cytometry analysis
9.3.1 General
The stained samples are analysed by flow cytometry.
Flow cytometry is a technique for rapid quantification of cells combining light source, optics, flow
chamber, liquid sample delivery system, light detectors, electronics and software. The flow cytometer
provides a constant flow of sheath fluid through a cuvette, singularizing and preparing the cells for
analysis. The cuvette is traversed by a beam of light to illuminate flowing cells. Around the cuvette,
detectors collect scattered light in two angles [forward scatter channel (FSC) and side scatter channel
(SSC)] and fluorescence in different colours (e.g. green, yellow, red). When a cell reaches the flow
cuvette, a proportion of the light beam is scattered and cellular fluorescence markers are excited to
emit fluorescence. The detection of the scattered light and the concomitant emission of fluorescence
are referred to as an event, i.e. each cell passing through gives rise to one event, each of which shows
the state of the cell.
Whereas the detected fluorescence is linked to the state of the cell, i.e. enzyme activity, membrane
integrity and/or membrane potential, the FSC provides information on cell size and optical density. The
SSC provides information on cell morphology, reflectivity and granularity.
The recorded events per microlitre sample indicate how many cells are counted and at the same time
differentiate, based on fluorescence parameters, the cells into two categories: active fluorescent and
non-active fluorescent.
9.3.2 Instruments and settings
Flow cytometer configuration settings for the optimal functioning of the three protocols are given in
Table 3. Some of the parameters, e.g. excitation source and filters for the detectors, are important for
the proper performance of the individual protocols, whereas some are less important, e.g. event rate is
equipment dependent and varies significantly from instrument to instrument.
The flow cytometer shall be properly calibrated in accordance with manufacturer instructions. Most
flow cytometers are calibrated for accurate volumetric determination of the analysed sample for easy
calculation of the cell concentration. For instruments without calibrated volumetric determination, the
number of AFUs or TFUs in the sample is calibrated against standardized fluorescent beads, added to
the sample as an internal standard, with a known concentration.
Even for instruments with calibrated volumetric determination, the use of standard fluorescent beads
is mandatory as it greatly increases the ability to trace inaccuracies in small volume determinations and
enables verification of proper performance of the detectors. These beads with known concentration and
fluorescence intensities shall be used to demonstrate appropriate detection of relevant wavelengths
and intensities of the emitted light as well as to document calibration status. The use of standard beads
also provides the ability to make accurate comparisons of data from sample to sample, from day to day
or from laboratory to laboratory.
The flow cytometer instrument shall be operated by a trained technician and as described in the
instruction manual provided by the manufacturer. The flow cytometer should also be cleaned and
serviced regularly in accordance with the manufacturer’s instructions.
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IDF 232:2015(E)
Table 3 — Recommendations for flow cytometer: configuration and settings
Optical Excitation source Laser 488 nm, minimum 20 mW
configuration
Detectors Emission: minimum 2 fluorescence channels and
scatter channels
FL1: Green channel
Protocol A: 500–570 nm
Protocol B: 500–540 nm
Protocol C: 515–545 nm
FL2 or FL3: Orange or red channel
Protocol A: Orange/red > 570 nm
Protocol B: Red > 630 nm
Protocol C: Red > 650 nm
Light scattering:
Si
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 19344
FIL
Première édition
2015-12-15
Lait et produits laitiers — Ferments
lactiques, probiotiques et produits
fermentés — Quantification de
bactéries lactiques par cytométrie en
flux
Milk and milk products — Starter cultures, probiotics and fermented
products — Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry
Numéros de référence
FIL 232:2015(F)
©
ISO et FIL 2015
FIL 232:2015(F)
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FIL 232:2015(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Diluants et réactifs . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Solution de peptone-sel . 3
5.3 Diluants et réactifs pour les protocoles de coloration . 3
5.3.1 Protocole A . 4
5.3.2 Protocole B . 5
5.3.3 Protocole C . 5
6 Appareillage . 6
7 Échantillonnage . 7
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 7
8.1 Généralités . 7
8.2 Cultures lyophilisées . 7
8.3 Cultures congelées . 8
8.4 Produits laitiers fermentés . 8
9 Mode opératoire. 9
9.1 Généralités . 9
9.2 Coloration . 9
9.2.1 Protocole A . 9
9.2.2 Protocole B . 9
9.2.3 Protocole C .10
9.3 Analyse par cytométrie en flux .10
9.3.1 Généralités .10
9.3.2 Instruments et réglages .11
9.4 Fenêtrage .12
9.4.1 Généralités .12
9.4.2 Protocole A .12
9.4.3 Protocole B .14
9.4.4 Protocole C .15
10 Calcul et expression des résultats .16
11 Facteurs critiques affectant les résultats .18
12 Fidélité .19
12.1 Essai interlaboratoires .19
12.2 Répétabilité .19
12.3 Reproductibilité .19
13 Rapport d’essai .20
Annexe A (informative) Schéma des protocoles de coloration .21
Annexe B (informative) Exemple de calcul de la dilution appropriée de l’échantillon .23
Annexe C (informative) Essai interlaboratoires .24
Bibliographie .27
© ISO et FIL 2015 – Tous droits réservés iii

FIL 232:2015(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de
brevets reçues (voir www.iso.org/patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos -
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale du Lait (FIL). Le présent document
est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
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FIL 232:2015(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
L’ISO 19344 | FIL 232 a été élaborée par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse pour
les microorganismes du lait de la Fédération internationale du lait (FIL) et par le Comité technique
ISO/TC 34 Produits alimentaires, sous-comité SC 5 Lait et produits laitiers.
Les travaux ont été réalisés par le groupe de projet mixte ISO/FIL sur la Quantification des bactéries
lactiques par cytométrie en flux du Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse pour les
microorganismes du lait, sous la conduite de son chef de projet, Dr Sandra Casani (DK).
© ISO et FIL 2015 – Tous droits réservés v

FIL 232:2015(F)
Introduction
La quantification des bactéries lactiques est un facteur important dans l’évaluation de la qualité
des ferments lactiques, des probiotiques et des produits laitiers fermentés. Les bactéries lactiques
contenues dans ces produits peuvent être examinées selon différents principes méthodologiques, les
techniques de numération sur plaque étant les plus traditionnelles et les plus couramment utilisées.
Les techniques plus récentes comprennent la cytométrie en flux qui permet de déterminer les
cellules en tant qu’unités actives et/ou totales. Les avantages de la cytométrie en flux comprennent
une faible variation, une différenciation entre cellules actives et cellules totales et la possibilité d’une
vitesse d’analyse élevée. De plus, la quantification et l’utilisation de la fraction de cellules actives par
cellules totales est une caractéristique clé et un outil important de la cytométrie en flux pour évaluer
l’adéquation d’une population de cellules donnée. Ceci est particulièrement intéressant pour certaines
applications telles que l’optimisation du procédé de production et l’évaluation de la stabilité pendant la
durée de conservation.
L’Organisation internationale de normalisation (ISO) et la Fédération Internationale du Lait (FIL)
attirent l’attention sur le fait que la conformité au présent document peut impliquer l’utilisation de
brevets relatifs au protocole de coloration C décrit dans le présent document.
Ni l’ISO ni la FIL ne prennent position en ce qui concerne la preuve, la validité et le domaine d’application
de ces droits de propriété intellectuelle.
Les détenteurs de ces droits de propriété intellectuelle ont garanti à l’ISO et à la FIL qu’ils souhaitent
négocier des licences gratuites ou à des conditions raisonnables et non discriminatoires avec les
demandeurs sur tout le territoire couvert par les brevets. À cet égard, les déclarations des détenteurs
de ces droits de propriété intellectuelle sont enregistrées avec l’ISO. Il est possible d’obtenir des
informations auprès de:
Chr. Hansen A/S
Boege Alle 10-12
2970 Hoersholm
Denmark
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues autres que ceux identifiés ci-devant. Ni l’ISO ni
la FIL ne sauraient être tenues pour responsables de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et
averti de leur existence.
L’ISO (www.iso.org/brevets) et l’IEC (http://patents.iec.ch) tiennent à jour des bases de données
de brevets concernant leurs normes, pouvant être consultées en ligne. Les utilisateurs sont invités à
consulter les bases de données pour obtenir les informations les plus récentes sur les brevets.
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NORME INTERNATIONALE
FIL 232:2015(F)
Lait et produits laitiers — Ferments lactiques, probiotiques
et produits fermentés — Quantification de bactéries
lactiques par cytométrie en flux
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l’emploi
de produits et la mise en œuvre d’opérations à caractère dangereux. La présente Norme
internationale n’a pas pour objectif de traiter tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation.
Il est de la responsabilité de l’utilisateur de la présente Norme internationale d’établir, avant
de l’utiliser, les procédures d’hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer si certaines
restrictions réglementaires s’appliquent.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode normalisée permettant de quantifier les
bactéries lactiques actives et/ou totales et les souches probiotiques dans les ferments lactiques utilisés
dans les produits laitiers, au moyen de la cytométrie en flux. La méthode s’applique également aux
probiotiques utilisés dans les produits laitiers et aux produits laitiers fermentés, tels que les yaourts,
contenant essentiellement des bactéries lactiques.
La présente Norme internationale ne s’applique pas à la différenciation taxonomique des bactéries.
En raison de sa non-spécificité, la méthode peut quantifier d’autres bactéries que celles indiquées
dans le domaine d’application de la présente Norme internationale, lorsqu’elles sont présentes dans
l’échantillon. Cela peut conduire à une surestimation des dénombrements.
La concentration minimale de cellules bactériennes dans l’échantillon avant l’application de cette
méthode normalisée dépend des taux de dilution utilisés dans chaque protocole. En général, on
considère que 10 cellules par gramme ou ml se situent dans la plage minimale.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1:1999, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-5:2010, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 5: Règles spécifiques pour la préparation
du lait et des produits laitiers
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 7889 | FIL 117, Yaourt — Dénombrement des micro-organismes caractéristiques — Technique de
comptage des colonies à 37 °C
ISO 15214, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries
lactiques mésophiles — Technique par comptage des colonies à 30 °C
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
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FIL 232:2015(F)
3.1
bactérie lactique
bactérie Gram-positive, non mobile, non sporogène, catalase-négative, nitrate-réductase-négative et
cytochrome-oxydase-négative, qui ne liquéfie pas la gélatine et ne produit pas d’indole
Note 1 à l’article: Une bactérie lactique présente un métabolisme fermentatif essentiellement saccharolytique.
L’acide lactique est le principal produit final résultant de l’utilisation de glucides.
EXEMPLE Les bactéries lactiques importantes pour l’industrie laitière sont: Streptococcus thermophilus,
Lactococcus lactis, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc et Lactobacillus.
3.2
souches probiotiques
microorganismes vivants qui, administrés en quantité suffisante, procurent un bénéfice pour la santé
de l’hôte
EXEMPLE Les souches probiotiques importantes sont: Bifidobacterium animalis, Lactobacillus casei,
Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus
plantarum et Propionibacterium freudenreichii.
Note 1 à l’article: Voir la Référence [1].
3.3
unités fluorescentes actives
UFA
événements dénombrés dans une fenêtre spécifique des caractéristiques de diffusion/fluorescence de
cellules supposées vivantes, c’est-à-dire de cellules colorées par l’indicateur d’activité spécifique utilisé
dans le protocole
3.4
unités fluorescentes non actives
n-UFA
événements dénombrés dans une fenêtre spécifique des caractéristiques de diffusion/fluorescence de
cellules supposées mortes, c’est-à-dire de cellules endommagées dans une mesure telle qu’elles ne sont
pas colorées par l’indicateur d’activité spécifique utilisé dans le protocole
3.5
unités fluorescentes totales
UFT
somme de UFA et n-UFA
3.6
% d’unités fluorescentes actives
% UFA
rapport en pourcentage de UFA à UFT
4 Principe
4.1 Une prise d’essai ou un échantillon pour essai est préparé(e) et dilué(e) si nécessaire.
4.2 Les suspensions initiales, et/ou dilutions si nécessaire, sont colorées conformément à l’un des trois
protocoles suivants, selon l’objet de la coloration des cellules fluorescentes, afin de différencier les unités
fluorescentes actives et totales:
a) double coloration ciblant les acides nucléiques par le colorant fluorescent rouge, non perméant,
iodure de propidium (PI), et l’activité enzymatique intracellulaire basée sur le clivage des isomères
mixtes de diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine (cFDA) en carboxyfluorescéine fluorescente verte
par les estérases intracellulaires;
2 © ISO et FIL 2015 – Tous droits réservés

FIL 232:2015(F)
b) double coloration des acides nucléiques par PI et un colorant fluorescent vert perméant pour les
cellules, à savoir le colorant fluorescent vert pour acides nucléiques perméant pour les cellules
1)
SYTO® 24 ;
c) coloration simple par le colorant cyanine sensible au potentiel de membrane, iodure de
3,3′-diéthyloxacarbocyanine (DiOC ). La longueur d’onde de la lumière émise varie avec l’activation
métabolique des cellules.
Le choix du protocole de coloration dépend des préférences ou possibilités de l’utilisateur.
4.3 Les échantillons colorés sont analysés à l’aide d’un cytomètre en flux utilisant une combinaison de
diffusion de la lumière et de détection de la lumière fluorescente émise. Lorsque les cellules passent dans
le cytomètre en flux, chaque cellule est comptée et la fluorescence est enregistrée.
4.4 Un fenêtrage est réalisé pour séparer les cellules du bruit et pour différencier les UFA des n-UFA.
4.5 Le calcul de la concentration dans l’échantillon initial consiste à multiplier les UFA (ou UFT) par
volume d’échantillon analysé et les facteurs de dilution employés lors de la préparation de l’échantillon.
5 Diluants et réactifs
5.1 Généralités
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau
distillée ou déionisée ou de l’eau d’une pureté équivalente, conformément à l’ISO 7218.
Préparer la suspension initiale (commune à tous les protocoles) avec le diluant spécifié en 5.2.
La composition et la préparation de tous les réactifs employés dans chacun des trois protocoles de
coloration (A, B et C) sont spécifiées en 5.3. Une vue d’ensemble des diluants et des réactifs est donnée
dans le Tableau 1 pour chaque protocole.
5.2 Solution de peptone-sel
La composition et la préparation de la solution de peptone-sel sont conformes à l’ISO 6887-5:2010, 5.2.1.
NOTE Pour la préparation de la suspension initiale, et des dilutions si nécessaire, d’autres diluants d’usage
général mentionnés dans l’ISO 6887-5:2010 peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
5.3 Diluants et réactifs pour les protocoles de coloration
AVERTISSEMENT — L’iodure de propidium est un mutagène potentiel. En cas de déversement
accidentel, il convient de prendre les mesures de désactivation appropriées. La solution de
colorant doit être préparée et appliquée dans une sorbonne, en utilisant un équipement de
protection et en respectant les bonnes pratiques de laboratoire. ®
1) Le colorant fluorescent vert pour acides nucléiques perméant pour les cellules SYTO 24 est fourni par
Life Technologies. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait
constituer un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés
s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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Tableau 1 — Réactifs utilisés pour chaque protocole
Réactif Protocole A Protocole B Protocole C
Diluant PBS (5.3.1.1) PBS (5.3.2.1) Bouillon MRS ou M17
(5.3.3.1 ou 5.3.3.2)
Solution de colorant cFDA (5.3.1.2) PI (5.3.2.2) Solution de glucose (5.3.3.3.1)
PI (5.3.1.3) SYTO® 24 (5.3.2.3) DiOC (5.3.3.3.2)
Solution tampon (5.3.3.3.3)
5.3.1 Protocole A
5.3.1.1 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
5.3.1.1.1 Composition
— 9 g de chlorure de sodium (NaCl)
— 795 mg d’hydrogénophosphate de sodium heptahydraté (Na HPO ·7H O)
2 4 2
— 144 mg de dihydrogénophosphate de potassium (KH PO )
2 4
5.3.1.1.2 Préparation
Dissoudre les composants (voir 5.3.1.1.1) dans de l’eau. Compléter avec de l’eau au volume final
de 1 000 ml. Ajuster le pH à 7,4 ± 0,05 avec du HCl, si nécessaire. Répartir la solution en aliquotes et
stériliser en autoclave à 121 °C ± 1 °C (cycle liquide) pendant 15 min. Le diluant peut être conservé à
une température de réfrigération de (3 °C ± 2 °C) pendant 6 mois au maximum.
5.3.1.2 Solution d’isomères mixtes de diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine (cFDA)
5.3.1.2.1 Composition
— 230 mg d’isomères mixtes de 5(6)-cFDA
— 100 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO)
5.3.1.2.2 Préparation
Une solution 5 mmol/l est préparée en dissolvant le cFDA dans du DMSO dans les quantités spécifiées
en 5.3.1.2.1. La solution peut être conservée pendant 6 mois au maximum à −18 °C ± 2 °C, à l’abri de la
lumière.
5.3.1.3 Iodure de propidium (PI)
5.3.1.3.1 Composition
— 100 mg de PI
— 100 ml d’eau ultrapure
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5.3.1.3.2 Préparation
Dissoudre le PI dans de l’eau ultrapure de manière à obtenir une concentration finale de 1,0 mg/ml,
correspondant approximativement à 1,5 mmol/l. La solution peut être conservée pendant 6 mois à
3 °C ± 2 °C, à l’abri de la lumière.
NOTE La concentration de la solution de PI utilisée est de 0,1 % et la concentration finale est de 0,002 %.
Cette valeur est inférieure au niveau de toxicité potentielle.
5.3.2 Protocole B
5.3.2.1 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Voir 5.3.1.1.
5.3.2.2 Iodure de propidium (PI)
Voir 5.3.1.3 pour la préparation de la solution de PI. Avant utilisation, la solution de PI doit être diluée à
0,2 mmol/l avec de l’eau.
NOTE La concentration de la solution de PI utilisée est de 0,01 % et la concentration finale est de 0,000 1 %.
Cette valeur est inférieure au niveau de toxicité potentielle.
5.3.2.3 Colorant fluorescent vert pour acides nucléiques perméant pour les cellules, SYTO® 24
Le colorant est une solution à 5 mmol/l dans du DSMO. Conserver à −20 °C, à l’abri de la lumière, pendant
douze mois au maximum. Avant utilisation, la solution doit être diluée à 0,1 mmol/l avec de l’eau.
5.3.3 Protocole C
5.3.3.1 Bouillon MRS
La composition et la préparation sont spécifiées dans l’ISO 15214, excepté que la gélose n’est pas ajoutée.
5.3.3.2 Bouillon M17
La composition et la préparation sont spécifiées dans l’ISO 7889, excepté que la gélose n’est pas ajoutée.
5.3.3.3 Mélange colorant
Le mélange colorant est constitué de 210 µl d’une solution de glucose à 50 % (5.3.3.3.1), 210 µl de DiOC2
à 1,5 mmol/l (5.3.3.3.2) et 50 ml de solution tampon (5.3.3.3.3). Le mélange colorant est préparé le jour
de son utilisation.
5.3.3.3.1 Solution de glucose
5.3.3.3.1.1 Composition
— 50 g de D(+)-glucose monohydraté
— 50 g d’eau
5.3.3.3.1.2 Préparation
Une solution de glucose à 50 % est préparée en dissolvant le glucose dans l’eau. La dissolution est
facilitée en chauffant la solution à une température inférieure au point d’ébullition. Éviter l’évaporation.
La solution est passée à l’autoclave à 121 °C ± 1 °C pendant 15 min et peut être conservée, sans ouvrir le
flacon, à 3 °C ± 2 °C pendant 3 mois au maximum.
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5.3.3.3.2 Iodure de 3,3’-diéthyloxacarbocyanine (DiOC )
5.3.3.3.2.1 Composition
— 69 mg d’iodure de 3,3’-DiOC , ≥ 98 %
— 100 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO)
5.3.3.3.2.2 Préparation
Le colorant DiOC est préparé sous forme d’une solution à 1,5 mmol/l en pesant le DiOC dans du DMSO
2 2
en respectant les quantités spécifiées en 5.3.3.3.2.1. Répartir dans des microtubes de 1 ml, par exemple.
Conserver le DiOC à 5 °C ± 3 °C pendant 12 mois au maximum, à l’abri de la lumière car il est instable à
la lumière.
5.3.3.3.3 Solution tampon
5.3.3.3.3.1 Composition
— 7,6 g de chlorure de sodium (NaCl; 130 mmol/l)
— 0,5 g de dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (NaH PO ·H O; 3 mmol/l)
2 4 2
— 1,24 g d’hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na HPO ·2H O; 7 mmol/l)
2 4 2
— 1 000 ml d’eau
5.3.3.3.3.2 Préparation
Peser et dissoudre les trois sels dans l’eau en respectant les quantités spécifiées en 5.3.3.3.3.1. Agiter
jusqu’à dissolution complète des sels. Ajuster le pH à 6,5 ± 0,05 avec du HCl à 2,5 mol/l. La solution
doit ensuite être filtrée à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Le mélange peut être conservé à 3 °C ± 2 °C
pendant une semaine au maximum. Pour une conservation plus longue ne dépassant pas 6 mois, une
température de − 20 °C est recommandée.
6 Appareillage
Le matériel courant de laboratoire et, en particulier, le matériel nécessaire pour la préparation des
échantillons pour essai et des dilutions, spécifié dans l’ISO 6887-5, ainsi que le matériel suivant doivent
être utilisés.
6.1 Bain d’eau thermostaté, réglable à 21 °C ± 1 °C.
6.2 Balance de précision, capable de peser à 1 mg près, avec une précision d’affichage de 0,1 mg.
6.3 pH-mètre, à compensation de température, d’une précision de ± 0,1 unité de pH.
6.4 Incubateur, bloc chauffant ou équivalent, capable de fonctionner aux températures spécifiées
dans le Tableau 2.
Tableau 2 — Températures d’incubation requises pour chaque protocole
Protocole Températures d’incubation
A 30 °C ± 1 °C et 37 °C ± 1 °C
B 37 °C ± 1 °C
C 30 °C ± 1 °C et 37 °C ± 1 °C
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6.5 Fioles, flacons et tubes à essai, de capacité suffisante pour contenir les volumes requis en laissant
un espace suffisant pour le mélange. La capacité dépend du protocole de coloration et de l’équipement
de cytométrie en flux.
6.6 Pipettes, stériles, étalonnées pour un usage bactériologique, ayant une précision de 2 % du volume
prélevé à la pipette.
6.7 Agitateur vortex.
6.8 Filtre, stérile, muni de membranes filtrantes ayant une taille de pores de 0,22 µm et 25 µm.
6.9 Cytomètre en flux, instrument capable de détecter et de dénombrer des particules ou des
cellules lorsqu’elles passent une à une dans un flux dirigé à travers un faisceau de lumière d’excitation.
L’instrument doit être équipé d’un laser bleu émettant à 488 nm et de détecteurs de lumière (émission
d’une fluorescence et diffusion de la lumière). De plus amples détails sur les propriétés et les réglages de
l’instrument sont donnés en 9.3.2.
6.10 Unité de préparation automatique des échantillons, unité de traitement automatique des
échantillons capable de manipuler les liquides pour la dilution, le mélange, l’incubation et/ou l’injection
des échantillons dans le cytomètre en flux. Cet équipement est facultatif.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[2]
méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 707 | FIL 50 .
Un échantillon représentatif est prélevé en vue de l’analyse. S’ils ne sont pas congelés, les échantillons
pour essai doivent être refroidis après l’échantillonnage à une température de 3 °C ± 2 °C et être
maintenus à cette température jusqu’au moment de l’essai ou de la congélation. L’âge des échantillons
au moment de l’essai et les conditions de congélation et de conservation peuvent avoir une incidence sur
le résultat du comptage.
L’échantillon ne doit pas être endommagé ni modifié pendant le transport ou la conservation.
L’échantillon doit être homogène et représentatif du lot de produit à soumettre à essai.
Avant essai, les ferments lactiques du commerce et les produits laitiers du commerce doivent être
conservés selon les recommandations du fabricant.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
8.1 Généralités
Les exigences générales sont conformes à l’ISO 6887-1:1999 et à l’ISO 6887-5:2010.
L’échantillon doit être traité en vue de l’essai conformément aux bonnes pratiques de laboratoire.
Les suspensions initiales et, si nécessaire, les dilutions ultérieures des échantillons à soumettre à essai,
c’est-à-dire les cultures lyophilisées, les cultures congelées et les produits laitiers fermentés contenant
des cultures, sont préparées comme spécifié en 8.2 à 8.4. La dilution appropriée requise pour l’analyse
par cytométrie en flux dépend de la concentration initiale de cellules dans l’échantillon, du protocole de
coloration et de l’équipement de cytométrie en flux.
8.2 Cultures lyophilisées
Avant de préparer la suspension initiale, laisser l’échantillon lyophilisé s’acclimater à température
ambiante avant d’ouvrir la pochette ou le récipient. En variante, mélanger soigneusement le contenu de
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l’échantillon initial, prélever la prise d’essai nécessaire à l’aide d’une spatule stérile et la transférer dans
un récipient stérile ou verser la prise d’essai nécessaire dans un récipient stérile. Laisser l’échantillon
atteindre la température ambiante comprise entre 20 °C et 25 °C.
Mélanger soigneusement le contenu du récipient/sachet fermé en le secouant et le retournant de façon
répétée.
Préparer une suspension initiale (diluée 10 à 100 fois) en pesant l’échantillon pour essai dans
un récipient stérile approprié, puis en ajoutant la quantité requise de diluant. En variante, peser
l’échantillon pour essai directement dans le flacon avec le diluant. Le diluant doit être une solution de
peptone-sel (5.2). La température du diluant doit être identique à celle de l’échantillon pour essai afin
d’éviter toute détérioration des microorganismes par de brusques variations de température.
Pour la réhydratation, la suspension initiale est laissée à une température ambiante comprise
entre 20 °C et 25 °C pendant environ 10 min, sans dépasser 45 min, en agitant par intermittence ou en
continu (par exemple à l’aide d’un homogénéisateur péristaltique), avant toute dilution supplémentaire.
S’assurer que l’échantillon est dissous avant de passer immédiatement aux étapes d’essai suivantes. Si
nécessaire, des dilutions supplémentaires sont préparées en mélangeant soigneusement une quantité
spécifique de la suspension initiale avec le volume approprié de diluant (5.2).
En variante à la préparation manuelle des échantillons, il est possible d’utiliser un module de préparation
automatique des échantillons assurant la préparation, la dilution et/ou l’injection des échantillons.
8.3 Cultures congelées
Avant de débuter la préparation de la suspension initiale, l’échantillon pour essai doit être décongelé.
Pour cela, il est possible de laisser l’échantillon à une température ambiante comprise entre 20 °C
et 25 °C jusqu’à ce que l’échantillon ait décongelé. En variante, placer l’échantillon dans un bain
d’eau thermostaté à 21 °C ± 1 °C et l’y maintenir jusqu’à ce que la prise d’essai ait décongelé; voir
[3]
l’ISO 26323 | FIL 213 . Les échantillons doivent être soumis à essai dès qu’ils sont décongelés. Mélanger
soigneusement l’échantillon pour essai après la décongélation.
Préparer la suspension initiale, et une (des) dilution(s) supplémentaire(s) si nécessaire, comme indiqué
en 8.2. L’échantillon pour essai est mesuré en volume ou en masse. L’unité du résultat final consigné
dans le rapport doit refléter le choix de l’unité pour la préparation de l’échantillon pour essai.
8.4 Produits laitiers fermentés
Les échantillons de produits laitiers fermentés, par exemple des yaourts, sont préparés comme suit:
a) introduire 90 ml ± 0,1 ml de solution de peptone-sel (5.2) dans un flacon stérile à une température
ambiante comprise entre 20 °C et 25 °C;
b) mélanger l’échantillon (yaourt, par exemple) soit en le renversant et l’agitant, soit en le mélangeant
à l’aide d’une spatule stérile;
-1
c) peser 10 g ± 0,1 g de l’échantillon et l’ajouter au diluant pour préparer une dilution de 10 . La
température du diluant doit être identique à celle de l’échantillon pour essai afin d’éviter toute
détérioration des microorganismes par de brusques variations de température;
d) agiter le flacon lentement 10 fois en le renversant et le secouant;
e) si nécessaire, préparer immédiatement la dilution en série afin d’obtenir la dilution adéquate pour
les essais.
-4 -5
NOTE Pour une dilution finale de 10 à 10 , il y aura si peu de bruit de fond dû aux matrices du yaourt
dans le cytomètre en flux qu’aucun prétraitement spécifique n’est nécessaire. Pour des échantillons de yaourt
contenant des particules, par exemple morceaux de fruit ou vanille, les débris peuvent être éliminés en filtrant la
dilution finale à l’aide d’un filtre de 25 µm avant la coloration.
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9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Après la préparation de l’échantillon pour essai, les essais comprennent les étapes suivantes:
— coloration (9.2);
— analyse par cytométrie en flux (9.3);
— fenêtrage (9.4);
— calcul des concentrations (Article 10).
9.2 Coloration
Les suspensions initiales, et/ou les dilutions de l’échantillon pour essai si nécessaire, sont traitées et
colorées selon le protocole choisi, tel que spécifié en 9.2.1, 9.2.2 et 9.2.3, avant la quantification par
cytométrie en flux. Des schémas des trois protocoles de coloration sont présentés à l’Annexe A.
Chaque protocole de coloration comprend des étapes de dilution pour atteindre une concentration de
cellules appropriée. Pour de plus amples détails sur la dilution appropriée, voir l’Article 11 et pour un
exemple de calcul, voir l’Annexe B.
9.2.1 Protocole A
Le principe de coloration est fondé sur l’activité enzymatique des cellules. Dans les cellules actives, le
colorant non fluorescent cFDA est clivé par une estérase cellulaire, libérant ainsi la carboxyfluorescéine
fluorescente verte (émission de fluorescence maximale à 520 nm). Pour une meilleure séparation des
cellules actives et non actives ou endommagées, on réalise une contre-coloration par PI, avec une
émission de fluorescence maximale à 620 nm (fluorescence rouge).
L’échantillon pour essai (8.2, 8.3 ou 8.4) est dilué de manière appropriée dans du PBS (5.3.1.1). Au
cours de la dernière étape de dilution, 870 µl de PBS et 100 µl d’échantillon sont ajoutés à 10 µl de cFDA
(5.3.1.2; 5 mmol/l dans du DMSO).
La solution est mélangée soigneusement à l’aide, par exemple, d’un agitateur mécanique pendant 5 s,
puis incubée pendant 15 min à l’abri de la lumière à 30 °C pour les ferments mésophiles et à 37 °C pour
les ferments thermophiles.
20 µl de PI (5.3.1.3; 1,5 mmol/l dans de l’eau) sont ajoutés au mélange ci-dessus et la solution est
mélangée soigneusement et incubée pendant 15 min à l’abri de la lumière et à température ambiante.
Le mélange est alors prêt pour l’analyse par cytométrie en flux (9.3). Analyser l’échantillon dans les
45 min qui suivent l’ajout du cFDA (voir A.1).
9.2.2 Protocole B
Le principe de coloration est fondé sur une double coloration des acides nucléiques par le colorant
perméant pour les cellules SYTO® 24 (émission de fluorescence maximale à 515 nm) et le colorant non
perméant pour les cellules PI (émission de fluorescence maximale à 620 nm). Le colorant SYTO® 24
traverse la membrane de l’ensemble des cellules et colore les acides nucléiques avec une fluorescence
dans le vert. Le colorant PI pénètre uniquement dans les bactéries ayant des membranes endommagées,
entraînant une diminution de la fluorescence verte du SYTO® 24 lorsque les deux colorants sont
présents. Ainsi, les bactéries vivantes dont les membranes cellulaires sont intactes émettent une
fluorescence vert vif (définie comme cellules fluorescentes actives), les bactéries ayant des membranes
cellulaires légèrement endommagées émettent une fluorescence à la fois verte et rouge (définie comme
cellules endommagées) et les bactéries dont la membrane est rompue émettent une fluorescence rouge
(définie comme cellules fluorescentes non actives).
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L’échantillon pour essai (8.2, 8.3 ou 8.4) est dilué de manière appropriée dans du PBS (5.3.2.1). Au cours
de la dernière étape de dilution, 100 µl de l’échantillon sont ajoutés à 880 µl de PBS (5.3.2.1) et mélangés
soigneusement.
10 µl de PI (5.3.2.2; 0,2 mmol/l dans de l’eau) et 10 µl de SYTO® 24 (5.3.2.3; 0,1 mmol/l dans de l’eau)
sont ajoutés au mélange. Ce dernier est soigneusement mélangé à l’aide, par exemple, d’un agitateur
mécanique pendant 5 s, puis incubé à l’abri de la lumière pendant 15 min à 37 °C.
Après la procédure de double coloration, l’échantillon doit être analysé immédiatement par cytométrie
en flux (9.3) (voir A.2).
9.2.3 Protocole C
Le principe de coloration est fondé sur
...