ISO 17678:2010
(Main)Milk and milk products — Determination of milk fat purity by gas chromatographic analysis of triglycerides (Reference method)
Milk and milk products — Determination of milk fat purity by gas chromatographic analysis of triglycerides (Reference method)
ISO 17678|IDF 202:2010 specifies a reference method for the determination of milk fat purity using gas chromatographic analysis of triglycerides. Both vegetable fats and animal fats such as beef tallow and lard can be detected. By using defined triglyceride equations, the integrity of milk fat is determined. Basically, the method applies to bulk milk, or products made thereof, irrespective of feeding, breed or lactation conditions. In particular, the method is applicable to fat extracted from milk products purporting to contain pure milk fat with unchanged composition, such as butter, cream, milk, and milk powder. However, under the circumstances listed hereafter, a false positive result can be obtained. Hence, the method is not applicable to milk fat: a) obtained from bovine milk other than cow's milk; b) obtained from single cows; c) obtained from cows which received an exceptionally high feeding of pure vegetable oils such as rapeseed oil; d) obtained from colostrum; e) subjected to technological treatment such as removal of cholesterol or fractionation; f) obtained from skim milk or buttermilk; g) extracted by using the Gerber, Weibull–Berntrop or Schmid–Bondzynski–Ratzlaff methods, or that has been isolated using detergents (e.g. the Bureau of Dairy Industries method). With the extraction methods specified in g), substantial quantities of partial glycerides or phospholipids can pass into the fat phase. Consequently, the scope of ISO 17678|IDF 202:2010 excludes certain products and particularly cheese, whose ripening process can also affect the fat composition to such a degree that a false positive result is obtained.
Lait et produits laitiers — Détermination de la pureté des matières grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des triglycérides (Méthode de référence)
L'ISO 17678|FIL 202:2010 spécifie une méthode de référence pour la détermination de la pureté des matières grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des triglycérides. La méthode permet de détecter des matières grasses d'origines végétale et animale telles que la graisse de bœuf et le saindoux. À l'aide de formules de triglycérides définies, l'intégrité de la matière grasse laitière est ainsi déterminée. En principe, la méthode s'applique au lait en vrac, ou aux produits laitiers dérivés, indépendamment des conditions d'alimentation, d'élevage ou de lactation. Elle s'applique en particulier aux matières grasses extraites de produits laitiers supposés contenir des matières grasses laitières pures, présentant une composition non modifiée, comme le beurre, la crème, le lait et le lait en poudre. Toutefois, dans les circonstances listées ci-après, un résultat faux positif peut être obtenu. Par conséquent, la méthode n'est pas applicable à la matière grasse laitière: a) issue de lait de bovin autre que le lait de vache; b) issue de vaches individuelles; c) issue de vaches ayant reçu une alimentation exceptionnellement riche en huiles végétales pures telles que l'huile de colza; d) issue du colostrum; e) soumise à un traitement technologique tel que l'élimination du cholestérol ou le fractionnement; f)issue du lait écrémé ou du lait battu (babeurre); g) extraite selon les méthodes Gerber, Weibull-Berntrop ou Schmid-Bondzynski-Ratzlaff, ou isolée au moyen de détergents [par exemple méthode BDI (Bureau of Dairy Industries)]. Avec les méthodes d'extraction spécifiées en g), d'importantes quantités de glycérides ou phospholipides partiaux peuvent passer dans la phase des matières grasses. Par conséquent, le domaine d'application de l'ISO 17678|FIL 202:2010 exclut certains produits et en particulier le fromage, dont le procédé d'affinage peut également affecter la composition de la matière grasse à tel point qu'un résultat faux positif est obtenu.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17678
IDF
202
First edition
2010-02-15
Milk and milk products — Determination
of milk fat purity by gas chromatographic
analysis of triglycerides (Reference
method)
Lait et produits laitiers — Détermination de la pureté des matières
grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des
triglycérides (Méthode de référence)
Reference numbers
ISO 17678:2010(E)
IDF 202:2010(E)
©
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Contents Page
Foreword .iv
1 Scope.1
2 Normative references.2
3 Terms and definitions .2
4 Principle .2
5 Reagents .2
6 Apparatus.3
7 Sampling .4
8 Procedure.4
8.1 Preparation of test samples .4
8.2 Preparation of fat sample solution .5
8.3 Chromatographic triglyceride determination .5
9 Integration, evaluation and control of the analytical performance .8
10 Calculation and expression of results .9
10.1 Triglyceride composition.9
10.2 S-values .10
10.3 Detection of foreign fat .10
11 Precision .11
11.1 Interlaboratory test.11
11.2 Repeatability .11
11.3 Reproducibility .12
12 Test report.12
Annex A (normative) Preparation of the packed column .13
Annex B (informative) Quantification of the foreign fat content.17
Annex C (informative) Uncertainty of measurement .19
Annex D (informative) Interlaboratory test.20
Bibliography.22
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17678⎪IDF 202 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
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Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to
publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least
50 % of the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17678⎪IDF 202 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Project Group on Foreign fats of the Standing Committee on
Analytical methods for composition under the aegis of its project leader, Dr J. Molkentin (DE).
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INTERNATIONAL STANDARD
IDF 202:2010(E)
Milk and milk products — Determination of milk fat purity by
gas chromatographic analysis of triglycerides (Reference
method)
1 Scope
This International Standard specifies a reference method for the determination of milk fat purity using gas
chromatographic analysis of triglycerides. Both vegetable fats and animal fats such as beef tallow and lard
can be detected. By using defined triglyceride equations, the integrity of milk fat is determined.
Basically, the method applies to bulk milk, or products made thereof, irrespective of feeding, breed or lactation
conditions. In particular, the method is applicable to fat extracted from milk products purporting to contain pure
milk fat with unchanged composition, such as butter, cream, milk, and milk powder.
However, under the circumstances listed hereafter, a false positive result can be obtained. Hence, the method
is not applicable to milk fat:
a) obtained from bovine milk other than cow's milk;
b) obtained from single cows;
c) obtained from cows which received an exceptionally high feeding of pure vegetable oils such as rapeseed
oil;
d) obtained from colostrum;
e) subjected to technological treatment such as removal of cholesterol or fractionation;
f) obtained from skim milk or buttermilk;
g) extracted by using the Gerber, Weibull–Berntrop or Schmid–Bondzynski–Ratzlaff methods, or that has
been isolated using detergents (e.g. the Bureau of Dairy Industries method).
With the extraction methods specified in g), substantial quantities of partial glycerides or phospholipids can
pass into the fat phase. Consequently, the scope of this International Standard excludes certain products and
particularly cheese, whose ripening process can also affect the fat composition to such a degree that a false
positive result is obtained.
NOTE 1 In nature, butyric (n-butanoic) acid (C4) occurs exclusively in milk fat and enables quantitative estimations of
low to moderate amounts of milk fat in vegetable and animal fats to be made. However, due to the large variation of C4,
whose approximate content ranges from 3,1 % mass fraction to 3,8 % mass fraction, it is difficult to provide qualitative and
quantitative information for foreign fat to pure milk fat ratios of up to 20 % mass fraction (see Reference [11]).
NOTE 2 In practice, quantitative results cannot be derived from the sterol content of vegetable fats, because they
depend on production and processing conditions. Furthermore, the qualitative determination of foreign fat using sterols is
ambiguous.
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2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 1211⎪IDF 1, Milk — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method)
ISO 2450⎪IDF 16, Cream — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method)
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 7328⎪IDF 116, Milk-based edible ices and ice mixes — Determination of fat content — Gravimetric
method (Reference method)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
milk fat purity
absence of vegetable and animal fats determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The purity is determined using S-values, which are calculated from the content of triglycerides. Triglyceride
mass fractions are expressed as percentages.
4 Principle
Fat extracted from milk or milk products is analysed by gas chromatography (GC) using a packed or a short
capillary column to determine triglycerides (TGs), separated by total carbon numbers. By inserting the mass
fraction, expressed as a percentage, of fat molecules of different sizes (C24 to C54, using even C numbers
only) into suitable TG equations, S-values are calculated. If the S-values exceed the limits established with
pure milk fat, the presence of foreign fat is detected.
NOTE 1 The suitability and equivalence of both packed and capillary columns have been demonstrated previously (see
References [8] to [10]).
NOTE 2 An S-value is the sum of weighted TG mass fractions.
5 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water complying with the requirements of ISO 3696, grade 2.
5.2 Carrier gas, nitrogen or, alternatively, helium or hydrogen, all with a purity of at least 99,995 % volume
fraction.
5.3 Fat standards, purity at least 99 % mass fraction, for standardizing the milk fat standard described in
8.3.3.
5.3.1 Triglyceride standards, saturated; suitable products are available commercially.
5.3.2 Cholesterol standard.
5.4 Methanol (CH OH), with a water content of not more than 0,05 % mass fraction.
3
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5.5 n-Hexane [CH (CH ) CH ].
3 2 4 3
5.6 n-Heptane [CH (CH ) CH ].
3 2 5 3
5.7 Other gases, hydrogen, purity at least 99,995 % volume fraction, free from organic impurities
(C H < 1 µl/l); synthetic air, free from organic impurities (C H < 1 µl/l).
n m n m
5.8 Anhydrous sodium sulfate (Na SO ).
2 4
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 High-temperature gas chromatograph, suitable for use at temperatures of at least 400 °C and
equipped with a flame ionization detector (FID). For capillary GC, an on-column or a programmed temperature
vaporization injector is indispensable while a split injector is unsuitable.
Septa used in the injector shall withstand high temperatures and exhibit a very low degree of “bleeding”.
Always use graphite seals to connect the column as well as injector and/or detector inserts (where applicable).
6.2 Chromatography column.
6.2.1 Packed column, glass, of internal diameter 2 mm and length 500 mm, packed with a stationary
1)
phase of 3 % OV-1 on 125 µm to 150 µm (100 mesh to 120 mesh) Gas ChromQ .
The preparation, silanization, packing and conditioning of the packed column is described in Annex A.
Alternatively, a capillary column (6.2.2) may be used.
6.2.2 Capillary column, short, e.g. of length 5 m, with a non-polar stationary phase that can withstand
2)
temperatures up to 400 °C or more .
Condition the column by performing 20 analyses of a milk fat solution (8.2) within no more than 2 days by
using the settings given in 8.3.4.2. After that, ensure that the response factors (8.3.3) are close to 1 and not
higher than 1,250 0.
Because of the variable overlap between C24 and cholesterol, a higher response factor may be accepted
for C24.
Columns with different dimensions and a different non-polar, highly temperature-resistant phase may be used
as long as their performance is consistent with this International Standard. However, the column length is
restricted by the indispensable limitation in resolution as shown in Figure 1. See also 8.3.4.2.
1)
6.3 Extrelut column , capacity 1 ml to 3 ml, filled with silica gel, for the extraction of milk fat in
accordance with 8.1.4 only.
6.4 Graphite seals, capable of withstanding temperatures of at least 400 °C; for the connection of the GC
column as well as for the injector and/or detector inserts.
6.5 Water bath, capable of being maintained at 50 °C ± 2 °C.
6.6 Oven, capable of operating at 50 °C ± 2 °C and 100 °C ± 2 °C.
1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does not constitute an endorsement by ISO or by IDF of this product.
2) CP-Ultimetal SimDist (5 m, 0,53 mm, 0,17 µm) is an example of a suitable product available commercially. This
information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by
ISO or by IDF of this product.
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6.7 Micropipette.
[2]
6.8 Graduated pipette, capacity 5 ml, ISO 835 class A.
6.9 Round-bottomed flask, capacity 50 ml.
6.10 Erlenmeyer flask, nominal capacity 250 ml.
6.11 Funnel.
6.12 Fine-pored filter paper.
6.13 Rotary evaporator.
6.14 Ampoules, nominal capacity 1 ml, fitted with a polytetrafluoroethylene-lined aluminium crimp cap or
screw cap.
6.15 Injection syringe, with syringe plunger not reaching into the tip of the needle (packed column GC).
NOTE With these syringes, better repeatability of the results is obtained.
6.16 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with a readability of 0,1 mg.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 707⎪IDF 50 .
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
8 Procedure
8.1 Preparation of test samples
8.1.1 General
For the preparation of test samples, use one of the milk fat isolation or extraction methods specified in 8.1.2 to
8.1.4.
8.1.2 Isolation from butter or butteroil
Melt 50 g to 100 g of test sample in the water bath (6.5) or the oven (6.6) at 50 °C.
Add 0,5 g to 1,0 g of sodium sulfate (5.8) to a folded filter paper (6.12). Preheat a 250 ml Erlenmeyer
flask (6.10) and a funnel (6.11) with the filter paper inserted, containing the sodium sulfate, in the oven (6.6) at
50 °C.
When a limited amount of test sample is available, use a smaller test sample and adapt the procedure
accordingly.
However, note that the handling of a smaller test portion involves a higher risk of obtaining a non-
representative sample.
While keeping the preheated flask, funnel, and inserted filter device in the oven, filter the fat layer of the
molten sample without transferring any serum.
NOTE 1 Butter can be obtained from cream by churning and thorough washing of the resulting butter grain.
NOTE 2 The milk fat obtained using the procedure in this subclause is almost free of phospholipids.
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8.1.3 Extraction according to the Röse–Gottlieb gravimetric method
Extract the fat fraction from the test sample by using the gravimetric method specified in one of:
ISO 1211⎪IDF 1, ISO 2450⎪IDF 16 or ISO 7328⎪IDF 116.
8.1.4 Extraction from milk using silica gel columns
Temper the milk to 20 °C. Using a micropipette (6.7), add 0,7 ml of the sample thus prepared into a 1 ml to
3 ml Extrelut column (6.3). Allow the sample to distribute uniformly on the silica gel for approximately 5 min.
To denature the protein–lipid complexes, using the graduated pipette (6.8), add 1,5 ml of methanol (5.4) to the
Extrelut column. Subsequently, extract the fat fraction from the test sample with 20 ml of n-hexane (5.5). Add
the n-hexane slowly in small amounts. Collect the solvent draining off in a 50 ml round-bottomed flask (6.9),
previously dried to a constant, known mass weighed to the nearest 1 mg and record the mass to 0,1 mg.
Allow the column to drain until empty after the extraction. Distil off the solvents from the eluate on a rotary
evaporator (6.13) with its water bath maintained at between 40 °C and 50 °C.
After distilling off the solvents, dry and subsequently weigh the round-bottomed flask and its contents to the
nearest 1 mg, recording the mass to 0,1 mg. Determine the fat mass yield by subtracting the mass of the dried
empty round-bottomed flask from the mass obtained.
Depending on the fat content of the milk and the required concentration of the sample solution, check whether
it is necessary to combine the yield of two or more extractions to obtain an adequate amount of fat.
8.2 Preparation of fat sample solution
For gas chromatography with a packed column, prepare a 5 % volume fraction solution of the fat obtained in
8.1.2, 8.1.3 or 8.1.4 in n-hexane (5.5) or n-heptane (5.6). Depending on the column dimensions, use a
concentration of 1 % [0,53 mm internal diameter (ID), wide-bore] or lower for on-column injection with a
capillary column.
When using the fat sample prepared in 8.1.4, calculate the amount of solvent (5.5 or 5.6) to be added to the
test sample in the flask based on the mass of fat obtained.
Completely dissolve the fat in the solvent used. Transfer approximately 0,5 ml to 1 ml of the fat sample
solution obtained into an ampoule (6.14).
8.3 Chromatographic triglyceride determination
8.3.1 Baseline drift
To minimize baseline rising, condition the column as specified in 6.2.2 (capillary column) or in Clause A.4
(packed column).
NOTE Because of the high column temperature, the analysis of TGs is particularly susceptible to a rise of the
baseline in the high carbon-number range.
8.3.2 Injection technique
8.3.2.1 Packed column
To avoid discrimination effects and to improve the quantification of the high-boiling TG components, apply the
hot-needle technique.
Fill the needle with air by drawing up the fat solution into the body of the syringe. Insert the needle into the
injector. Heat the needle prior to injection for about 3 s. Then, rapidly inject the syringe contents.
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8.3.2.2 Capillary column
When using cool on-column injection (8.3.4.2), insert the needle of the syringe and inject immediately. Choose
a suitable subsequent dwell time of the needle in the injector so as to avoid broad tailing of the solvent peak.
NOTE The optimum dwell time is typically about 3 s.
8.3.3 Calibration
8.3.3.1 General
For the calibration of test samples, perform two to three analyses of standardized milk fat at the beginning of
every working day. Use the last analysis of the standardized milk fat to determine the response factors, f
i
(mass fraction divided by area fraction), of the TGs and of cholesterol and apply these to the subsequent test
samples (see 10.1):
wA∑
ii
f = (1)
i
∑wA
ii
where
w is the mass fraction, expressed as a percentage, of each TG or cholesterol in the standardized milk
i
fat;
A is the numerical value of the peak area of each TG or cholesterol in the standardized milk fat.
i
Express the response factors to four decimal places.
Proceed in accordance with either 8.3.3.2 or 8.3.3.3 to obtain a standardized milk fat with a known TG
composition.
8.3.3.2 Commercial milk fat standard
3)
Use a standardized milk fat with a certified TG composition to determine the response factor of each
constituent of the test sample.
8.3.3.3 Laboratory milk fat standard
Prepare about 1 g of a mixture of the fat standards (5.3) — containing at least the saturated TGs, C24, C30,
C36, C42, C48 and C54, as well as cholesterol; plus, preferably, C50 and C52 — by weighing to the nearest
1 mg and recording the mass to 0,1 mg to obtain a relative TG composition similar to milk fat.
Analyse repeatedly a solution of the fat standards mixture in n-hexane (5.5) or n-heptane (5.6) in accordance
with 8.3.4. In the same sequence, analyse repeatedly milk fat of typical composition.
Determine the TG response factors from the fat standards mixture. Calculate the intermediate response
factors of TGs not present in the mixture by mathematical interpolation. Apply the response factors obtained to
the milk fat in order to obtain a standardized composition.
The standardized milk fat thus obtained has a stock life of several years, if stored under nitrogen at a
maximum temperature of −18 °C.
3) CRM 519 (anhydrous milk fat) is an example of a suitable product available commercially. This information is given for
the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO or by IDF of this
product.
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8.3.4 Chromatographic conditions
8.3.4.1 Packed column
8.3.4.1.1 Use of a packed column generally results in a resolution similar to that in Figure 1. Although not
normally observed, avoid splitting of the even-numbered TGs.
8.3.4.1.2 Temperature programme: set the initial oven temperature to 210 °C. Maintain it at that
temperature for 1 min. Then increase the temperature at a rate of 6 °C/min to 350 °C. Maintain it at that (final)
temperature for 5 min.
8.3.4.1.3 Detector and injector temperatures: set both at 370 °C.
8.3.4.1.4 Carrier gas: use nitrogen at a constant flow rate of about 40 ml/min. Adjust the exact carrier gas
flow in such a manner that C54 is eluted at 341 °C.
8.3.4.1.5 Duration of analysis: 29,3 min.
8.3.4.1.6 Injection volume: inject 0,5 µl of a 5 % volume fraction sample solution.
8.3.4.1.7 When no TG analyses are being carried out, maintain the initial oven temperature as given in
8.3.4.1.2, the detector and injector temperatures as in 8.3.4.1.3, and the carrier gas flow rate as in 8.3.4.1.4 at
a constant level, also overnight and during weekends and holidays. This ensures optimum performance of the
column.
8.3.4.2 Capillary column
8.3.4.2.1 Use of a capillary column generally results in a resolution similar to that in Figure 1. Although not
normally observed, avoid splitting of the even-numbered TGs.
8.3.4.2.2 Temperature programme: set the initial oven temperature 80 °C. Maintain it at that temperature
for 0,5 min. Then increase the temperature at a rate of 50 °C/min to 190 °C and subsequently at a rate of
6 °C/min to 350 °C. Maintain it at that (final) temperature for 5 min.
8.3.4.2.3 Detector temperature: set at 370 °C.
8.3.4.2.4 Carrier gas: use nitrogen at a constant flow rate of about 3 ml/min.
8.3.4.2.5 Duration of analysis: 34,4 min.
8.3.4.2.6 Injection volume: inject 0,5 µl of a 1 % volume fraction sample solution.
8.3.4.2.7 Maintain these settings during standby to ensure best performance (see 8.3.4.1.7).
When using cool on-column injection, set the injector temperature to oven track mode to obtain best results.
The analytical settings given in 8.3.4.2 are suitable for use with on-column injection on to a wide-bore column
(0,53 mm ID) as specified in 6.2.2. Different conditions may be applied if another column dimension or phase
is used. The scope includes the use of ultrafast GC. In any case, be aware of the indispensable requirement
for appropriate resolution (see Figure 1).
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IDF 202:2010(E)
9 Integration, evaluation and control of the analytical performance
Evaluate the chromatogram peaks with an integration system capable of baseline drawing and reintegration.
Figure 1 shows an example of a correctly integrated chromatogram, whereas Figure 2 demonstrates an
example of a sporadic error in the baseline ending after C54 that influences the percentages of all TGs.
Nevertheless, exclude peaks eluting after C54 from the evaluation.
Combine TGs with an odd acyl-C number (2n + 1) with the preceding even-numbered TG (2n). Do not take
into account the low C56 content. Multiply the area percentages of the remaining TGs, including cholesterol,
by the corresponding response factors of the standardized milk fat (latest calibration) and normalize altogether
to 100 % in accordance with 10.1.
Key
1 cholesterol
t time
Figure 1 — Example of a triglyceride chromatogram of milk fat with baseline set correctly
Key
1 choles
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17678
FIL
202
Première édition
2010-02-15
Lait et produits laitiers — Détermination
de la pureté des matières grasses
laitières par analyse chromatographique
en phase gazeuse des triglycérides
(Méthode de référence)
Milk and milk products — Determination of milk fat purity by gas
chromatographic analysis of triglycerides (Reference method)
Numéros de référence
ISO 17678:2010(F)
FIL 202:2010(F)
©
ISO et FIL 2010
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.2
3 Termes et définitions .2
4 Principe .2
5 Réactifs.2
6 Appareillage .3
7 Échantillonnage.4
8 Mode opératoire.5
8.1 Préparation des échantillons pour essai .5
8.2 Préparation de la solution échantillon de matière grasse .6
8.3 Analyse chromatographique des triglycérides .6
9 Intégration, évaluation et contrôle de la performance analytique .8
10 Calcul et expression des résultats .10
10.1 Composition des triglycérides.10
10.2 Valeurs de S.11
10.3 Détection des matières grasses étrangères.11
11 Fidélité .12
11.1 Essai interlaboratoires.12
11.2 Répétabilité .12
11.3 Reproductibilité .12
12 Rapport d'essai.13
Annexe A (normative) Préparation de la colonne remplie.14
Annexe B (informative) Quantification des matières grasses étrangères .18
Annexe C (informative) Incertitude de mesure .20
Annexe D (informative) Essai interlaboratoires.21
Bibliographie.23
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17678⎪FIL 202 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération Internationale de Laiterie (FIL). Elle est publiée conjointement
par l'ISO et la FIL.
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FIL 202:2010(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération Internationale de Laiterie) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
La tâche principale des Comités permanents est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les Comités permanents sont soumis aux Comités Nationaux pour
approbation avant publication en tant que Norme internationale. La publication comme Norme internationale
requiert l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17678⎪FIL 202 a été élaborée par la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été confié au Groupe de projet mixte ISO-FIL, Matières grasses étrangères, du
Comité permanent chargé des Méthodes d'analyse de la composition, sous la conduite de son chef de projet,
Dr J. Molkentin (DE).
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NORME INTERNATIONALE
FIL 202:2010(F)
Lait et produits laitiers — Détermination de la pureté des
matières grasses laitières par analyse chromatographique en
phase gazeuse des triglycérides (Méthode de référence)
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de référence pour la détermination de la pureté des
matières grasses laitières par analyse chromatographique en phase gazeuse des triglycérides. La méthode
permet de détecter des matières grasses d'origines végétale et animale telles que la graisse de bœuf et le
saindoux. À l'aide de formules de triglycérides définies, l'intégrité de la matière grasse laitière est ainsi
déterminée.
En principe, la méthode s'applique au lait en vrac, ou aux produits laitiers dérivés, indépendamment des
conditions d'alimentation, d'élevage ou de lactation. Elle s'applique en particulier aux matières grasses
extraites de produits laitiers supposés contenir des matières grasses laitières pures, présentant une
composition non modifiée, comme le beurre, la crème, le lait et le lait en poudre.
Toutefois, dans les circonstances listées ci-après, un résultat faux positif peut être obtenu. Par conséquent, la
méthode n'est pas applicable à la matière grasse laitière:
a) issue de lait de bovin autre que le lait de vache;
b) issue de vaches individuelles;
c) issue de vaches ayant reçu une alimentation exceptionnellement riche en huiles végétales pures telles
que l'huile de colza;
d) issue du colostrum;
e) soumise à un traitement technologique tel que l'élimination du cholestérol ou le fractionnement;
f) issue du lait écrémé ou du lait battu (babeurre);
g) extraite selon les méthodes Gerber, Weibull–Berntrop ou Schmid–Bondzynski–Ratzlaff, ou isolée au
moyen de détergents [par exemple méthode BDI (Bureau of Dairy Industries)].
Avec les méthodes d'extraction spécifiées en g), d'importantes quantités de glycérides ou phospholipides
partiaux peuvent passer dans la phase des matières grasses. Par conséquent, le domaine d'application de la
présente Norme internationale exclut certains produits et en particulier le fromage, dont le procédé d'affinage
peut également affecter la composition de la matière grasse à tel point qu'un résultat faux positif est obtenu.
NOTE 1 Dans la nature, l'acide butyrique (n-butanoïque) (C4) se trouve exclusivement dans les matières grasses
laitières et permet d'effectuer des estimations quantitatives de petites et moyennes quantités de matières grasses laitières
dans les graisses végétales et animales. Cependant, en raison de la grande variation de C4, dont la fraction massique est
comprise approximativement entre 3,1 % et 3,8 %, des informations qualitatives et quantitatives peuvent difficilement être
fournies lorsque le rapport des matières grasses étrangères aux matières grasses laitières pures atteint jusqu'à 20 % en
fraction massique (voir Référence [11]).
NOTE 2 Dans la pratique, des résultats quantitatifs ne peuvent pas être déduits de la teneur en stérols des matières
grasses végétales, étant donné que celles-ci sont fonction des conditions de production et de traitement. En outre, la
détermination qualitative de matières grasses étrangères au moyen de stérols est ambiguë.
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2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 1211⎪FIL 1, Lait — Détermination de la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique (Méthode de
référence)
ISO 2450⎪FIL 16, Crème — Détermination de la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique
(Méthode de référence)
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 7328⎪FIL 116, Glaces de consommation et préparations pour glaces à base de lait — Détermination de
la teneur en matière grasse — Méthode gravimétrique (méthode de référence)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
pureté des matières grasses laitières
absence de graisses végétales et animales déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente
Norme internationale
NOTE La pureté est déterminée à l'aide de valeurs de S qui sont calculées à partir de la composition des
triglycérides. Les fractions massiques des triglycérides sont exprimées en pourcentage.
4 Principe
La matière grasse extraite du lait ou des produits laitiers est analysée par chromatographie en phase
gazeuse (CPG) sur une colonne remplie ou une colonne capillaire courte pour doser les triglycérides (TG),
lesquels se distinguent en fonction de leur nombre total d'atomes de carbone. Les valeurs de S sont calculées
en insérant la fraction massique, exprimée en pourcentage, correspondant au poids des molécules de
matières grasses de différentes tailles (C24 à C54 en utilisant uniquement les nombres de C pairs) dans des
formules de TG appropriées. Si les valeurs de S dépassent les limites établies pour de la matière grasse
laitière pure, la présence de matières grasses étrangères est avérée.
NOTE 1 L'aptitude à l'emploi des colonnes remplie et capillaire a déjà été démontrée, tout comme les conditions de
leur équivalence (voir Références [8] à [10]).
NOTE 2 La valeur de S est la somme des fractions massiques pondérées des TG.
5 Réactifs
Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue.
5.1 Eau, conforme aux exigences de l'ISO 3696, qualité 2.
5.2 Gaz vecteur, azote ou, en variante, hélium ou hydrogène, tous d'une pureté d'au moins 99,995 % en
fraction volumique.
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5.3 Étalons de matière grasse, d'une pureté d'au moins 99 % en fraction massique, pour l'étalonnage de
l'étalon de matière grasse laitière décrit en 8.3.3.
5.3.1 Étalons de triglycérides, saturés; des produits adaptés sont disponibles dans le commerce.
5.3.2 Étalon de cholestérol.
5.4 Méthanol (CH OH), ayant une teneur maximale en eau de 0,05 % en fraction massique.
3
5.5 n-Hexane [CH (CH ) CH ].
3 2 4 3
5.6 n-Heptane [CH (CH ) CH ].
3 2 5 3
5.7 Autres gaz, hydrogène, d'une pureté d'au moins 99,995 % en fraction volumique, exempt d'impuretés
organiques (C H < 1 µl/l); air synthétique, exempt d'impuretés organiques (C H < 1 µl/l).
n m n m
5.8 Sulfate de sodium anhydre (Na SO ).
2 4
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Chromatographe en phase gazeuse à haute température, adapté pour une utilisation à des
températures de 400 °C au minimum et équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (DIF). En cas de CPG
sur colonne capillaire, il est essentiel d'utiliser un système d'injection sur colonne (à dépôt direct) ou un
injecteur à température programmée (PTV), tandis qu'un injecteur à division de flux ne convient pas.
Les septums utilisés dans l'injecteur doivent résister à des températures élevées et présenter un très faible
degré «d'écoulement». Utiliser uniquement des joints de graphite pour le raccordement de la colonne ainsi
que pour l'insert dans le détecteur et/ou l'injecteur (le cas échéant).
6.2 Colonne de chromatographie.
6.2.1 Colonne remplie, en verre ayant un diamètre intérieur de 2 mm et une longueur de 500 mm, remplie
1)
d'une phase stationnaire OV-1 à 3 % sur 125 µm à 150 µm (100 mesh à 120 mesh) Gas ChromoQ .
La préparation, la silanisation, le garnissage et le conditionnement de la colonne remplie sont décrits dans
l'Annexe A.
En variante, une colonne capillaire (6.2.2) peut être utilisée.
6.2.2 Colonne capillaire, courte, par exemple de 5 m de long, avec une phase stationnaire non polaire
2)
résistant à des températures de l'ordre de 400 °C ou plus .
Conditionner la colonne en effectuant 20 analyses d'une solution de matières grasses laitières (8.2) dans un
délai n'excédant pas plus de deux jours, avec les réglages indiqués en 8.3.4.2. Après cela, les facteurs de
réponse (8.3.3) doivent se situer autour de 1 sans dépasser 1,250 0.
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de
la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
2) CP-Ultimetal SimDist (5 m, 0,53 mm, 0,17 µm) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette
information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO
ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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En raison du chevauchement variable entre le C24 et le cholestérol, un facteur de réponse supérieur peut être
admis pour le C24.
Il est possible d'utiliser des colonnes de dimensions différentes et avec une phase non polaire différente
résistant à des températures élevées à condition qu'elles présentent des performances compatibles avec la
présente Norme internationale. Toutefois, la longueur de la colonne est restreinte par la limitation
indispensable de la résolution comme illustré à la Figure 1. Voir également 8.3.4.2.
1)
6.3 Colonne Extrelut , d'une capacité de 1 ml à 3 ml, remplie de gel de silice, requise uniquement pour
l'extraction de la matière grasse laitière conformément à 8.1.4.
6.4 Joints de graphite, capables de résister à des températures de 400 °C au minimum; à utiliser pour le
raccordement de la colonne CPG ainsi que pour l'insert dans le détecteur et/ou l'injecteur.
6.5 Bain d'eau, pouvant être maintenu à une température de 50 °C ± 2 °C.
6.6 Armoire de dessiccation, capable de fonctionner à 50 °C ± 2 °C et à 100 °C ± 2 °C.
6.7 Micropipette.
[2]
6.8 Pipette graduée, d'une capacité de 5 ml, ISO 835 , classe A.
6.9 Fiole à fond rond, d'une capacité de 50 ml.
6.10 Fiole Erlenmeyer, d'une capacité nominale de 250 ml.
6.11 Entonnoir.
6.12 Papier-filtre à micropores.
6.13 Évaporateur rotatif.
6.14 Ampoules, d'une capacité nominale de 1 ml, munies d'un capuchon serti ou vissé en aluminium revêtu
de polytétrafluoroéthylène.
6.15 Seringue à injection, le piston de la seringue ne devant pas toucher le bout de l'aiguille (CPG sur
colonne remplie).
NOTE Ces seringues permettent d'obtenir une meilleure répétabilité des résultats.
6.16 Balance analytique, capable de peser à 1 mg près, avec une lisibilité de 0,1 mg.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 707⎪FIL 50 .
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été transmis au laboratoire. Il convient qu'il n'ait pas été
endommagé ou modifié pendant le transport ou le stockage.
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8 Mode opératoire
8.1 Préparation des échantillons pour essai
8.1.1 Généralités
Pour la préparation des échantillons pour essai, utiliser l'une des méthodes d'isolement ou d'extraction des
matières grasses laitières spécifiées en 8.1.2 à 8.1.4.
8.1.2 Isolement des matières grasses laitières du beurre ou de l'huile de beurre
Faire fondre 50 g à 100 g de l'échantillon pour essai dans le bain d'eau (6.5) ou l'armoire de dessiccation (6.6)
à 50 °C.
Placer 0,5 g à 1,0 g de sulfate de sodium (5.8) sur un papier-filtre plié (6.12). Préchauffer, dans l'armoire de
dessiccation (6.6) réglée à 50 °C, une fiole Erlenmeyer de 250 ml (6.10) et un entonnoir (6.11) dans lequel est
inséré le papier-filtre contenant le sulfate de sodium.
Lorsque la quantité d'échantillon pour essai disponible est limitée, utiliser un échantillon pour essai plus petit
et adapter le mode opératoire en conséquence.
Noter toutefois que la mise en œuvre d'une prise d'essai plus petite engendre un risque plus élevé d'obtenir
un échantillon non représentatif.
En conservant dans l'armoire de dessiccation la fiole préchauffée, l'entonnoir et le dispositif de filtration inséré,
filtrer la couche de matières grasses de l'échantillon fondu sans transférer le sérum.
NOTE 1 Le beurre peut être obtenu à partir de crème en battant et lavant à fond les grains de beurre qui en résultent.
NOTE 2 La matière grasse laitière obtenue en utilisant le mode opératoire décrit dans le présent paragraphe est
presque exempt de phospholipides.
8.1.3 Extraction conformément à la méthode gravimétrique de Röse–Gottlieb
Extraire la fraction de matières grasses de l'échantillon pour essai à l'aide de la méthode gravimétrique
spécifiée dans l'ISO 1211⎪FIL 1, l'ISO 2450⎪FIL 16 ou l'ISO 7328⎪FIL 116.
8.1.4 Extraction du lait au moyen de colonnes de gel de silice
Porter le lait à une température de 20 °C. À l'aide d'une micropipette (6.7), introduire 0,7 ml de l'échantillon
ainsi préparé dans une colonne Extrelut (6.3) de 1 ml à 3 ml de capacité. Laisser l'échantillon se répartir
uniformément sur le gel de silice pendant environ 5 min.
Pour dénaturer les complexes protéines-lipides, ajouter dans la colonne Extrelut 1,5 ml de méthanol (5.4)
avec la pipette graduée (6.8). Extraire ensuite la fraction de matières grasses de l'échantillon pour essai avec
20 ml de n-hexane (5.5). Ajouter le n-hexane progressivement, par petites quantités. Recueillir le solvant qui
s'égoutte dans une fiole à fond rond de 50 ml (6.9), préalablement séchée jusqu'à stabilisation, à 1 mg près,
de sa masse à une valeur connue. Noter la masse à 0,1 mg près.
Après extraction, laisser la colonne s'écouler jusqu'à ce qu'elle soit vide. À partir de l'éluat, éliminer par
distillation les solvants sur un évaporateur rotatif (6.13), la température du bain d'eau étant maintenue entre
40 °C et 50 °C.
Une fois les solvants éliminés par distillation, sécher puis peser la fiole à fond rond et son contenu à 1 mg
près et noter la masse à 0,1 mg près. Déterminer la masse de matières grasses obtenue en soustrayant la
masse de la fiole à fond rond, vide et séchée, de la masse obtenue.
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Selon la teneur en matière grasse du lait et la concentration requise de la solution échantillon, vérifier s'il est
nécessaire de combiner le résultat de deux extractions, ou plus, pour obtenir une quantité adéquate de
matière grasse.
8.2 Préparation de la solution échantillon de matière grasse
Pour la chromatographie en phase gazeuse sur colonne remplie, préparer une solution à 5 % (fraction
volumique) de la matière grasse obtenue en 8.1.2, 8.1.3 ou 8.1.4 dans du n-hexane (5.5) ou du
n-heptane (5.6). En fonction des dimensions de la colonne, utiliser une concentration à 1 % (grand diamètre
intérieur 0,53 mm) ou inférieure en cas d'injection sur colonne (à dépôt direct) avec une colonne capillaire.
Lorsque l'échantillon de matière grasse préparé en 8.1.4 est utilisé, calculer la quantité de solvant (5.5 ou 5.6)
à ajouter à l'échantillon pour essai dans la fiole en se fondant sur la masse de matière grasse obtenue.
Dissoudre complètement la matière grasse dans le solvant utilisé. Transférer environ 0,5 ml à 1 ml de la
solution échantillon de matière grasse obtenue dans une ampoule (6.14).
8.3 Analyse chromatographique des triglycérides
8.3.1 Dérive de la ligne de base
Pour réduire au minimum le relèvement de la ligne de base, conditionner la colonne comme spécifié en 6.2.2
(colonne capillaire) ou en A.4 (colonne remplie).
NOTE En raison des températures élevées dans la colonne, l'analyse des TG est particulièrement susceptible de
montrer un relèvement de la ligne de base dans la plage correspondant à un nombre élevé d'atomes de carbone.
8.3.2 Technique d'injection
8.3.2.1 Colonne remplie
Pour éviter des effets de discrimination et obtenir de meilleurs résultats quantitatifs avec les composants de
TG à point d'ébullition élevé, appliquer la technique «d'injection chaude».
Remplir l'aiguille avec de l'air en aspirant la solution de matière grasse dans le corps de la seringue. Insérer
l'aiguille dans l'injecteur. Chauffer l'aiguille préalablement à l'injection pendant environ 3 s, puis injecter
rapidement le contenu de la seringue.
8.3.2.2 Colonne capillaire
En cas d'injection à froid sur colonne (à dépôt direct) (8.3.4.2), insérer l'aiguille de la seringue et procéder
immédiatement à l'injection. Choisir de manière adéquate le temps de séjour ultérieur de l'aiguille dans l'orifice
d'injection afin d'éviter l'apparition d'une large traînée du pic de solvant.
NOTE Le temps de séjour optimal est typiquement de l'ordre de 3 s.
8.3.3 Étalonnage
8.3.3.1 Généralités
En vue de l'étalonnage des échantillons pour essai, effectuer deux à trois analyses de la matière grasse
laitière étalonnée au début de chaque journée de travail. Utiliser la dernière analyse de la matière grasse
laitière étalonnée pour déterminer les facteurs de réponse f (fraction massique divisée par fraction surfacique)
i
des TG et du cholestérol et les appliquer aux échantillons pour essai ultérieurs (voir 10.1):
wA∑
ii
f = (1)
i
∑wA
ii
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où
w est la fraction massique, exprimée en pourcentage, de chaque TG ou du cholestérol présent dans la
i
matière grasse laitière étalonnée;
A est la valeur numérique de l'aire du pic de chaque TG ou du cholestérol présent dans la matière
i
grasse laitière étalonnée.
Exprimer les facteurs de réponse à quatre décimales.
Procéder conformément à 8.3.3.2 ou 8.3.3.3 pour obtenir une matière grasse étalonnée de composition en
TG connue.
8.3.3.2 Étalon de matière grasse laitière obtenu dans le commerce
3)
Utiliser une matière grasse laitière étalonnée dont la composition en TG est certifiée pour déterminer le
facteur de réponse de chaque composant de l'échantillon pour essai.
8.3.3.3 Étalon de matière grasse laitière réalisé en laboratoire
Préparer environ 1 g d'un mélange des étalons de matière grasse (5.3) — comprenant au moins les TG
saturés C24, C30, C36, C42, C48 et C54, ainsi que le cholestérol; plus, de préférence, C50 et C52 — en
pesant à 1 mg près, et en notant la masse à 0,1 mg près pour obtenir une composition relative en TG similaire
à la matière grasse laitière.
Analyser à plusieurs reprises une solution du mélange d'étalons de matière grasse dans du n-hexane (5.5) ou
du n-heptane (5.6) conformément à 8.3.4. Simultanément, analyser à plusieurs reprises la matière grasse
laitière de composition type.
Déterminer les facteurs de réponse des TG à partir du mélange d'étalons de matière grasse. Calculer les
facteurs de réponse intermédiaires des TG non présents dans le mélange par interpolation mathématique.
Appliquer les
...
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