ISO 14851:1999
(Main)Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium — Method by measuring the oxygen demand in a closed respirometer
Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium — Method by measuring the oxygen demand in a closed respirometer
Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des matériaux plastiques en milieu aqueux — Méthode par détermination de la demande en oxygène dans un respiromètre fermé
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14851
First edition
1999-05-15
Corrected version
2003-07-15
Determination of the ultimate aerobic
biodegradability of plastic materials in an
aqueous medium — Method by measuring
the oxygen demand in a closed
respirometer
Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des matériaux plastiques
en milieu aqueux — Méthode par détermination de la demande en oxygène
dans un respiromètre fermé
A
Reference number
ISO 14851:1999(E)
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ISO 14851:1999(E)
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Published in Switzerland
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ISO 14851:1999(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 14851 was prepared by Technical Committee ISO/TC 61, Plastics, Subcommittee SC 5,
Physical-chemical properties.
Annexes A to G of this International Standard are for information only.
This corrected version of ISO 14851:1999 incorporates the following corrections:
— in Clause 2, the year of publication of ISO 9408 has been inserted and the footnote deleted;
— the remaining footnotes have been renumbered;
— in Annex C, errors in the key to Figure C.1 have been corrected and minor improvements made to the figure
itself;
— in the Bibliography, references [1] and [2] have been updated.
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ISO 14851:1999(E)
Introduction
With the increasing use of plastics, their recovery and disposal have become a major issue. As a first priority,
recovery should be promoted. Complete recovery of plastics, however, is difficult. For example, plastic litter, which
comes mainly from consumers, is difficult to recover completely. Additional examples of plastics which are difficult to
recover are fishing tackle, agricultural mulches and water-soluble polymers. These plastic materials tend to leak
from closed waste-management cycles into the environment. Biodegradable plastics are now emerging as one of
the options available to solve such environmental problems. Plastic materials, such as products or packaging, which
are sent to composting facilities should be potentially biodegradable. Therefore it is very important to determine the
potential biodegradability of such materials and to obtain an indication of their biodegradability in natural
environments.
iv
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INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 14851:1999(E)
Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic
materials in an aqueous medium — Method by measuring the
oxygen demand in a closed respirometer
WARNING — Sewage, activated sludge, soil and compost may contain potentially pathogenic organisms.
Therefore appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds and those
whose properties are unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard specifies a method, by measuring the oxygen demand in a closed respirometer, for the
determination of the degree of aerobic biodegradability of plastic materials, including those containing formulation
additives. The test material is exposed in an aqueous medium under laboratory conditions to an inoculum from
activated sludge, compost or soil.
If an unadapted activated sludge is used as the inoculum, the test simulates the biodegradation processes which
occur in a natural aqueous environment; if a mixed or pre-exposed inoculum is used, the method can be used to
investigate the potential biodegradability of a test material.
The conditions used in this International Standard do not necessarily correspond to the optimum conditions allowing
maximum biodegradation to occur, but the standard is designed to determine the potential biodegradability of plastic
materials or give an indication of their biodegradability in natural environments.
The method enables the assessment of the biodegradability to be improved by calculating a carbon balance
(optional, see annex E).
The method applies to the following materials:
Natural and/or synthetic polymers, copolymers or mixtures thereof.
Plastic materials which contain additives such as plasticizers, colorants or other compounds.
Water-soluble polymers.
Materials which, under the test conditions, do not inhibit the microorganisms present in the inoculum. Inhibitory
[3]
effects can be determined using an inhibition control or by another appropriate method (see e.g. ISO 8192 ). If
the test material is inhibitory to the inoculum, a lower test concentration, another inoculum or a pre-exposed
inoculum can be used.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
1
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ISO 14851:1999(E)
ISO 8245:1999,
Water quality — Guidelines for the determination of total organic carbon (TOC) and dissolved
organic carbon (DOC).
ISO 9408:1999, Water quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous
medium by determination of oxygen demand in a closed respirometer.
ISO 10634:1995, Water quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic
compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
ISO/TR 15462:1997, Water quality — Selection of tests for biodegradability.
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the following definitions apply:
3.1
ultimate aerobic biodegradation
the breakdown of an organic compound by microorganisms in the presence of oxygen into carbon dioxide, water
and mineral salts of any other elements present (mineralization) plus new biomass
3.2
activated sludge
biomass produced in the aerobic treatment of waste water by the growth of bacteria and other microorganisms in
the presence of dissolved oxygen
3.3
concentration of suspended solids in an activated sludge
the amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge and drying at
o
about 105 C to constant mass
3.4
biochemical oxygen demand
BOD
the mass concentration of the dissolved oxygen consumed under specified conditions by the aerobic biological
oxidation of a chemical compound or organic matter in water, expressed as milligrams of oxygen uptake per
milligram or gram of test compound
3.5
theoretical oxygen demand
ThOD
the theoretical maximum amount of oxygen required to oxidize a chemical compound completely, calculated from
the molecular formula, expressed as milligrams of oxygen uptake per milligram or gram of test compound
3.6
total organic carbon
TOC
all the carbon present in organic matter which is dissolved or suspended in water
3.7
dissolved organic carbon
DOC
that part of the organic carbon in water which cannot be removed by specified phase separation, for example by
-2
centrifugation at 40 000 m⋅s for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores of 0,2 mm to
0,45 mm diameter
2
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3.8
lag phase
the time, measured in days, from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading
microorganisms is achieved and the degree of biodegradation of a chemical compound or organic matter has
increased to about 10 % of the maximum level of biodegradation
3.9
maximum level of biodegradation
the degree of biodegradation, measured in per cent, of a chemical compound or organic matter in a test, above
which no further biodegradation takes place during the test
3.10
biodegradation phase
the time, measured in days, from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of
biodegradation has been reached
3.11
plateau phase
the time, measured in days, from the end of the biodegradation phase until the end of a test
3.12
pre-exposure
the pre-incubation of an inoculum in the presence of the chemical compound or organic matter under test, with the
aim of enhancing the ability of the inoculum to biodegrade the test material by adaptation and/or selection of the
microorganisms
3.13
pre-conditioning
the pre-incubation of an inoculum under the conditions of the subsequent test in the absence of the chemical
compound or organic matter under test, with the aim of improving the test by acclimatization of the microorganisms
to the test conditions
4 Principle
The biodegradability of a plastic material is determined using aerobic microorganisms in an aqueous system. The
test mixture contains an inorganic medium, the organic test material (the sole source of carbon and energy) with a
concentration between 100 mg/l and 2 000 mg/l of organic carbon, and activated sludge or a suspension of active
soil or compost as the inoculum. The mixture is stirred in closed flasks in a respirometer for a period not exceeding
6 months. The carbon dioxide evolved is absorbed in a suitable absorber in the headspace of the flasks. The
consumption of oxygen (BOD) is determined, for example by measuring the amount of oxygen required to maintain
a constant volume of gas in the respirometer flasks, or by measuring the change in volume or pressure (or a
combination of the two) either automatically or manually. An example of a respirometer is given in annex C.
[4]
Alternatively, the two-phase closed-bottle version described in ISO 10708 may be used (see annex D).
The level of biodegradation is determined by comparing the BOD with the theoretical amount (ThOD) and
expressed in per cent. The influence of possible nitrification processes on the BOD have to be considered. The test
result is the maximum level of biodegradation determined from the plateau phase of the biodegradation curve.
Optionally, a carbon balance may be calculated to give additional information on the biodegradation (see annex E).
Unlike ISO 9408, which is used for a variety of organic compounds, this International Standard is specially designed
for the determination of the biodegradability of plastic materials. The special requirements necessary affect the
choice of the inoculum and the test medium, and there is the possibility of improving the evaluation of the
biodegradability by calculating a carbon balance.
3
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5 Test environment
Incubation shall take place in the dark or in diffuse light in an enclosure which is free from vapours inhibitory to
microorganisms and which is maintained at a constant temperature, preferably between 20 °C and 25 °C, to an
accuracy of ± 1 °C, or at any other appropriate temperature depending on the inoculum used and the environment
to be assessed.
NOTE With a compost inoculum, higher temperatures may be appropriate.
6 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
6.1 Distilled or deionized water, free of toxic substances (copper in particular) and containing less than 2 mg/l of
DOC.
6.2 Test medium.
Depending on the purpose of the test, different test media may be used. For example, if simulating a natural
environment use the standard test medium (6.2.1). If a test material is used at higher concentrations, use the
optimized test medium (6.2.2) with higher buffering capacity and nutrient concentrations.
6.2.1 Standard test medium
6.2.1.1 Solution A
Dissolve
anhydrous potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 8,5 g
2 4
anhydrous dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 21,75 g
2 4
disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na HPO ×2H O) 33,4 g
2 4 2
ammonium chloride (NH Cl) 0,5 g
4
in water (6.1) and make up to 1000 ml.
NOTE The correct composition of the solution can be checked by measuring the pH, which should be 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ×7H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
4 2
6.2.1.3 Solution C
Dissolve 36,4 g of calcium chloride dihydrate (CaCl ×2H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
2 2
6.2.1.4 Solution D
Dissolve 0,25 g of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl ×6H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
3 2
Prepare this solution freshly before use to avoid precipitation, or add a drop of concentrated hydrochloric acid (HCl)
or a drop of 0,4 g/l aqueous solution of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
6.2.1.5 Preparation
To prepare 1 litre of test medium, add, to about 500 ml of water (6.1),
4
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10 ml of solution A;
1 ml of each of solutions B to D.
Make up to 1000 ml with water (6.1).
6.2.2 Optimized test medium
This optimized medium is highly buffered and contains more inorganic nutrients. This is necessary to keep the pH
constant in the system during the test, even at high concentrations of the test material. The medium contains about
2400 mg/l of phosphorus and 50 mg/l of nitrogen and is therefore suitable for concentrations in the test material of
up to 2000 mg/l of organic carbon. If higher test-material concentrations are used, increase the nitrogen content to
keep the C:N ratio at about 40:1.
6.2.2.1 Solution A
Dissolve
anhydrous potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) 37,5 g
2 4
disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na HPO ×2H O) 87,3 g
2 4 2
ammonium chloride (NH Cl) 2,0 g
4
in water (6.1) and make up to 1000 ml.
6.2.2.2 Solution B
Dissolve 22,5 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ×7H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
4 2
6.2.2.3 Solution C
Dissolve 36,4 g of calcium chloride dihydrate (CaCl ×2H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
2 2
6.2.2.4 Solution D
Dissolve 0,25 g of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl ×6H O) in water (6.1) and make up to 1000 ml (see second
3 2
paragraph of 6.2.1.4).
(trace-element solution, optional)
6.2.2.5 Solution E
Dissolve in 10 ml of aqueous HCl solution (25 %, 7,7 mol/l), in the following sequence:
70 mg of ZnCl , 100 mg of MnCl ×4H O, 6 mg of H BO , 190 mg of CoCl ×6H O, 3 mg of CuCl ×2H O, 240 mg of
2 2 2 3 3 2 2 2 2
NiCl ×6H O, 36 mg of Na MoO ×2H O, 33 mg of Na WO ×2H O and 26 mg of Na SeO ×5H O
2 2 2 4 2 2 4 2 2 3 2
and make up to 1000 ml with water (6.1).
6.2.2.6 Solution F (vitamin solution, optional)
Dissolve in 100 ml of water (6.1) 0,6 mg of biotine, 2,0 mg of niacinamide, 2,0 mg of p-aminobenzoate, 1,0 mg of
panthotenic acid, 10,0 mg of pyridoxal hydrochloride, 5,0 mg of cyanocobalamine, 2,0 mg of folic acid, 5,0 mg of
riboflavin, 5,0 mg of DL-thioctic acid and 1,0 mg of thiamine dichloride or use a solution of 15 mg of yeast extract in
100 ml of water (6.1). Filter the solution for sterilization using membrane filters (see 7.4).
NOTE Solutions E and F are optional and are not required if a sufficient concentration of the inoculum is used, e.g.
activated sludge, soil or compost. It is recommended that 1 ml portions be prepared and kept refrigerated until use.
5
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6.2.2.7 Preparation
To prepare 1 litre of test medium, add, to about 800 ml of water (6.1),
100 ml of solution A;
1 ml of each of solutions B to D and, optionally, E and F.
Make up to 1000 ml with water (6.1) and measure the pH.
NOTE The correct composition of the test medium can be checked by measuring the pH, which should be 7,0 ± 0,2.
6.3 Pyrophosphate solution.
Dissolve 2,66 g of anhydrous sodium pyrophosphate (Na P O ) in water (6.1) and make up to 1000 ml.
4 2 7
6.4 Carbon dioxide absorber, preferably soda lime pellets or another suitable absorbant.
7 Apparatus
Ensure that all glassware is thoroughly cleaned and, in particular, free from organic or toxic matter.
Required is usual laboratory equipment, plus the following:
7.1 Closed respirometer, including test vessels (glass flasks) fitted with stirrers and all other necessary
equipment, and located in a constant-temperature room or in a thermostatted apparatus (e.g. water-bath). For an
example, see annex C.
NOTE Any respirometer able to determine with sufficient accuracy the biochemical oxygen demand is suitable, preferably
an apparatus which measures and replaces automatically and continuously the oxygen consumed so that no oxygen deficiency
and no inhibition of the microbial activity occurs during the degradation process. Instead of an ordinary respirometer, the two-
phase closed-bottle version may be used (see annex D).
7.2 Analytical equipment for measuring total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC)
(see ISO 8245).
7.3 Analytical equipment for measuring nitrate and nitrite concentrations.
NOTE A qualitative test is recommended first to decide if any nitrification has occurred. If there is evidence of nitrate/nitrite
in the medium, a quantitative determination using a suitable method (for example ion chromatography) is required.
7.4 Centrifuge, or filtration device with membrane filters (0,45 mm pore size) which neither adsorb nor release
organic carbon significantly.
7.5 Analytical balance (usual laboratory equipment).
7.6 pH meter (usual laboratory equipment).
8 Procedure
8.1 Test material
The test material shall be of known mass and contain sufficient carbon to yield a BOD that can be adequately
measured by the respirometer used. Calculate from the chemical formula or determine by elemental analysis the
ThOD (see annex A) and the TOC (using e.g. ISO 8245). Use a test-material concentration of at least 100 mg/l,
corresponding to a ThOD of about 170 mg/l or a TOC of about 60 mg/l. Use lower concentrations only if the
sensitivity of the respirometer is adequate. The maximum amount of test material is limited by the oxygen supply to
the respirometer and the test medium used. When using the optimized test medium (6.2.2), the test-material
6
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concentration shall be such that the TOC does not exceed about 2000 mg/l, i.e. a C:N ratio of about 40:1. If higher
concentrations are to be tested, increase the amount of nitrogen in the test medium.
NOTE 1 If biodegradation processes in natural environments are to be simulated, the use of the standard medium and a
test-material concentration of 100 mg/l are recommended.
NOTE 2 The test material should preferably be used in powder form, but it may also be introduced as films, pieces,
fragments or shaped articles. The form and shape of the test material may influence its biodegradability. Similar shapes should
preferably be used if different kinds of plastic material are to be compared. If the test material is used in the form of a powder,
particles of known, narrow size distribution should be used. A particle-size distribution with the maximum at 250 mm diameter is
recommended. Also, the size of the test equipment used may depend on the form of the test material. It should be ascertained
that no substantial mechanical aberrations occur due to the test conditions, for example due to the type of stirring mechanism
used. Processing of the test material (e.g. the use of powder in the case of composites) should not influence significantly the
degradation behaviour of the material. Optionally, record the hydrogen, oxygen, nitrogen, phosphorus and sulfur contents and
the molecular mass of a polymeric test material, using for example liquid exclusion chromatography (see e.g.
[1]
ASTM D 3536-91 or any other applicable standard method). Preferably, plastic materials without additives such as
plasticizers should be tested. When the material does contain such additives, information on their biodegradability will be
needed to assess the biodegradability of the polymeric material itself.
For details on how to handle poorly water-soluble compounds, see ISO 10634.
8.2 Reference material
Use aniline and/or a well defined biodegradable polymer (for example microcrystalline cellulose powder, ashless
cellulose filters or poly- -hydroxybutyrate) as a reference material. If possible, the TOC, form and size should be
ß
comparable to that of the test material.
As a negative control, a non-biodegradable polymer (e.g. polyethylene) in the same form as the test material can
optionally be used.
8.3 Preparation of the inoculum
Activated sludge from a sewage-treatment plant treating predominantly domestic sewage is a suitable source of the
inoculum. It is obtained from an active aerobic environment and is available over a wide geographical area in which
a broad range of plastic materials has to be tested. Alternatively, soil and/or compost suspensions can be used for
inoculation, as with some plastic materials the activity of fungi is important for biodegradation. When biodegradation
in a specific waste-treatment system is to be determined, collect the inoculum from that environment.
The inoculum can be prepared from the sources described in 8.3.1 and 8.3.2, or from a mixture of these sources in
order to obtain a varied and concentrated microbial flora with sufficient biodegradation activity. If the endogenous
respiration of the inoculum is too high, stabilize the inoculum by aeration before use. Harmonize the test
temperature with the inoculum used (see note to clause 5).
NOTE It may be useful to determine the colony-forming units (cfu) of the inoculum used. The test mixture should preferably
-6
contain about 10 cfu/ml.
8.3.1 Inoculum from wastewater-treatment plants
Take a sample of activated sludge collected from a well-operated sewage-treatment plant or a laboratory plant
handling predominantly domestic sewage. Mix well, keep the sample under aerobic conditions and use preferably
on the day of collection (at least within 72 h).
[5]
Before use, determine the concentration of suspended solids (use e.g. ISO 11923 ). If necessary, concentrate the
sludge by settling so that the volume of sludge added to the test assay is minimal. Add a suitable volume to obtain
suspended solids in the range 30 mg/l to 1000 mg/l in the final mixture.
NOTE 1 When biodegradation processes in a natural environment are to be simulated or when a carbon balance
determination (see annex E) is to be carried out, an inoculum concentration of 30 mg/l suspended solids is recommended. As
solid matter can interfere with the carbon balance determination, the following procedure for preparing the inoculum is
recommended. Take 500 ml of the activated sludge and homogenize for 2 min at medium speed in a blender or in a suitable
high-speed mixer. Allow to settle until the supernatant liquid contains no significant amounts of suspended matter, but in any
case for at least 30 min. Decant a sufficient volume of the supernatant liquid and add it to the test flasks to obtain a
concentration of 1 % (V/V) to 5 % (V/V) in the test medium. Avoid carrying over sludge particles.
7
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NOTE 2 An inoculum may be pre-conditioned, but normally no pre-exposed inoculum should be used, especially in the case
of standard tests simulating biodegradation behaviour in natural environments. Depending on the purpose of the test, a pre-
exposed inoculum may also be used, provided this is clearly stated in the test report (e.g. per cent biodegradation = x %, using
pre-exposed inocula) and the method of pre-exposure detailed in the test report. Pre-exposed inocula can be obtained from
suitable laboratory biodegradation tests (see ISO/TR 15462) conducted under a variety of conditions or from samples collected
from locations where relevant environmental conditions exist (e.g. contaminated areas or industrial treatment plants).
8.3.2 Inoculum from soil and/or compost
Suspend 10 g of non-sterile, fertile soil or compost from a composting plant treating predominantly organic waste in
100 ml of the test medium (6.2.1 or 6.2.2) or in a pyrophosphate solution (6.3) which is commonly used in soil
microbiology. Allow to settle for about 30 min. Decant and filter the supernatant liquid through a coarse porous filter
and add the inoculum to the test flasks to obtain a concentration of 1 % (V/V) to 5 % (V/V) in the test medium.
Higher amounts of inoculum can be used if necessary, but this may cause problems in establishing carbon
balances. The use of compost can increase the number of fungi in the test flasks and improve the biodegradation of
plastic materials. In this case, indicate the state of the compost used in the test report (e.g. mature compost,
compost from the hot phase at about 50 °C).
When a higher inoculum concentration is needed, suspend a higher amount of soil or compost in the test medium
and dilute to an appropriate concentration for inoculation.
8.4 Test
Provide a number of flasks, so that the test includes at least the following:
a) Two test flasks for the test material (symbol F ).
T
b) Two flasks for the blank (symbol F ).
B
c) One flask for checking the inoculum activity using a reference material (symbol F ).
C
And, if required:
d) One flask for checking for possible abiotic degradation or non-biological change in the test material such as by
hydrolysis (symbol F ). The test solution in F shall be sterilized, for example by autoclaving or by the addition
S S
of a suitable inorganic toxic compound to prevent microbial activity. Use, for example, 5 ml/l of a solution
containing 10 g/l of mercury(II) chloride (HgCl ). Add the same amount of the toxic substance during the test if
2
required.
e) One flask as a negative control (symbol F ) using a non-biodegradable polymeric substance (e.g.
N
polyethylene) in the same form as the test material.
f) One flask for checking the possible inhibiting effect of the test material on microbial activity (symbol F ). Take
I
care that the ratio of carbon in the test and reference material to nitrogen in the medium is at least about
C:N = 40:1. Add nitrogen if required.
Add appropriate amounts of the test medium (6.2) and the inoculum (see 8.3) to the test flasks as indicated in
table 1.
Measure the pH in the flasks and adjust to 7 if necessary. Add carbon dioxide absorber (6.4) to the absorber
compartments of the respirometer (see annex C). Add the test material (see 8.1), the reference material and the
material for the negative control (see 8.2) to the respective flasks as indicated in table 1. If a carbon balance is to be
run (see annex E), remove a known sufficient volume of the inoculated test medium from each flask or from
additional separate flasks for DOC and biomass determination at the beginning and the end of the incubation
period. Consider the removed volume when adjusting the final volume or when calculating the test results.
Place the flasks in a constant-temperature environment (see clause 5) and allow all vessels to reach the desired
temperature. Make any necessary connections, seal the flasks, place them in the respirometer and start the stirrer.
Take the necessary readings on the manometers (if manual) and verify that the recorder of oxygen consumption is
8
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ISO 14851:1999(E)
functioning properly (automatic respirometer). As an alternative, the two-phase closed-bottle version described in
annex D may be used.
Table 1 — Final distribution of test and reference materials
Flask Test material Reference material Inoculum
F Test + - +
T
F Test + - +
T
F Blank - - +
B
F Blank - - +
B
F Inoculum check - + +
C
F Abiotic degradation check (optional) + - -
S
F Inhibitio
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14851
Première édition
1999-05-15
Version corrigée
2003-07-15
Évaluation de la biodégradabilité aérobie
ultime des matériaux plastiques en milieu
aqueux — Méthode par détermination de la
demande en oxygène dans un respiromètre
fermé
Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in
an aqueous medium — Method by measuring the oxygen demand in a
closed respirometer
A
Numéro de référence
ISO 14851:1999(F)
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Publié en Suisse
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14851 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 61, Plastiques, sous-comité
SC 5, Propriétés physicochimiques.
Les annexes A à G de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
Cette version corrigée de l'ISO 14851:1999 incorpore les corrections suivantes:
— dans l'Article 2, l'année de publication de l'ISO 9408 a été insérée et la note de bas de page a été supprimée;
— les notes de bas de page restantes ont été renumérotées;
— dans l'Annexe C, des erreurs dans la légende de la Figure C.1 ont été corrigées et des améliorations mineures
ont été faites dans la figure elle-même;
— dans la Bibliographie, les références [1] et [2] ont été mises à jour.
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Introduction
Les plastiques étant de plus en plus utilisés, leur recyclage et leur mise au rebut sont devenus un problème majeur.
Il convient de favoriser en priorité le recyclage. Cependant, le recyclage complet des plastiques est difficile. Par
exemple, les déchets en matériau plastique rejetés principalement par les consommateurs, sont difficiles à recycler
complètement. Autres exemples de produits difficiles à recycler: le matériel de pêche, les films pour paillis en
agriculture et les polymères hydrosolubles. Ces matériaux plastiques tendent à migrer des infrastructures fermées
de management des déchets vers le milieu naturel. Désormais, les plastiques biodégradables apparaissent comme
l'une des possibilités qui permettent de résoudre ce genre de problème environnemental. Il convient que les
matériaux plastiques sous forme de produits ou d'emballages, qui sont envoyés dans les installations de
compostage, soient biodégradables. Il est donc très important de déterminer leur biodégradabilité potentielle et
d'obtenir des indications sur la biodégradabilité de ce type de matériaux plastiques dans le milieu naturel.
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NORME INTERNATIONALE ISO ISO 14851:1999(F)
Évaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des matériaux
plastiques en milieu aqueux — Méthode par détermination de la
demande en oxygène dans un respiromètre fermé
AVERTISSEMENT — Les eaux usées, les boues activées et les matières en suspension dans le sol et le
compost peuvent contenir des organismes potentiellement pathogènes. Il convient donc de les manipuler
avec les précautions appropriées, de même que les composés à analyser toxiques ou dont les propriétés
ne sont pas connues.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale prescrit une méthode d'évaluation du taux de biodégradation aérobie des
matériaux plastiques contenant des additifs, par la détermination de la demande d'oxygène dans un respiromètre
fermé. Le matériau d'essai en milieu aqueux est exposé dans des conditions de laboratoire à un inoculum
provenant de boues activées, d'échantillons de compost ou de sol.
La méthode simule les processus de biodégradation d'un environnement aquatique naturel si l'on utilise, par
exemple, des boues activées non adaptées; si, par exemple, on utilise un inoculum mélangé ou pré-exposé, la
méthode permet d'étudier la biodégradabilité potentielle du matériau d'essai.
Les conditions utilisées dans la présente Norme internationale ne correspondent pas nécessairement aux
conditions optimales permettant d'obtenir le taux maximal de biodégradation; cependant, elle est conçue pour
déterminer la biodégradabilité potentielle ou pour donner une indication de la biodégradabilité des matériaux
plastiques dans le milieu naturel.
La méthode permet d'affiner l'évaluation de la biodégradabilité par le calcul d'un bilan de carbone (facultatif, voir
l’annexe E).
La présente méthode s'applique aux matériaux suivants:
polymères naturels et/ou synthétiques, copolymères ou mélanges de ceux-ci;
matériaux plastiques contenant des additifs tels que plastifiants, colorants ou tout autre composé;
polymères hydrosolubles;
matériaux n'ayant pas d'effet inhibiteur dans les conditions d'essai sur les micro-organismes présents dans
l'inoculum. Les effets inhibiteurs peuvent être déterminés en utilisant un dispositif de contrôle de l'inhibition ou
[3]
par toute autre méthode appropriée (voir, par exemple, l'ISO 8192 ). Si le matériau d'essai a un effet inhibiteur
vis-à-vis de l'inoculum, il est possible d'utiliser une plus faible concentration, un autre inoculum ou un inoculum
pré-exposé.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
1
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indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 8245:1999, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour le dosage du carbone organique total (COT) et du carbone
organique dissous (COD).
ISO 9408:1999, Qualité de l'eau — Évaluation, en milieu aqueux, de la biodégradabilité aérobie ultime des composés
organiques par détermination de la demande en oxygène dans un respiromètre fermé.
ISO 10634:1995, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour la préparation et le traitement des composés
organiques peu solubles dans l'eau en vue de l'évaluation de leur biodégradabilité en milieu aqueux.
ISO/TR 15462:1997, Qualité de l'eau — Sélection d'essais de biodégradabilité.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s'appliquent:
3.1
biodégradation aérobie ultime
décomposition d'un composé chimique organique par des micro-organismes en présence d'oxygène, en dioxyde de
carbone, eau et sels minéraux de tous les autres éléments présents (minéralisation) et en une nouvelle biomasse
3.2
boue activée
biomasse formée lors du traitement aérobie de l'eau résiduaire par croissance de bactéries et d'autres micro-
organismes en présence d'oxygène dissous
3.3
concentration de la boue activée en matières solides en suspension
quantité de matières solides obtenue par filtration ou centrifugation d'un volume connu de boue activée et séchage
à environ 105 °C jusqu'à l'obtention d'une masse constante
3.4
demande biochimique en oxygène
DBO
concentration en masse de l'oxygène dissous consommé, dans des conditions définies, lors de l'oxydation
biologique aérobie d'un composé chimique ou de matières organiques contenues dans l'eau, exprimée en
l'occurrence en milligrammes d'oxygène absorbé par milligramme ou gramme de composé à analyser
3.5
demande théorique en oxygène
DThO
quantité théorique maximale d'oxygène nécessaire pour oxyder complètement un composé chimique, calculée
d'après la formule moléculaire, exprimée en l'occurrence en milligrammes d'oxygène nécessaire par milligramme ou
gramme de composé à analyser
3.6
carbone organique total
COT
tout le carbone présent dans la matière organique en solution ou suspension dans l'eau
2
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3.7
carbone organique dissous
COD
proportion du carbone organique contenu dans l'eau qui ne peut pas être éliminée par une séparation de phase
-2
spécifique, telle qu'une centrifugation à 40 000 m×s pendant 15 min, ou par une filtration sur membrane au moyen
de membranes ayant des pores de 0,2 μm à 0,45 μm de diamètre
3.8
phase de latence
durée, mesurée en jours, écoulée à partir du début de l'essai jusqu'à l'obtention de l'adaptation et/ou de la sélection
des micro-organismes qui provoquent la dégradation, et jusqu'à ce que le taux de biodégradation du composé
chimique ou de la matière organique ait atteint environ 10 % du niveau maximal de biodégradation
3.9
niveau maximal de biodégradation
degré de biodégradation, mesurée en pourcentage, d'un composé chimique ou d'un matériau organique lors d'un
essai, au-dessus duquel la biodégradation ne se poursuit pas
3.10
phase de biodégradation
durée, mesurée en jours, depuis la fin de la phase de latence de l'essai jusqu'à ce que l'on ait obtenu environ 90 %
du niveau maximal de biodégradation
3.11
phase stationnaire
durée, mesurée en jours, écoulée entre la fin de la phase de biodégradation et la fin de l'essai
3.12
pré-exposition
pré-incubation d'un inoculum en présence de la matière organique ou du composé chimique à analyser, dans le but
de renforcer la capacité de l'inoculum à biodégrader le matériau d'essai par adaptation et/ou sélection des micro-
organismes
3.13
préconditionnement
pré-incubation d'un inoculum dans les conditions de l'essai effectué ultérieurement, en l'absence de la matière
organique ou du composé chimique à analyser, dans le but d'améliorer l'essai par acclimatation des micro-
organismes aux conditions d'essai
4 Principe
La biodégradabilité d'un matériau plastique est déterminée en utilisant des micro-organismes aérobies en système
aqueux. Le mélange d'essai contient un milieu inorganique, le matériau d'essai organique (comme seule source de
carbone et d'énergie) à une concentration comprise entre 100 mg/l et 2 000 mg/l de carbone organique, et un
inoculum, sous forme de boue activée ou de suspension de compost ou de sol actif. Ce mélange est agité dans les
fioles fermées d'un respiromètre pendant une durée ne dépassant pas 6 mois. Le dioxyde de carbone dégagé est
absorbé dans un absorbant approprié placé dans l'espace de tête des fioles d'essai. La consommation d'oxygène
(DBO) est déterminée, par exemple, en mesurant la quantité d'oxygène nécessaire pour maintenir un volume de
gaz constant dans les stocks du respiromètre, ou en mesurant la variation de volume ou pression (ou une
combinaison des deux), automatiquement ou manuellement. Un exemple de respiromètre est donné dans l'annexe
[4]
C. Une autre solution consiste à utiliser la version du flacon fermé à deux phases, conforme à l'ISO 10708 (voir
l’annexe D).
Le niveau de biodégradation est déterminé en comparant la DBO avec la quantité théorique (DThO) et en
l'exprimant en pourcentage. L'influence des processus de nitrification éventuelle sur la DBO doit être prise en
compte. Le résultat d'essai est le niveau maximal de biodégradation déterminé à partir du plateau de la courbe de
biodégradation. Il est également possible de calculer le bilan de carbone pour obtenir des informations
supplémentaires sur la biodégradation (voir l’annexe E).
3
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En comparaison avec l'ISO 9408 qui est utilisée pour un large éventail de composés organiques, la présente Norme
internationale est spécifiquement consacrée à la détermination de la biodégradabilité des matériaux plastiques. Les
exigences particulières concernent le choix de l'inoculum et du milieu d'essai, il est possible d'affiner l'évaluation de
la biodégradabilité par le calcul du bilan de carbone.
5 Environnement d'essai
L'incubation doit avoir lieu dans l'obscurité ou sous une lumière diffuse dans une enceinte exempte de vapeurs
inhibitives pour les micro-organismes, qui doit être maintenue à une température constante, de préférence entre
20 °C et 25 °C avec une précision de ± 1 °C, ou à toute autre température appropriée en fonction de l'inoculum
utilisé et de l'environnement d'essai retenu.
NOTE Lorsque l'inoculum provient d'un compost, il peut s'avérer approprié d'utiliser des températures plus élevées.
6 Réactifs
Utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Eau distillée ou déminéralisée, exempte de matières toxiques (en particulier, le cuivre) et contenant moins
de 2 mg/l de COD.
6.2 Milieu d'essai.
Il est possible d'utiliser différents milieux d'essai selon le but de l'essai. Par exemple, si l'on simule un
environnement naturel, utiliser le milieu d'essai normal (6.2.1). Si le matériau d'essai est utilisé à des concentrations
plus élevées, utiliser le milieu d'essai optimisé (6.2.2) avec de plus fortes concentrations en nutriments et un
pouvoir tampon plus élevé.
6.2.1 Milieu d'essai normal
6.2.1.1 Solution A
Dissoudre
dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO ) 8,5 g
2 4
hydrogénophosphate dipotassique anhydre (K HPO ) 21,75 g
2 4
hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na HPO ,2H O) 33,4 g
2 4 2
chlorure d'ammonium (NH Cl) 0,5 g
4
dans de l''eau (6.1), et compléter à 1 000 ml
NOTE La composition adéquate de la solution peut être vérifiée par un mesurage du pH qui devrait être de 7,4.
6.2.1.2 Solution B
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans de l'eau (6.1), et compléter à
4 2
1 000 ml.
6.2.1.3 Solution C
Dissoudre 36,4 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans de l'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
2 2
6.2.1.4 Solution D
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer (III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans de l'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
3 2
Préparer cette solution juste avant utilisation pour éviter qu'il n'y ait précipitation, ou ajouter une goutte d'acide
chlorhydrique concentré (HCl) ou d'une solution aqueuse d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) à 0,4 g/l.
4
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6.2.1.5 Préparation
Pour 1 litre de milieu d'essai, ajouter à environ 500 ml d'eau (6.1)
10 ml de solution A;
1 ml de chacune des solutions B à D.
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1).
6.2.2 Milieu d'essai optimisé
Le présent milieu optimisé est fortement tamponné et contient davantage de nutriments inorganiques. Cela est
nécessaire pour maintenir le pH constant dans le système pendant l'essai même lorsque le matériau d'essai est
présent à des concentrations élevées. Ce milieu contient environ 2 400 mg/l de phosphore et 50 mg/l d'azote et
convient pour des concentrations de matériaux d'essai allant jusqu'à 2 000 mg/l de carbone organique. Si l'on doit
utiliser des concentrations de matériaux d'essai plus élevées, augmenter la teneur en azote pour maintenir un
rapport C:N d'environ 40:1.
6.2.2.1 Solution A
Dissoudre
dihydrogénophosphate de potassium anhydre (KH PO ) 37,5 g
2 4
hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na HPO ,2H O) 87,3 g
2 4 2
chlorure d'ammonium (NH Cl) 2,0 g
4
dans de l'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml
6.2.2.2 Solution B
Dissoudre 22,5 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) dans de l'eau (6.1), et compléter à
4 2
1 000 ml.
6.2.2.3 Solution C
Dissoudre 36,4 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) dans de l'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
2 2
6.2.2.4 Solution D
Dissoudre 0,25 g de chlorure de fer (III) hexahydraté (FeCl ,6H O) dans de l'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml (voir
3 2
6.2.1.4, deuxième alinéa).
6.2.2.5 Solution E (solution d'oligo-éléments, facultative)
Dissoudre dans 10 ml de solution aqueuse de HCl (25 %, 7,7 mol/l), dans l'ordre suivant:
70 mg de ZnCl ; 100 mg de MnCl ,4H O; 6 mg de H BO 190 mg de CoCl ,6H O; 3 mg de CuCl ,2H O; 240 mg
2 2 2 3 3; 2 2 2 2
de NiCl ,6H O; 36 mg de Na MoO ,2H O; 33 mg de Na WO ,2H O; 26 mg de Na SeO ,5H O,
2 2 2 4 2 2 4 2 2 3 2
et compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1).
6.2.2.6 Solution F (solution de vitamines, facultative)
Dissoudre dans 100 ml d'eau (6.1) 0,6 mg de biotine, 2,0 mg de niacinamide, 2,0 mg de p-aminobenzoate, 1,0 mg
d'acide panthoténique, 10,0 mg de chlorhydrate de pyridoxal, 5,0 mg de cyanocobalamine, 2,0 mg d'acide folique,
5,0 mg de riboflavine, 5,0 mg de DL-acide thioctique et 1,0 mg de dichlorure de thiamine ou utiliser une solution de
15 mg d'extrait de levure dans 100 ml d'eau (6.1). Filtrer la solution en vue de la stérilisation en utilisant les filtres à
membranes (voir 7.4).
5
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NOTE Les solutions E et F sont facultatives et non requises si l'on utilise un inoculum en concentration suffisante, comme
les boues activées et des échantillons de sol ou de compost. Il est recommandé de préparer et de réfrigérer des prises de 1 ml
jusqu'à utilisation.
6.2.2.7 Préparation
Pour 1 litre de milieu d'essai, ajouter à environ 800 ml d'eau (6.1)
100 ml de solution A;
1 ml de chacune des solutions B à D et facultativement E et F.
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau (6.1) et mesurer le pH.
NOTE La composition adéquate du milieu peut être vérifiée par un mesurage du pH qui devrait être de 7,0 ± 0,2.
6.3 Solution de pyrophosphate.
Dissoudre 2,66 g de pyrophosphate de sodium anhydre (Na P O ) dans de l'eau (6.1), et compléter à 1 000 ml.
4 2 7
6.4 Absorbant du dioxyde de carbone, de préférence, des pastilles de chaux sodée ou tout autre absorbant
approprié.
7 Appareillage
S'assurer que la verrerie de laboratoire a été soigneusement nettoyée et, en particulier, qu'elle est exempte de
toute trace de substances organiques ou toxiques.
Matériel courant de laboratoire, et
7.1 Respiromètre fermé, comprenant tous les récipients d'essai (fioles en verre) avec agitateurs incorporés et
tout autre équipement nécessaire, placé dans une salle à température constante ou dans un appareil thermostaté
(par exemple, bain-marie). Voir l'exemple donné dans l'annexe C.
NOTE Tout respiromètre permettant de déterminer avec une précision suffisante la demande biochimique en oxygène est
approprié: utiliser, de préférence, un appareil qui mesure et remplace automatiquement et en continu l'oxygène consommé de
telle sorte qu'il ne manque pas d'oxygène et qu'il ne se produise pas d'inhibition de l'activité microbienne pendant les
processus de dégradation. Au lieu d'un respiromètre ordinaire, il est possible d'utiliser un flacon fermé à deux phases (voir
l’annexe D).
7.2 Appareillage analytique pour le mesurage du carbone organique total (COT) et du carbone organique
dissous (COD) (voir l’ISO 8245).
7.3 Appareillage analytique pour le mesurage des concentrations en nitrate et nitrite.
NOTE Il est tout d'abord recommandé d'effectuer un essai qualitatif pour décider s'il s'est produit une nitrification. Si l'on a la
preuve qu'il existe du nitrate/nitrite dans le milieu, il est nécessaire de procéder à une détermination quantitative à l'aide d'une
méthode d'essai appropriée (par exemple, par chromatographie par échange d'ions).
7.4 Centrifugeuse, ou dispositif de filtration équipé de filtres à membranes (grosseur de pore 0,45 μm)
n'absorbant, ni ne relargant le carbone organique de manière significative.
(matériel courant de laboratoire).
7.5 Balance analytique
7.6 pH-mètre (matériel courant de laboratoire).
6
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8 Mode opératoire
8.1 Matériau d'essai
Le matériau d'essai doit avoir une masse connue et contenir suffisamment de carbone pour donner une DBO
susceptible d'être adéquatement mesurée par le respiromètre utilisé. Calculer d'après la formule chimique ou
déterminer par des analyses élémentaires la DThO (voir l’annexe A) et le COT (en utilisant, par exemple,
l'ISO 8245). Utiliser une concentration de matériau d'essai d'au moins 100 mg/l correspondant à une DThO
d'environ 170 mg/l ou à environ 60 mg/l de COT. Il n'est possible d'utiliser de plus faibles concentrations que si la
sensibilité du respiromètre est appropriée. La quantité maximale de matériau d'essai est limitée par l'apport en
oxygène du respiromètre et par le milieu d'essai utilisé. Dans le cas du milieu d'essai optimisé (6.2.2), la
concentration du matériau d'essai ne doit pas dépasser environ 2 000 mg/l de COT de façon à avoir un rapport C:N
d'environ 40:1. Si l'on doit soumettre à l'essai des concentrations plus élevées, augmenter la quantité d'azote dans
le milieu d'essai.
NOTE 1 Si l'on doit simuler les processus de biodégradation dans le milieu naturel, il est recommandé d'utiliser le milieu
normal et une concentration de matériau d'essai de 100 mg/l.
NOTE 2 Il convient d'utiliser, de préférence, un matériau d'essai sous forme de poudre; toutefois, ce dernier peut également
être employé sous forme de films, de morceaux, de fragments ou d'articles façonnés. La forme du matériau d'essai peut influer
sur sa biodégradabilité. Il convient d'utiliser, de préférence, des formes semblables si l'on doit comparer différents types de
matériaux plastiques. Si le matériau d'essai est sous forme de poudre, il est recommandé d'utiliser des particules étroites et
définies ayant une répartition granulométrique connue (diamètre maximal recommandé 250 μm). D'autre part, la forme du
matériau d'essai peut également avoir une influence sur la taille du dispositif d'essai utilisé. En outre, il convient de s'assurer
qu'aucune aberration mécanique importante ne peut être causée par les conditions d'essai, par exemple, causée par le
mécanisme d'agitation utilisé. Il convient que la mise en œuvre du matériau d'essai (par exemple, emploi de poudres pour les
composites) n'influe pas de manière significative sur le comportement de dégradation du matériau. À titre facultatif, il est
[1]
possible d'enregistrer par chromatographie liquide par exclusion (voir, par exemple, l'ASTM D 3536-91 ou toute autre
méthode normalisée applicable) la teneur en hydrogène, oxygène, azote, phosphore et soufre ainsi que la masse moléculaire
de tout matériau d'essai polymère. Il convient, de préférence, de soumettre à l'essai des matériaux plastiques exempts
d'additifs comme les plastifiants. Lorsque le matériau contient de tels additifs, des informations relatives à leur biodégradabilité
seront nécessaires pour évaluer la biodégradabilité du matériau polymère lui-même.
Pour obtenir de plus amples détails sur le mode de manipulation des composés faiblement hydrosolubles, voir
l'ISO 10634.
8.2 Matériau de référence
Utiliser de l'aniline et/ou un polymère biodégradable bien défini (tel que de la poudre de cellulose microcristalline,
des filtres de cellulose exempts de cendres ou du poly-b-hydroxybutyrate) comme matériau de référence. Il
convient, si possible, que le COT, la forme et la taille du matériau de référence soient comparables à ceux du
matériau d'essai soumis à l'évaluation.
Comme substance témoin négative, il est possible d'utiliser un polymère non biodégradable (par exemple du
polyéthylène) sous la même forme que le matériau d'essai.
8.3 Préparation de l'inoculum
Les boues activées provenant d'une installation de traitement traitant des eaux usées principalement domestiques
constituent une source appropriée d'inoculum. Ces boues proviennent d'un environnement aérobie actif et sont
disponibles sur une zone géographique étendue dans laquelle on doit soumettre à l'essai un large éventail de
matériaux plastiques. Une autre solution consiste à utiliser pour l'ensemencement des échantillons de sol et/ou de
compost en suspension. Comme dans le cas de certains matériaux plastiques, l'activité des champignons est
importante pour la biodégradation. Lorsqu'on doit déterminer la biodégradation dans un système de traitement des
eaux usées spécifique, prélever l'inoculum dans l'environnement en question.
L'inoculum peut être préparé à partir des sources décrites en 8.3.1 et 8.3.2 ou d'un mélange de ces sources afin
d'obtenir une flore microbienne variée et concentrée avec une activité de biodégradation suffisante. Si la respiration
endogène de l'inoculum est trop élevée, stabiliser ce dernier par aération avant utilisation. Harmoniser la
température d'essai par rapport à l'inoculum utilisé (voir la note dans l’article 5).
7
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NOTE Il peut être utile de déterminer les unités formant colonie (cfu) de l'inoculum utilisé. Il convient, de préférence, que le
-6
mélange d'essai contienne au moins 10 cfu/ml.
8.3.1 Inoculum provenant d'une installation de traitement des eaux résiduaires
Prélever un échantillon de boue activée dans une installation de traitement des eaux usées convenablement
exploitée ou dans une installation expérimentale traitant principalement des eaux usées domestiques. Bien
mélanger, conserver l'échantillon dans des conditions aérobies et l'utiliser, de préférence, le jour du prélèvement
(en l'espace de 72 h).
Avant utilisation, déterminer la concentration en matières solides en suspension (utiliser, par exemple,
[5]
l'ISO 11923 ). Si nécessaire, concentrer la boue par sédimentation de façon que le volume de boue ajouté à
l'échantillon soit minimal. Ajouter un volume approprié pour obtenir entre 30 mg/l et 1 000 mg/l de matières solides
en suspension dans le mélange final.
NOTE 1 Lorsqu'il faut simuler des processus de biodégradation dans un environnement naturel ou effectuer un bilan de
carbone (voir l’annexe E), il est recommandé d'utiliser une concentration d'inoculum en matières solides en suspension de
30 mg/l. Étant donné que les matières solides peuvent influer sur le bilan de carbone, il est recommandé de préparer
l'inoculum selon le mode opératoire suivant. Prélever 500 ml de boue activée et homogénéiser pendant 2 min à moyenne
vitesse dans un malaxeur ou un mélangeur adéquat à haute vitesse. Laisser décanter jusqu'à ce que le surnageant ne
contienne plus de quantités significatives de matières en suspension, mais en tout cas pendant au moins 30 min. Décanter un
volume suffisant de surnageant et l'ajouter aux fioles d'essai pour obtenir une concentration de 1 % (V/V) à 5 % (V/V) dans le
milieu d'essai. Éviter de laisser passer les particules de boue.
NOTE 2 L'inoculum peut être précondionné mais, en principe, il convient de ne pas utiliser d'inoculum pré-exposé, en
particulier dans le cas des essais normalisés simulant la biodégradation en milieu naturel. Selon le but de l'essai, il est
également possible d'utiliser un inoculum pré-exposé à condition que cela soit clairement indiqué dans le rapport d'essai (par
exemple, pourcentage de biodégradation = x %, en utilisant des inoculums pré-exposés) et que la méthode de pré-exposition
soit détaillée dans le rapport d'essai. Les inoculums pré-exposés peuvent être obtenus lors d'essais de biodégradation
appropriés (voir l’ISO/TR 15462) conduits en laboratoire dans des conditions variées, ou à partir d'échantillons prélevés dans
des emplacements où prévalent les conditions environnementales adéquates (par exemple, zones contaminées ou
installations de traitement industrielles).
8.3.2 Inoculum provenant d'un échantillon de sol et/ou compost
Mettre en suspension 10 g de sol fertile, non stérile ou de compost provenant d'une install
...
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