ISO 22119:2011
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22119:2010 defines terms for the detection of food-borne pathogens in foodstuffs, and isolates obtained from them, using the polymerase chain reaction (PCR). ISO 22119:2010 specifies requirements for the amplification and detection of nucleic acid sequences (DNA or RNA after reverse transcription) by real-time PCR. The minimum requirements laid down in ISO 22119:2010 provide the basis for comparable and reproducible results within individual and between different laboratories. ISO 22119:2010 is also applicable, for example, to the detection of food-borne pathogens in environmental samples and in animal feeding stuffs.
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
L'ISO 22119:2010 définit les termes relatifs à la détection de micro-organismes pathogènes présents dans les aliments et les extraits obtenus à partir de ces aliments, en faisant appel à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). L'ISO 22119:2010 spécifie également les exigences relatives à l'amplification et à la détection des séquences d'acide nucléique (ADN ou ARN après transcription inverse) par une PCR en temps réel. Les exigences minimales spécifiées dans l'ISO 22119:2010 servent de base pour l'obtention de résultats comparables et reproductibles au sein d'un laboratoire et dans des laboratoires différents. L'ISO 22119:2010 peut également être utilisée, par exemple, pour la détection de micro-organismes pathogènes d'origine alimentaire dans des prélèvements environnementaux ainsi que dans les aliments pour animaux.
General Information
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 22119
Первое издание
2011-07-15
Микробиология пищевых продуктов и
кормов для животных. Метод
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
для обнаружения и количественного
определения пищевых патогенных
микроорганизмов. Общие требования
и определения
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection and quantification of food borne
pathogens — General requirements and definitions
Ответственность за подготовку русской версии несѐт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьѐй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 22119:2011(R)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2011
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
Содержание
Предисловие. iv
Введение . v
1 Область применения . 1
2 Нормативные ссылки . 1
3 Термины и определения . 1
4 Принцип . 5
4.1 Общие положения . 5
4.2 Зонды для ПЦР в реальном времени . 6
5 Общие требования к лабораториям . 6
6 Реактивы и материалы . 6
7 Аппаратура . 8
8 Лабораторная проба . 8
9 Проведение анализа . 8
9.1 Подготовка пробы . 8
9.2 Амплификация . 9
9.3 Контроли . 9
9.4 Анализ данных флуоресценции . 10
10 Оценивание и документация . 11
Библиография . 12
© ISO 2011 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной
электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, установленными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы данной части ISO 16065 могут быть объектом
патентных прав. Организация ISO не должна нести ответственность за идентификацию какого-либо
одного или всех патентных прав.
ISO 22119 был подготовлен Европейским комитетом по стандартизации (CEN), Техническим комитетом
CEN/TC 275, Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы, совместно с Техническим
комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 9, Микробиология, в соответствии с
Соглашением по техническому сотрудничеству между ISO и CEN (Венское Соглашение).
iv © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
Введение
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) показал себя, как быстрый, чувствительный и
специфичный к обнаружению пищевых патогенных микроорганизмов. Дальнейшие разработки
технологии позволят обнаруживать специфические ПЦР-продукты, созданные в процессе
амплификации. Принцип опирается на возбуждение флуоресцентных маркеров во время ПЦР-
процесса.
Настоящий международный стандарт является частью серии документов под общим называнием
Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной реакции
(ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов:
ISO/TS 20836, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной
цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Определение характеристик
термоциклеров
ISO 20837, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Требования к подготовке образцов
для качественного обнаружения
ISO 20838, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Требования к амплификации и
обнаружению для методов качественного анализа
ISO 22118, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Показатели результативности
ISO 22119, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения
ISO 22174, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения
Следующие Технические условия находятся в стадии разработки:
ISO/TS 13136, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод
обнаружения бактерий Escherichia coli, выделяющих токсин Шига (STEC), принадлежащих к
серотипам O157, O111, O26, O103 и O145. Качественный метод на основе полимеразной цепной
реакции (ПЦР)
© ISO 2011 – Все права сохраняются v
---------------------- Page: 5 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 22119:2011(R)
Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для
обнаружения и количественного определения пищевых
патогенных микроорганизмов. Общие требования и
определения
1 Область применения
Настоящий международный стандарт определяет термины для обнаружения пищевых патогенных
микроорганизмов и полученных из пищевых продуктов изолятов с помощью полимеразной цепной
реакции (ПЦР). Настоящий международный стандарт также устанавливает требования к
амплификации и обнаружению последовательностей нуклеиновых кислот (ДНК или РНК после
обратной транскрипции) методом ПЦР в реальном времени.
Минимальные требования, заложенные в данном международном стандарте, обеспечивают основу для
получения сопоставимых и воспроизводимых результатов в одной лаборатории и в разных лабораториях.
Настоящий международный стандарт также применим, например, для обнаружения пищевых патогенных
микроорганизмов в пробах из различных объектов окружающей среды и кормов для животных.
ПРИМЕЧАНИЕ Ввиду стремительного развития в данной области приведенные примеры являются наиболее
часто используемыми на момент разработки данного стандарта.
2 Нормативные ссылки
Нижеследующие документы являются обязательными для применения данного документа. Для
датированных ссылок действительно только указанное издание. В случае недатированных ссылок
используется последняя редакция документа, на который дается ссылка (включая все изменения).
ISO 20838, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Требования к амплификации и
обнаружению в методах качественного анализа
ISO 22174:2005, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод полимеразной
цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
3.1
полимеразная цепная реакция в реальном времени
ПЦР в реальном времени
real-time polymerase chain reaction
real-time PCR
ферментативная методика, объединяющая амплификацию in vitro специфических фрагментов ДНК в
процессе денатурации, отжига специфических праймеров и синтеза ДНК с обнаружением
специфических ПЦР-продуктов в процессе амплификации
© ISO 2011 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Обычно реакционная смесь амплификации содержит один или несколько специфических ДНК-
зондов наряду с одним или несколькими флуоресцентными красителями. По этой технологии генерируется сигнал
после специфической гибридизации зондов в целевую последовательность нуклеиновых кислот и возбуждения с
помощью света определенной длины волны.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Использование неспецифических привязанных к ДНК флуоресцентных красителей можно
применять в том случае, если положительные результаты проверяются в соответствии с ISO 20838.
3.2
ПЦР-продукт
PCR product
Фрагмент ДНК, амплифицированный в ПЦР
[ISO 22174:2005, 3.4.5]
3.3
резонансный перенос энергии флуоресценции (по Фѐрстеру)
fluorescence resonance energy transfer
FRET
обнаружение пищевых патогенных микроорганизмов методом ПЦР зависимый от расстояния перенос
энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору, в результате которого происходит флуоресценция
молекулы-акцептора после возбуждения электромагнитным излучением определенной длины волны
ПРИМЕЧАНИЕ Взято из Ссылки [2].
3.4
репортѐр
reporter
обнаружение пищевых патогенных микроорганизмов методом ПЦР флуоресцентная молекула
(флуорофор-донор), используемая для обнаружения гибридизации специфических зондов
посредством возбуждения электромагнитным излучением соответствующей длины волны
3.5
(молекула-)тушитель
quencher
обнаружение пищевых патогенных микроорганизмов методом ПЦР флуоресцентная молекула
(флуорофор-акцептор), служащая акцептором энергии и, таким образом, гасящая флуоресцентный
сигнал репортѐра (донора)
3.6
темный тушитель
dark quencher
молекула, служащая акцептором, которая не испускает энергию в спектральном диапазоне,
обнаруживаемом оптической детекторной системой прибора ПЦР в реальном времени
3.7
активность 5′-3′-экзонуклеазы
5′-3′-exonuclease activity
Способность фермента, например, полимеразы нуклеиновой кислоты, расщеплять молекулу
гибридизованной нуклеиновой кислоты в направлении 5′-3′
ПРИМЕЧАНИЕ Активность 5′-3′-экзонуклеазы специфична к двухцепочечной ДНК. Она зависит от типа
фермента и может быть представлена, например Taq-, Tth- и Tfl-полимеразой.
3.8
флуоресцентный зонд
fluorescent probe
олигонуклеотид или or олигонуклеотид-аналог определенной последовательности в сочетании с одной
или несколькими флуоресцентными молекулами
2 © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
ПРИМЕЧАНИЕ Любую систему, испускающую флуоресцентный сигнал после специфической гибридизации в
целевую последовательность нуклеиновых кислот, которую можно обнаружить конкретным прибором, можно
использовать в качестве флуоресцентного зонда.
3.9
гидролизный зонд
hydrolysis probe
флуоресцентный зонд в сочетании с двумя флуоресцентными молекулами, которые пространственно
разделяются в результате активности фермента 5′-3′-экзонуклеазы в процессе амплификации
ПРИМЕЧАНИЕ Принцип работы гидролизного зонда показан на Рисунке 1.
a) Негибридизованный зонд в растворе b) Ращепление гибридизованного зонда
c) Расщепленный зонд, приводящий к
флуоресценции молекулы-репортѐра после
возбуждения
Обозначение
1 субстрат ДНК
2 флуоресцентная молекула (репортѐр)
3 молекула-тушитель
4 фермент
Рисунок 1 — Принцип работы гидролизного зонда
3.10
зонды (для флуоресцентной) гибридизации
hybridization probe
система двух флуоресцентных зондов, каждый в сочетании с одной флуоресцентной молекулой, в
которой одна молекула служит донором, а другая акцептором
ПРИМЕЧАНИЕ Принцип работы зонда для гибридизации показан на Рисунке 2.
© ISO 2011 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
a) Негибридизованные зонды в растворе b) Гибридизованные зонды, вызывающие
флуоресценцию акцептора
Обозначение
1 субстрат ДНК
2 молекула-акцептор
3 молекула-донор
Рисунок 2 — Принцип действия зонда для гибридизации
3.11
молекулярный маяк
molecular beacon
флуоресцентный зонд, состоящий из трех различных частей: центральной части, комплементарной
целевой последовательности нуклеиновых кислот, плюс 5′-часть и 3′-часть, которые комплементарны;
репортѐр присоединяется к одному из концов молекулы, а на другом конце молекулы располагается
тушитель
ПРИМЕЧАНИЕ Принцип действия молекулярного маяка показан на Рисунке 3.
a) Негибридизованный молекулярный маяк b) Гибридизованный молекулярный маяк,
в растворе приводящий к флуоресуенции репортера
Обозначение
1 субстрат ДНК
2 флуоресцентная молекула (репортѐр)
3 молекула-тушитель
Рисунок 3 — Принцип действия молекулярного маяка
3.12
зонд для обнаружения специфической последовательности ДНК патогенного микроорганизма
probe for detection of a specific pathogen DNA sequence
зонд и с последовательностью, комплементарной ДНК патогенного микроорганизма, репортер которого
испускает сигнал с определенной длиной волны, который можно обнаружить с помощью оптической системы
4 © ISO 2011 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22119:2011(R)
3.13
зонд для обнаружения внутреннего контроля последовательности нуклеиновых кислот
probe for detection of an internal control nucleic acid sequence
зонд м репортером, предназначенным для подтверждения результативности амплификации
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Такой зонд испускает сигнал, четко отличающийся от сигнала зонда, предназначенного для
обнаружения специфического патогенного микроорганизма.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Применение внутренних контролей требует использования прибора/, способного к
обнаружению сигналов различной длины волны.
3.14
пассивный контроль
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22119
First edition
2011-07-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Real-time polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-
borne pathogens — General
requirements and definitions
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) en temps réel pour la détection des micro-organismes
pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
Reference number
ISO 22119:2011(E)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2011
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
Contents
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.5
4.1 General .5
4.2 Probes for real-time PCR.5
5 General laboratory requirements.6
6 Reagents and materials .6
7 Apparatus.7
8 Laboratory sample .8
9 Procedure.8
9.1 Sample preparation .8
9.2 Amplification.8
9.3 Controls.9
9.4 Analysis of the fluorescence data .9
10 Evaluation and documentation .11
Bibliography.12
© ISO 2011 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 22119 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,
Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
iv © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
Introduction
The polymerase chain reaction (PCR) has been shown to be a fast, sensitive, and specific method for
detection of food-borne pathogens. Further developments of the technology allow the detection of specific
PCR products generated by the amplification process. The principle relies on the excitation of fluorescent
markers during the PCR process.
This International Standard is part of a series of documents under the general title Microbiology of food and
animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens:
ISO/TS 20836, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Performance testing for thermal cyclers
ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for sample preparation for qualitative detection
ISO 20838, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for amplification and detection for qualitative methods
ISO 22118, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection and quantification of food-borne pathogens — Performance characteristics
ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
The following Technical Specification is in preparation:
ISO/TS 13136, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Shiga
toxin-producing Escherichia coli (STEC) belonging to O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups —
Qualitative real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method
© ISO 2011 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 22119:2011(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time
polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-
borne pathogens — General requirements and definitions
1 Scope
This International Standard defines terms for the detection of food-borne pathogens in foodstuffs, and isolates
obtained from them, using the polymerase chain reaction (PCR). This International Standard also specifies
requirements for the amplification and detection of nucleic acid sequences (DNA or RNA after reverse
transcription) by real-time PCR.
The minimum requirements laid down in this International Standard provide the basis for comparable and
reproducible results within individual and between different laboratories.
This International Standard is also applicable, for example, to the detection of food-borne pathogens in
environmental samples and in animal feeding stuffs.
NOTE Because of the rapid progress in this field, the examples given are those most frequently in use at the time of
development of this International Standard.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 20838, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — Requirements for amplification and detection for qualitative methods
ISO 22174:2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
real-time polymerase chain reaction
real-time PCR
enzymatic procedure which combines the in vitro amplification of specific DNA segments by a process of
denaturation, annealing of specific primers, and synthesis of DNA with the detection of specific PCR products
during the amplification process
NOTE 1 Generally, the amplification reaction mixture contains one or more specific DNA probes coupled with one or
more fluorescent dyes. Using this technology, the signal is generated after specific hybridization of the probes to the target
nucleic acid sequence and excitation with light of a definite wavelength.
© ISO 2011 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
NOTE 2 The use of non-specific DNA-binding fluorescent dyes can be applied if positive results are verified in
accordance with ISO 20838.
3.2
PCR product
DNA amplified by PCR
[ISO 22174:2005, 3.4.5]
3.3
fluorescence resonance energy transfer
FRET
〈food-borne pathogen detection by PCR〉 distance-dependent energy transfer from a donor molecule to an
acceptor molecule resulting in enhanced fluorescence of the acceptor molecule after excitation with
electromagnetic radiation of a definite wavelength
NOTE Taken from Reference [2].
3.4
reporter
〈food-borne pathogen detection by PCR〉 fluorescent molecule used to detect the hybridization of specific
probes by excitation with electromagnetic radiation of an appropriate wavelength
3.5
quencher
〈food-borne pathogen detection by PCR〉 fluorescent molecule serving as an energy acceptor and thus
quenching the fluorescence signal of the reporter (donor)
3.6
dark quencher
molecule serving as an acceptor, which does not emit energy in a spectral range detected by the optical
detection system of the real-time PCR instrument
3.7
5′-3′-exonuclease activity
ability of an enzyme, e.g. a nucleic acid polymerase, to cleave a hybridized nucleic acid molecule in the 5′-3′-
direction
NOTE The activity of 5′-3′-exonuclease is double stranded DNA specific. It is dependent on the type of enzyme and
can be present, for example, in Taq-, Tth- and Tfl-polymerase.
3.8
fluorescent probe
oligonucleotide or oligonucleotide analogon of defined sequence coupled with one or more fluorescent
molecules
NOTE Any system emitting a fluorescence signal after specific hybridization to the target nucleic acid sequence
which can be detected by the specific equipment can be used as a fluorescent probe.
3.9
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with two fluorescent molecules which are sterically separated by the 5′-3′-
exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
NOTE The principle of a hydrolysis probe is illustrated in Figure 1.
2 © ISO 2011 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
a) Unhybridized probe in solution b) Cleavage of the hybridized probe
c) Cleaved probe resulting in reporter
fluorescence after excitation
Key
1 DNA substrate
2 fluorescent molecule (reporter)
3 quenching molecule
4 enzyme
Figure 1 — Principle of a hydrolysis probe
3.10
hybridization probe
system of two fluorescent probes coupled with one fluorescent molecule each, where one molecule serves as
donor and the other serves as acceptor
NOTE The principle of a hybridization probe is illustrated in Figure 2.
a) Unhybridized probes in solution b) Hybridized probes resulting in acceptor
fluorescence
Key
1 DNA substrate
2 acceptor molecule
3 donor molecule
Figure 2 — Principle of a hybridization probe
© ISO 2011 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22119:2011(E)
3.11
molecular beacon
fluorescent probe consisting of three different parts: a central part complementary to the target nucleic acid
sequence, plus a 5′-part and a 3′-part which are complementary; the reporter is attached to one arm of the
molecule, while the end of the other carries a quencher
NOTE The principle of a molecular beacon is illustrated in Figure 3.
a) Unhybridized molecular beacon in solution b) Hybridized molecular beacon resulting
in reporter fluorescence
Key
1 DNA substrate
2 fluorescent molecule (reporter)
3 quenching molecule
Figure 3 — Principle of a molecular beacon
3.12
probe for detection of a specific pathogen DNA sequence
probe with a sequence complementary to the DNA of a pathogen with a reporter emitting a signal of a definite
wavelength which can be detected by the optical detection system
3.13
probe for detection of an internal control nucleic acid sequence
probe with a reporter designed to confirm amplification performance
NOTE 1 The probe emits a signal clearly distinguishable from the signal of the probe designed for the detection of the
specific pathogen.
NOTE 2 The application of internal controls requires the use of an instrument able to detect signals of different
wavelength.
3.14
passive reference
fluorescent molecules present in the reaction mix used to normalize the signal
NOTE These may be coupled nucleic acid sequences or other molecules not taking part in the reaction.
3.15
baseline fluorescence detection level
“baseline”
point at which a reaction reaches a fluorescence intensity above the background
4 © ISO 2011 – All rights res
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 22119
Première édition
2011-07-15
Microbiologie des aliments — Réaction
de polymérisation en chaîne (PCR) en
temps réel pour la détection des micro-
organismes pathogènes dans les
aliments — Exigences générales et
définitions
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase
chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens —
General requirements and definitions
Numéro de référence
ISO 22119:2011(F)
©
ISO 2011
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2011
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes et définitions .1
4 Principe.5
4.1 Généralités .5
4.2 Sondes pour PCR en temps réel.5
5 Exigences générales relatives aux laboratoires .6
6 Réactifs et matériaux .6
7 Appareillage .7
8 Échantillon pour laboratoire.8
9 Mode opératoire.8
9.1 Préparation de l'échantillon .8
9.2 Amplification.8
9.3 Témoins.9
9.4 Analyse des données de fluorescence .9
10 Évaluation et documentation .11
Bibliographie.12
© ISO 2011 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 22119 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l'Accord de
coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
Introduction
Il a été démontré que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est une méthode spécifique rapide et
sensible pour la détection de micro-organismes pathogènes dans les aliments. De nouveaux progrès
technologiques permettent de détecter des produits PCR spécifiques générés par le processus d'amplification.
Le principe repose sur l'excitation de marqueurs fluorescents pendant le processus PCR.
La présente Norme internationale fait partie d'une série de documents présentés sous le titre général
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection de
micro-organismes pathogènes dans les aliments:
ISO/TS 20836, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche
de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Essais de performance des thermocycleurs
ISO 20837, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la préparation des échantillons pour
la détection qualitative
ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l'amplification et à la détection pour
les méthodes qualitatives
ISO 22118, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection et la
quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Caractéristiques de performance
ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
La Spécification technique suivante est en cours d'élaboration:
ISO/TS 13136, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la détection d'Escherichia coli
produisant des Shiga-toxines (STEC) appartenant aux séro-groupes O157, O111, O26, O103 et O145 —
Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qualitative en temps réel
© ISO 2011 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 22119:2011(F)
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en
chaîne (PCR) en temps réel pour la détection des micro-
organismes pathogènes dans les aliments — Exigences
générales et définitions
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale définit les termes relatifs à la détection de micro-organismes pathogènes
présents dans les aliments et les extraits obtenus à partir de ces aliments, en faisant appel à la réaction de
polymérisation en chaîne (PCR). La présente Norme internationale spécifie également les exigences relatives
à l'amplification et à la détection des séquences d'acide nucléique (ADN ou ARN après transcription inverse)
par une PCR en temps réel.
Les exigences minimales spécifiées dans la présente Norme internationale servent de base pour l'obtention
de résultats comparables et reproductibles au sein d'un laboratoire et dans des laboratoires différents.
La présente Norme internationale peut également être utilisée, par exemple, pour la détection de micro-
organismes pathogènes d'origine alimentaire dans des prélèvements environnementaux ainsi que dans les
aliments pour animaux.
NOTE En raison de la rapidité des progrès dans ce domaine, les exemples fournis sont ceux les plus fréquemment
utilisés au moment de l'élaboration de la présente Norme internationale.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 20838, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences relatives à l'amplification et à la détection pour
les méthodes qualitatives
ISO 22174:2005, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
PCR en temps réel
méthode enzymatique combinant l'amplification in vitro de segments spécifiques d'ADN par un processus de
dénaturation, d'hybridation d'amorces spécifiques et de synthèse de l'ADN avec la détection de produits PCR
spécifiques pendant le processus d'amplification
NOTE 1 En général, le mélange réactionnel d'amplification contient une ou plusieurs sondes d'ADN spécifiques,
associées à un ou plusieurs colorants fluorescents. Grâce à cette technologie, le signal est généré après hybridation
spécifique des sondes avec la séquence d'acide nucléique cible et excitation par une lumière de longueur d'onde définie.
© ISO 2011 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
NOTE 2 L'utilisation de l'ADN non spécifique liée à des colorants fluorescents peut être appliquée si des résultats
positifs sont vérifiés conformément à l'ISO 20838.
3.2
produit PCR
ADN amplifié par PCR
[ISO 22174:2005, 3.4.5]
3.3
transfert d'énergie de fluorescence par résonance
FRET
〈détection des micro-organismes pathogènes présents dans les aliments par PCR〉 transfert d'énergie entre
une molécule donneuse et une molécule accepteuse, tributaire de la distance, aboutissant à une plus grande
fluorescence de la molécule accepteuse après excitation par un rayonnement électromagnétique de longueur
d'onde définie
NOTE Extrait de la Référence [2].
3.4
reporter
donneur
〈détection des micro-organismes pathogènes présents dans les aliments par PCR〉 molécule fluorescente
utilisée pour détecter l'hybridation de sondes spécifiques après excitation par un rayonnement
électromagnétique de longueur d'onde appropriée
3.5
quencher
capteur
〈détection des micro-organismes pathogènes présents dans les aliments par PCR〉 molécule fluorescente
servant d'accepteur d'énergie et éteignant ainsi le signal de fluorescence du reporter (donneur)
3.6
quencher (capteur) sombre
molécule servant d'accepteur, et n'émettant pas d'énergie dans un domaine spectral détecté par le système
de détection optique de l'instrument de PCR en temps réel
3.7
activité exonucléasique 5′-3′
aptitude d'une enzyme, par exemple une polymérase d'acide nucléique, à cliver une molécule d'acide
nucléique hybridée dans la direction 5′-3′
NOTE L'activité exonucléasique 5′-3′ est spécifique à l'ADN bicaténaire. Elle dépend du type d'enzyme et peut se
manifester par exemple avec les polymérases Taq, Tth et Tfl.
3.8
sonde fluorescente
oligonucléotide ou analogue d'oligonucléotide d'une séquence définie associée à une ou plusieurs molécules
fluorescentes
NOTE Tout système émettant un signal de fluorescence après hybridation spécifique à la séquence d'acide
nucléique cible qui peut être détecté par l'équipement spécifique peut être utilisé comme sonde fluorescente.
3.9
sonde d'hydrolyse
sonde fluorescente associée à deux molécules fluorescentes qui subissent une séparation stérique du fait de
l'activité exonucléasique 5′-3′ de l'enzyme pendant le processus d'amplification
NOTE Le principe de la sonde d'hydrolyse est illustré à la Figure 1.
2 © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
a) Sonde non hybridée en solution b) Clivage de la sonde hybridée
c) Sonde clivée résultant en une fluorescence
du reporter (donneur) après excitation
Légende
1 support ADN
2 molécule fluorescente (reporter)
3 molécule éteinte
4 enzyme
Figure 1 — Principe d'une sonde d'hydrolyse
3.10
sonde d'hybridation
système de deux sondes fluorescentes associées chacune à une molécule fluorescente, dans lequel une
molécule sert de donneur et l'autre d'accepteur
NOTE Le principe de la sonde d'hybridation est illustré à la Figure 2.
a) Sondes non hybridées en solution b) Sondes hybridées résultant en une
fluorescence de l'accepteur
Légende
1 support ADN
2 molécule accepteuse
3 molécule donneuse
Figure 2 — Principe d'une sonde d'hybridation
© ISO 2011 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
3.11
balise moléculaire
sonde fluorescente constituée de trois parties différentes: une partie centrale complémentaire de la séquence
d'acide nucléique cible, plus une partie 5′ et une partie 3′ complémentaires l'une de l'autre; le reporter
(donneur) est fixé sur un bras de la molécule, l'extrémité de l'autre bras portant un quencher (capteur)
NOTE Le principe d'une balise moléculaire est illustré à la Figure 3.
a) Balise moléculaire non hybridée en solution b) Balise moléculaire hybridée résultant en une
fluorescence du reporter (donneur)
Légende
1 support ADN
2 molécule fluorescente (reporter)
3 molécule éteinte
Figure 3 — Principe d'une balise moléculaire
3.12
sonde de détection d'une séquence d'ADN d'un micro-organisme pathogène spécifique
sonde dont une séquence est complémentaire de l'ADN d'un micro-organisme pathogène et dont le reporter
(donneur) émet un signal de longueur d'onde définie qui peut être détecté par le système de détection optique
3.13
sonde de détection d'une séquence d'acide nucléique d'un témoin interne
sonde comprenant un reporter (donneur) et conçue pour confirmer les performances de l'amplification
NOTE 1 La sonde émet un signal qui se distingue facilement du signal de la sonde conçue pour détecter un micro-
organisme pathogène spécifique.
NOTE 2 La mise en œuvre de témoins internes nécessite l'utilisation d'un instrument capable de détecter des signaux
de différentes longueurs d'onde.
3.14
référence passive
molécules fluorescentes présentes dans le mélange réactionnel, utilisées pour normaliser le signal
NOTE Il peut s'agir de séquences d'acide nucléique couplées ou d'autres molécules n'intervenant pas dans la
réaction.
3.15
ligne de base de niveau de détection de fluorescence
«ligne de base»
point auquel une réaction atteint une intensité de fluorescence supérieure au bruit de fond
4 © ISO 2011 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22119:2011(F)
3.16
bruit de fond de fluorescence
«bruit de fond»
nivea
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.