ISO 6651:2001

Animal feeding stuffs — Semi-quantitative determination of aflatoxin B1 — Thin-layer chromatographic methods

Aliments des animaux — Dosage semi-quantitatif de l'aflatoxine B1 — Méthodes par chromatographie sur couche mince

Krma - Semi-kvantitativno določevanje aflatoksina B1 - Tankoplastne kromatografske metode

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 19-Dec-2001
• Withdrawal Date: 19-Dec-2001
• ICS: 65.120 - Animal feeding stuffs
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 28-May-2018
• Ref Project: SIST ISO 6651:2003 - Animal feeding stuffs -- Semi-quantitative determination of aflatoxin B1 -- Thin-layer chromatographic methods

Relations

• Revises: ISO 6651:1987 - Animal feeding stuffs — Determination of aflatoxin B1 content
• Effective Date: 15-Apr-2008
• Revised: SIST ISO 6651:1995 - Animal feeding stuffs -- Determination of aflatoxin B1 content
• Effective Date: 12-May-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6651
Third edition
2001-12-15
Animal feeding stuffs — Semi-quantitative
determination of aflatoxin B —Thin-layer
1
chromatographic methods
Aliments des animaux — Dosage semi-quantitatif de l'aflatoxine B —
1
Méthodes par chromatographie sur couche mince
Reference number
ISO 6651:2001(E)
© ISO 2001

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ISO 6651:2001(E)
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ISO 6651:2001(E)
Contents Page
1 Scope . 1
2 Normative reference . 1
3 Principle . 1
4 Reagents . 2
5 Apparatus . 3
6 Sampling . 4
7 Procedure . 5
8 Expression of results and calculations . 11
9 Interlaboratory tests . 12
10 Test report . 12
Annex
A Results of interlaboratory tests . 13
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ISO 6651:2001(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 6651 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 10, Animal feeding stuffs.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 6651:1987), of which it constitutes a minor revision.
Annex A of this International Standard is for information only.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 6651:2001(E)
Animal feeding stuffs — Semi-quantitative determination of
aflatoxin B — Thin-layer chromatographic methods
1
1 Scope
1.1 This International Standard specifies two methods for the determination of aflatoxin B in animal feeding stuffs.
1
These methods can only be used for semi-quantitative determinations.
1.2 Method A is applicable to the following simple feeding stuffs:
— oilseeds and oilseed residues, and in particular groundnut, copra, linseed, soya, babassu palm;
—maniocmeal;
— maize germ expeller;
— cereals and cereal products;
— pea meal;
— potato pulp and flour.
In the presence of substances interfering with the determination by method A, it is recommended that the
determination be carried out in accordance with method B.
1.3 Method B is applicable to mixed feeding stuffs and to simple feeding stuffs not mentioned in 1.2.
This method is not applicable to feeding stuffs containing citrus pulp.
2 Normative reference
The following normative document contains provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent edition of the normative document indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Preparation of test samples
3 Principle
A test portion is extracted with chloroform then filtration. An aliquot portion is purified on a silica gel column.
The eluate is evaporated and the residue is dissolved in a specified volume of chloroform or a mixture of benzene
and acetonitrile.
Thin-layer chromatography, one-dimensional for method A and two-dimensional for method B, is carried out on an
aliquot portion of this solution.
The aflatoxin B content is determined either visually or by fluorodensitometry, by examination of the chromatogram
1
under ultraviolet light and comparison with known quantities of standard aflatoxin B applied to the same plate as the
1
test portion extract.
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The identify of aflatoxin B is confirmed by formation of the hemiacetal derivative.
1
4Reagents
Use only reagents of recognized analytical quality, and distilled or deonized water or water of at least equivalent
purity.
4.1 Chloroform, stabilized with 0,5 % to 1,0 % of 96 % (volume fraction) ethanol.
4.2 n-Hexane.
4.3 Diethyl ether, anhydrous, free from peroxides.
4.4 Benzene/acetonitrile,(98 + 2)mixture.
Mix 98 volumes of benzene with 2 volumes of acetonitrile.
4.5 Chloroform/methanol,(97 + 3) mixture.
Mix 97 volumes of chloroform with 3 volumes of methanol.
4.6 Developing solvents.
The solvents should be used in covered tanks. When saturated tanks are specified, this is achieved by lining the
tanks with absorbent paper and allowing the interiors to become saturated with solvent vapour.
4.6.1 Chloroform/acetone,(90 + 10) mixture.
Mix 90 volumes of chloroform with 10 volumes of acetone, in an unsaturated tank.
4.6.2 Diethyl ether/methanol/water,(96 + 3 + 1)mixture.
Mix 96 volumes of diethyl ether, 3 volumes of methanol and 1 volume of water, in an unsaturated tank.
4.6.3 Diethyl ether/methanol/water,m(94 + 4,5 + 1,5)ixture.
Mix 94 volumes of diethyl ether with 4,5 volumes of methanol and 1,5 volumes of water, in a saturated tank.
4.6.4 Chloroform/methanol,)(94 + 6mixture.
Mix 94 volumes of chloroform with 6 volumes of methanol, in a saturated tank.
(97 + 3
4.6.5 Chloroform/methanol,)mixture.
Mix 97 volumes of chloroform with 3 volumes of methanol, in a saturated tank.
4.7 Silica gel, for column chromatography, of particle size 0,05 mm to 0,20 mm.
4.8 Silica gel, G-HR or equivalent, for thin-layer chromatography.
4.9 Diatomaceous earth (Hyflosupercel), acid-washed.
4.10 Sodium sulfate, anhydrous granules.
4.11 Trifluoroacetic acid.
4.12 Inert gas, for example nitrogen.
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4.13 Sulfuric acid, 50 % solution (volume fraction).
4.14 Aflatoxin B , standard solution containing about 0,1g of aflatoxin B per millilitre, in the chloroform (4.1) or
1 1
in the benzene/acetonitrile mixture (4.4).
WARNING — Aflatoxins are highly carcinogenic and must be handled with great care.
Prepare and check the solution as follows.
4.14.1 Preparation of stock solution and determination of concentration
Prepare a solution of aflatoxin B in the chloroform (4.1) or the benzene/acetonitrile mixture (4.4) such that the
1
concentration is between 8g/ml and 10g/ml. Determine the absorption spectrum between 330 nm and 370 nm by
means of the spectrometer (5.9).
Measure the absorbance (A) at 363 nm in the case of the chloroform solution, or at 348 nm in the case of the
benzene/acetronitrile mixture solution.
Calculate the concentration of aflatoxin B , in micrograms per millilitre of solution, from the formulae:
1
a) for the chloroform solution
312�A� 1 000
22 300
b) for the solution in the benzene/acetonitrile mixture
312�A� 1 000
19 800
4.14.2 Dilution
Dilute the stock solution (4.14.1), as appropriate, away from daylight, to obtain a standard solution with a
of about .
concentration of aflatoxin B 0,1g/ml
1
�
If kept in a refrigerator at 4 C, this solution is stable for 2 weeks.
4.14.3 Testing of chromatographic purity of the solution
Onto a plate (5.7), apply a spot of 5l8of the standard aflatoxin B solution of concentration g/ml to 10g/ml
1
(4.14.1). Develop the chromatogram as indicated in 7.5.1. Under ultraviolet light, the chromatogram shall show only
one spot and no fluorescence shall be perceptible in the original deposition zone.
4.15 Aflatoxin B and B (see the warning in 4.14), solutions for qualitative testing, containing about 0,1g of
1 2
aflatoxin B and B per millilitre, in the chloroform (4.1) or in the benzene/acetonitrile mixture (4.4).
1 2
These concentrations are given as a guide. They shall be adjusted so as to obtain the same intensity of fluorescence
for bothaflatoxins (see7.5.1).
5Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Grinder/mixer.
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5.2 Sieve, of aperture size 1,0 mm.
1)
For details, see ISO 565 .
5.3 Shaking apparatus or magnetic stirrer.
5.4 Chromatographic tubes, made of glass (internal diameter 22 mm, length 300 mm), with a
polytetrafluoroethylene tap and a 250 ml reservoir, plugged at the bottom end with cotton or glass wool.
5.5 Rotary vacuum evaporator, with a 500 ml round-bottomed flask.
5.6 Apparatus for thin-layer chromatography (TLC), i.e. that necessary for the preparation of the plates (5.7)
and application of spots (capillary pipettes or microsyringes), a developing tank, and spraying apparatus for applying
the sulfuric acid (4.13) to the plates.
5.7 Glass TLC plates, 200 mm� 200 mm, prepared as follows (the quantities indicated are sufficient to cover five
plates).
Place 30 g of the silica gel (4.8) in a conical flask, add 60 ml of water, stopper and shake for 1 min. Spread the
suspension on the plates so as to obtain a uniform layer 0,25 mm thick. Leave to dry in the air and then store in a
�
desiccator containing silica gel. At the time of use, activate the plates by keeping them in an oven at 110C1for h.
Ready-to-use plates are suitable if they give results similar to those obtained with the plates prepared as indicated
above.
5.8 Long-wavelength (360 nm) ultraviolet lamp.
The intensity of irradiation shall make it possible for a spot of 1,0 ng of aflatoxin B to be clearly distinguished on a
1
TLC plate at a distance of 10 cm from the lamp.
WARNING — Ultraviolet light is dangerous to the eyes. Protective goggles shall be worn.
5.9 Spectrometer, suitable for making measurements in the ultraviolet region of the spectrum.
5.10 Fluorodensitometer (optional).
5.11 Fluted filter paper.
5.12 Graduated tube, of capacity 10,0 ml, with a polyethylene stopper.
5.13 Conical flask, of capacity 500 ml, with a ground glass stopper.
5.14 Pipette,ofcapacity 50 ml.
5.15 Analytical balance.
6 Sampling
Take the laboratory sample from the material to be sampled in accordance with the International Standard for the
material concerned unless sampling for the determination of aflatoxin is excluded from its field of application. If no
appropriate International Standard exists, agreement shall be reached between the parties concerned, taking into
account the characteristics of the material being sampled.
1) ISO 565, Test sieves — Metal wire cloth, perforated metal plate and electroformed sheet — Nominal sizes of openings.
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4 ISO 2001 – All rights reserved

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7 Procedure
7.1 Preparation of test sample
5%
7.1.1 If the sample contains more than of fat, it shall be defatted with light petroleum before grinding.
In such cases, the analytical results shall be expressed in terms of the mass of the non-defatted sample.
7.1.2 Grind the laboratory sample so that is completely passes through the sieve (5.2). Mix thoroughly. See
ISO 6498.
7.2 Test portion
Weigh, to the nearest 0,01 g, 50 g of the prepared test sample into the conical flask (5.13).
7.3 Extraction
Add to the test portion (7.2) 25 g of the diatomaceous earth (4.9), 25 ml of water, and 250 ml of the chloroform (4.1)
accurately measured from a measuring cylinder. Stopper the flask, and shake or stir for 30 min using the shaking
apparatus (5.3). Filter through the fluted filter paper (5.11), taking care to discard the first 10 ml of the filtrate, and
50 ml
subsequently collect at least of the filtrate.
7.4 Column clean-up
7.4.1 Preparation of the column
Fill two-thirds of the chromatographic tube (5.4) with the chloroform (4.1) and add 5g of the sodium sulfate (4.10).
Check that the upper surface of the sodium sulfate layer is flat, then add 10 g, in small portions, of the silica gel (4.7).
Stir carefully after each addition to eliminate air bubbles. Leave to stand for 15 min and then carefully add 10 g of the
sodium sulfate (4.10). Open the tap and allow the liquid to flow until it is just above the upper surface of the sodium
sulfate layer. Close the tap.
7.4.2 Purification
Transfer, by means of the pipette (5.14), 50 ml of the filtrate collected in 7.3 to a 250 ml conical flask, and add 100 ml
of the n-hexane (4.2). Mix and quantitatively transfer the mixture to the column, rinsing the flask with the n-hexane.
Open the tap and allow the liquid to flow at a rate of 8 ml/min to 12 ml/min until it is level with the upper surface of the
sodium sulfate layer. Close the tap. Discard the liquid collected and pour 100 ml
...

2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.QHAliments des animaux -- Dosage semi-quantitatif de l'aflatoxine B1 -- Méthodes par chromatographie sur couche minceAnimal feeding stuffs -- Semi-quantitative determination of aflatoxin B1 -- Thin-layer chromatographic methods65.120KrmilaAnimal feeding stuffsICS:Ta slovenski standard je istoveten z:ISO 6651:2001SIST ISO 6651:2003en01-maj-2003SIST ISO 6651:2003SLOVENSKI
STANDARD



SIST ISO 6651:2003



INTERNATIONALSTANDARDISO6651Thirdedition2001-12-15ReferencenumberISO6651:2001(E)©ISO2001Animalfeedingstuffs—Semi-quantitativedeterminationofaflatoxinB1—Thin-layerchromatographicmethodsAlimentsdesanimaux—Dosagesemi-quantitatifdel'aflatoxineB1—MéthodesparchromatographiesurcoucheminceSIST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)ii©ISO2001–AllrightsreservedPDFdisclaimerThisPDFfilemaycontainembeddedtypefaces.InaccordancewithAdobe'slicensingpolicy,thisfilemaybeprintedorviewedbutshallnotbeeditedunlessthetypefaceswhichareembeddedarelicensedtoandinstalledonthecomputerperformingtheediting.Indownloadingthisfile,partiesacceptthereintheresponsibilityofnotinfringingAdobe'slicensingpolicy.TheISOCentralSecretariatacceptsnoliabilityinthisarea.AdobeisatrademarkofAdobeSystemsIncorporated.DetailsofthesoftwareproductsusedtocreatethisPDFfilecanbefoundintheGeneralInforelativetothefile;thePDF-creationparameterswereoptimizedforprinting.EverycarehasbeentakentoensurethatthefileissuitableforusebyISOmemberbodies.Intheunlikelyeventthataproblemrelatingtoitisfound,pleaseinformtheCentralSecretariatattheaddressgivenbelow.©ISO2001Allrightsreserved.Unlessotherwisespecified,nopartofthispublicationmaybereproducedorutilizedinanyformorbyanymeans,elec-tronicormechanical,includingphotocopyingandmicrofilm,withoutpermissioninwritingfromeitherISOattheaddressbeloworISO'smem-berbodyinthecountryoftherequester.ISOcopyrightofficeCasepostale56•[e-mail]ST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)©ISO2001–AllrightsreservediiiContentsPage1Scope.12Normativereference.13Principle.14Reagents.25Apparatus.36Sampling.47Procedure.58Expressionofresultsandcalculations.119Interlaboratorytests.1210Testreport.12AnnexAResultsofinterlaboratorytests.13SIST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)iv©ISO2001–AllrightsreservedForewordISO(theInternationalOrganizationforStandardization)isaworldwidefederationofnationalstandardsbodies(ISOmemberbodies).TheworkofpreparingInternationalStandardsisnormallycarriedoutthroughISOtechnicalcommittees.Eachmemberbodyinterestedinasubjectforwhichatechnicalcommitteehasbeenestablishedhastherighttoberepresentedonthatcommittee.Internationalorganizations,governmentalandnon-governmental,inliaisonwithISO,alsotakepartinthework.ISOcollaboratescloselywiththeInternationalElectrotechnicalCommission(IEC)onallmattersofelectrotechnicalstandardization.InternationalStandardsaredraftedinaccordancewiththerulesgivenintheISO/IECDirectives,Part3.DraftInternationalStandardsadoptedbythetechnicalcommitteesarecirculatedtothememberbodiesforvoting.PublicationasanInternationalStandardrequiresapprovalbyatleast75%ofthememberbodiescastingavote.AttentionisdrawntothepossibilitythatsomeoftheelementsofthisInternationalStandardmaybethesubjectofpatentrights.ISOshallnotbeheldresponsibleforidentifyinganyorallsuchpatentrights.InternationalStandardISO6651waspreparedbyTechnicalCommitteeISO/TC34,Foodproducts,SubcommitteeSC10,Animalfeedingstuffs.Thisthirdeditioncancelsandreplacesthesecondedition(ISO6651:1987),ofwhichitconstitutesaminorrevision.AnnexAofthisInternationalStandardisforinformationonly.SIST ISO 6651:2003



INTERNATIONALSTANDARDISO6651:2001(E)©ISO2001–Allrightsreserved1Animalfeedingstuffs—Semi-quantitativedeterminationofaflatoxinB1—Thin-layerchromatographicmethods1Scope1.1ThisInternationalStandardspecifiestwomethodsforthedeterminationofaflatoxinB1inanimalfeedingstuffs.Thesemethodscanonlybeusedforsemi-quantitativedeterminations.1.2MethodAisapplicabletothefollowingsimplefeedingstuffs:—oilseedsandoilseedresidues,andinparticulargroundnut,copra,linseed,soya,babassupalm;—maniocmeal;—maizegermexpeller;—cerealsandcerealproducts;—peameal;—potatopulpandflour.InthepresenceofsubstancesinterferingwiththedeterminationbymethodA,itisrecommendedthatthedeterminationbecarriedoutinaccordancewithmethodB.1.3MethodBisapplicabletomixedfeedingstuffsandtosimplefeedingstuffsnotmentionedin1.2.Thismethodisnotapplicabletofeedingstuffscontainingcitruspulp.2NormativereferenceThefollowingnormativedocumentcontainsprovisionswhich,throughreferenceinthistext,constituteprovisionsofthisInternationalStandard.Fordatedreferences,subsequentamendmentsto,orrevisionsof,anyofthesepublicationsdonotapply.However,partiestoagreementsbasedonthisInternationalStandardareencouragedtoinvestigatethepossibilityofapplyingthemostrecenteditionofthenormativedocumentindicatedbelow.Forundatedreferences,thelatesteditionofthenormativedocumentreferredtoapplies.MembersofISOandIECmaintainregistersofcurrentlyvalidInternationalStandards.ISO6498,Animalfeedingstuffs—Preparationoftestsamples3PrincipleAtestportionisextractedwithchloroformthenfiltration.Analiquotportionispurifiedonasilicagelcolumn.Theeluateisevaporatedandtheresidueisdissolvedinaspecifiedvolumeofchloroformoramixtureofbenzeneandacetonitrile.Thin-layerchromatography,one-dimensionalformethodAandtwo-dimensionalformethodB,iscarriedoutonanaliquotportionofthissolution.TheaflatoxinB1contentisdeterminedeithervisuallyorbyfluorodensitometry,byexaminationofthechromatogramunderultravioletlightandcomparisonwithknownquantitiesofstandardaflatoxinB1appliedtothesameplateasthetestportionextract.SIST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)2©ISO2001–AllrightsreservedTheidentifyofaflatoxinB1isconfirmedbyformationofthehemiacetalderivative.4ReagentsUseonlyreagentsofrecognizedanalyticalquality,anddistilledordeonizedwaterorwaterofatleastequivalentpurity.4.1Chloroform,stabilizedwithtoof(volumefraction)ethanol.4.2n-Hexane.4.3Diethylether,anhydrous,freefromperoxides.4.4Benzene/acetonitrile,()mixture.Mix98volumesofbenzenewith2volumesofacetonitrile.4.5Chloroform/methanol,()mixture.Mix97volumesofchloroformwith3volumesofmethanol.4.6Developingsolvents.Thesolventsshouldbeusedincoveredtanks.Whensaturatedtanksarespecified,thisisachievedbyliningthetankswithabsorbentpaperandallowingtheinteriorstobecomesaturatedwithsolventvapour.4.6.1Chloroform/acetone,()mixture.Mix90volumesofchloroformwith10volumesofacetone,inanunsaturatedtank.4.6.2Diethylether/methanol/water,()mixture.Mix96volumesofdiethylether,3volumesofmethanoland1volumeofwater,inanunsaturatedtank.4.6.3Diethylether/methanol/water,mixture.Mix94volumesofdiethyletherwith4,5volumesofmethanoland1,5volumesofwater,inasaturatedtank.4.6.4Chloroform/methanol,)mixture.Mix94volumesofchloroformwith6volumesofmethanol,inasaturatedtank.4.6.5Chloroform/methanol,)mixture.Mix97volumesofchloroformwith3volumesofmethanol,inasaturatedtank.4.7Silicagel,forcolumnchromatography,ofparticlesizeto.4.8Silicagel,G-HRorequivalent,forthin-layerchromatography.4.9Diatomaceousearth(Hyflosupercel),acid-washed.4.10Sodiumsulfate,anhydrousgranules.4.11Trifluoroaceticacid.4.12Inertgas,forexamplenitrogen.0,5%1,0%96%98+297+390+1096+3+1(94+4,5+1,5)(94+6(97+30,05mm0,20mmSIST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)©ISO2001–Allrightsreserved34.13Sulfuricacid,solution(volumefraction).4.14AflatoxinB1,standardsolutioncontainingaboutofaflatoxinB1permillilitre,inthechloroform(4.1)orinthebenzene/acetonitrilemixture(4.4).WARNING—Aflatoxinsarehighlycarcinogenicandmustbehandledwithgreatcare.Prepareandcheckthesolutionasfollows.4.14.1PreparationofstocksolutionanddeterminationofconcentrationPrepareasolutionofaflatoxinB1inthechloroform(4.1)orthebenzene/acetonitrilemixture(4.4)suchthattheconcentrationisbetweenand.Determinetheabsorptionspectrumbetweenandbymeansofthespectrometer(5.9).Measuretheabsorbance()atinthecaseofthechloroformsolution,oratinthecaseofthebenzene/acetronitrilemixturesolution.CalculatetheconcentrationofaflatoxinB1,inmicrogramspermillilitreofsolution,fromtheformulae:a)forthechloroformsolutionb)forthesolutioninthebenzene/acetonitrilemixture4.14.2DilutionDilutethestocksolution(4.14.1),asappropriate,awayfromdaylight,toobtainastandardsolutionwithaconcentrationofaflatoxinB1ofabout.Ifkeptinarefrigeratorat,thissolutionisstablefor2weeks.4.14.3TestingofchromatographicpurityofthesolutionOntoaplate(5.7),applyaspotofofthestandardaflatoxinB1solutionofconcentrationto(4.14.1).Developthechromatogramasindicatedin7.5.1.Underultravioletlight,thechromatogramshallshowonlyonespotandnofluorescenceshallbeperceptibleintheoriginaldepositionzone.4.15AflatoxinB1andB2(seethewarningin4.14),solutionsforqualitativetesting,containingaboutofaflatoxinB1andB2permillilitre,inthechloroform(4.1)orinthebenzene/acetonitrilemixture(4.4).Theseconcentrationsaregivenasaguide.Theyshallbeadjustedsoastoobtainthesameintensityoffluorescenceforbothaflatoxins(see7.5.1).5ApparatusUsuallaboratoryequipmentand,inparticular,thefollowing.5.1Grinder/mixer.50%0,1g8g/ml10g/ml330nm370nmA363nm348nm312A100022300312A1000198000,1g/ml4C5l8g/ml10g/ml0,1gSIST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)4©ISO2001–Allrightsreserved5.2Sieve,ofaperturesize.Fordetails,seeISO5651).5.3Shakingapparatusormagneticstirrer.5.4Chromatographictubes,madeofglass(internaldiameter,length),withapolytetrafluoroethylenetapandareservoir,pluggedatthebottomendwithcottonorglasswool.5.5Rotaryvacuumevaporator,witharound-bottomedflask.5.6Apparatusforthin-layerchromatography(TLC),i.e.thatnecessaryforthepreparationoftheplates(5.7)andapplicationofspots(capillarypipettesormicrosyringes),adevelopingtank,andsprayingapparatusforapplyingthesulfuricacid(4.13)totheplates.5.7GlassTLCplates,,preparedasfollows(thequantitiesindicatedaresufficienttocoverfiveplates).Placeofthesilicagel(4.8)inaconicalflask,addofwater,stopperandshakefor.Spreadthesuspensionontheplatessoastoobtainauniformlayerthick.Leavetodryintheairandthenstoreinadesiccatorcontainingsilicagel.Atthetimeofuse,activatetheplatesbykeepingtheminanovenatfor.Ready-to-useplatesaresuitableiftheygiveresultssimilartothoseobtainedwiththeplatespreparedasindicatedabove.5.8Long-wavelength()ultravioletlamp.TheintensityofirradiationshallmakeitpossibleforaspotofofaflatoxinB1tobeclearlydistinguishedonaTLCplateatadistanceoffromthelamp.WARNING—Ultravioletlightisdangeroustotheeyes.Protectivegogglesshallbeworn.5.9Spectrometer,suitableformakingmeasurementsintheultravioletregionofthespectrum.5.10Fluorodensitometer(optional).5.11Flutedfilterpaper.5.12Graduatedtube,ofcapacity,withapolyethylenestopper.5.13Conicalflask,ofcapacity,withagroundglassstopper.5.14Pipette,ofcapacity.5.15Analyticalbalance.6SamplingTakethelaboratorysamplefromthematerialtobesampledinaccordancewiththeInternationalStandardforthematerialconcernedunlesssamplingforthedeterminationofaflatoxinisexcludedfromitsfieldofapplication.IfnoappropriateInternationalStandardexists,agreementshallbereachedbetweenthepartiesconcerned,takingintoaccountthecharacteristicsofthematerialbeingsampled.1)ISO565,Testsieves—Metalwirecloth,perforatedmetalplateandelectroformedsheet—Nominalsizesofopenings.1,0mm22mm300mm250ml500ml200mm200mm30g60ml1min0,25mm110C1h360nm1,0ng10cm10,0ml500ml50mlSIST ISO 6651:2003



ISO6651:2001(E)©ISO2001–Allrightsreserved57Procedure7.1Preparationoftestsample7.1.1Ifthesamplecontainsmorethanoffat,itshallbedefattedwithlightpetroleumbeforegrinding.Insuchcases,theanalyticalresultsshallbeexpressedintermsofthemassofthenon-defattedsample.7.1.2Grindthelaboratorysamplesothatiscompletelypassesthroughthesieve(5.2).Mixthoroughly.SeeISO6498.7.2TestportionWeigh,tothenearest,ofthepreparedtestsampleintotheconicalflask(5.13).7.3ExtractionAddtothetestportion(7.2)ofthediatomaceousearth(4.9),ofwater,andofthechloroform(4.1)accuratelymeasuredfromameasuringcylinder.Stoppertheflask,andshakeorstirforusingtheshakingapparatus(5.3).Filterthroughtheflutedfilterpaper(5.11),takingcaretodiscardthefirstofthefiltrate,andsubsequentlycollectatleastofthefiltrate.7.4Columnclean-up7.4.1PreparationofthecolumnFilltwo-thirdsofthechromatographictube(5.4)withthechloroform(4.1)andaddofthesodiumsulfate(4.10).Checkthattheuppersurfaceofthesodiumsulfatelayerisflat,thenadd,insmallportions,ofthesilicagel(4.7).Stircarefullyaftereachadditiontoeliminateairbubbles.Leavetostandforandthencarefullyad
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 6651
Troisième édition
2001-12-15
Aliments des animaux — Dosage semi-
quantitatif de l'aflatoxine B — Méthodes
1
par chromatographie sur couche mince
Animal feeding stuffs — Semi-quantitative determination of aflatoxin B —
1
Thin-layer chromatographic methods
Numéro de référence
ISO 6651:2001(F)
© ISO 2001

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ISO 6651:2001(F)
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ISO 6651:2001(F)
Sommaire Page
1 Domaine d'application . 1
2 Référence normative . 1
3 Principe . 1
4 Réactifs . 2
5 Appareillage . 4
6 Échantillonnage . 5
7 Mode opératoire . 5
8 Calculs et expressions des résultats . 12
9 Essais interlaboratoires . 12
10 Rapport d’essai . 13
Annexe
A Résultats des essais interlaboratoires . 14
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ISO 6651:2001(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison
avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire l'objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas
avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 6651 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,sous-
comité SC 10, Aliments des animaux.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 6651:1987), dont elle constitue une révision
mineure.
L'annexe A de la présente Norme internationale est donnée uniquement à titre d'information.
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NORME INTERNATIONALE ISO 6651:2001(F)
Aliments des animaux — Dosage semi-quantitatif de l'aflatoxine
B — Méthodes par chromatographie sur couche mince
1
1 Domaine d'application
1.1 La présente Norme internationale spécifie deux méthodes pour le dosage de l’aflatoxine B dans les aliments
1
des animaux. Ces méthodes se prêtent uniquement aux dosages semi-quantitatifs.
1.2 Méthode A, applicable aux aliments simples suivants:
— graines oléagineuses et tourteaux, en particulier d’arachide, de coprah, de lin, de soja, de sésame, de babassu;
— farinedemanioc;
— tourteaux de germes de maïs;
— céréales et produits céréaliers;
— farinedepois;
— pulpe et fécule de pommes de terre.
En présence de substances interférentes qui entravent les déterminations selon la méthode A, il est recommandé
d’effectuer la détermination selon la méthode B.
1.3 Méthode B, applicable aux aliments composés ainsi qu’aux aliments simples non mentionnés en 1.2.
Cette méthode n’est pas applicable aux aliments contenant des pulpes d’agrumes.
2 Référence normative
Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les amendements ultérieurs
ou les révisions de ces publications ne s'appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords fondés sur la
la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer l'édition la plus récente du
document normatif indiqué ci-après. Pour les références non datées, la dernière édition du document normatif en
référence s'applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des Normes internationales en
vigueur.
ISO 6498, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai
3Principe
Extraction au chloroforme sur une prise d’essai, filtration puis purification d’une partie aliquote sur colonne de gel de
silice.
Évaporation de l’éluat et dissolution du résidu dans un volume déterminé de chloroforme ou d’un mélange benzène-
acétonitrile.
Chromatographie sur couche mince, monodimensionnelle pour la méthode A et bidimensionnelle pour la méthode B,
d’une partie aliquote de cette solution.
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ISO 6651:2001(F)
Détermination de la teneur en aflatoxine B , par mesure visuelle ou à laide d’un fluorodensitomètre, de l’intensité de
1
fluorescence du chromatogramme examiné à la lumière UV, par comparaison avec des quantités connues d’un
étalon d’aflatoxine B placé sur la même plaque que l’échantillon.
1
Confirmation de l’identité de l’aflatoxine B par formation du dérivé hémiacétal.
1
4 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de
pureté équivalente.
4.1 Chloroforme, stabilisé par 0,5 % à 1,0 % d’éthanol à 96 % (fraction volumique).
4.2 n-Hexane.
4.3 Oxyde diéthylique, anhydre, exempt de peroxydes.
4.4 Benzène/acétonitrile, mélange (98 + 2).
Mélanger 98 volumes de benzène avec 2 volumes d’acétonitrile.
4.5 Chloroforme/méthanol, mélange (97 + 3).
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de méthanol.
4.6 Solvants de développement.
Il convient d’utiliser les solvants dans des cuves couvertes. Lorsque des cuves saturées sont spécifiées, ceci est
réalisé en les recouvrant intérieurement avec du papier-filtre et en laissant la cuve se saturer avec les vapeurs de
solvant.
4.6.1 Chloroforme/acétone, mélange (90 + 10).
Mélanger 90 volumes de chloroforme avec 10 volumes d’acétone, en cuve non saturée.
4.6.2 Oxyde diéthylique/méthanol/eau, mélange (96 + 3 + 1).
Mélanger 96 volumes d’oxyde diéthylique avec 3 volumes de méthanol et 1 volume d’eau, en cuve non saturée.
4.6.3 Oxyde diéthylique/méthanol/eau, mélange (94 + 4,5 + 1,5).
Mélanger 94 volumes d’oxyde diéthylique avec 4,5 volumes de méthanol et 1,5 volumes d’eau, en cuve saturée.
4.6.4 Chloroforme/méthanol, mélange (94 + 6).
Mélanger 94 volumes de chloroforme avec 6 volumes de méthanol, en cuve saturée.
4.6.5 Chloroforme/méthanol, mélange (97 + 3).
Mélanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de méthanol, en cuve saturée.
4.7 Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granulométrie: 0,05 mm à 0,20 mm.
4.8 Gel de silice, G-HR ou équivalent, pour chromatographie sur couche mince.
4.9 Terre de diatomées (Hyflosupercel), lavée à l’acide.
4.10 Sulfate de sodium,granulés anhydres.
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2 ISO 2001 – Tous droits réservés

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ISO 6651:2001(F)
4.11 Acide trifluoroacétique.
4.12 Gaz inerte, par exemple azote.
4.13 Acide sulfurique, solution à 50 % (fraction volumique).
4.14 Aflatoxine B , solution étalon contenant environ 0,1g d’aflatoxine B par millilitre dans le chloroforme (4.1)
1 1
ou dans le mélange benzène/acétonitrile (4.4).
AVERTISSEMENT — Les aflatoxines sont fortement cancérigènes et doivent être manipulées avec
beaucoup de précaution.
Préparer et contrôler la solution comme indiqué ci-après.
4.14.1 Préparation de la solution mère et détermination de sa concentration
Préparer une solution d’aflatoxine B , dans le chloroforme (4.1) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (4.4), de
1
8g/ml 10g/ml 330 nm 370 nm
concentration comprise entre et . Déterminer son spectre d’absorption entre et à
l’aide du spectromètre (5.9).
A 363 nm 348 nm
Relever l’absorbance ( ) à dans le cas d’une solution chloroformique, ou à dans le cas d’une
solution dans le mélange benzène/acétonitrile.
Calculer la concentration d’aflatoxine B , en microgrammes par millilitre de solution, à partir des formules suivantes:
1
a) pour la solution chloroformique
312�A� 1 000
22 300
b) pour la solution dans le mélange benzène/acétonitrile
312�A� 1 000
19 800
4.14.2 Dilution
Effectuer à l’abri de la lumière les dilutions convenables de la solution mère (4.14.1) pour obtenir une solution étalon
dont la concentration en aflatoxine B soit d’environ 0,1g/ml.
1
�
Conservée au réfrigérateur à 4 C, cette solution est stable durant 2 semaines.
4.14.3 Contrôle de la pureté chromatographique de la solution
Déposer sur une plaque (5.7) une tache de 5l8de la solution mère d’aflatoxine B de concentration g/ml à
1
10g/ml (4.14.1). Développer le chromatogramme comme indiqué en 7.5.1. Sous lumière ultraviolette, la
fluorescence ne doit donner lieu qu’à la perception d’une seule tache et aucune fluorescence ne doit être perçue
dans la zone du dépôt d’origine.
4.15 Aflatoxines B et B (voir l’avertissement en 4.14), solutions pour l’essai qualitatif, contenant environ 0,1g
1 2
d’aflatoxines B et B par millilitre dans le chloroforme (4.1) ou dans le mélange benzène/acétonitrile (4.4).
1 2
Ces concentrations sont données à titre indicatif. Elles doivent être ajustées de manière à obtenir la même intensité
de fluorescence pour les deux aflatoxines (voir 7.5.1).
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ISO 2001 – Tous droits réservés 3

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ISO 6651:2001(F)
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Broyeur.
5.2 Tamis, de 1,0 mm d’ouverture de maille.
1)
Pour plus de détails, voir l’ISO 565 .
5.3 Appareil à secouer ou agitateur magnétique.
5.4 Tube pour chromatographie, en verre (diamètre intérieur 22 mm, longueur 300 mm), avec robinet en
polytétrafluoroéthylène (PTFE) et réservoir de 250 ml, muni à son extrémité d’un tampon de coton ou de laine de
verre.
5.5 Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon à fond rond de 500 ml.
5.6 Appareillage pour chromatographie sur couche mince, à savoir matériel nécessaire à la préparation des
plaques (5.7) et au dépôt des taches (pipettes capillaires ou microseringues), cuve de développement et appareil
pour pulvériser l’acide sulfurique (4.13) sur les plaques.
5.7 Plaques de verre pour chromatographie sur couche mince, 200 mm� 200 mm, préparées comme suit
(les quantités indiquées conviennent pour recouvrir cinq plaques).
Introduire 30 g de gel de silice (4.8) dans une fiole conique, ajouter 60 ml d’eau, boucher et agiter durant 1 min.
Étendre la suspension sur les plaques, de manière à obtenir une couche uniforme de 0,25 mm d’épaisseur. Laisser
sécher à l’air et conserver ensuite dans un dessiccateur garni de gel de silice. Au moment de l’emploi, activer les
�
plaques en les maintenant durant 1h dans une étuve à 110 C.
Les plaques prêtes à l’emploi conviennent dans la mesure où elles donnent des résultats semblables à ceux des
plaques préparées comme indiqué ci-dessus.
360 nm
5.8 Lampe à ultraviolet à ondes longues ( ).
L’intensité d’irradiation doit permettre de distinguer encore nettement une tache de 1,0 ng d’aflatoxine B sur une
1
plaque pour chromatographie sur couche mince, à une distance de 10 cm de la lampe.
AVERTISSEMENT — La lumière ultraviolette étant dangereuse pour les yeux, il y a lieu de porter des
lunettes protectrices.
5.9 Spectromètre, permettant d’effectuer les mesures dans l’ultraviolet.
5.10 Fluorodensitomètre (éventuellement).
5.11 Papier-filtre à plis.
5.12 Tube gradué, de 10,0 ml de capacité, avec bouchon de polyéthylène.
5.13 Fiole conique, de 500 ml de capacité, à bouchon rodé.
5.14 Pipette, de 50 ml de capacité.
5.15 Balance analytique.
1) ISO 565, Tamis de contrôle — Tissus métalliques, tôles métalliques perforées et feuilles électroformées — Dimensions
nominales des ouvertures.
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4 ISO 2001 – Tous droits réservés

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ISO 6651:2001(F)
6 Échantillonnage
Prélever l’échantillon pour laboratoire sur le produit à échantillonner, en se conformant à la Norme internationale
relative au produit concerné, sauf si l’échantillonnage en vue de la détermination de l’aflatoxine est exclu de son
domaine d’application. S’il n’existe pas de Norme internationale appropriée, les parties concernées doivent se
mettre d’accord, en tenant compte des caractéristiques du produit à échantillonner.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon pour essai
7.1.1 Si l’échantillon contient plus de 5% de matières grasses, il doit être dégraissé à l’éther de pétrole avant
d’effectuer le broyage.
Les résultats devront alors être rapportés à la masse d’échantillon non dégraissé.
7.1.2 Broyer l’échantillon pour laboratoire, de façon qu’il passe en totalité au travers du tamis (5.2). Bien
homogénéiser. Voir l’ISO 6498.
7.2 Prise d’essai
Peser, à 0,01 g près, 50 g de l’échantillon pour essai dans la fiole conique (5.13).
7.3 Extraction
Ajouter à la prise d’essai (7.2) 25 g de terre de diatomées (4.9), puis 25 ml d’eau et 250 ml de chloroforme (4.1)
mesurés avec soin à l’aide d’une éprouvette. Boucher la fiole, secouer ou agiter durant 30 min à l’aide de l’appareil
(5.3). Filtrer sur papier-filtre (5.11) en ayant soin d’éliminer les 10 premiers millilitres de filtrat et de recueillir une
quantité de filtrat supérieure à 50 ml.
7.4 Purification
7.4.1 Préparation de la colonne
Remplir les deux tiers du tube pour chromatographie (5.4) avec du chloroforme (4.1) et ajouter 5g de sulfate de
sodium (4.10). S’assurer que la surface supérieure de la couche de sulfate de sodium est plane, puis ajouter par
10 g
petites fractions de gel de silice (4.7). Remuer avec précaution après chaque addition pour éliminer les bulles
d’air. Laisser décanter durant 15 min et ajouter ensuite avec précaution 10 g de sulfate de sodium (4.10). Ouvrir le
robinet et laisser s’écouler le liquide jusqu’à proximité immédiate de la surface supérieure de la couche de sulfate de
sodium. Fermer le robinet.
7.4.2 Purification
Prélever à la pipette (5.14) 50 ml du filtrat recueilli en 7.3 dans une fiole conique de 250 ml, ajouter 100 ml de
n-hexane (4.2). Mélanger et transvaser quantitativement le mélange dans la colonne en rinçant avec du n-hexane.
Ouvrir le robinet et laisser s
...