ISO 8069:2005

Dried milk — Determination of content of lactic acid and lactates

ISO 8069|IDF 69:2005 specifies an enzymatic method for the determination of the lactic acid and lactates content of all types of dried milk.

Lait sec — Determination de la teneur en acide lactique et en lactates

L'ISO 8069|FIL 69:2005 spécifie une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur en acide lactique et en lactates, applicable à tous les types de laits secs.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 08-Sep-2005
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 20-Dec-2022

Relations

• Revises: ISO 8069:1986 - Dried milk — Determination of lactic acid and lactates content — Enzymatic method
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 8069
IDF
69
Second edition
2005-09-15

Dried milk — Determination of content of
lactic acid and lactates
Lait sec — Determination de la teneur en acide lactique et en lactates




Reference numbers
ISO 8069:2005(E)
IDF 69:2005(E)
©
ISO and IDF 2005

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IDF 69:2005(E)
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Published in Switzerland

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IDF 69:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 1
4 Reagents. 1
5 Apparatus . 3
6 Sampling. 3
7 Preparation . 4
7.1 Preparation of test sample. 4
7.2 Test portion . 4
7.3 Blank test. 4
7.4 Preparation of solution and deproteination. 4
8 Procedure . 4
8.1 Test to check the activity of reagents. 4
8.2 Determination. 5
9 Calculation and expression of results. 6
9.1 Calculation. 6
9.2 Expression of results . 7
10 Precision. 7
10.1 Interlaboratory test . 7
10.2 Repeatability. 7
10.3 Reproducibility. 8
11 Test report . 8
Annex A (normative) Good laboratory practice (GLP) rules for the performance of enzymatic
analyses. 9
Bibliography . 13

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ISO 8069:2005(E)
IDF 69:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 8069⎪IDF 69 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
This edition of ISO 8069⎪IDF 69 cancels and replaces ISO 8069:1986, which has been technically revised.

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ISO 8069:2005(E)
IDF 69:2005(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 8069⎪IDF 69 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team on Lactose and lactate determination, of the
Standing Committee on Main components of milk, under the aegis of its project leader, Mr J Romero (US).
This edition of ISO 8069⎪IDF 69 cancels and replaces IDF 69:1987, which has been technically revised.
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ISO 8069:2005(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 69:2005(E)

Dried milk — Determination of content of lactic acid and lactates
1 Scope
This International Standard specifies an enzymatic method for the determination of the lactic acid and lactates
content of all types of dried milk.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
lactic acid and lactates content
mass of substances determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE It is expressed as milligrams of lactic acid per 100 g of non-fat solids.
3 Principle
A test portion of dried milk is dissolved in warm water. The fat and proteins are precipitated then filtered. The
filtrate is treated with the following enzymes and biochemical substances, added simultaneously, but acting in
sequence:
a) L-lactate dehydrogenase (L-LDH) and D-lactate dehydrogenase (D-LDH), in the presence of nicotinamide
adenine dinucleotide (NAD), to oxidize lactate to pyruvate and to convert NAD to its reduced form NADH;
b) glutamate pyruvate transaminase (GPT), in the presence of L-glutamate, to transform pyruvate into
L-alanine and to convert L-glutamate to α-ketoglutarate.
The amount of NADH produced is determined by spectrophotometric measurement at a wavelength of
340 nm, and is proportional to the lactic acid and lactates content.
4 Reagents
Use only reagents recognized analytical grade. The water used in the preparation of the enzyme solutions
shall be of at least doubly glass-distilled purity and the water used for other purposes shall be glass-distilled or
of at least equivalent purity.
4.1 Potassium hexacyanoferrate(II) solution, c(K [Fe(CN) ]⋅3H O) = 35,9 g/l.
4 6 2
Dissolve 35,9 g of potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate in water. Dilute with water to 1 000 ml and mix.
4.2 Zinc sulfate solution, c(ZnSO⋅7H O) = 71,8 g/l.
4 2
Dissolve 71,8 g of zinc sulfate heptahydrate in water. Dilute with water to 1 000 ml and mix.
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IDF 69:2005(E)
4.3 Sodium hydroxide solutions
4.3.1 Sodium hydroxide solution I, c(NaOH) = 10 mol/l.
Dissolve 400 g of sodium hydroxide in water. Dilute with water to 1 000 ml and mix.
4.3.2 Sodium hydroxide solution II, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
Dissolve 4,0 g of sodium hydroxide in water. Dilute with water to 1 000 ml and mix.
4.4 Glycerol solution (C H O ), with a volume fraction of 50 % glycerol.
3 8 3
4.5 Ammonium sulfate solution, c[(NH ) SO ] = 3,2 mol/l.
4 2 4
Dissolve 422,84 g of ammonium sulfate in water. Dilute with water to 1 000 ml and mix.
4.6 Buffer solution, pH 10.
Dissolve 7,92 g of glycylglycine (C H N O ) and 1,47 g of L-glutamic acid (C H NO ) in about 80 ml of water.
4 8 2 3 5 9 4
Adjust the pH to 10,0 ± 0,1 at 20 °C with sodium hydroxide solution I (4.3.1). Dilute with water to 100 ml and
mix.
This solution may be kept for 3 months if stored in a refrigerator at between 0 °C and +5 °C.
4.7 Nicotinamide adenine dinucleotide solution (NAD).
Dissolve 350 mg of nicotinamide adenine dinucleotide (C H N O P ) in 10 ml of water.
21 27 7 14 2
This solution may be kept for 4 weeks if stored in a refrigerator at between 0 °C and +5 °C. When the solution
is being used, keep the vessel immersed in crushed ice.
4.8 L-Lactate dehydrogenase (L-LDH), from hog muscle suspension.
Dissolve 10 mg of L-lactate dehydrogenase suspension in 1 ml of glycerol solution (4.4). The pH of the
obtained suspension should be about 7. The specific activity of the L-lactate dehydrogenase
(L-LDH, EC 1.1.1.27) suspension shall be at least 5 500 units/ml at 25 °C. If not, prepare another L-LDH
suspension.
The L-LDH suspension may be kept for 12 months if stored in a refrigerator at between 0 °C and +5 °C. When
the suspension is being used, keep the vessel immersed in crushed ice.
4.9 D-Lactate dehydrogenase (D-LDH), from Lactobacillus leichmannii suspension.
Dissolve 5 mg of D-LDH suspension in 1 ml of ammonium sulfate solution (4.5). The pH of the obtained
suspension should be about 6. The specific activity of the D-lactate dehydrogenase (D-LDH, EC 1.1.1.28)
suspension shall be at least 1 500 units/ml at 25 °C. If not, prepare another D-LDH suspension.
The D-LDH suspension may be kept for 12 months if stored in a refrigerator at between 0 °C and +5 °C. When
the suspension is being used, keep the vessel immersed in crushed ice.
4.10 Glutamate pyruvate transaminase (GPT), from pig heart suspension.
Dissolve 20 mg of GPT suspension in 1,0 ml of ammonium sulfate solution (4.5). The pH of the obtained
suspension should be about 7. The specific activity of the glutamate pyruvate transaminase (GPT, EC 2.6.1.2)
suspension shall be at least 1 600 units/mI at 25 °C. If not, prepare another GPT suspension.
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IDF 69:2005(E)
Add 1,0 ml of ammonium sulfate solution (4.5) to the 1 ml suspension with 20 mg of GPT and mix. Centrifuge
this 2,0 ml suspension containing 10 mg of GPT/ml at a radial acceleration of 4 000 g for 10 min. Transfer
1,0 ml of the clear supernatant liquid and discard the remaining solution and pellet.
The suspension may be kept for 12 months if stored in a refrigerator at between 0 °C and +5 °C. When the
suspension is being used, keep the vessel immersed in crushed ice.
4.11 Lithium L-lactate solution
Dissolve 50 mg of lithium L-lactate (C H O Li) in water. Dilute with water to 500 ml and mix.
3 5 3
4.12 Lithium D-lactate solution
Dissolve 50 mg of lithium D-lactate (C H O Li) in water. Dilute with water to 500 ml and mix.
3 5 3
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg, with a readability of 0,1 mg.
5.2 Glass beaker, of capacity 50 ml.
5.3 Graduated cylinder, of capacity 50 ml.
5.4 One-mark volumetric flasks, of capacity 100 ml.
5.5 Pipettes, capable of delivering 0,02 ml, 0,05 ml, 0,2 ml, 1,0 ml and 2,0 ml.
5.6 Graduated pipettes, capable of delivering 5 ml and 10 ml, graduated in 0,1 ml divisions.
5.7 Glass filter funnel, of diameter about 7 cm.
5.8 Filter paper, medium fast grade, of diameter about 15 cm, free from lactic acid and lactates.
5.9 Glass rod.
5.10 Plastic paddles, capable of mixing the sample-enzyme mixture in the spectrometric cell.
5.11 Spectrophotometer, capable of measuring at 340 nm, equipped with cells of optical path length 1 cm.
TM1)
5.12 Parafilm .
6 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
is given in ISO 707⎪IDF 50.
Store the sample in such a way that deterioration and change in composition are prevented.

TM
1) Parafilm is an example of a product available commercially. This information is given for the convenience of users
of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
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ISO 8069:2005(E)
IDF 69:2005(E)
7 Preparation
7.1 Preparation of test sample
Transfer the test sample to a container with capacity about twice the volume of the sample and provided with
an airtight lid. Close the container immediately. Mix the sample thoroughly by repeatedly shaking and inverting
the container.
During preparation, avoid exposure of the test sample to the atmosphere in order to minimize adsorption of
water.
7.2 Test portion
Weigh, to the nearest 1 mg, 1,0 g of the test sample in a 50 ml glass beaker (5.2).
7.3 Blank test
Carry out a blank test by proceeding as specified in 7.4 and 8.2, using all reagents but omitting the test portion.
7.4 Preparation of solution and deproteination
7.4.1 Dissolve the test portion (7.2) in about 20 ml of water preheated to between 40 °C and 50 °C, while
stirring with the glass rod (5.9) or suitable means. Transfer the contents of the glass beaker quantitatively to a
100 ml one-mark volumetric flask (5.4) by rinsing the beaker with water. Cool the contents of the flask to about
20 °C.
7.4.2 Add to the solution (7.4.1), in the following order, 5,0 ml of potassium hexacyanoferrate(II) solution
(4.1), 5,0 ml of zinc sulfate solution (4.2) and 10,0 ml of sodium hydroxide solution II (4.3.2), swirling
thoroughly after each addition. Dilute with water to the 100 ml mark. Mix thoroughly and allow the mixture to
stand at room temperature for 30 min.
7.4.3 Filter through a filter paper (5.8), discarding the first fraction of the filtrate.
Use of a centrifuge is a suitable alternative to filtration.
8 Procedure
CAUTION — Avoid contamination, especially with perspiration.
8.1 Test to check the activity of reagents
8.1.1 Whenever a new batch of reagents (4.6 to 4.10 inclusive) is prepared, or when such reagents have
been kept in a refrigerator without being used for more than 2 weeks, or when restarting analytical work after a
period of analytical inactivity, or whenever other conditions may justify it, perform the following test for the
recovery of lactates.
8.1.2 Pipette 10 ml of lithium L-lactate solution (4.11)
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 8069
FIL
69
Deuxième édition
2005-09-15


Lait sec — Determination de la teneur en
acide lactique et en lactates
Dried milk — Determination of content of lactic acid and lactates



Numéros de référence
ISO 8069:2005(F)
FIL 69:2005(F)
©
ISO et FIL 2005

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ISO 8069:2005(F)
FIL 69:2005(F)
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Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Version française parue en 2006
Publié en Suisse

ii © ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés

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ISO 8069:2005(F)
FIL 69:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Avant-propos FIL . v
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 1
4 Réactifs . 1
5 Appareillage . 3
6 Échantillonnage . 4
7 Mode opératoire . 4
7.1 Préparation de l’échantillon pour essai. 4
7.2 Prise d’essai . 4
7.3 Essai à blanc . 4
7.4 Préparation de la solution et déprotéination . 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Vérification de l’activité des réactifs. 4
8.2 Détermination. 5
9 Calcul et expression des résultats. 7
9.1 Calcul . 7
9.2 Expression des résultats . 8
10 Fidélité . 8
10.1 Essai interlaboratoires . 8
10.2 Répétabilité. 8
10.3 Reproductibilité. 8
11 Rapport d'essai . 9
Annexe A (normative) Règles de bonne pratique de laboratoire (GLP) pour la conduite d'analyses
suivant une méthode enzymatique. 10
Bibliographie . 14

© ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés iii

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ISO 8069:2005(F)
FIL 69:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 8069|FIL 69 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5,
Lait et produits laitiers et la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) et est publiée conjointement par l'ISO et
la FIL.
La présente édition de l'ISO 8069|FIL 69 annule et remplace l’ISO 8069:1986, qui a fait l’objet d’une révision
technique.
iv © ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés

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ISO 8069:2005(F)
FIL 69:2005(F)
Avant-propos FIL
La FIL (Fédération Internationale de la laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier qui a un
Comité national dans chaque pays membre. Chaque Comité national a le droit d’être représenté aux Comités
permanents de la FIL chargés des travaux techniques. La FIL collabore avec l’ISO pour l’élaboration de
méthodes normalisées d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les groupes tripartites et les comités permanents sont
soumis aux comités nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des comités nationaux FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 8069|FIL 69 a été élaborée par la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l’ISO.
La totalité des travaux a été confiée à l’équipe de travail conjointe ISO-FIL Dosage du lactose et des lactates,
du comité permanent Principaux constituants du lait sous l’égide de son chef de projet, Monsieur J. Romero
(États-Unis).
La présente édition de l’ISO 8069|FIL 69 annule et remplace la FIL 69:1987, qui a fait l'objet d'une révision
technique.

© ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés v

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ISO 8069:2005(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 69:2005(F)

Lait sec — Determination de la teneur en acide lactique et en
lactates
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode enzymatique pour la détermination de la teneur en
acide lactique et en lactates, applicable à tous les types de laits secs.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en acide lactique et en lactates
masse des substances déterminées par le mode opératoire spécifié dans la présente Norme internationale
NOTE Elle est exprimée en milligrammes d’acide lactique pour 100 g de solides non gras.
3 Principe
Dissolution d’une prise d’essai de lait sec dans l’eau chaude. Précipitation de la matière grasse et des
protéines, suivie d’une filtration. Traitement du filtrat avec les enzymes et substances biochimiques suivantes,
ajoutées simultanément, mais agissant successivement:
a) L-lactate déshydrogénase (L-LDH) et D-lactate déshydrogénase (D-LDH) en présence de nicotinamide
adénine dinucléotide (NAD) pour oxyder le lactate en pyruvate et transformer le NAD en sa forme réduite
(NADH);
b) glutamate pyruvate transaminase (GPT) en présence de L-glutamate pour transformer le pyruvate en
L-alanine et transformer le L-glutamate en α-cétoglutarate.
Mesurage spectrométrique à la longueur d’onde de 340 nm pour déterminer la quantité de NADH produite,
laquelle est proportionnelle à la teneur en acide lactique et en lactates.
4 Réactifs
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L’eau utilisée pour préparer les solutions
d’enzymes doit être d’une pureté au moins équivalente à celle de l’eau doublement distillée dans un récipient
en verre et l’eau destinée aux autres usages doit être de l’eau distillée dans un récipient en verre ou de l’eau
d’une pureté au moins équivalente.
4.1 Solution d’hexacyanoferrate(II) de potassium, c(K [Fe(CN) ],3H O) = 35,9 g/l.
4 6 2
Dissoudre 35,9 g d’hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté dans l’eau. Diluer avec de l’eau à 1 000 ml et
mélanger.
© ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés 1

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ISO 8069:2005(F)
FIL 69:2005(F)
4.2 Solution de sulfate de zinc, c(ZnSO ,7H O) = 71,8 g/l.
4 2
Dissoudre 71,8 g de sulfate de zinc heptahydraté dans l’eau. Diluer avec de l’eau à 1 000 ml et mélanger.
4.3 Solutions d’hydroxyde de sodium
4.3.1 Solution d’hydroxyde de sodium I, c(NaOH) = 10 mol/l.
Dissoudre 400 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Diluer avec de l’eau à 1 000 ml et mélanger.
4.3.2 Solution d’hydroxyde de sodium II, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
Dissoudre 4,0 g d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Diluer avec de l’eau à 1 000 ml et mélanger.
4.4 Solution de glycérol, (C H O ) ayant une fraction volumique de 50 % de glycérol.
3 8 3
4.5 Solution de sulfate d’ammonium, c[(NH ) SO ] = 3,2 mol/l.
4 2 4
Dissoudre 422,84 g de sulfate d’ammonium dans l’eau. Diluer avec de l’eau à 1 000 ml et mélanger.
4.6 Solution tampon, pH 10.
Dissoudre 7,92 g de glycylglycine (C H N O ) et 1,47 g d’acide L-glutamique (C H NO ) dans environ 80 ml
4 8 2 3 5 9 4
d’eau. Ajuster le pH à 10,0 ± 0,1 à 20 °C avec une solution d’hydroxyde de sodium (4.3.1). Diluer à 100 ml
avec de l’eau et mélanger.
Cette solution peut se garder pendant 3 mois si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 °C et + 5 °C.
4.7 Solution de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD).
Dissoudre 350 mg de nicotinamide adénine dinucléotide (C H N O P ) dans 10 ml d’eau.
21 27 7 14 2
Cette solution peut se garder 4 semaines si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 °C et + 5 °C. En cours
d’utilisation, maintenir immergé dans de la glace pilée le récipient contenant la solution.
4.8 Suspension de L-lactate déshydrogénase (L-LDH), extraite de muscle de porc.
Dissoudre 10 mg de la suspension de L-LDH dans 1 ml de la solution de glycérol (4.4). Le pH de la solution
doit être d’environ 7. L’activité spécifique de la solution de L-lactate déshydrogénase (L-LDH, EC 1.1.1.27)
doit être d’au moins 5 500 unités/ml à 25 °C. Si tel n’est pas le cas, préparer une autre suspension de L-LDH.
Cette suspension peut se garder pendant 12 mois si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 °C et + 5 °C.
En cours d’utilisation, maintenir immergé dans de la glace pilée le récipient contenant la suspension.
4.9 Suspension de D-lactate déshydrogénase (L-LDH), provenant du Lactobacillus leichmannii.
Dissoudre 5 mg de la suspension de D-LDH dans 1 ml de la solution de sulfate d’ammonium (4.5). Le pH doit
être d’environ 6. L’activité spécifique de la suspension de D-lactate déshydrogénase (D-LDH, EC 1.1.1.28)
doit être d’au moins 1 500 unités/ml à 25 °C. Si tel n’est pas le cas, préparer une autre suspension de D-LDH.
Cette suspension peut se garder pendant 12 mois si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 °C et + 5 °C.
En cours d’utilisation, maintenir immergé dans de la glace pilée le récipient contenant la suspension.
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4.10 Suspension de glutamate pyruvate transaminase (GPT), extraite de coeur de porc.
Dissoudre 20 mg de la suspension de GPT dans 1 ml de la solution de sulfate d’ammonium (4.5). Le pH doit
être d’environ 7. L’activité spécifique de la suspension de glutamate pyruvate transaminase (GPT, EC 2.6.1.2)
doit être d’au moins 1 600 unités/ml à 25 °C. Si tel n’est pas le cas, préparer une autre suspension de GPT.
Ajouter 1,0 ml de solution de sulfate d’ammonium (4.5) au 1 ml de la suspension avec 20 mg de GPT et
mélanger. Centrifuger 2,0 ml d’une suspension contenant 10 mg de GPT par millilitre à une accélération
radiale de 4 000 g pendant 10 min. Transférer 1,0 ml du liquide limpide surnageant et éliminer la solution
restante
Cette suspension peut se garder pendant 12 mois si elle est conservée au réfrigérateur entre 0 °C et + 5 °C.
En cours d’utilisation, maintenir immergé dans de la glace pilée le récipient contenant la suspension.
4.11 Solution de L-lactate de lithium
Dissoudre 50 mg de L-lactate de lithium (C H O Li) dans l’eau. Diluer à 500 ml avec de l’eau et mélanger.
3 5 3
4.12 Solution de D-lactate de lithium
Dissoudre 50 mg de D-lactate de lithium (C H O Li) dans l’eau. Diluer à 500 ml avec de l’eau et mélanger.
3 5 3
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit:
5.1 Balance analytique, capable de peser à 1 mg près, avec une précision de lecture de 0,1 mg.
5.2 Bécher en verre, de 50 ml de capacité.
5.3 Éprouvette graduée, de 50 ml de capacité.
5.4 Fioles jaugées à un trait, de 100 ml de capacité.
5.5 Pipettes, permettant de distribuer 0,02 ml, 0,05 ml, 0,2 ml, 1,0 ml et 2,0 ml.
5.6 Pipettes graduées, permettant de distribuer 5 ml et 10 ml, graduées en divisions de 0,1 ml.
5.7 Entonnoir en verre, d’environ 7 cm de diamètre.
5.8 Papier-filtre, à filtration moyenne, d’environ 15 cm de diamètre, exempt d’acide lactique et de lactates.
5.9 Baguette en verre.
5.10 Palettes en plastique, permettant d’agiter le mélange échantillon-enzyme dans la cuve du
spectromètre.
5.11 Spectrophotomètre, permettant d’effectuer des mesures à 340 nm, équipé de cuves ayant un trajet
optique de 1 cm.
TM1)
5.12 Parafilm .

TM
1) Parafilm est un exemple d’un produit disponible sur le marché. Cette information est donnée à titre d’information à
l’utilisateur de la présente Norme internationale et ne constitue pas un engagement de l’ISO ou de la FIL à l’égard de ce
produit.
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6 Échantillonnage
Il est important que l’échantillon reçu par le laboratoire soit réellement représentatif et qu’il n’ait pas été
détérioré ou modifié pendant le transport ou le stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 707|FIL 50.
Conserver l’échantillon en veillant à éviter toute détérioration et toute modification de sa composition.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon pour essai
Transférer l’échantillon dans un récipient ayant une capacité d’environ deux fois le volume de l’échantillon et
muni d’un couvercle étanche à l’air. Fermer immédiatement le récipient. Mélanger soigneusement l’échantillon
en agitant et en retournant plusieurs fois le récipient.
Pendant la préparation, éviter d’exposer l’échantillon pour essai à l’atmosphère afin de réduire le plus possible
l’adsorption d’eau.
7.2 Prise d’essai
Peser, à 1 mg près, 1,0 g d’échantillon pour essai et le transvaser dans un bécher en verre de 50 ml (5.2).
7.3 Essai à blanc
Effectuer un essai à blanc conformément aux dispositions des 7.4 et 8.2 en utilisant tous les réactifs mais en
omettant la prise d’essai.
7.4 Préparation de la solution et déprotéination
7.4.1 Dissoudre la prise d’essai (7.2) dans environ 20 ml d’eau préalablement chauffée entre 40 °C et 50 °C
tout en agitant à l’aide de la baguette en verre (5.9) ou de tout autre moyen approprié. Transférer
quantitativement le contenu du bécher en verre dans une fiole jaugée à un trait de 100 ml (5.4) en rinçant le
bécher avec de l’eau. Laisser refroidir le contenu de la fiole à environ 20 °C.
7.4.2 Ajouter à la solution (7.4.1) dans l’ordre suivant: 5,0 ml de la solution d’hexacyanoferrate(II) de
potassium (4.1), 5,0 ml de la solution de sulfate de zinc (4.2) et 10,0 ml de la solution d’hydroxyde de
sodium (4.3.2), en agitant soigneusement après chaque ajout. Diluer au trait de 100 ml avec de l’eau. Bien
mélanger et laisser le mélange reposer à la température ambiante, pendant 30 min.
7.4.3 Filtrer sur du papier-filtre (5.8) en éliminant les premières fractions du filtrat.
La centrifugation est une alternative à la filtration qui convient également.
8 Mode opératoire
ATTENTION — Éviter les contaminations, surtout celles dues à la transpiration.
8.1 Vérification de l’activité des réactifs
8.1.1 Chaque fois qu’un nouveau lot de réactifs (4.6 à 4.10 inclus) est préparé ou si des réactifs ont été
conservés au réfrigérateur pendant plus de 2 semaines sans avoir été utilisés, si les travaux analytiques
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reprennent après une période d’inactivité ou si d’autres conditions peuvent le justifier, effectuer l’essai suivant
de récupération des lactates.
8.1.2 Introduire à la pipette 10 ml de la solution de L-lactate de lithium (4.11) dans chacune des deux fioles
jaugées à un trait de 100 ml (5.4). Introduire à la pipette 10 ml de la solution de D-lactate de lithium (4.12)
dans chacune de deux autres fioles jaugées à un trait (5.4). Déterminer la teneur en acide L-lactique
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