ISO 9998:1991
(Main)Water quality — Practices for evaluating and controlling microbiological colony count media used in water quality tests
Water quality — Practices for evaluating and controlling microbiological colony count media used in water quality tests
Describes a method used for the comparison and evaluation of the same medium prepared from different lots of materials, and deals with the comparison and evaluation of different media which are used for the same purpose. Annexes A and B form an integral part of this Standard.
Qualité de l'eau — Techniques d'évaluation et de contrôle des milieux microbiologiques servant au comptage des colonies pour les essais d'évaluation de la qualité de l'eau
Kakovost vode - Načini vrednotenja in kontrole mikrobioloških gojišč za štetje kolonij pri preskusih kakovosti vode
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
STANDARD
First edition
1991-11-01
._------. .---.--_ .--. - ---_- -- I----- -----.--v---v
Water quality - Practices for evaluating and
controlling microbiological colony count media
used in water quality tests
Qualite de I’eau
- Techniques d’&aluation et de controle des milieux
microbiologiques set-vant au camptage des colonies pour les essais
d%valuation de la qualite de I’eau
Reference number
ISO 9998:1991(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9998:1991(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a wot-ldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to bc
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. ISO collaborates closely with the International Electrotcchnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committces are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75 % of the member
bodies casting a vote.
International Standard ISO 9998 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality.
Annexes A and B form an integral part of this International Standard.
Annex C is for information only.
0 ISO 1991
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, eiectronic or mechanical, including photocopylng and microfilm, without
Permission in writing from the publisher.
Intern ational Organizati on for Standardiz ation
Case Postale 56 l CH-1 21 1 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 9998:1991(E)
Introduction
The development of micro-organisms upon culture media is dependent
upon a number of very important factors.
a) The proper nutrients must be available.
b) Oxygen or other gases must be available.
c) A certain degree of moisture is necessary.
d) The medium must be of the proper pH reaction.
e) Proper temperatures must be maintained.
f) The medium musf be sterile and maintained free of contamination
after inoculation.
g) Media must be able to be reproduced consistently with minimum
variations.
h) Care should be taken to avoid plates which are too crowded.
To ensure the reproducibility of microbiological results and to enable
inter-laboratoty comparison studies to be made, the preparation of
microbiological media must be strictly regulated. Guidelines for ensur-
ing the proper preparation of media which tan be used with similar
growth expectations from laboratory to laboratory are presented below.
---------------------- Page: 3 ----------------------
This page intentionally left bJank
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 9998:1991(E)
INTERNATIONAL STANDARD
- Practices for evaluating and controlling
Water quality
microbiological colony count media used in water quality tests
Inoculation tan be either a quantitative method or
1 Scope
simple plate-spreading by wire loop and seeding of
liquid media by pipette. Alternatively, a series of
This International Standard covers the comparison
natura1 aquatic samples with high bacterial popu-
and evaluation of the Same medium prepared from
lations may be used. This type of screening is closer
different lots of materials.
to reality, but has the disadvantage that the most
demanding organisms may not be present in the
lt also covers the comparison and evaluation of dif-
water Sample used.
ferent media which are used for the Same purpose.
lt only deals with the finished product ready to be
3.2 Examples of statistical analyses are given in
tested, and not media formulation or preparation.
annex A.
This method applies to the evaluation of any solid
media intended for bacteriological isolation and
4 Media preparation and tests
enumeration procedures.
4.1 Application
2 Normative reference
The following tests and procedures tan be applied
The following Standard contains provisions which, to each lot of medium prepared from either a com-
through reference in this text, constitute provisions mercial Source or in a laboratory using primary in-
of this International Standard. At the time of publi-
gredients (see also ISO 8199).
cation, the edition indicated was valid. All Standards
are subject to revision, and Parties to agreements
4.2 Measurement of pH-value
based on this International Standard are encour-
aged to investigate the possibility of applying the
Prepare the medium, sterilize as directed and
most recent edition of the Standard indicated below.
measure the pH using an electronie pH-meter. The
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
pH of most media should be within +0,2 of a unit of
rently valid International Standards.
the target value at 25 OC. Check the-pH of the steril-
ized media, in the case of solid media after
ISO 8199:1988, Wafer quality - General guide to the
solidification.
enumeration of micro-organisms by culture.
The pH or reaction of the culture medium, express-
ing its hydrogen ion concentration, is very important
3 Productivitykelectivity testing
for the qrowth of micro-organisms. Most micro-
organisms prefer media which are approximately
3.1 The general procedure is to inoculate appro-
neutral, although some may require media which
priate organisms onto the media under evaluation
are distinctly acid.
and to compare their Performance, when trying
Drift in pH or other pH Problems may be caused by
a) to choose between various manufacturer’s me-
-
superheating;
dia;
-
b) to select the most appropriate medium; or incomplete mixing;
-
c) to assess batch-to-batch Variation. excessive sterilization;
1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
-
use of alkaline glass; ommended. Water which does not meet the re-
quirements of glass-distilled water may contain
-
contaminated Containers; compounds which interfere with the Performance of
the media.
-
impure distilled water;
Although the pH measurement of purified water is
characterized by drift, extreme readings are indica-
- repeated melti or prolong ed storage, es-
w
tive of Chemical contamination.
pecially at high tem ratures;
Pe
- hydrolysis of ingredients.
4.5 Glassware
4.3 Gel strength Clean glassware is critical in the preparation of
media. Traces of detergent or chemicals tan greatly
influence medium composition and growth charac-
For agar medium, a predried plate tan be checked
with a wire loop. Drying methods are described in teristics. Because some cleaning solutions are diffi-
clause 6. cult to remove completely, spot checking of clean
glassware for pH reaction (especially if soaked in
Improper gel strength may be due to one of the fol-
alkali or acid) should be carried out.
lowing:
Certain wetting agents or detergents used in wash-
-
agar not in Solution; ing glassware may contain bacteriostatic or inhibit-
ing substances requiring 6 to 12 successive rinsings
-
with Ultra-pure water, to remove all traces and en-
incomplete mixing;
Sure freedom from residual bacteriostatic action.
- inc0 rrect ions of dehydrated medium to
Pro Port
The procedure for testing these compounds, which
volu me of wa ter;
is taken from [Al, is described in annex B.
-
pH drift due to acid hydrolysis (“acid” agars e.g.
malt extract agar, will hydrolyze on prolonged
heating or if repeatedly melted);
4.6 Appearance
-
failure to compensate for dilution of agar by the
The colour and clarity of a prepared medium should
inoculum.
be typical for the product. Some obvious media
preparation errors are a darkening of the medium
An agar with excess gel strength may inhibit the
and the appearance of a precipitate. Superheating
formation of typical colonies and the usual effect is
due to incomplete mixing tan also Cause a darken-
a high-domed colony, which is usually smaller than
ing of the medium.
normal. The inhibitory effect of a dry agar surface
may be even stronger on membranes.
Incomplete solubility of the powdered medium may
be noted. This may be due to inadequate soaking,
inadequate heating, incomplete mixing, use of tap
4.4 Water water or of a Container too small to allow adequate
convection.
The water used to prepare media is very important
Agar media are apt to show a precipitate as a result
and could be one of the major Causes for incompar-
of prolonged sterilization or heating. Repeated
ability between media prepared in different labora-
melting of solidified agar or maintenance of melted
tories or even within the Same laboratory. Tap water
agar at a high temperature may Iikewise Cause a
should never be used in the preparation of media
precipitate to form in the media. Media containing
as it will contain a variety of substances, varying
agar may also form flocculant precipitates if the liq-
from day to day, which may Cause growth stimu-
uid medium remains in the water bath at 43 OC to
lation or inhibition when used in medium prep-
45 OC for longer than 30 min. The flocculant agar
aration.
precipitate, however, may be dispersed by reheating
the medium. Such media may also undergo nu-
Glass-distilled water is recommended for medium
For critical growth studies, double tritional impairment if held in the molten state for too
preparation.
long.
glass-distilled or ultra-pure’) water are rec-
1) Water that tan be obtained by using a device similar to a 4 cartridge Milli-Q System with membrane filtration of the final
product.
The Milli-Q able sy stem available commercially. This infor mation is given for the convenience
System is an example of a suit
nt by of this
of users of this International Standard an d does not constitute an endorseme ISO System.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
4.7 Chemicals
5 Statistical analyses
To ensure compatibiiity of media, reagents and sol-
utions and reproducibility of test results, it is rec- 5.1 General
ommended to use the purest grade chemicals in
their preparation. For instance, it is weil docu- Microbiologists are constantly seeking the medium
mented that some brands of potassium dihydrogen which is the most suitable for selectively isolating
Phosphate, KH,PO, contain Iarge amounts of im- and enumerating a target organism or population of
organisms from a specific specimen or Sample. The
purities, any one of which tan have an inhibitory or
growth stimulating effect on bacteria. The grade of literature on this subject is very comprehensive,
with many authors recommending a wide variety of
Chemical used should be carefully documented so
that later formulations will be consistent with the media as being best under the test conditions im-
original. posed. lnvariably, in these comparative studies and
recommendations, the media recommended tend to
The proper dissolution of chemicals and mixing of
have a regional following, which makes water qual-
solutions, media and reagents are important factors
ity comparison studies difficult, as noted in [2].
in ensuring homogeneity and compatibility from one
batch to the next within and between laboratories. Thus, for national and international water quality
comparison purposes, it is very important that one
of the basic tools of water microbiology, the media,
4.8 Changes in bacterial recovery or
be standardized as much as possible, not only to
differentiating characteristics
provide consistent results, but also to enable the
development of standardized procedures for enu-
There are many reasons for a medium to suddenly
merating specific micro-organisms.
be less efficacious than it once was. These reasons
include: repeated melting; prolonged or excessive
heating; incomplete mixing; charring or burning;
5.2 Principle
failure to compensate for dilution of ingredients by
inoculum; disturbance of the formula by the
Aqueous samples or pure cultures (normal, stressed
inoculum e.g. the addition of strong electrolytes or
or injured) or dilutions of these are spread plated,
sugar Solution, detergents, antiseptics, metallic poi-
pour plated or membrane filtered and the mem-
sons, Protein material, etc.
brane filters placed on the surface of two or more
types of agar medium plates to be compared using
The important Point about some of these errors is
a numerically significant number of colonies on
that the medium is often, visually, the Same as if it
replicated plates.
was properly prepared. Sometimes the error will be
continued for months until there is a realization that
For pure culture tests, the following three basic
either the medium is not as efficacious as it used to
procedures are used for spread plate, pour plate
be, or that the samples have become less contami-
and membrane filtration procedures.
nated. Only constant vigilante will decrease the oc-
currence of this type of Problem. The use of a pure
a) Cultures diluted to yield. countable ranges.
culture producing a typical reaction on the medium
(a positive control) is recommended.
b) Natura1 aquatic samples with low bacterial
populations to which a pure target organism cul-
ture is added to produce target organisms within
4.9 Shelf life
the normal counting range.
The useful life of a culture medium, once prepared,
c) Natura1 aquatic samples with high bacterial
depends on a number of factors and many media
populations to which a pure target organism cul-
may safely be stored in a refrigerator for several
ture is added to produce target organisms within
weeks before use, although it is desirable to use
the normal counting range, with or without di-
them on the day of preparation for the most critical
lution.
tasks. Liquid or solid media in screw-capped con-
tainers (to prevent evaporation) are more suitable
For natura1 aqueous samples for which “colony
for prolonged storage than media on plates or in
counts” are required, the following two basic for-
Containers plugged with cotton wool.
mats are used.
Prolonged of sterile media is not rec-
st0 rage
a) Direct spread of pour plating of up to 1,O ml of
been established.
ommended unl ess s tabil ity has
Sample or dilution of Sample using appropriate
All prepared media and packaged media which have procedures.
been opened should be dated for shelf Iife. The
Conte ntr ation of sam ple th rough a
manufacturer’s shelf life specifications should be mem brane
b)
filter a nd depositi on of the m
observed for unopened dehydrated media. embrane filter on an
3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
Immediately after establishing the target organism
appropriate agar medium to obtain organisms
density, use the appropriate volume required and
within count ing range.
immediately proceed with pure culture and/or mixed
culture tests.
5.3 Reagents and materials
6 Procedure
Suitable for comparing the media by either the
spread plate, pour plate, or membrane filtration
6.1 General
procedure. A nutrient non-specific agar may be in-
cluded in all tests to establish pure culture colony
The spread plate procedures described are based
counts. Recovery of target and non-target organisms
on the use of 0,5 ml of liquid inoculum and predried
on selective media should be compared with recov-
agar plates. Agar plates to be used for membrane
ery on non-selective media. Both specificity and
selectivity should be verified. filter counts are not dried but, to avoid confluent
growth, free water should not be present on the
surface of the agar.
5.4 Apparatus
To dry the plates for spread plate procedures, store
the freshly prepared Petri dishes plus covers upside
Suitable for performing spread plate, pour plate and
down in the dark (if the media are light sensitive) at
membrane filtration tests for target organism enu-
meration. Petri dishes for spread plating are ap- 30 OC to 35 OC for 15 h to 18 h.
proximately 100 mm. These may also be used for
membrane filter procedures. However, plates vary-
6.2 Spread plate procedure, pure stressed
ing from 50 mm to 60 mm in diameter may be more
culture
appropriate.
After preparing dilutions of pure stressed target
organism so that 0,5 ml contains 50 to 200
5.5 Sample preparation
organisms, plate out 0,5 ml of the diluted stressed
organism on each medium to be compared, in ran-
Collect fresh or salt water samples, either for
5.5.1
dom fashion, as well as on a non-selective nutrient
total count tests or to provide background flora for
medium. A total of five replicates should be made,
target organisms, and following routine laboratory
plus five on the non-selective nutrient medium.
procedures, use spread or pour plate or membrane
Enough dilutions should be plated to give an appro-
filter procedures for inoculation. Incubate the inocu-
priate colony number.
lated Petri dishes at an appropriate temperature
A bent glass rod with or without a bacteriological
during a suitable time. The water tan be stored at
2 “C to 4 “C. turntable should be used to distribute the inoculum
evenly over the predried agar surface.
After incubation, examine the Petri dishes and es-
Replace Petri dish covers and allow the plated
tablish the colony count. The water samples should
now be used immediately for total count tests or be Sample to be completely absorbed before inverting.
augmented with known volumes of target organism All plates should be incubated as soon as possible
for use in the media comparison studies. after the inoculum is absorbed at the required tem-
perature for the required time, these values being
based on the target organism used in the test.
5.5.2 Culture the target organism for the media
being compared in broth culture at an appropriate
6.3 Spread plate procedure, stressed target
stress the target
temperature. After incubation,
organism and Sample
organism by maintaining it at 2 OC to 4 “C for 24 h.
Other stressing or injuring procedures which have
Prepare dilutions so that 0,5 ml contain 400 to 500
been agreed upon may also be used.
organisms (Suspension
A) and 4000 to 5000
Spread plate, pour plate or membrane filter the
organisms (Suspension B).
stressed target organism and incubate on a non-
Add an appropriate volume of target organism cul-
selective nutrient medium at an appropriate tem-
ture to these dilutions so that 0,5 ml of augmented
perature during a suitable incubation period, which
may be longer than that required by non-stressed Sample also contains approximately 50 to 200
stressed target organisms.
organisms. Return the stressed organism culture to
the stressing condition, i.e. between 2 OC and 4 OC.
Plate out 0,5 ml of Suspension A or B on each me-
Count both the target and non-target organism col- dium to be compared, in random fashion, as well as
plating the appropriate target organism dilution (to
onies, immediately following incubation, then estab-
achieve 50 to 200 target organism colonies) on non-
lish the appropriate dilution for either pure culture
selective nutrient media to establish baseline
comparison studies or for addition to water samples.
4
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
concentration of the stressed target organism to
counts. A total of five replicates of each medium are
yield 50 to 200 organisms per millilitre. Place the
compared, plus five on the non-selective medium.
membranes on non-selective nutrient media.
Enough dilutions should be plated to give an appro-
priate colony number.
At least five replicates of each medium are com-
pared.
Refer to the second and third Paragraphs of 6.2 for
the completion of this procedure.
Refer to the last paraqraph of 6.5 for the last step of
this procedure. c
6.4 Pour plate procedure
6.7 Spread plate procedure, Sample
colony
The pour plate procedure, using pure stressed cul-
count
ture with or without Sample, tan be applied
analogically to the spread plate procedure (6.2 and
Randomly plate out 0,5 ml of Sample or Sample di-
6.3). In this technique the plates are not predried
lution, which hypothetically contain 50 to 200
and the volume of Sample and its dilutions to be
organisms per ml capable of growing on the non-
plated is normally 1,0 ml.
selective control medium, on each of the predried
media to be compared. Compare five replicates of
each medium.
6.5 Membrane filter procedure, stressed
target organism
Refer to the second and third Paragraphs of 6.2 for
the completion of this procedure.
After preparing dilutions of pure stressed target
organisms so that 1,O ml added to 30 ml of diluent
and membrane filter contains approximately 50 to
6.8 Pour plate procedure, Sample colony
200 target organism colony forming units, use stan-
count
dard membrane filtration procedures and a Standard
membrane filter and distribute the inoculated mem-
The pour plate procedure tan be applied to evaluate
branes at random on the media being compared, as
the background growth analogically to the spread
well as on a non-selective nutrient medium for
plate procedure (see 6.4 and 6.7).
background levels. lt is also recommended that
0,5 ml of stressed target organism dilution (25 to 100
colonies) be spread plated on a non-selective nutri-
6.9 Membrane filter procedure, Sample
ent medium to evaluate membrane stress. A total
colony count
of at least five replicates of each medium are com-
pared. Filter enough dilutions to give an appropriate
After verifying that the volume of Sample or Sample
colony number.
dilution produces 50 to 200 colonies on a membrane
filter incubated on non-selective nutrient media, use
Immediately after all samples are processed, invert
this volume combined with up to 30 ml of diluent to
the Petri dishes and incubate at appropriate tem-
test the media beinq compared. The total volume
peratures for an appropriate time.
tested should not be‘less than IO ml.
Filter a sufficient number of samples and randomly
6.6 Membrane filter procedure, stressed
place the membranes on Chosen test media.
target organism and Sample
If a Sample requires dilution, spread plate 0,5 ml of
an appropriate Sample dilution to produce 50 to 200
Prepare concentrations of water Sample or dilutions
colonies on the agar plates used in the comparison
of water Sample so that 1,O ml contains 400 to 500
study. The samples should be placed on randomly
organisms (A) and 4000 to 5000 organisms (B).
selected agars and included within the membrane
Add appropriate volumes of target organism culture filtration series.
to these concentrations or dilutions (A or B), so that
Refer to 6.5 for the completion of this procedure.
1,O ml of water Sample also contains approximately
50 to 200 stressed target organisms.
Add 1,0 ml of a mixture of water and sample-
7 Expression of results
stressed organism to 30 ml of diluent and follow
routine membrane filtration procedures to process
7.1 After appropriate incubation periods, using a
the Sample. Repeat the procedure as frequently as
required, randomly distributing the membrane filter stereoscopic microscope (x 10) or other counting
on the media to be compared. As an integral patt aid, count and record the number of typical and
atypical colonies growing on each medium and each
of this procedure and as part of the random distri-
control medium.
bution Pattern, filter the appropriate volume and
5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
ante, as described in annex A. In the two-way
7.2 Tabulate the counts of typical colonies and
analysis, the significance of the interaction will de-
consult annex A for the appropriate statistical
termine how the analysis is to be continued for the
methods. The counts of atypical colonies give an in-
testing of differentes between media (see
dication of the selectivity of media.
annex A).
7.3 Convert the counts into logarithms (add 1 or 0,5
7.7 If the Ftest is significant in the one-way
to all values before conversion, if Zero is observed).
analysis of variance, a more detailed analysis
should be carried out.
7.4 Calculate the mean and the Standard deviation
for each medium.
7.8 If the decision was made a priori to test all new
media against a reference medium, this tan be done
7.5 If the Standard deviations are approximately
by a t-test for paired comparisons or by forming the
the Same (less than a four-fold differente) then the
appropriate contrasts in the analysis of variance.
experiment is under control. Different Standard de-
viations tan be the result of differentes between
7.9 If it were only planned to test if there are dif-
media.
ferences between media, then an a posteriori
Student-Newman-Keuls test should be done to study
7.6 If only one Sample is analysed, perform one-
the differentes in detail.
way analysis of variance for comparing the differ-
ences between media means, and if more samples
are analysed, perform a two-way analysis of vari-
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
Annex A
(normative)
Statistical designs in method comparisons
A.l General
Assume that a selection is to be made between rn different culture media for the enumeration of a certain
bacterial group or species. Basically the statistical design is the Same for other comparisons, such as choices
between plating techniques, incubation conditions, dilution solutions, membrane filter types, etc. Therefore, in
the following, the nz alternatives will simply be referred to as different “methods”.
assumed that the yield, i.e. the count of typical colonies, is the sole basis of evaluation and compari-
It w ill be
son of th e methods.
A.2 Analysis of one Sample
In the simplest instance, when a method is to be selected for the colony count of a pure culture, a simple design
is sufficient. lt is sufficient to make only k replicate plates in random Order using rn different methods. The m
methods tan be compared using a one-way analysis of variance (ANOVA) on the 172 x k counts. The calcu-
lations are illustrated in A.4.1 and A.4.2.
In practice, it is highly unlikely that an acceptable count tan always be secured from all k plates of the m
methods. Some values will be missing for one reason or another. The statistical design becomes an ANOVA
with unequal numbers of replicates in the different methods (see A.4.3). The value of k should always be at
least 2.
With pure cultures as test material, a one-time test may be assunied to apply generally; the result tan be ex-
pected to hold for other strains of the Same species.
A.3 Analysis of two or more samples
When selecting a method for the quantitative determination of a bacterial group from a mixture of species or
from a natura1 Sample, the Situation is more complex. One cannot generalize about the result of a Single
comparison without risk. There is no a priori reason why the Same method should be the best for all types of
natura1 samples. The statistical design must at least be able to test whether this is the case. This tan be done
by applying a two-way ANOVA on the data of 171 methods with k replicates tested independently in .r different
natura1 samples. The most important component to test is the samples times methods (S x M) interaction.
When statistically significant, it indicates significant differentes in yield using different methods depending on
the Sample type. The mathematical analysis of such a design is iltustrated in A.5. The number of replicates, k,
the experiments are independent; each
need not be very large; two or three is quite enough. Fur-thermore,
different Sample tan be tested on a different date if necessary.
This annex does not cover means of dealing with missing values in the two-way analysis of variance. If by ac-
cident a count cannot be made, it is best to discard the whole set of data from that particular Sample. The data
tan be replaced by testing the Sample again on another occasion or by studying another Sample.
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 9998:1991 (E)
A.4 One-way analysis of variance
A.4.1 Design 1: Comparison of the productivity of UZ methods when there are k replicates for each
A.4.1.1 Arrange the colony counts C, in a 771 x k table (tableA.1).
Table A.1
Method
Replicate
1 2 3 . . . fl1
1 c,g .*. C
Cl1 Cl2 Im
2 c
C21 C22 c23 -** '2m
.
. . . .
.
k
A.4.1.2 Transform the data given in table A-1 into logarithms and obtain sums of replicates. (See table A.2.)
The data actually tested statistically are thus the values X, = log C,.
Table A.2
Method
Replicate
1 2 3 .s 131
1 x,g . . . X
Xll XI2 1Pl
1-
2 x23 . . . X
X21 X22 2m
.
. . . .
. . .
. .
. . . . .
k
Xkj X,2 xhj *** ‘km
X.
Totals x.3 . . . X
‘m
x-1 X-2
A.4.1.3 Prepare an analysis of variance (ANOVA) table (table A.3).
Table A.3
7
Degrees of
Mean Square Value of test statistic
Sum of squares
freedom
Source of Variation
DF SS MS F
m(k - 1)
n
fl
Between medi a m-l n
(m - 1)
(nt-l)X C
C
m(k - 1) c
Within replicates
nt(k - 1)
-PI
mk - 1 n
Total
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 9998:1991(E)
Calculate the sum of squares between media, n, usinq the equation
.
x2., + x2., + . . . + x2.,
-
-
- CT
A
k
where
k is the number of replicates;
m is the number of media;
is the sum of column 1 in table A.2;
x-1
is the sum of column 2 in table A.2;
x-2
X
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 9998:1998
01-maj-1998
.DNRYRVWYRGH1DþLQLYUHGQRWHQMDLQNRQWUROHPLNURELRORãNLKJRMLãþ]DãWHWMH
NRORQLMSULSUHVNXVLKNDNRYRVWLYRGH
Water quality -- Practices for evaluating and controlling microbiological colony count
media used in water quality tests
Qualité de l'eau -- Techniques d'évaluation et de contrôle des milieux microbiologiques
servant au comptage des colonies pour les essais d'évaluation de la qualité de l'eau
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 9998:1991
ICS:
07.100.20 Mikrobiologija vode Microbiology of water
SIST ISO 9998:1998 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
---------------------- Page: 1 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
---------------------- Page: 2 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
INTERNATIONAL
STANDARD
First edition
1991-11-01
._------. .---.--_ .--. - ---_- -- I----- -----.--v---v
Water quality - Practices for evaluating and
controlling microbiological colony count media
used in water quality tests
Qualite de I’eau
- Techniques d’&aluation et de controle des milieux
microbiologiques set-vant au camptage des colonies pour les essais
d%valuation de la qualite de I’eau
Reference number
ISO 9998:1991(E)
---------------------- Page: 3 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a wot-ldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to bc
represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the
work. ISO collaborates closely with the International Electrotcchnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committces are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an Inter-
national Standard requires approval by at least 75 % of the member
bodies casting a vote.
International Standard ISO 9998 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 147, Water quality.
Annexes A and B form an integral part of this International Standard.
Annex C is for information only.
0 ISO 1991
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced or utilized in any form
or by any means, eiectronic or mechanical, including photocopylng and microfilm, without
Permission in writing from the publisher.
Intern ational Organizati on for Standardiz ation
Case Postale 56 l CH-1 21 1 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
---------------------- Page: 4 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991(E)
Introduction
The development of micro-organisms upon culture media is dependent
upon a number of very important factors.
a) The proper nutrients must be available.
b) Oxygen or other gases must be available.
c) A certain degree of moisture is necessary.
d) The medium must be of the proper pH reaction.
e) Proper temperatures must be maintained.
f) The medium musf be sterile and maintained free of contamination
after inoculation.
g) Media must be able to be reproduced consistently with minimum
variations.
h) Care should be taken to avoid plates which are too crowded.
To ensure the reproducibility of microbiological results and to enable
inter-laboratoty comparison studies to be made, the preparation of
microbiological media must be strictly regulated. Guidelines for ensur-
ing the proper preparation of media which tan be used with similar
growth expectations from laboratory to laboratory are presented below.
---------------------- Page: 5 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
This page intentionally left bJank
---------------------- Page: 6 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991(E)
INTERNATIONAL STANDARD
- Practices for evaluating and controlling
Water quality
microbiological colony count media used in water quality tests
Inoculation tan be either a quantitative method or
1 Scope
simple plate-spreading by wire loop and seeding of
liquid media by pipette. Alternatively, a series of
This International Standard covers the comparison
natura1 aquatic samples with high bacterial popu-
and evaluation of the Same medium prepared from
lations may be used. This type of screening is closer
different lots of materials.
to reality, but has the disadvantage that the most
demanding organisms may not be present in the
lt also covers the comparison and evaluation of dif-
water Sample used.
ferent media which are used for the Same purpose.
lt only deals with the finished product ready to be
3.2 Examples of statistical analyses are given in
tested, and not media formulation or preparation.
annex A.
This method applies to the evaluation of any solid
media intended for bacteriological isolation and
4 Media preparation and tests
enumeration procedures.
4.1 Application
2 Normative reference
The following tests and procedures tan be applied
The following Standard contains provisions which, to each lot of medium prepared from either a com-
through reference in this text, constitute provisions mercial Source or in a laboratory using primary in-
of this International Standard. At the time of publi-
gredients (see also ISO 8199).
cation, the edition indicated was valid. All Standards
are subject to revision, and Parties to agreements
4.2 Measurement of pH-value
based on this International Standard are encour-
aged to investigate the possibility of applying the
Prepare the medium, sterilize as directed and
most recent edition of the Standard indicated below.
measure the pH using an electronie pH-meter. The
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
pH of most media should be within +0,2 of a unit of
rently valid International Standards.
the target value at 25 OC. Check the-pH of the steril-
ized media, in the case of solid media after
ISO 8199:1988, Wafer quality - General guide to the
solidification.
enumeration of micro-organisms by culture.
The pH or reaction of the culture medium, express-
ing its hydrogen ion concentration, is very important
3 Productivitykelectivity testing
for the qrowth of micro-organisms. Most micro-
organisms prefer media which are approximately
3.1 The general procedure is to inoculate appro-
neutral, although some may require media which
priate organisms onto the media under evaluation
are distinctly acid.
and to compare their Performance, when trying
Drift in pH or other pH Problems may be caused by
a) to choose between various manufacturer’s me-
-
superheating;
dia;
-
b) to select the most appropriate medium; or incomplete mixing;
-
c) to assess batch-to-batch Variation. excessive sterilization;
1
---------------------- Page: 7 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
-
use of alkaline glass; ommended. Water which does not meet the re-
quirements of glass-distilled water may contain
-
contaminated Containers; compounds which interfere with the Performance of
the media.
-
impure distilled water;
Although the pH measurement of purified water is
characterized by drift, extreme readings are indica-
- repeated melti or prolong ed storage, es-
w
tive of Chemical contamination.
pecially at high tem ratures;
Pe
- hydrolysis of ingredients.
4.5 Glassware
4.3 Gel strength Clean glassware is critical in the preparation of
media. Traces of detergent or chemicals tan greatly
influence medium composition and growth charac-
For agar medium, a predried plate tan be checked
with a wire loop. Drying methods are described in teristics. Because some cleaning solutions are diffi-
clause 6. cult to remove completely, spot checking of clean
glassware for pH reaction (especially if soaked in
Improper gel strength may be due to one of the fol-
alkali or acid) should be carried out.
lowing:
Certain wetting agents or detergents used in wash-
-
agar not in Solution; ing glassware may contain bacteriostatic or inhibit-
ing substances requiring 6 to 12 successive rinsings
-
with Ultra-pure water, to remove all traces and en-
incomplete mixing;
Sure freedom from residual bacteriostatic action.
- inc0 rrect ions of dehydrated medium to
Pro Port
The procedure for testing these compounds, which
volu me of wa ter;
is taken from [Al, is described in annex B.
-
pH drift due to acid hydrolysis (“acid” agars e.g.
malt extract agar, will hydrolyze on prolonged
heating or if repeatedly melted);
4.6 Appearance
-
failure to compensate for dilution of agar by the
The colour and clarity of a prepared medium should
inoculum.
be typical for the product. Some obvious media
preparation errors are a darkening of the medium
An agar with excess gel strength may inhibit the
and the appearance of a precipitate. Superheating
formation of typical colonies and the usual effect is
due to incomplete mixing tan also Cause a darken-
a high-domed colony, which is usually smaller than
ing of the medium.
normal. The inhibitory effect of a dry agar surface
may be even stronger on membranes.
Incomplete solubility of the powdered medium may
be noted. This may be due to inadequate soaking,
inadequate heating, incomplete mixing, use of tap
4.4 Water water or of a Container too small to allow adequate
convection.
The water used to prepare media is very important
Agar media are apt to show a precipitate as a result
and could be one of the major Causes for incompar-
of prolonged sterilization or heating. Repeated
ability between media prepared in different labora-
melting of solidified agar or maintenance of melted
tories or even within the Same laboratory. Tap water
agar at a high temperature may Iikewise Cause a
should never be used in the preparation of media
precipitate to form in the media. Media containing
as it will contain a variety of substances, varying
agar may also form flocculant precipitates if the liq-
from day to day, which may Cause growth stimu-
uid medium remains in the water bath at 43 OC to
lation or inhibition when used in medium prep-
45 OC for longer than 30 min. The flocculant agar
aration.
precipitate, however, may be dispersed by reheating
the medium. Such media may also undergo nu-
Glass-distilled water is recommended for medium
For critical growth studies, double tritional impairment if held in the molten state for too
preparation.
long.
glass-distilled or ultra-pure’) water are rec-
1) Water that tan be obtained by using a device similar to a 4 cartridge Milli-Q System with membrane filtration of the final
product.
The Milli-Q able sy stem available commercially. This infor mation is given for the convenience
System is an example of a suit
nt by of this
of users of this International Standard an d does not constitute an endorseme ISO System.
2
---------------------- Page: 8 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
4.7 Chemicals
5 Statistical analyses
To ensure compatibiiity of media, reagents and sol-
utions and reproducibility of test results, it is rec- 5.1 General
ommended to use the purest grade chemicals in
their preparation. For instance, it is weil docu- Microbiologists are constantly seeking the medium
mented that some brands of potassium dihydrogen which is the most suitable for selectively isolating
Phosphate, KH,PO, contain Iarge amounts of im- and enumerating a target organism or population of
organisms from a specific specimen or Sample. The
purities, any one of which tan have an inhibitory or
growth stimulating effect on bacteria. The grade of literature on this subject is very comprehensive,
with many authors recommending a wide variety of
Chemical used should be carefully documented so
that later formulations will be consistent with the media as being best under the test conditions im-
original. posed. lnvariably, in these comparative studies and
recommendations, the media recommended tend to
The proper dissolution of chemicals and mixing of
have a regional following, which makes water qual-
solutions, media and reagents are important factors
ity comparison studies difficult, as noted in [2].
in ensuring homogeneity and compatibility from one
batch to the next within and between laboratories. Thus, for national and international water quality
comparison purposes, it is very important that one
of the basic tools of water microbiology, the media,
4.8 Changes in bacterial recovery or
be standardized as much as possible, not only to
differentiating characteristics
provide consistent results, but also to enable the
development of standardized procedures for enu-
There are many reasons for a medium to suddenly
merating specific micro-organisms.
be less efficacious than it once was. These reasons
include: repeated melting; prolonged or excessive
heating; incomplete mixing; charring or burning;
5.2 Principle
failure to compensate for dilution of ingredients by
inoculum; disturbance of the formula by the
Aqueous samples or pure cultures (normal, stressed
inoculum e.g. the addition of strong electrolytes or
or injured) or dilutions of these are spread plated,
sugar Solution, detergents, antiseptics, metallic poi-
pour plated or membrane filtered and the mem-
sons, Protein material, etc.
brane filters placed on the surface of two or more
types of agar medium plates to be compared using
The important Point about some of these errors is
a numerically significant number of colonies on
that the medium is often, visually, the Same as if it
replicated plates.
was properly prepared. Sometimes the error will be
continued for months until there is a realization that
For pure culture tests, the following three basic
either the medium is not as efficacious as it used to
procedures are used for spread plate, pour plate
be, or that the samples have become less contami-
and membrane filtration procedures.
nated. Only constant vigilante will decrease the oc-
currence of this type of Problem. The use of a pure
a) Cultures diluted to yield. countable ranges.
culture producing a typical reaction on the medium
(a positive control) is recommended.
b) Natura1 aquatic samples with low bacterial
populations to which a pure target organism cul-
ture is added to produce target organisms within
4.9 Shelf life
the normal counting range.
The useful life of a culture medium, once prepared,
c) Natura1 aquatic samples with high bacterial
depends on a number of factors and many media
populations to which a pure target organism cul-
may safely be stored in a refrigerator for several
ture is added to produce target organisms within
weeks before use, although it is desirable to use
the normal counting range, with or without di-
them on the day of preparation for the most critical
lution.
tasks. Liquid or solid media in screw-capped con-
tainers (to prevent evaporation) are more suitable
For natura1 aqueous samples for which “colony
for prolonged storage than media on plates or in
counts” are required, the following two basic for-
Containers plugged with cotton wool.
mats are used.
Prolonged of sterile media is not rec-
st0 rage
a) Direct spread of pour plating of up to 1,O ml of
been established.
ommended unl ess s tabil ity has
Sample or dilution of Sample using appropriate
All prepared media and packaged media which have procedures.
been opened should be dated for shelf Iife. The
Conte ntr ation of sam ple th rough a
manufacturer’s shelf life specifications should be mem brane
b)
filter a nd depositi on of the m
observed for unopened dehydrated media. embrane filter on an
3
---------------------- Page: 9 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
Immediately after establishing the target organism
appropriate agar medium to obtain organisms
density, use the appropriate volume required and
within count ing range.
immediately proceed with pure culture and/or mixed
culture tests.
5.3 Reagents and materials
6 Procedure
Suitable for comparing the media by either the
spread plate, pour plate, or membrane filtration
6.1 General
procedure. A nutrient non-specific agar may be in-
cluded in all tests to establish pure culture colony
The spread plate procedures described are based
counts. Recovery of target and non-target organisms
on the use of 0,5 ml of liquid inoculum and predried
on selective media should be compared with recov-
agar plates. Agar plates to be used for membrane
ery on non-selective media. Both specificity and
selectivity should be verified. filter counts are not dried but, to avoid confluent
growth, free water should not be present on the
surface of the agar.
5.4 Apparatus
To dry the plates for spread plate procedures, store
the freshly prepared Petri dishes plus covers upside
Suitable for performing spread plate, pour plate and
down in the dark (if the media are light sensitive) at
membrane filtration tests for target organism enu-
meration. Petri dishes for spread plating are ap- 30 OC to 35 OC for 15 h to 18 h.
proximately 100 mm. These may also be used for
membrane filter procedures. However, plates vary-
6.2 Spread plate procedure, pure stressed
ing from 50 mm to 60 mm in diameter may be more
culture
appropriate.
After preparing dilutions of pure stressed target
organism so that 0,5 ml contains 50 to 200
5.5 Sample preparation
organisms, plate out 0,5 ml of the diluted stressed
organism on each medium to be compared, in ran-
Collect fresh or salt water samples, either for
5.5.1
dom fashion, as well as on a non-selective nutrient
total count tests or to provide background flora for
medium. A total of five replicates should be made,
target organisms, and following routine laboratory
plus five on the non-selective nutrient medium.
procedures, use spread or pour plate or membrane
Enough dilutions should be plated to give an appro-
filter procedures for inoculation. Incubate the inocu-
priate colony number.
lated Petri dishes at an appropriate temperature
A bent glass rod with or without a bacteriological
during a suitable time. The water tan be stored at
2 “C to 4 “C. turntable should be used to distribute the inoculum
evenly over the predried agar surface.
After incubation, examine the Petri dishes and es-
Replace Petri dish covers and allow the plated
tablish the colony count. The water samples should
now be used immediately for total count tests or be Sample to be completely absorbed before inverting.
augmented with known volumes of target organism All plates should be incubated as soon as possible
for use in the media comparison studies. after the inoculum is absorbed at the required tem-
perature for the required time, these values being
based on the target organism used in the test.
5.5.2 Culture the target organism for the media
being compared in broth culture at an appropriate
6.3 Spread plate procedure, stressed target
stress the target
temperature. After incubation,
organism and Sample
organism by maintaining it at 2 OC to 4 “C for 24 h.
Other stressing or injuring procedures which have
Prepare dilutions so that 0,5 ml contain 400 to 500
been agreed upon may also be used.
organisms (Suspension
A) and 4000 to 5000
Spread plate, pour plate or membrane filter the
organisms (Suspension B).
stressed target organism and incubate on a non-
Add an appropriate volume of target organism cul-
selective nutrient medium at an appropriate tem-
ture to these dilutions so that 0,5 ml of augmented
perature during a suitable incubation period, which
may be longer than that required by non-stressed Sample also contains approximately 50 to 200
stressed target organisms.
organisms. Return the stressed organism culture to
the stressing condition, i.e. between 2 OC and 4 OC.
Plate out 0,5 ml of Suspension A or B on each me-
Count both the target and non-target organism col- dium to be compared, in random fashion, as well as
plating the appropriate target organism dilution (to
onies, immediately following incubation, then estab-
achieve 50 to 200 target organism colonies) on non-
lish the appropriate dilution for either pure culture
selective nutrient media to establish baseline
comparison studies or for addition to water samples.
4
---------------------- Page: 10 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
concentration of the stressed target organism to
counts. A total of five replicates of each medium are
yield 50 to 200 organisms per millilitre. Place the
compared, plus five on the non-selective medium.
membranes on non-selective nutrient media.
Enough dilutions should be plated to give an appro-
priate colony number.
At least five replicates of each medium are com-
pared.
Refer to the second and third Paragraphs of 6.2 for
the completion of this procedure.
Refer to the last paraqraph of 6.5 for the last step of
this procedure. c
6.4 Pour plate procedure
6.7 Spread plate procedure, Sample
colony
The pour plate procedure, using pure stressed cul-
count
ture with or without Sample, tan be applied
analogically to the spread plate procedure (6.2 and
Randomly plate out 0,5 ml of Sample or Sample di-
6.3). In this technique the plates are not predried
lution, which hypothetically contain 50 to 200
and the volume of Sample and its dilutions to be
organisms per ml capable of growing on the non-
plated is normally 1,0 ml.
selective control medium, on each of the predried
media to be compared. Compare five replicates of
each medium.
6.5 Membrane filter procedure, stressed
target organism
Refer to the second and third Paragraphs of 6.2 for
the completion of this procedure.
After preparing dilutions of pure stressed target
organisms so that 1,O ml added to 30 ml of diluent
and membrane filter contains approximately 50 to
6.8 Pour plate procedure, Sample colony
200 target organism colony forming units, use stan-
count
dard membrane filtration procedures and a Standard
membrane filter and distribute the inoculated mem-
The pour plate procedure tan be applied to evaluate
branes at random on the media being compared, as
the background growth analogically to the spread
well as on a non-selective nutrient medium for
plate procedure (see 6.4 and 6.7).
background levels. lt is also recommended that
0,5 ml of stressed target organism dilution (25 to 100
colonies) be spread plated on a non-selective nutri-
6.9 Membrane filter procedure, Sample
ent medium to evaluate membrane stress. A total
colony count
of at least five replicates of each medium are com-
pared. Filter enough dilutions to give an appropriate
After verifying that the volume of Sample or Sample
colony number.
dilution produces 50 to 200 colonies on a membrane
filter incubated on non-selective nutrient media, use
Immediately after all samples are processed, invert
this volume combined with up to 30 ml of diluent to
the Petri dishes and incubate at appropriate tem-
test the media beinq compared. The total volume
peratures for an appropriate time.
tested should not be‘less than IO ml.
Filter a sufficient number of samples and randomly
6.6 Membrane filter procedure, stressed
place the membranes on Chosen test media.
target organism and Sample
If a Sample requires dilution, spread plate 0,5 ml of
an appropriate Sample dilution to produce 50 to 200
Prepare concentrations of water Sample or dilutions
colonies on the agar plates used in the comparison
of water Sample so that 1,O ml contains 400 to 500
study. The samples should be placed on randomly
organisms (A) and 4000 to 5000 organisms (B).
selected agars and included within the membrane
Add appropriate volumes of target organism culture filtration series.
to these concentrations or dilutions (A or B), so that
Refer to 6.5 for the completion of this procedure.
1,O ml of water Sample also contains approximately
50 to 200 stressed target organisms.
Add 1,0 ml of a mixture of water and sample-
7 Expression of results
stressed organism to 30 ml of diluent and follow
routine membrane filtration procedures to process
7.1 After appropriate incubation periods, using a
the Sample. Repeat the procedure as frequently as
required, randomly distributing the membrane filter stereoscopic microscope (x 10) or other counting
on the media to be compared. As an integral patt aid, count and record the number of typical and
atypical colonies growing on each medium and each
of this procedure and as part of the random distri-
control medium.
bution Pattern, filter the appropriate volume and
5
---------------------- Page: 11 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
ante, as described in annex A. In the two-way
7.2 Tabulate the counts of typical colonies and
analysis, the significance of the interaction will de-
consult annex A for the appropriate statistical
termine how the analysis is to be continued for the
methods. The counts of atypical colonies give an in-
testing of differentes between media (see
dication of the selectivity of media.
annex A).
7.3 Convert the counts into logarithms (add 1 or 0,5
7.7 If the Ftest is significant in the one-way
to all values before conversion, if Zero is observed).
analysis of variance, a more detailed analysis
should be carried out.
7.4 Calculate the mean and the Standard deviation
for each medium.
7.8 If the decision was made a priori to test all new
media against a reference medium, this tan be done
7.5 If the Standard deviations are approximately
by a t-test for paired comparisons or by forming the
the Same (less than a four-fold differente) then the
appropriate contrasts in the analysis of variance.
experiment is under control. Different Standard de-
viations tan be the result of differentes between
7.9 If it were only planned to test if there are dif-
media.
ferences between media, then an a posteriori
Student-Newman-Keuls test should be done to study
7.6 If only one Sample is analysed, perform one-
the differentes in detail.
way analysis of variance for comparing the differ-
ences between media means, and if more samples
are analysed, perform a two-way analysis of vari-
---------------------- Page: 12 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
Annex A
(normative)
Statistical designs in method comparisons
A.l General
Assume that a selection is to be made between rn different culture media for the enumeration of a certain
bacterial group or species. Basically the statistical design is the Same for other comparisons, such as choices
between plating techniques, incubation conditions, dilution solutions, membrane filter types, etc. Therefore, in
the following, the nz alternatives will simply be referred to as different “methods”.
assumed that the yield, i.e. the count of typical colonies, is the sole basis of evaluation and compari-
It w ill be
son of th e methods.
A.2 Analysis of one Sample
In the simplest instance, when a method is to be selected for the colony count of a pure culture, a simple design
is sufficient. lt is sufficient to make only k replicate plates in random Order using rn different methods. The m
methods tan be compared using a one-way analysis of variance (ANOVA) on the 172 x k counts. The calcu-
lations are illustrated in A.4.1 and A.4.2.
In practice, it is highly unlikely that an acceptable count tan always be secured from all k plates of the m
methods. Some values will be missing for one reason or another. The statistical design becomes an ANOVA
with unequal numbers of replicates in the different methods (see A.4.3). The value of k should always be at
least 2.
With pure cultures as test material, a one-time test may be assunied to apply generally; the result tan be ex-
pected to hold for other strains of the Same species.
A.3 Analysis of two or more samples
When selecting a method for the quantitative determination of a bacterial group from a mixture of species or
from a natura1 Sample, the Situation is more complex. One cannot generalize about the result of a Single
comparison without risk. There is no a priori reason why the Same method should be the best for all types of
natura1 samples. The statistical design must at least be able to test whether this is the case. This tan be done
by applying a two-way ANOVA on the data of 171 methods with k replicates tested independently in .r different
natura1 samples. The most important component to test is the samples times methods (S x M) interaction.
When statistically significant, it indicates significant differentes in yield using different methods depending on
the Sample type. The mathematical analysis of such a design is iltustrated in A.5. The number of replicates, k,
the experiments are independent; each
need not be very large; two or three is quite enough. Fur-thermore,
different Sample tan be tested on a different date if necessary.
This annex does not cover means of dealing with missing values in the two-way analysis of variance. If by ac-
cident a count cannot be made, it is best to discard the whole set of data from that particular Sample. The data
tan be replaced by testing the Sample again on another occasion or by studying another Sample.
---------------------- Page: 13 ----------------------
SIST ISO 9998:1998
ISO 9998:1991 (E)
A.4 One-way analysis of variance
A.4.1 Design 1: Comparison of the productivity of UZ methods when there are k replicates for each
A.4.1.1 Arrange the colony counts C, in a 771 x k table (tableA.1).
Table A.1
Method
Replicate
1 2 3 . . . fl1
1 c,g .*. C
Cl1 Cl2 I
...
ISO
NORME
INTERNATIONALE 9998
Première édition
1991-l l-01
Ib---- .----_-_ -.-.- --.-.---.---
Qualité de l’eau - Techniques d’évaluation et
de contrôle des milieux microbiologiques
servant au comptage des colonies pour les
essais d’évaluation de la qualité de l’eau
Water qualify - Praclices /or evaluating and controlling microbiological
colony Count media used in water quality tests
----.-e-p .-----.------.---_-._-_-_-_----
--
-_._._ -. .- ---
-- - .- .--
Numéro de référence
_ . . .-_.
- ---- ~ ----- - ISO 9998:1991(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
Avant-propos
L’lSO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9998 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 147, Qualité de l’eau.
L es annex es A et B font partie in tégrante de la présente Norme inter-
n ationale. L’a nnexe C es t donnée uniquement à titre d’information
0 ISO 1991
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
Introduction
des m icro-organis mes sur milieu de culture
Le dévelop pement dépend
de plusieur ‘s facteu rs très importants, à savoir
a) les substances nutritives adéquates doivent être disponibles;
b) l’oxygène ou d’autres gaz doivent être disponibles;
c) un certain degré d’humidité est nécessaire;
d) le milieu doit être au pH de réaction adéquat;
e) les températures adéquates doivent htre maintenues;
stérile et maintenu exempt de contamination après
f) le milieu doit être
ensemencement:
q) le milieu doit pouvoir être reproduit avec une variabitité minimale;
.
h) il convient d’éviter le surpeuplement des boites.
Pour assurer la reproductibilité des résultats microbiologiques et per-
mettre la réalisation d’études comparatives interlaboratoires, il faut
suivre des règles strictes pour la préparation des milieux microbiologi-
ques. Des directives visant à assurer la préparation adéquate de milieux
pouvant être employés avec des espérances de croissance similaires
dans différents laboratoires sont présentées ci-après.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
NORME INTERNATIONALE
Qualité de l’eau - Techniques d’évaluation et de contrôle des
milieux microbiologiques servant au comptage des colonies
pour les essais d’évaluation de la qualité de l’eau
a) effectuer un choix entre plusieurs milieux propo-
1 Domaine d’application
sés par différents fabricants, ou
La présente Norme internationale traite de la com-
b) sélectionner le milieu le mieux approprié, ou
paraison et de l’évaluation du même milieu préparé
à partir de constituants provenant de lots différents.
c) évaluer la variabilité interlots.
Elle traite également de la comparaison et de I’éva-
L’ensemencement peut être réalisé soit par une
luation de milieux différents utilisés pour un objectif
méthode quantitative, soit par simple étalement sur
identique.
boîte à l’aide d’une anse bouclée ou, pour les mi-
Elle ne traite ni de la formulation ni de la prépa- lieux liquides, introduction des germes à la pipette.
ration des milieux, mais seulement du produit fini II est également possible d’utiliser une série
prêt à l’emploi. d’échantillons d’eau naturelle à forte population
bactérienne. Ce mode de sélection est plus proche
La présente méthode est applicable à l’évaluation
de la réalité, mais présente un inconvénient: les or-
de tout milieu solide destiné à l’isolement et au dé-
ganismes les plus exigeants peuvent ne pas être
nombrement de colonies bactériennes.
présents dans l’échantillon d’eau employé.
2 Référence normative
3.2 Des exemples d’analyses statist ques sont
La norme suivante contient des dispositions qui, par
présentés dans l’annexe A.
suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme inter-
nationale. Au moment de la publication, l’édition in-
diquée était en vigueur. Toute norme est sujette à 4 Préparation et contrôle des mi ieux
révision et les parties prenantes des accords fondés
sur la présente Norme internationale sont invitées
à rechercher la possibilité d’appliquer l’édition la
4.1 Application
plus récente de la norme indiquée ci-après. Les
membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre
Les contrôles et modes opératoires suivants peu-
des Normes internationales en vigueur a un moment
vent être appliqués à chaque lot de milieu fourni par
donné.
un fabricant ou préparé en laboratoire à partir des
constituants de base (voir également I’ISO 8199).
ISO 8199:1988, Qualité de l’eau - Guide général pour
le dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture.
4.2 Mesure du pH
3 Essais de productivitélde sélectivité
Préparer le milieu, le stériliser comme spécifié et
,
mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre électronique.
Pour la plupart des milieux, il convient d’ajuster le
3.1 La méthode générale à suivre consiste à en-
semencer les milieux de culture à évaluer avec des pH à la valeur cible à 25 OC, +0,2 unités. Vérifier le
pH du milieu stérilisé, après-solidification dans le
organismes et à comparer leurs performances,
cas des milieux solides.
lorsqu’on veut
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
Le pH de réaction du milieu de culture, qui exprime Un milieu gélosé presentant une résistance exces-
sa concentration en ions hydrogène, est un facteur sive peut inhiber la formation de colonies typiques,
très important de la croissance des micro- ce qui entraîne généralement le développement de
colonies bombées, souvent plus petites que la nor-
organismes. La plupart des micro-organismes pré-
fèrent des milieux de pH à peu près neutre, mais male. L’effet inhibiteur de la sécheresse de surface
certains exigent un milieu nettement acide. du milieu gélosé peut être encore plus marqué pour
les cultures sur membrane.
La dérive problèm
ai nsi qu e d’autres es rela-
du PH,
tifs au pH, peuve nt avoir di fférentes causes:
4.4 Eau
-
surchauffe;
La nature de l’eau utilisée pour préparer les milieux
est un facteur très important et peut constituer l’une
-
homogénéisation insuffisante;
des principales causes de non-comparabilité de mi-
lieux préparés dans des laboratoires différents ou
-
stérilisation trop poussée;
même dans le même laboratoire. Il est fortement
déconseillé d’utiliser l’eau du robinet pour préparer
-
utilisation de verre alcalin;
les milieux, car elle contient diverses substances,
variables d’un jour sur l’autre, dont la présence
- contamination des récipients;
dans le milieu peut stimuler ou inhiber la crois-
sance.
-
impuretés de l’eau distillée;
II est recommandé d’utiliser, pour préparer les mi-
- régénération répétée du milieu ou stock age pro-
lieux, de l’eau distillée sur verre et, pour les études
longé, notam ment à d es températu res é levées;
de croissance critique, de l’eau bidistillée sur verre
ou de l’eau ultra-pure? L’eau non conforme aux
-
hydrolyse des constituants.
prescriptions définies pour l’eau distillée sur verre
peut contenir des substances susceptibles d’altérer
les performances des milieux.
4.3 Résistance du gel
Bien que la dérive du pH soit une caractéristique
inhérente à l’eau purifiée, l’obtention de valeurs ex-
Pour les milieux gélosés, on peut effectuer un
trêmes indique une contamination chimique.
contrôle de résistance sur une boîte préalablement
séchée, à l’aide d’une anse bouctee. Des méthodes
de séchage sont spécifiées dans l’article 6.
4.5 Verrerie
Une résistance insuffisante peut avoir différentes
La propreté de la verrerie est un facteur critique de
causes:
la préparation des milieux. Des traces de détergents
ou de substances chimiques peuvent avoir une forte
-
absence de gélose dans la solution;
influence sur la composition du milieu et la crois-
sance sur ce milieu. Certaines solutions .de net-
- homogénéisation insuffisante;
toyage étant difficiles à éliminer totalement, il est
recommandé de procéder à des contrôles de pH sur
turne d’eau in-
- proportio n milieu déshydraté/vo
la verrerie propre (notamment si elle a été trempée
correcte;
dans des solutions acides ou basiques).
- dérive du pH due à l’hydrolyse d’un acide (les Certains agents mouillants ou détergents utilisés
géloses ((acides>), par exemple à base d’extrait pour laver la verrerie peuvent contenir des sub-
stances bactériostatiques ou inhibitrices, et il faut
de malt, se décomposent lors d’un chauffage
effectuer 6 à 12 rincages successifs à l’eau ultra-
prolongé ou à de régénérations répétées);
pure pour éliminer toute trace de ces produits et
-
non compensation de la dilution du milieu gélosé assurer l’absence d’action bactériostatique rési-
due à l’addition de I’inoculum. duelle.
avec filtr ation
Eau pouvant être obtenue avec un dispositif similaire à un système Milli-Q à 4 cartouches sur membrane
1)
du produit final.
Le système Milli-Q est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
Le mode opératoire à suivre pour vérifier l’absence 4.8 Altération des propriétés conditionnant la
de résidus, qui est extrait de fi], est décrit dans
revivification bactérienne ou la différenciation
l’annexe B.
La perte d’efficacité soudaine d’un milieu peut avoir
de multiples causes,
entre autres: régénérations
répetées, chauffage prolongé ou excessif, homogé-
néisation insuffisante, carbonisation ou combustion,
4.6 Aspect
non compensation de la dilution des ingrédients due
à l’addition de I’inoculum, modification de la com-
Le milieu préparé doit normalement avoir la couleur
position par I’inoculum, par exemple par introduc-
et la limpidité typiques. Le brunissement et I’appa-
tion d’electrolytes forts ou de sucre en solution, de
rition d’un précipité font partie des signes évidents
détergents, d’antiseptiques, de métaux toxiques, de
d’erreur de préparation. Le brunissement peut ré-
matériel protéiquet etc.
sulter d’un échauffement excessif dû à une ho-
Le point à noter est que certaines de ces erreurs
mogénéisation insuffisante.
n’entraînent pas de modification de l’aspect visuel
On observe parfois une dissolution incomplète du
par rapport à un milieu correctement préparé. La
milieu déshydraté, Ce phénomène peut être dû à
même erreur peut parfois être reproduite pendant
une imprégnation insuffisante, un chauffage
des mois avant que l’on en arrive à se demander si
inadéquat, une homogénéisation incomplète, ou à
le milieu a perdu de son efficacité, ou si les échan-
l’utilisation d’eau du robinet ou d’un récipient de
tillons sont plus faiblement contaminés. Seule une
taille trop petite pour permettre une convection suf-
surveillance constante peut permettre de réduire la
fisante.
fréquence de tels problèmes. II est recommandé
d’utiliser une culture pure produisant la réaction
Les milieux gélosés peuvent précipiter lors d’une
type sur le milieu (témoin positif).
stérilisation ou d’un chauffage prolongés. De même,
la régénération répétée de la gélose solidifiée ou le
4.9 Durée de conservation
maintien prolongé de la gélose liquéfiée à tempéra-
ture élevée peuvent entraîner la formation d’un
La durée de vie d’un milieu de culture, une fois
précipité dans le milieu. II peut également y avoir
préparé, dépend de plusieurs facteurs. S’il est sou-
floculation de la gélose si le milieu liquide est
haitable, pour les travaux les plus critiques, d’utili-
maintenu au bain-marie à 43-45 OC pendant plus de
de sa préparation, de
ser le milieu le jour même
30 min, mais il est possible de disperser le précipité
nombreux milieux peuvent être conservés sans ris-
fluctuant en recuisant le milieu. Le maintien pro-
que au réfrigérateur pendant plusieurs semaines
longé des milieux gélosés à l’état fondu peut
avant l’emploi. Les milieux liquides ou solides en-
également entraîner une dégradation de leurs qua-
fermés dans des récipients à bouchon vissé (pour
lités nutritives.
empêcher l’évaporation) se prêtent mieux à une
conservation prolongée que les milieux stockés en
boîte ou dans des récipients bouchés avec de
l’ouate.
4.7 Produits chimiques
Le stockage prolongé des milieux stériles n’est pas
recommandé, à moins que leur stabilité n’ait été
Pour assurer la compatibilité des milieux, des réac-
établie.
tifs et des solutions et la reproductibilité des résul-
tats d’essai, il est recommandé d’utiliser pour la
II convient de porter sur tous les milieux préparés
des produits chimiques de qualité
préparation
et tous les emballages enta’més la date indiquant
maximale. Il a souvent été signalé, par exemple,
leur durée de conservation. Pour les milieux déshy-
que certaines marques de dihydrogénophosphate
dratés non entamés, il convient de respecter les
de potassium (KH,PO,) contiennent des quantités
spécifications du fabricant relatives à la durée de
importantes d’impuretés pouvant toutes avoir une
conservation.
action inhibitrice ou stimulante sur la croissance
bactérienne. La qualité des produits chimiques utili-
sés doit être consignée avec soin afin que les for-
5 Analyses statistiques
mulations ultérieures soient conformes à la
formulation initiale.
5.1 Généralités
La mise en solution correcte des produits chimiques
,
et l’homogénéisation des solutions, des milieux et Les microbiologistes sont constamment à la re-
cherche du milieu le mieux approprié pour isoler et
des réactifs sont des facteurs importants pour as-
dénombrer de façon sélective un organisme cible
surer l’homogénéité et la compatibilité des diffé-
rents lots au sein d’un même laboratoire et d’un ou une population d’organismes issus d’une prise
laboratoire à l’autre. d’essai OIJ d’un échantillon donné. Il existe sur ce
3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
sujet une littérature abondante, et de nombreux au- gélosé approprié, pour obtenir un nombre d’or-
ganismes compris dans la gamme de comptage.
teurs qui préconisent chacun l’utilisation d’un milieu
qu’ils considèrent comme le milieu optimal dans les
conditions d’essai imposées. Les milieux préconisés
5.3 Réactifs et produits
dans ces études comparatives et ces recomman-
dations tendent invariablement à avoir des adeptes
Adaptés aux milieux comparés par les méthodes
régionaux, ce qui rend difficile les études compa-
d’étalement, d’incorporation ou de filtration sur
ratives de la qualité de l’eau comme le soulignait
membrane. Une gélose nutritive non spécifique peut
une étude notée en 121.
être incluse dans tous les essais pour les comp-
tages de colonies issues de cultures pures. II
II est donc très important, pour pouvoir mener à
convient de comparer la revivification d’organismes,
l’échelle nationale et internationale des études
cibles ou non, sur des milieux sélectifs avec la
comparatives de qualité des eaux, de normaliser
revivification sur des milieux non sélectifs, et de
autant que possible les milieux, qui constituent l’un
vérifier la spécificité et la sélectivité.
des outils fondamentaux de l’analyse microbiologi-
que de l’eau, afin de fournir des résultats cohérents
mais aussi de permettre le développement de mé- 5.4 Appareillage
thodes normalisées pour le dénombrement de
micro-organismes spécifiques. Matériel permettant d’effectuer des essais d’étale-
ment, d’incorporation au milieu, et de filtration sur
membrane pour le dénombrement de l’organisme
5.2 Principe
cible. Les boîtes de Petri destinées à l’étalement ont
un diamètre de 100 mm environ. Elles peuvent
Des échantillons d’eau, des cultures pures (nor-
également servir pour les essais avec filtration sur
males, stressées ou endommagées) ou des dilutions
membranes. Toutefois, des boîtes de diamètre
de ces échantillons ou cultures sont étalés, incor-
compris entre 50 mm et 60 mm peuvent s’avérer
porés ou filtrés sur membrane. Les membranes sont
mieux adaptées.
ensuite déposées sur deux types au moins de mi-
lieux gélosés à comparer, la comparaison portant
5.5 Préparation des échantillons
sur un nombre significatif de colonies observées sur
plusieurs boîtes de répétition.
5.5.1 Prélever des échantillons d’eau douce ou sa-
Pour les essais sur cultures pures, on utilise essen- lée destinés à la réalisation d’essais de comptage
j ou à l’obtention de la flore de fond pour
tiellement les trois modes opératoires suivants,
l’organisme cible puis, suivant les méthodes de la-
avant étalement, incorporation ou filtration sur
membrane. boratoire courantes, procéder à l’étalement, I’incor-
poration ou la filtration sur membrane. Faire incuber
Dilution des cultures pour permettre le dénom- les boîtes de Petri ensemencées, à la température
a)
et pendant le temps appropriés. L’eau peut être
brement.
conservée à une température comprise entre 2 OC
et 4 OC.
b) Addition à des échantillons d’eau naturels à fai-
bles populations bactériennes d’une culture pure
Après incubation, examiner les boîtes de Petri et
de l’organisme cible, afin d’obtenir un nombre
procéder au comptage des colonies. II convient
d’organismes cibles compris dans la gamme de
d’utiliser l’échantillon d’eau directement pour les
comptage normale.
essais de comptage ((totaux)) ou de le compléter par
des volumes connus d’organisme cible pour les
c) Addition à des échantillons d’eau naturels à for-
études comparatives de milieux.
tes populations bactériennes d’une culture pure
de l’organisme cible, afin d’obtenir un nombre
d’organismes cibles compris dans la gamme de 5.5.2 Mettre en culture l’organisme cible pour les
comptage normale, avec ou sans dilution. milieux à comparer dans un bouillon, à la tempéra-
ture appropriée. Après incubation, mettre I’orga-
Pour les comptages de colonies à partir d’échan-
nisme cible en état de stress en l’exposant pendant
tillons d’eau naturels, on utilise essentiellement les
24 h à une température comprise entre 2 OC et 4 OC.
deux méthodes suivantes.
II est admis d’utiliser d’autres méthodes de mise en
Hat de choc ou d’endommagement préalablement
a) Etalement direct ou incorporation directe d’un
convenues.
volume inférieur ou égal à 1,O ml de l’échantillon
Étaler, incorporer ou filtrer sur membrane I’orga-
pur ou dilué, selon les modes opératoires ap-
propriés. nisme cible stress& puis faire incuber sur un milieu
nutritif non sélectif à la température appropriée et
b) Concentration de l’échantillon sur membrane fil- pendant le temps requis, qui peut être plus long que
trante et dépôt de cette membrane sur un milieu pour les organismes non mis en état de choc. Ex-
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
poser une seconde fois la culture de l’organisme en 6.3 Méthode par étaiement, organisme cible
état de choc à une température comprise entre 2 OC
stressé plus échantillon
et 4 OC.
Effectuer des dilutions appropriées de l’échantillon
Immédiatement après l’incubation, procéder au
pour obtenir des suspensions contenant, dans
comptage des colonies d’organismes cibles et non
0,5 ml, de 400 à 500 organismes (suspension A) et
cibles et déterminer la dilution appropriée pour les
de 4000 à 5000 organismes (suspension B).
études comparatives sur cultures pures ou pour
l’addition à des échantillons d’eau.
Ajouter à ces suspensions un volume de la culture
de I’orqanisme cible tel que 0,5 ml de l’échantillon
Dès que la densité convenable d’organisme cible a
complkté contienne également environ 50 à 200 or-
été établie, prélever le volume approprié de culture
qanismes cibles stressés.
L
et procéder aux essais sur culture pures et/ou
cultures mélangées.
Etaler de facon aléatoire 0,5 ml de l’une ou l’autre
des suspensions (A et B) sur chacun des milieux à
comparer, et étaler en même temps sur un milieu
nutritif non sélectif la culture de l’organisme cible
6 Mode opératoire
diluée de facon à fournir 50 à 200 colonies, afin de
déterminer fa ligne de base. On compare au total
cinq répétitions pour chacun des milieux et pour le
6.1 Généralités
milieu non sélectif. II convient d’étaler suffisamment
de suspensions pour obtenir un nombre de colonies
Les méthodes d’étalement décrites sont fondées sur
approprié.
l’utilisation de 0,5 ml d’inoculum liquide et de boîtes
Se reporter au deuxième et au troisième alinéas de
de gélose préséchées. Les boîtes de gélose utili-
6.2 pour achever cette méthode.
sées pour les dénombrements sur membrane ne
sont pas préséchées, mais il convient d’éviter la
présence d’eau libre sur la gélose, qui risque d’en-
6.4 Méthode par incorporation
traîner une croissance confluente.
Pour appliquer la méthode par incorporation, on
Pour sécher les boîtes destinées aux essais par
peut procéder comme pour la méthode par étale-
étalement, fermer les boîtes de Petri fraîchement
ment (6.2 et 6.3) en utilisant une culture pure
préparées avec leur couvercle, les retourner et les
stressée avec ou sans addition d’échantillon. Cette
placer à l’obscurité (pour les milieux sensibles à la
technique ne nécessite pas de préséchage des boî-
lumière) pendant 15 h à 18 h a température com-
tes, et le volume d’échantillon pur ou dilué à incor-
prise entre 30 OC et 35 OC.
poré est normalement de 1,0 ml.
6.5 Méthode par filtration sur membrane,
6.2 Méthode par étaiement, culture pure en
organisme cible stressé
état de choc
Après dilution de la culture pure de l’organisme ci-
Après dilution de la culture pure de l’organisme ci-
ble stressé de facon à obtenir des suspensions
ble stressé de facon à obtenir des suspensions
contenant, dans 1,O’ml plus 30 ml de diluant et après
contenant, dans 015 ml, de 50 à 200 organismes,
filtration sur membrane, environ 50 à 200 unités gé-
étaler de facon aléatoire 0,5 ml de ces suspensions
nératrices de colonies de l’organisme cible, procé-
sur chacun des milieux à comparer, et sur un milieu
der à la filtration sur membrane en utilisant une
nutritif non sélectif. II convient de réaliser cinq ré-
méthode et des membranes normalisées et répartir
pétitions sur chacun des milieux ainsi que sur le
de facon aléatoire les membranes ensemencées sur
milieu non sélectif, et d’étaler suffisamment de sus-
les milieux à comparer ainsi que sur un milieu
pensions pour obtenir un nombre de colonies ap-
nutritif non sélectif destiné au comptage du fond. II
proprié.
est également recommandé d’étaler sur un milieu
Pour répartir uniformément I’inoculum sur la gélose nutritif non sélectif 0,5 ml d’une dilution de la culture
préséchée, utiliser une tige en verre courbée, avec de l’organisme cible stressé (25 à 100 colonies),
ou sans plaque bactériologique tournante. pour évaluer le stress dû à la membrane. On com-
pare au total cinq répétitions au moins pour chacun
Refermer les boîtes de Petri et attendre que la prise
des milieux. II convient de filtrer suffisamment de
d’essai étalée soit complètement absorbée avant de
suspensions pour obtenir un nombre de colonies
I
les retourner. Une fois I’inoculum absorbé, il
approprié.
convient de mettre toutes les boîtes à incuber aussi
rapidement que possible, à la temperature appro- Aussitôt aprés avoir préparé les éch antillons , re-
priée et pendant le temps requis selon la nature de tourner les boît es de Petri et les faire incuber à la
l’organisme cible utilisé. température et pendant le temps appropriés.
5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
à comparer. Le volume total soumis à l’essai ne doit
6.6 Méthode par filtration sur memb’rane,
pas être inférieur à 10 ml.
organisme cible stressé plus échantillon
Filtrer un nombre suffisa nt d’échant illons et répartir
Concentrer ou diluer l’échantillon d’eau de facon à
les mem branes d e fac0 n aléatoire sur les milieux
obtenir des suspensions contenant, dans 1,O rk, de
d’essai choisis.
400 à 500 organismes (A) et 4000 à 5 000 organismes
2
.
0
Si la dilution d’un échantillon est nécessaire, étaler
0,5 ml d’échantillon dilué de facon à produire 50 à
Ajouter à ces suspensions (A ou B) diluées ou
200 colonies sur les boîtes de gélose utilisées dans
concentrées des volumes de la culture de I’orga-
les essais comparatifs. II convient de répartir les
nisme cible tels que 1,0 ml de l’échantillon d’eau
échantillons sur des boîtes choisies de faqon aléa-
contienne environ 50 à 200 organismes cibles
toire et de les inclure à la série étudiée par filtration
stressés.
sur membrane.
Ajouter 1,O ml du mélange échantillon/organisme
Se reporter à 6.5 pour achever cette méthode.
stressé à 30 ml de diluant, et procéder à une fïl-
tration sur membrane selon les méthodes de labo-
ratoire courantes. Répéter cette opération autant de
7 Expression des résultats
fois que nécessaire, et répartir de facon aléatoire
les membranes filtrantes sur les milkux à compa-
7.1 Après incubation pendant le temps requis,
rer. Dans la même expérience et en utilisant le
compter les colonies typiques et atypiques qui se
même plan de répartition aléatoire. filtrer le volume
sont développées sur chacun des milieux essayés
approprié de la culture de l’organisme cible stress&
et des milieux témoins, à l’aide d’un microscope
à la concentration adéquate pour obtenir 50 à 200
stéréoscopique (grossissement x 10) ou d’un autre
organismes par millilitre. Placer les membranes sur
instrument, et noter la valeur obtenue.
un milieu nutritif non sélectif.
7.2 Présenter sous forme de tableau les nombres
On com pare au tota I cinq répétitions au moins pour
de colonies typiques observées, et se reporter à
cha cun des milieux.
l’annexe A pour appliquer les méthodes d’analyse
Se reporter au dernier alinéa de 6.5 pour la dernière Les nombres de colonies
statistique appropriées.
étape de cette méthode.
atypiques sont indicatifs de la sélectivité du milieu.
7.3 Convertir les résultats en logarithmes (si la
6.7 Méthode par étalement, échantillon
valeur zéro a été obtenue, majorer toutes les va-
leurs de 1 ou 0,5 avant conversion).
Étaler de facon aléatoire sur chacun des milieux
préséchés à’comparer 0,5 ml d’échantillon pur ou
7.4 Calculer la moyenne et l’écart-type des nom-
dilué de facon à contenir, par millilitre, 50 à 200 or-
bres de colonies obtenus sur chaque milieu.
ganismes iapables de croître sur le milieu témoin
non sélectif. On compare au total cinq répétitions
7.5 Si les écarts-types obtenus sont approxi-
pour chacun des milieux.
mativement égaux (écart inférieur à quatre fois
Se roisième alinéas de
reporter au deuxième et au t l’écart-type), l’expérience est sous contrôle. Des
6.2 pour achever cette méthode. écarts-types différents peuvent refléter des diffé-
rences dans les milieux.
6.8 Méthode par incorporation, échantillon
7.6 Comme décrit dans l’annexe A, effectuer une
analyse de variante unidimensionnelle si l’essai a
Pour évaluer la croissance du fond par la méthode porté sur un seul échantillon, pour comparer les
par incorporation, on peut procéder comme pour la différences entre les moyennes obtenues pour cha-
méthode par étalement (voir 6.4 et 6.7). milieu, et une analyse de variante
que
bidimensionnelle si l’essai a porté sur plusieurs
échantillons. Dans le second cas, l’existence ou non
d’une interaction significative déterminera la facon
6.9 Méthode par filtration sur membrane,
dont l’analyse sera poursuivie pour évaluer les dif-
échantillon
férences entre milieux (voir annexe A).
Une fois déterminé le volume d’échantillon, pur ou
7.7
dilué, nécessaire pour obtenir 50 à 200 colonies Si le test I;’ met en évidence une différence si-
l’analyse de
gnificative lors de variante
après filtration sur membrane et incubation sur un
unidimensionnelle, il convient d’effectuer une ana-
milieu nutritif non sélectif, ajouter ce volume à
lyse plus détaillée.
30 ml maximum de diluant pour essayer les milieux
6
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
7.8 S’il a été décidé a priori d’essayer tous les 7.9 Si la seule décision prise a été de rechercher
milieux nouveaux par rapport à un milieu de réfé- l’existence éventuelle de différences entre les mi-
rente, cette comparaison peut être effectuée au lieux, il convient d’appliquer a posteriori un test de
moyen d’un test z pour les comparaisons par paires Studen-Newman-Keul
...
ISO
NORME
INTERNATIONALE 9998
Première édition
1991-l l-01
Ib---- .----_-_ -.-.- --.-.---.---
Qualité de l’eau - Techniques d’évaluation et
de contrôle des milieux microbiologiques
servant au comptage des colonies pour les
essais d’évaluation de la qualité de l’eau
Water qualify - Praclices /or evaluating and controlling microbiological
colony Count media used in water quality tests
----.-e-p .-----.------.---_-._-_-_-_----
--
-_._._ -. .- ---
-- - .- .--
Numéro de référence
_ . . .-_.
- ---- ~ ----- - ISO 9998:1991(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
Avant-propos
L’lSO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres
de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre inté-
ressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé
à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent également aux tra-
vaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotech-
nique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techni-
ques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins
des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 9998 a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 147, Qualité de l’eau.
L es annex es A et B font partie in tégrante de la présente Norme inter-
n ationale. L’a nnexe C es t donnée uniquement à titre d’information
0 ISO 1991
Droits de reproduction réservés. Aucune partie de cette publication ne peut être repro-
duite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou
mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
Introduction
des m icro-organis mes sur milieu de culture
Le dévelop pement dépend
de plusieur ‘s facteu rs très importants, à savoir
a) les substances nutritives adéquates doivent être disponibles;
b) l’oxygène ou d’autres gaz doivent être disponibles;
c) un certain degré d’humidité est nécessaire;
d) le milieu doit être au pH de réaction adéquat;
e) les températures adéquates doivent htre maintenues;
stérile et maintenu exempt de contamination après
f) le milieu doit être
ensemencement:
q) le milieu doit pouvoir être reproduit avec une variabitité minimale;
.
h) il convient d’éviter le surpeuplement des boites.
Pour assurer la reproductibilité des résultats microbiologiques et per-
mettre la réalisation d’études comparatives interlaboratoires, il faut
suivre des règles strictes pour la préparation des milieux microbiologi-
ques. Des directives visant à assurer la préparation adéquate de milieux
pouvant être employés avec des espérances de croissance similaires
dans différents laboratoires sont présentées ci-après.
. . .
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
NORME INTERNATIONALE
Qualité de l’eau - Techniques d’évaluation et de contrôle des
milieux microbiologiques servant au comptage des colonies
pour les essais d’évaluation de la qualité de l’eau
a) effectuer un choix entre plusieurs milieux propo-
1 Domaine d’application
sés par différents fabricants, ou
La présente Norme internationale traite de la com-
b) sélectionner le milieu le mieux approprié, ou
paraison et de l’évaluation du même milieu préparé
à partir de constituants provenant de lots différents.
c) évaluer la variabilité interlots.
Elle traite également de la comparaison et de I’éva-
L’ensemencement peut être réalisé soit par une
luation de milieux différents utilisés pour un objectif
méthode quantitative, soit par simple étalement sur
identique.
boîte à l’aide d’une anse bouclée ou, pour les mi-
Elle ne traite ni de la formulation ni de la prépa- lieux liquides, introduction des germes à la pipette.
ration des milieux, mais seulement du produit fini II est également possible d’utiliser une série
prêt à l’emploi. d’échantillons d’eau naturelle à forte population
bactérienne. Ce mode de sélection est plus proche
La présente méthode est applicable à l’évaluation
de la réalité, mais présente un inconvénient: les or-
de tout milieu solide destiné à l’isolement et au dé-
ganismes les plus exigeants peuvent ne pas être
nombrement de colonies bactériennes.
présents dans l’échantillon d’eau employé.
2 Référence normative
3.2 Des exemples d’analyses statist ques sont
La norme suivante contient des dispositions qui, par
présentés dans l’annexe A.
suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme inter-
nationale. Au moment de la publication, l’édition in-
diquée était en vigueur. Toute norme est sujette à 4 Préparation et contrôle des mi ieux
révision et les parties prenantes des accords fondés
sur la présente Norme internationale sont invitées
à rechercher la possibilité d’appliquer l’édition la
4.1 Application
plus récente de la norme indiquée ci-après. Les
membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre
Les contrôles et modes opératoires suivants peu-
des Normes internationales en vigueur a un moment
vent être appliqués à chaque lot de milieu fourni par
donné.
un fabricant ou préparé en laboratoire à partir des
constituants de base (voir également I’ISO 8199).
ISO 8199:1988, Qualité de l’eau - Guide général pour
le dénombrement des micro-organismes sur milieu
de culture.
4.2 Mesure du pH
3 Essais de productivitélde sélectivité
Préparer le milieu, le stériliser comme spécifié et
,
mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre électronique.
Pour la plupart des milieux, il convient d’ajuster le
3.1 La méthode générale à suivre consiste à en-
semencer les milieux de culture à évaluer avec des pH à la valeur cible à 25 OC, +0,2 unités. Vérifier le
pH du milieu stérilisé, après-solidification dans le
organismes et à comparer leurs performances,
cas des milieux solides.
lorsqu’on veut
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
Le pH de réaction du milieu de culture, qui exprime Un milieu gélosé presentant une résistance exces-
sa concentration en ions hydrogène, est un facteur sive peut inhiber la formation de colonies typiques,
très important de la croissance des micro- ce qui entraîne généralement le développement de
colonies bombées, souvent plus petites que la nor-
organismes. La plupart des micro-organismes pré-
fèrent des milieux de pH à peu près neutre, mais male. L’effet inhibiteur de la sécheresse de surface
certains exigent un milieu nettement acide. du milieu gélosé peut être encore plus marqué pour
les cultures sur membrane.
La dérive problèm
ai nsi qu e d’autres es rela-
du PH,
tifs au pH, peuve nt avoir di fférentes causes:
4.4 Eau
-
surchauffe;
La nature de l’eau utilisée pour préparer les milieux
est un facteur très important et peut constituer l’une
-
homogénéisation insuffisante;
des principales causes de non-comparabilité de mi-
lieux préparés dans des laboratoires différents ou
-
stérilisation trop poussée;
même dans le même laboratoire. Il est fortement
déconseillé d’utiliser l’eau du robinet pour préparer
-
utilisation de verre alcalin;
les milieux, car elle contient diverses substances,
variables d’un jour sur l’autre, dont la présence
- contamination des récipients;
dans le milieu peut stimuler ou inhiber la crois-
sance.
-
impuretés de l’eau distillée;
II est recommandé d’utiliser, pour préparer les mi-
- régénération répétée du milieu ou stock age pro-
lieux, de l’eau distillée sur verre et, pour les études
longé, notam ment à d es températu res é levées;
de croissance critique, de l’eau bidistillée sur verre
ou de l’eau ultra-pure? L’eau non conforme aux
-
hydrolyse des constituants.
prescriptions définies pour l’eau distillée sur verre
peut contenir des substances susceptibles d’altérer
les performances des milieux.
4.3 Résistance du gel
Bien que la dérive du pH soit une caractéristique
inhérente à l’eau purifiée, l’obtention de valeurs ex-
Pour les milieux gélosés, on peut effectuer un
trêmes indique une contamination chimique.
contrôle de résistance sur une boîte préalablement
séchée, à l’aide d’une anse bouctee. Des méthodes
de séchage sont spécifiées dans l’article 6.
4.5 Verrerie
Une résistance insuffisante peut avoir différentes
La propreté de la verrerie est un facteur critique de
causes:
la préparation des milieux. Des traces de détergents
ou de substances chimiques peuvent avoir une forte
-
absence de gélose dans la solution;
influence sur la composition du milieu et la crois-
sance sur ce milieu. Certaines solutions .de net-
- homogénéisation insuffisante;
toyage étant difficiles à éliminer totalement, il est
recommandé de procéder à des contrôles de pH sur
turne d’eau in-
- proportio n milieu déshydraté/vo
la verrerie propre (notamment si elle a été trempée
correcte;
dans des solutions acides ou basiques).
- dérive du pH due à l’hydrolyse d’un acide (les Certains agents mouillants ou détergents utilisés
géloses ((acides>), par exemple à base d’extrait pour laver la verrerie peuvent contenir des sub-
stances bactériostatiques ou inhibitrices, et il faut
de malt, se décomposent lors d’un chauffage
effectuer 6 à 12 rincages successifs à l’eau ultra-
prolongé ou à de régénérations répétées);
pure pour éliminer toute trace de ces produits et
-
non compensation de la dilution du milieu gélosé assurer l’absence d’action bactériostatique rési-
due à l’addition de I’inoculum. duelle.
avec filtr ation
Eau pouvant être obtenue avec un dispositif similaire à un système Milli-Q à 4 cartouches sur membrane
1)
du produit final.
Le système Milli-Q est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
2
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
Le mode opératoire à suivre pour vérifier l’absence 4.8 Altération des propriétés conditionnant la
de résidus, qui est extrait de fi], est décrit dans
revivification bactérienne ou la différenciation
l’annexe B.
La perte d’efficacité soudaine d’un milieu peut avoir
de multiples causes,
entre autres: régénérations
répetées, chauffage prolongé ou excessif, homogé-
néisation insuffisante, carbonisation ou combustion,
4.6 Aspect
non compensation de la dilution des ingrédients due
à l’addition de I’inoculum, modification de la com-
Le milieu préparé doit normalement avoir la couleur
position par I’inoculum, par exemple par introduc-
et la limpidité typiques. Le brunissement et I’appa-
tion d’electrolytes forts ou de sucre en solution, de
rition d’un précipité font partie des signes évidents
détergents, d’antiseptiques, de métaux toxiques, de
d’erreur de préparation. Le brunissement peut ré-
matériel protéiquet etc.
sulter d’un échauffement excessif dû à une ho-
Le point à noter est que certaines de ces erreurs
mogénéisation insuffisante.
n’entraînent pas de modification de l’aspect visuel
On observe parfois une dissolution incomplète du
par rapport à un milieu correctement préparé. La
milieu déshydraté, Ce phénomène peut être dû à
même erreur peut parfois être reproduite pendant
une imprégnation insuffisante, un chauffage
des mois avant que l’on en arrive à se demander si
inadéquat, une homogénéisation incomplète, ou à
le milieu a perdu de son efficacité, ou si les échan-
l’utilisation d’eau du robinet ou d’un récipient de
tillons sont plus faiblement contaminés. Seule une
taille trop petite pour permettre une convection suf-
surveillance constante peut permettre de réduire la
fisante.
fréquence de tels problèmes. II est recommandé
d’utiliser une culture pure produisant la réaction
Les milieux gélosés peuvent précipiter lors d’une
type sur le milieu (témoin positif).
stérilisation ou d’un chauffage prolongés. De même,
la régénération répétée de la gélose solidifiée ou le
4.9 Durée de conservation
maintien prolongé de la gélose liquéfiée à tempéra-
ture élevée peuvent entraîner la formation d’un
La durée de vie d’un milieu de culture, une fois
précipité dans le milieu. II peut également y avoir
préparé, dépend de plusieurs facteurs. S’il est sou-
floculation de la gélose si le milieu liquide est
haitable, pour les travaux les plus critiques, d’utili-
maintenu au bain-marie à 43-45 OC pendant plus de
de sa préparation, de
ser le milieu le jour même
30 min, mais il est possible de disperser le précipité
nombreux milieux peuvent être conservés sans ris-
fluctuant en recuisant le milieu. Le maintien pro-
que au réfrigérateur pendant plusieurs semaines
longé des milieux gélosés à l’état fondu peut
avant l’emploi. Les milieux liquides ou solides en-
également entraîner une dégradation de leurs qua-
fermés dans des récipients à bouchon vissé (pour
lités nutritives.
empêcher l’évaporation) se prêtent mieux à une
conservation prolongée que les milieux stockés en
boîte ou dans des récipients bouchés avec de
l’ouate.
4.7 Produits chimiques
Le stockage prolongé des milieux stériles n’est pas
recommandé, à moins que leur stabilité n’ait été
Pour assurer la compatibilité des milieux, des réac-
établie.
tifs et des solutions et la reproductibilité des résul-
tats d’essai, il est recommandé d’utiliser pour la
II convient de porter sur tous les milieux préparés
des produits chimiques de qualité
préparation
et tous les emballages enta’més la date indiquant
maximale. Il a souvent été signalé, par exemple,
leur durée de conservation. Pour les milieux déshy-
que certaines marques de dihydrogénophosphate
dratés non entamés, il convient de respecter les
de potassium (KH,PO,) contiennent des quantités
spécifications du fabricant relatives à la durée de
importantes d’impuretés pouvant toutes avoir une
conservation.
action inhibitrice ou stimulante sur la croissance
bactérienne. La qualité des produits chimiques utili-
sés doit être consignée avec soin afin que les for-
5 Analyses statistiques
mulations ultérieures soient conformes à la
formulation initiale.
5.1 Généralités
La mise en solution correcte des produits chimiques
,
et l’homogénéisation des solutions, des milieux et Les microbiologistes sont constamment à la re-
cherche du milieu le mieux approprié pour isoler et
des réactifs sont des facteurs importants pour as-
dénombrer de façon sélective un organisme cible
surer l’homogénéité et la compatibilité des diffé-
rents lots au sein d’un même laboratoire et d’un ou une population d’organismes issus d’une prise
laboratoire à l’autre. d’essai OIJ d’un échantillon donné. Il existe sur ce
3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
sujet une littérature abondante, et de nombreux au- gélosé approprié, pour obtenir un nombre d’or-
ganismes compris dans la gamme de comptage.
teurs qui préconisent chacun l’utilisation d’un milieu
qu’ils considèrent comme le milieu optimal dans les
conditions d’essai imposées. Les milieux préconisés
5.3 Réactifs et produits
dans ces études comparatives et ces recomman-
dations tendent invariablement à avoir des adeptes
Adaptés aux milieux comparés par les méthodes
régionaux, ce qui rend difficile les études compa-
d’étalement, d’incorporation ou de filtration sur
ratives de la qualité de l’eau comme le soulignait
membrane. Une gélose nutritive non spécifique peut
une étude notée en 121.
être incluse dans tous les essais pour les comp-
tages de colonies issues de cultures pures. II
II est donc très important, pour pouvoir mener à
convient de comparer la revivification d’organismes,
l’échelle nationale et internationale des études
cibles ou non, sur des milieux sélectifs avec la
comparatives de qualité des eaux, de normaliser
revivification sur des milieux non sélectifs, et de
autant que possible les milieux, qui constituent l’un
vérifier la spécificité et la sélectivité.
des outils fondamentaux de l’analyse microbiologi-
que de l’eau, afin de fournir des résultats cohérents
mais aussi de permettre le développement de mé- 5.4 Appareillage
thodes normalisées pour le dénombrement de
micro-organismes spécifiques. Matériel permettant d’effectuer des essais d’étale-
ment, d’incorporation au milieu, et de filtration sur
membrane pour le dénombrement de l’organisme
5.2 Principe
cible. Les boîtes de Petri destinées à l’étalement ont
un diamètre de 100 mm environ. Elles peuvent
Des échantillons d’eau, des cultures pures (nor-
également servir pour les essais avec filtration sur
males, stressées ou endommagées) ou des dilutions
membranes. Toutefois, des boîtes de diamètre
de ces échantillons ou cultures sont étalés, incor-
compris entre 50 mm et 60 mm peuvent s’avérer
porés ou filtrés sur membrane. Les membranes sont
mieux adaptées.
ensuite déposées sur deux types au moins de mi-
lieux gélosés à comparer, la comparaison portant
5.5 Préparation des échantillons
sur un nombre significatif de colonies observées sur
plusieurs boîtes de répétition.
5.5.1 Prélever des échantillons d’eau douce ou sa-
Pour les essais sur cultures pures, on utilise essen- lée destinés à la réalisation d’essais de comptage
j ou à l’obtention de la flore de fond pour
tiellement les trois modes opératoires suivants,
l’organisme cible puis, suivant les méthodes de la-
avant étalement, incorporation ou filtration sur
membrane. boratoire courantes, procéder à l’étalement, I’incor-
poration ou la filtration sur membrane. Faire incuber
Dilution des cultures pour permettre le dénom- les boîtes de Petri ensemencées, à la température
a)
et pendant le temps appropriés. L’eau peut être
brement.
conservée à une température comprise entre 2 OC
et 4 OC.
b) Addition à des échantillons d’eau naturels à fai-
bles populations bactériennes d’une culture pure
Après incubation, examiner les boîtes de Petri et
de l’organisme cible, afin d’obtenir un nombre
procéder au comptage des colonies. II convient
d’organismes cibles compris dans la gamme de
d’utiliser l’échantillon d’eau directement pour les
comptage normale.
essais de comptage ((totaux)) ou de le compléter par
des volumes connus d’organisme cible pour les
c) Addition à des échantillons d’eau naturels à for-
études comparatives de milieux.
tes populations bactériennes d’une culture pure
de l’organisme cible, afin d’obtenir un nombre
d’organismes cibles compris dans la gamme de 5.5.2 Mettre en culture l’organisme cible pour les
comptage normale, avec ou sans dilution. milieux à comparer dans un bouillon, à la tempéra-
ture appropriée. Après incubation, mettre I’orga-
Pour les comptages de colonies à partir d’échan-
nisme cible en état de stress en l’exposant pendant
tillons d’eau naturels, on utilise essentiellement les
24 h à une température comprise entre 2 OC et 4 OC.
deux méthodes suivantes.
II est admis d’utiliser d’autres méthodes de mise en
Hat de choc ou d’endommagement préalablement
a) Etalement direct ou incorporation directe d’un
convenues.
volume inférieur ou égal à 1,O ml de l’échantillon
Étaler, incorporer ou filtrer sur membrane I’orga-
pur ou dilué, selon les modes opératoires ap-
propriés. nisme cible stress& puis faire incuber sur un milieu
nutritif non sélectif à la température appropriée et
b) Concentration de l’échantillon sur membrane fil- pendant le temps requis, qui peut être plus long que
trante et dépôt de cette membrane sur un milieu pour les organismes non mis en état de choc. Ex-
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
poser une seconde fois la culture de l’organisme en 6.3 Méthode par étaiement, organisme cible
état de choc à une température comprise entre 2 OC
stressé plus échantillon
et 4 OC.
Effectuer des dilutions appropriées de l’échantillon
Immédiatement après l’incubation, procéder au
pour obtenir des suspensions contenant, dans
comptage des colonies d’organismes cibles et non
0,5 ml, de 400 à 500 organismes (suspension A) et
cibles et déterminer la dilution appropriée pour les
de 4000 à 5000 organismes (suspension B).
études comparatives sur cultures pures ou pour
l’addition à des échantillons d’eau.
Ajouter à ces suspensions un volume de la culture
de I’orqanisme cible tel que 0,5 ml de l’échantillon
Dès que la densité convenable d’organisme cible a
complkté contienne également environ 50 à 200 or-
été établie, prélever le volume approprié de culture
qanismes cibles stressés.
L
et procéder aux essais sur culture pures et/ou
cultures mélangées.
Etaler de facon aléatoire 0,5 ml de l’une ou l’autre
des suspensions (A et B) sur chacun des milieux à
comparer, et étaler en même temps sur un milieu
nutritif non sélectif la culture de l’organisme cible
6 Mode opératoire
diluée de facon à fournir 50 à 200 colonies, afin de
déterminer fa ligne de base. On compare au total
cinq répétitions pour chacun des milieux et pour le
6.1 Généralités
milieu non sélectif. II convient d’étaler suffisamment
de suspensions pour obtenir un nombre de colonies
Les méthodes d’étalement décrites sont fondées sur
approprié.
l’utilisation de 0,5 ml d’inoculum liquide et de boîtes
Se reporter au deuxième et au troisième alinéas de
de gélose préséchées. Les boîtes de gélose utili-
6.2 pour achever cette méthode.
sées pour les dénombrements sur membrane ne
sont pas préséchées, mais il convient d’éviter la
présence d’eau libre sur la gélose, qui risque d’en-
6.4 Méthode par incorporation
traîner une croissance confluente.
Pour appliquer la méthode par incorporation, on
Pour sécher les boîtes destinées aux essais par
peut procéder comme pour la méthode par étale-
étalement, fermer les boîtes de Petri fraîchement
ment (6.2 et 6.3) en utilisant une culture pure
préparées avec leur couvercle, les retourner et les
stressée avec ou sans addition d’échantillon. Cette
placer à l’obscurité (pour les milieux sensibles à la
technique ne nécessite pas de préséchage des boî-
lumière) pendant 15 h à 18 h a température com-
tes, et le volume d’échantillon pur ou dilué à incor-
prise entre 30 OC et 35 OC.
poré est normalement de 1,0 ml.
6.5 Méthode par filtration sur membrane,
6.2 Méthode par étaiement, culture pure en
organisme cible stressé
état de choc
Après dilution de la culture pure de l’organisme ci-
Après dilution de la culture pure de l’organisme ci-
ble stressé de facon à obtenir des suspensions
ble stressé de facon à obtenir des suspensions
contenant, dans 1,O’ml plus 30 ml de diluant et après
contenant, dans 015 ml, de 50 à 200 organismes,
filtration sur membrane, environ 50 à 200 unités gé-
étaler de facon aléatoire 0,5 ml de ces suspensions
nératrices de colonies de l’organisme cible, procé-
sur chacun des milieux à comparer, et sur un milieu
der à la filtration sur membrane en utilisant une
nutritif non sélectif. II convient de réaliser cinq ré-
méthode et des membranes normalisées et répartir
pétitions sur chacun des milieux ainsi que sur le
de facon aléatoire les membranes ensemencées sur
milieu non sélectif, et d’étaler suffisamment de sus-
les milieux à comparer ainsi que sur un milieu
pensions pour obtenir un nombre de colonies ap-
nutritif non sélectif destiné au comptage du fond. II
proprié.
est également recommandé d’étaler sur un milieu
Pour répartir uniformément I’inoculum sur la gélose nutritif non sélectif 0,5 ml d’une dilution de la culture
préséchée, utiliser une tige en verre courbée, avec de l’organisme cible stressé (25 à 100 colonies),
ou sans plaque bactériologique tournante. pour évaluer le stress dû à la membrane. On com-
pare au total cinq répétitions au moins pour chacun
Refermer les boîtes de Petri et attendre que la prise
des milieux. II convient de filtrer suffisamment de
d’essai étalée soit complètement absorbée avant de
suspensions pour obtenir un nombre de colonies
I
les retourner. Une fois I’inoculum absorbé, il
approprié.
convient de mettre toutes les boîtes à incuber aussi
rapidement que possible, à la temperature appro- Aussitôt aprés avoir préparé les éch antillons , re-
priée et pendant le temps requis selon la nature de tourner les boît es de Petri et les faire incuber à la
l’organisme cible utilisé. température et pendant le temps appropriés.
5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 9998:1991 (F)
à comparer. Le volume total soumis à l’essai ne doit
6.6 Méthode par filtration sur memb’rane,
pas être inférieur à 10 ml.
organisme cible stressé plus échantillon
Filtrer un nombre suffisa nt d’échant illons et répartir
Concentrer ou diluer l’échantillon d’eau de facon à
les mem branes d e fac0 n aléatoire sur les milieux
obtenir des suspensions contenant, dans 1,O rk, de
d’essai choisis.
400 à 500 organismes (A) et 4000 à 5 000 organismes
2
.
0
Si la dilution d’un échantillon est nécessaire, étaler
0,5 ml d’échantillon dilué de facon à produire 50 à
Ajouter à ces suspensions (A ou B) diluées ou
200 colonies sur les boîtes de gélose utilisées dans
concentrées des volumes de la culture de I’orga-
les essais comparatifs. II convient de répartir les
nisme cible tels que 1,0 ml de l’échantillon d’eau
échantillons sur des boîtes choisies de faqon aléa-
contienne environ 50 à 200 organismes cibles
toire et de les inclure à la série étudiée par filtration
stressés.
sur membrane.
Ajouter 1,O ml du mélange échantillon/organisme
Se reporter à 6.5 pour achever cette méthode.
stressé à 30 ml de diluant, et procéder à une fïl-
tration sur membrane selon les méthodes de labo-
ratoire courantes. Répéter cette opération autant de
7 Expression des résultats
fois que nécessaire, et répartir de facon aléatoire
les membranes filtrantes sur les milkux à compa-
7.1 Après incubation pendant le temps requis,
rer. Dans la même expérience et en utilisant le
compter les colonies typiques et atypiques qui se
même plan de répartition aléatoire. filtrer le volume
sont développées sur chacun des milieux essayés
approprié de la culture de l’organisme cible stress&
et des milieux témoins, à l’aide d’un microscope
à la concentration adéquate pour obtenir 50 à 200
stéréoscopique (grossissement x 10) ou d’un autre
organismes par millilitre. Placer les membranes sur
instrument, et noter la valeur obtenue.
un milieu nutritif non sélectif.
7.2 Présenter sous forme de tableau les nombres
On com pare au tota I cinq répétitions au moins pour
de colonies typiques observées, et se reporter à
cha cun des milieux.
l’annexe A pour appliquer les méthodes d’analyse
Se reporter au dernier alinéa de 6.5 pour la dernière Les nombres de colonies
statistique appropriées.
étape de cette méthode.
atypiques sont indicatifs de la sélectivité du milieu.
7.3 Convertir les résultats en logarithmes (si la
6.7 Méthode par étalement, échantillon
valeur zéro a été obtenue, majorer toutes les va-
leurs de 1 ou 0,5 avant conversion).
Étaler de facon aléatoire sur chacun des milieux
préséchés à’comparer 0,5 ml d’échantillon pur ou
7.4 Calculer la moyenne et l’écart-type des nom-
dilué de facon à contenir, par millilitre, 50 à 200 or-
bres de colonies obtenus sur chaque milieu.
ganismes iapables de croître sur le milieu témoin
non sélectif. On compare au total cinq répétitions
7.5 Si les écarts-types obtenus sont approxi-
pour chacun des milieux.
mativement égaux (écart inférieur à quatre fois
Se roisième alinéas de
reporter au deuxième et au t l’écart-type), l’expérience est sous contrôle. Des
6.2 pour achever cette méthode. écarts-types différents peuvent refléter des diffé-
rences dans les milieux.
6.8 Méthode par incorporation, échantillon
7.6 Comme décrit dans l’annexe A, effectuer une
analyse de variante unidimensionnelle si l’essai a
Pour évaluer la croissance du fond par la méthode porté sur un seul échantillon, pour comparer les
par incorporation, on peut procéder comme pour la différences entre les moyennes obtenues pour cha-
méthode par étalement (voir 6.4 et 6.7). milieu, et une analyse de variante
que
bidimensionnelle si l’essai a porté sur plusieurs
échantillons. Dans le second cas, l’existence ou non
d’une interaction significative déterminera la facon
6.9 Méthode par filtration sur membrane,
dont l’analyse sera poursuivie pour évaluer les dif-
échantillon
férences entre milieux (voir annexe A).
Une fois déterminé le volume d’échantillon, pur ou
7.7
dilué, nécessaire pour obtenir 50 à 200 colonies Si le test I;’ met en évidence une différence si-
l’analyse de
gnificative lors de variante
après filtration sur membrane et incubation sur un
unidimensionnelle, il convient d’effectuer une ana-
milieu nutritif non sélectif, ajouter ce volume à
lyse plus détaillée.
30 ml maximum de diluant pour essayer les milieux
6
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 9998:1991(F)
7.8 S’il a été décidé a priori d’essayer tous les 7.9 Si la seule décision prise a été de rechercher
milieux nouveaux par rapport à un milieu de réfé- l’existence éventuelle de différences entre les mi-
rente, cette comparaison peut être effectuée au lieux, il convient d’appliquer a posteriori un test de
moyen d’un test z pour les comparaisons par paires Studen-Newman-Keul
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.