ISO 10253:1995
(Main)Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum
Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum
Specifies a method for the determination of the toxicity of chemical compounds on the growth of marine algae. The method can be used for testing substances which are readily soluble in water. With minor changes also applicable for the determination of the inhibitory effects of effluents.
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues marines avec Skeletonema costatum et Phaeodactylum tricornutum
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour la détermination des effets toxiques de substances chimiques sur la croissance d'algues marines. La méthode est applicable à des substances facilement solubles dans l'eau qui ne sont pas significativement dégradées ou éliminées au cours de l'essai. NOTE 1 Avec quelques modifications mineures, elle est également applicable à la détermination de l'effet inhibiteur des effluents. Voir cependant la note du tableau 2.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
STANDARD
First edition
1995-10-01
- Marine algal growth
Water quality
inhibition test with Skeletonema costatum
and Phaeodactylum tricornutum
- Essai d’inhibition de Ia croissance des algues marines
Quake de I’eau
avec Skeletonema costatum et Phaeodactylum tricornutum
Reference number
iSQ 10253:1995(E)
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IISO 10253:1995(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(1 EC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 10253 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annex A of this International Standard is for information only.
0 ISO 1995
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or utilized in any form or by any means, electrorxc or mechanlcal, Inciuding photocopying and
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56 0 CH-121
Case Postale 1 Geneve 20 l Switzerland
Printed In Swltzertand
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INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO ISO 10253:1995(E)
Water quality - Marine algal growth inhi.bition test
with Skeletonema costatum and Phaeodactylum
tricornutum
3.3 growth rate: Expression of rate of increase in
1 Scope
cell density with respect to time.
This International Standard specifies a method for the
See 8.2.2.
determination of the toxic effects of Chemical com-
pounds on the growth of marine algae.
3.4 test solution: Mixture of seawater, nutrients
and test substance in which algal cells are incubated.
The method tan be used for testing substances which
are readily soluble in water and are not significantly
3.5 control: Mixture of seawater, nutrients and algal
degraded or eliminated from the test.
cells without test substance.
NOTE 1 With minor changes, the method tan also be
used to determine the inhibitory effects of effluents. See
3.6 effective concentration, EC10 or EC50: The
however the note to table 2.
concentration of test substance which results in re-
spectively a 10 % or 50 % reduction in either growth
or growth rate relative to the controls.
2 Principle
3.7 no observed effect concentration, NOEC: The
highest concentration tested at which there is no
Monospecific algal cells are cultured for several gen-
statistically significant reduction of growth or growth
erations in a defined medium containing a range of
rate relative to the controls.
concentrations of the test substance, prepared by
mixing appropriate quantities of nutrient concentrate,
seawater, stock solutions of the test substance, and
4 Materials
an inoculum of exponentially growing algal cells. The
test solutions are incubated for a minimum period of
72 h, during which the cell density in each is meas-
4.1 Test organisms
ured at intervals of at least every 24 h. Inhibition is
measured as a reduction in growth, or growth rate,
Use either of the following marine algae.
relative to control cultures grown under identical con-
ditions.
a) Skeletonema costatum (Greville) Cleve (CCAP
1077/lC, NIVA BAC 1, ISTPM P4 - Bouin).
or
3 Definitions
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin
(CCAP
For the purposes of this International Standard, the
1052/1 A - Oban, 1090/1A Göttingen, NIVA BAC
following definitions apply.
2, ISTPM Pl).
3.1 ceIl density: Number of cells per unit volume.
These algae are important and widely distributed
pianktonic phytoplankton species (Phylum
3.2 growth: Increase in cell density. Bacillariophyta) in estuarine and coastai areas.
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ISO 10253:1995(E)
The strains recommended are available in unialgal,
non-axenic cultures from the following sources: Table 1 - Synthetic seawater
Concentration of salt in
N IVA:
Norwegian Institute for Water Research
Salt
synthetic seawater
P.O. Box 173 Kjelsas
sll
N-O41 1 Oslo
Norway
22
NaCI
ISTPM Pl
MgCI,GH,O
9,7
ISTPM P4 - I I
Bouin: INERIS
Na,SO, (anhydrous)
3,7
r---- 1
9, rue de Rocroy
CaCI, (anhydrous)
w
l- 1
75010 Paris
France
KCI 0,65
l-
1
CCAP: Dunstaffnage Marine Laboratory
NaHCO, 0,20
r- 1
P.0 Box 3 Oban
Salts of H,BO, 0,023
r- 1
Argyll PA34 4AD
United Kingdom
Sterilize the seawater by membrane filtration (5.4).
Göttingen: Collection of Algal Cultures
Institute of Plant Physiology
University of Göttingen
Nikolausberger Weg 18
4.4 Nutrients
D-3400 Göttingen
Germany
Prepare three nutrient stock solutions in water, with
the compositions given in table 2.
NOTE 2 Stock cultures may be maintained in the medium
(see 4.3 and 6.1). Regular subculturing is necessary. Weekly
intervals may be necessary for Skeletonema; every two or
Table 2 - Nutrient stock solutions
three weeks may be sufficient for Phaeodactylum.
Final
Nutrient Concentration
in stock concentration
solution in test
4.2 Water
Solution
Stock Solution 1
All water used in the preparation of the synthetic
FeCI,.GH,O 48 mg/1
149 pg/l Fe)
seawater, nutrient medium and test substance sol-
MnCl,.4H,O 144 mg/1 605 pg/l (Mn)
utions shall be deionized or of equivalent purity. Take
ZnS0,.7H,O 45 mg/1
150 cig/l (Zn)
special care to avoid contamination of the water by
CuS0,5H,O 0,157 mg/1
08 pg/l Ku)
inorganic or organic substances during preparation
C0CI,~6H,0 0,404 mg/1
1,5 pg/l (Co)
and storage. Equipment made of topper shall not be
1 140 mg/1
17J cig/l
HW3
used.
Na,EDTA 1) 1 000 mg/1
15,O l-g/1
Stock Solution 2
Thiamin hydrochlo-
4.3 Seawater
50 mg/1
25 l-4
ride
Biotin 0,Ol mg/1
0,005 cigll
For culturing and testing Phaeodactylum, the medium
Vitamin B,,
0,lO mg/1
0,05 lall
(6.1) is made up by adding nutrients to either natura1
(cyanocobalamin)
or synthetic seawater. For Skeletonema, the use of
Stock Solution 3
natura1 seawater is necessaty for the long-term main-
tenance of cultures, and may also be necessary for
3,O g/l 3,O mg/1
Km4
50,O mg/1
NaNO,
the test medium because a synthetic seawater me- 50,O 911
Na,SiO,-5H,O 14,9 mg/1
149 g/l
dium may not always support sufficient growth to
meet the test quality criteria. If natura/ seawater [of
1) Complexing of heavy metals by the relatively high
salinity 30 %O @/VI) + 5 %O (m/m)] is used, care shall
concentration of EDTA present in the nutrient medium
be taken to ensure that it is not polluted.
may preclude the testing of effluents containing heavy
metals.
Prepare synthetic seawater with the composition
given in table 1.
NOTE 3 These stock solutions will eventually be diluted
(see 6.1) to obtain the final nutrient concentrations In the
All the chemicals used shall be of analytical grade.
test solutions.
2
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cJ ISO
ISO ~o~53:1995(E)
All the chemicals used shall be of analytical grade.
6.2 Preparation of inoculum
Sterilize stock solutions 1 and 3 by autoclaving at
The algal inoculum for the test shall be taken from an
120 “C for at least 15 min, and stock Solution 2 by
exponentially growing pre-culture. The pre-culture
membrane filtration (5.4).
shall be set up 3 d k 1 d before the Start of the test,
as follows.
Store the solutions in the dark at 4 “C.
Add sufficient cells from the algal stock culture to the
culture medium (6.1) to obtain an initial cell density
5 Apparatus
of approximately 2 x IO3 to IO4 cells per millilitre.
Maintain the pre-culture under the same conditions
All equipment which will come into contact with the
as those in the test (see 6.6) for 3 d + 1 d. After this,
test medium shall be made of glass or a chemically
the pre-culture should be in exponential growth and
inert material.
of sufficient cell density to be used as an inoculum for
Normal laboratory apparatus and
the test. Measure the cell density in the pre-culture
immediately before use (see 6.7) in Order to calculate
the required inoculum volume.
5.1 Temperature-controlled cabinet or room, with
a white fluorescent light providing continuous even il-
lumination, suitable for the lighting requirements
6.3 Choice of test concentrations
specified for the test in 6.6.
The concentrations of substance to be tested shall
normally follow a geometric Progression, for example
5.2 Apparatus for measuring algal cell density,
10 mg/l; 3,2 mg/l; 1 ,0 mg/l; 0,32 mg/l; . . . . 0,Ol mg/l.
preferably a particle counter, or a microscope with a
counting chamber. Alternatively, determine the state
If possible, the concentrations shall be Chosen to ob-
of growth of the algal cultures by an indirect pro-
tain several (i.e. 4 or 5) levels of inhibition of growth
cedure using a spectrometer, turbidimeter or
ranging from less than 10 % to greater than 90 %.
fluorimeter, when sufficiently sensitive and if shown
to be sufficiently well correlated with the cell density.
NOTE 4 A suitable concentration range is best deter-
The apparatus used shall be capable of accurately
mined by carrying out a preliminary range-finding test
measunng cell densities as low as IO4 cells per milli-
covering several orders of magnitude of differente between
litre and to distinguish between algal growth and dis-
test concentrations. Replication of test concentrations is
turbing effects, for example the presence of unnecessary during this preliminary test.
particulate matter and colour of the Sample.
6.4 Preparation of test substance stock
5.3 Culture flasks, for example conical flasks of ca-
Solution
pacity 250 ml, with air-permeable Stoppers.
Prepare stock solutions of the test substance, where
necessary, in the algal growth medium by dilution.
5.4 Apparatus for membrane filtration, with filters
The concentration of test substance in the stock sol-
of mean pore diameter 0,2 Pm.
utions shall be such that, when added to the test
vessels containing growth medium inoculated with
5.5 Autoclave.
the algae, the intended range of test concentrations
is obtained.
5.6 pH-meter.
Normally, the test shall be carried out without adjust-
ing the pH. However, some substances may exert a
6 Procedure
toxic effect due to extreme acidity or alkalinity. In or-
der to determine the toxicity of a substance inde-
6.1 Preparation of culture medium
pendent of pH, adjust the pH of the master stock
Solution (before the dilution in series) to that of the
Add 15 ml of nutrient stock Solution 1, 0,5 ml of nu-
culture medium, using either 1 mol/1 hydrochloric acid
trient stock Solution 2 and 1 ml of nutrient stock sol-
or 1 mol/1 sodium hydroxide Solution.
ution 3 (see table 2) to approximately 900 ml of natura1
or synthetic seawater (4.3) and then make up to 1 litre
6.5 Preparation of test solutions
with the Same seawater.
Prepare the test sofut ions by mix ing the a ,iate
Adjust the pH to 8,O -I- 0,2 by adding dilute
P ProPr
volumes of test subst ante stock solutions cul-
hydrochloric acid or sodiumhydroxide solution. ( 6.4,
3
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Q ISO
ISO 10253:1995(E)
NOTES
ture medium (6.1) and inoculum (6.2) in the test
vessels. The total
...
NORME
Iso
INTERNATIONALE
10253
Première édition
1995-l O-OI
Qualité de l’eau - Essai d’inhibition de la
croissance des algues marines avec
Skeletonema costatum et Phaeodactylum
trîcornutum
Wa ter quality - Marine algal growth inhibition test with Skeletonema
costatum and Phaeodactylum tricornutum
Numéro de référence
KO 10253: 1995(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10253 a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
I
la présen te Norme internationale est donnée u niquement
L annexe A de
titre d’inform ation.
à
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
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ISO 10253:1995(F)
NORME INTERNATIONALE 0 60
Qualité de l’eau - Essai d’inhibition de la croissance
des algues marines avec Skeletonema costatum et
Phaeodactylum tricornutum
3.1 concentration cellulaire: Nombre de cellules
1 Domaine d’application
par unité de volume.
La présente Norme internationale prescrit une mé-
3.2 croissance: Augmentation de la concentration
thode pour la détermination des effets toxiques de
cellulaire.
substances chimiques sur la croissance d’algues ma-
rines.
3.3 taux de croissance: Expression du taux d’aug-
mentation de la concentration cellulaire dans le
La méthode est applicable à des substances faci-
temps.
lement solubles dans l’eau qui ne sont pas significa-
tivement dégradées ou éliminées au cours de l’essai.
Voir 8.2.2.
Avec quelques modifications mineures, elle est
NOTE 1
3.4 solution d’essai: Mélange d’eau de mer, de
également applicable à la détermination de l‘effet inhibiteur
substances nutritives et de substance à expérimenter,
des effluents. Voir cependant la note du tableau 2.
dans lequel les cellules algales sont incubées.
3.5 solution témoin: Mélange d’eau de mer, de
2 Principe
substances nutritives et de cellules algales, sans
substance à expérimenter.
Plusieurs générations de cellules algales appartenant
à la même espèce sont cultivées dans un milieu défini
3.6 concentration efficace, CE10 ou CE50:
contenant une série de concentrations de la subs-
Concentration de la substance à expérimenter qui
tance à expérimenter, préparée en mélangeant des
entraîne une diminution de respectivement 10 % ou
quantités appropriées de concentrés nutritifs, d’eau
50 % de la croissance ou du taux de croissance par
de mer, de solutions mères de substance à expéri-
rapport aux solutions témoins.
menter et un inoculum de cellules algales en phase
exponentielle de croissance. Les solutions d’essai
3.7 concentration sans effet observé, CSEO:
sont incubées pendant une période minimale de
Concentration la plus élevée de la substance à expé-
72 h, pendant laquelle la concentration cellulaire de
rimenter pour laquelle il n’y a aucune diminution sta-
chacune d’entre elles est mesurée au moins toutes
tistiquement significative de la croissance ou du taux
,
les 24 h. L’inhibition est mesurée comme étant la di-
de croissance par rapport aux solutions témoins.
minution de la croissance ou du taux de croissance
par rapport aux cultures témoins réalisées dans des
4 Réactifs
conditions identiques.
4.1 Organismes d’essai
3 Définitions
Utiliser comme algue marine, soit
Pour les besoins de la présente Norme internationale, a) Skeletonema costatum (Greville) Cleve (CCAP
les définitions suivantes s’appliquent. 1077/1C, NIVA BAC 1, ISTPM P4 - Bouin);
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0 ISO
ISO 10253:1995(F)
substances nutritives à de l’eau de mer naturelle ou
soit
synthétique. Pour Skeletonema, l’utilisation d’eau de
b) Phaeodactylum tricorn u tum Bohlin (CCAP mer naturelle est nécessaire pour le maintien à long
1052/lA - Oban, 109O/lA Gottingen, NIVA BAC terme des cultures et peut également être nécessaire
2, ISTPM PI). pour le milieu d’essai, car un milieu d’eau de mer
synthétique ne permet pas toujours une croissance
Ces algues sont des espèces phytoplanctoniques
suffisante pour satisfaire les critères de qualité de
courantes (phylum Bacillariophyta) et largement pré-
l’essai. Si de l’eau de mer naturelle [de salinité égale
sentes dans les eaux estuariennes et côtières.
à 30 %O (m/m) + 5 %CI (m/m)] est utilisée, veiller à ce
qu’elle ne soit pas polluée.
On peut se procurer les souches recommandées sous
forme de cultures monospécifiques et non axéniques
Préparer l’eau de mer synthétique selon la compo-
auprès de:
sition indiquée dans le tableau 1.
N IVA: Norwegian Institute for Water Research
Toutes les substances chimiques utilisées doivent
P.O. Box 173 Kjelsas
être de qualité analytique.
N-041 1 Oslo
Norvège
ISTPM Pl
Tableau 1 - Eau de mer synthétique
ISTPM P4 -
INERIS
Bouin: Concentration de sel
9, rue de Rocroy
Sel dans l’eau de mer
75010 Paris
synthétique
France
911
NaCI 22
Dunstaffnage Marine Laboratory
CCAP:
P.O. Box 3 Oban
MgCI,,GH,O
917
Argyll PA34 4AD
Na,SO, (anhydre)
Royaume-Uni 3,7
CaCI, (anhydre) J#O
Collection of Algal Cultures
Gottingen:
Institute of Plant Physiology
KCI 0,65
University of Gottingen
NaHCO, 0,20
Nikolausberger Weg 18
D-3400 Gottingen
0,023
Sels de H,BO,
Allemagne
Stériliser l’eau de mer par filtration sur membrane
NOTE 2 Les cultures met-es peuvent être maintenues
(5.4).
dans le milieu (voir 4.3 et 6.1). Un repiquage régulier est
nécessaire. Des intervalles d’une semaine peuvent être né-
cessaires pour Skeletonema; des intervalles de deux
ou de trois semaines peuvent être suffisants pour
Phaeodactylum.
4.4 Substances nutritives
Préparer trois solutions mères de substances
4.2 Eau
nutritives dans l’eau, selon les compositions indi-
quées dans le tableau2.
L’eau utilisée pour la préparation de l’eau de mer
synthétique, du milieu nutritif et des solutions de
NOTE 3 Ces solutions mères seront éventuellement di-
substance à expérimenter, doit être déionisée ou
luées (voir 6.1) pour obtenir les concentrations finales en
d’une qualité équivalente. Veiller à éviter toute conta-
substances nutritives des solutions d’essai.
mination de l’eau par des substances inorganiques ou
organiques pendant la préparation et le stockage. Au-
Toutes les substances chimiques utilisées doivent
cun matériel en cuivre ne doit être utilisé.
être de qualité analytique.
Stériliser les solutions mères 1 et 3 en autoclave à
120 “C pendant au moins 15 min, et la solution mère
4.3 Eau de mer
2 par filtration sur membrane (5.4).
Pour la culture et l’essai relatif à Phaeodactylum, le
Conserver les solutions dans l’obscurité à 4 “C.
milieu de culture (6.1) est préparé à partir d’ajout de
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ISO 10253:1995(F)
0 ISO
exemple la présence de matières particulaires et la
couleur de l’échantillon.
Solutions mères de substances
Tableau 2 -
nutritives
5.3 Flacons de culture, par exemple fioles coniques
Concentration Concentration
Substance nutritive
de 250 ml avec bouchons perméables à l’air.
dans la finale de la
solution mère solution
d’essai
5.4 Appareillage pour filtration sur membrane,
utilisant des filtres de 0,2 prn de diamètre moyen de
Solution mère 1
pore.
48 mg/1 149 pg/l Fe)
FeCI,,GH,O
MnCl,,4H,O 144 mg/1 605 pg/l (Mn)
5.5 Autoclave.
ZnS0,,7H,O 45 mg/1 150 pg/l 0)
0,157 mg/1 0,6 pg/l (CU)
CuSO,,SH,O
CoCI,,6H,O 0,404 mg/1 L5 pg/l (Cd
5.6 pH-mètre.
1 140 mg/1
17J cigll
H3f303
1 000 mg/1
Na,EDTA 1) 15,O WI
6 Mode opératoire
Solution mère 2
Hydrochlorure
50 mg/1
25 la
6.1 Préparation du milieu de culture
de thiamine
0,005 pg/l
Biotine 0,Ol mg/1
Ajouter 15 ml de solution mère 1, 0,5 ml de solution
Vitamine B12
OJO mg/1 0,05 pg/l
mère 2 et 1 ml de solution mère 3 (voir tableau 2) à
(cyanocobalamine)
environ 900 ml d’eau de mer naturelle ou synthétique
Solution mère 3
(4.3) et compléter à 1 litre avec cette même eau de
3‘0 911 3,O mg/1
K3PO, mer.
50,O mg/1
NaNO, 50,O g/l
14,9 g/i 14,9 mg/1
Na,Si0,,5H,O
Ajuster le pH à 8,0 + 0,2 en ajoutant une solution di-
luée d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium.
1) La formation de complexes à partir des métaux
lourds, due à la présence dans le milieu nutritif d’EDTA
à concentration relativement élevée, peut rendre l’essai 6.2 Préparation de I’inoculum
inapplicable aux effluents contenant des métaux lourds.
L’inocolum d’algues utilisé pour l’essai doit être pré-
levé sur une préculture en phase de croissance
5 Appareillage
La préculture doit être préparée
exponentielle.
3 d + 1 d avant le début de l’essai, comme suit.
-
Tout matériel en contact avec le milieu d’essai doit
être en verre ou en matériau chimiquement inerte. Ajouter au milieu de culture (6.1) une quantité suffi-
sante de cellules provenant de la culture algale mère,
Appareillage courant de laboratoire, et
de façon à obtenir une concentration cellulaire initiale
d’environ 2 x 1 O3 à 1 O4 cellules par millilitre. Maintenir
5.1 Armoire ou pièce à température contrôlée,
la préculture dans les mêmes conditions que celles
pourvue d’une lampe fluorescente blanche assurant
de l’essai (voir 6.6) pendant 3 d + 1 d. Après ce délai,
un éclairement continu convenant pour satisfaire aux
la préculture est normalement en phase de croissance
prescriptions sur les conditions d’éclairement spéci-
exponentielle et possède une concentration cellulaire
fiées en 6.6.
suffisante pour pouvoir être utilisée comme inoculum.
Mesurer la concentration cellulaire de la préculture
immédiatement avant l’essai (voir 6.7), afin de calculer
5.2 Appareil permettant de mesurer la concen-
tration cellulaire algale, de préférence un compte- le volume d’inoculum nécessaire.
particules ou un microscope à chambre de comptage.
L’état de la croissance des cultures d’algues peut
6.3 Choix des concentrations d’essai
également être déterminé par une méthode indirecte
à l’aide d’un spectromètre, d’un turbidimètre ou d’un
Les concentrations de la substance à expérimenter
fluorimètre de sensibilité suffisante et s’il est établi
doivent normalement suivre une progression géomé-
une corrélation acceptable avec la concentration cel-
trique, par exemple 10 mg/l; 3,2 mg/l; i,O mg/l;
lulaire. L’appareil utilisé doit permettre de mesurer
mg/l.
0,32 mg/l; . . . . 0,Ol
avec précision des concentrations cellulaires aussi
faibles que 104 cellules par millilitre et de distinguer Si possible, les concentrations doivent être choisies
la croissance algale des effets perturbateurs, par de façon à obtenir plusieurs (c’est-à-dire 4 ou 5) ni-
3
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0 ISO
ISO 10253:1995(F)
Préparer une série séparée de concentrations de la
veaux d’inhibition de croissance allant de moins de
substance à expérimenter, sans algues, pour servir
10 % à plus de 90 %.
de blancs pour les déterminations de concentration
NOTE 4 La gamme de concentrations acceptables est
cellulaire.
déterminée en réalisant un essai préliminaire de «recherche
de la gamme)) couvrant plusieurs ordres de grandeur de
II est admis, si cela est justifié par des considérations
différence entre les concentrations d’essai. Lors de cet es-
techniques, de modifier le plan d’essai en augmentant
sai préliminaire, il n’est pas nécessaire de procéder a une
le nombre de concentrations et en réduisant le nom-
répétition pour chaque concentration d’essai.
bre de répétitions pour chaque concentration.
Mesurer le pH des échantillons pour chaque concen-
64 Préparation des solutions mères de
tration des solutions d’essai et des solutions témoins.
s;b Istance à expérimenter
Si nécessaire, préparer des solutions mères de subs-
tance à expérimenter dans le milieu de croissance
algale par dilution. La concentration de la substance
à expérimenter dans les solutions mères doit être
6.6 Incubation
telle qu’après ajout dans les récipients d’essai conte-
nant le milieu de croissance ensemencé avec les al-
Incuber les flacons de culture bouchés à 20 “C, sous
on obtienne la gamme de concentrations
gues,
lumière blanche continue. La température ne doit pas
requise pour l’essai.
varier de plus de 2 “C durant l’essai. L’intensité lumi-
neuse au niveau moyen des solutions d’essai, mesu-
L’essai doit normalement être effectué sans ajus-
rée à l’aide d’un récepteur approprié dans le domaine
tement du pH. Toutefois, c
...
NORME
Iso
INTERNATIONALE
10253
Première édition
1995-l O-OI
Qualité de l’eau - Essai d’inhibition de la
croissance des algues marines avec
Skeletonema costatum et Phaeodactylum
trîcornutum
Wa ter quality - Marine algal growth inhibition test with Skeletonema
costatum and Phaeodactylum tricornutum
Numéro de référence
KO 10253: 1995(F)
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10253 a été élaborée par le comité technique
lSO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
I
la présen te Norme internationale est donnée u niquement
L annexe A de
titre d’inform ation.
à
0 ISO 1995
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-l 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
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ISO 10253:1995(F)
NORME INTERNATIONALE 0 60
Qualité de l’eau - Essai d’inhibition de la croissance
des algues marines avec Skeletonema costatum et
Phaeodactylum tricornutum
3.1 concentration cellulaire: Nombre de cellules
1 Domaine d’application
par unité de volume.
La présente Norme internationale prescrit une mé-
3.2 croissance: Augmentation de la concentration
thode pour la détermination des effets toxiques de
cellulaire.
substances chimiques sur la croissance d’algues ma-
rines.
3.3 taux de croissance: Expression du taux d’aug-
mentation de la concentration cellulaire dans le
La méthode est applicable à des substances faci-
temps.
lement solubles dans l’eau qui ne sont pas significa-
tivement dégradées ou éliminées au cours de l’essai.
Voir 8.2.2.
Avec quelques modifications mineures, elle est
NOTE 1
3.4 solution d’essai: Mélange d’eau de mer, de
également applicable à la détermination de l‘effet inhibiteur
substances nutritives et de substance à expérimenter,
des effluents. Voir cependant la note du tableau 2.
dans lequel les cellules algales sont incubées.
3.5 solution témoin: Mélange d’eau de mer, de
2 Principe
substances nutritives et de cellules algales, sans
substance à expérimenter.
Plusieurs générations de cellules algales appartenant
à la même espèce sont cultivées dans un milieu défini
3.6 concentration efficace, CE10 ou CE50:
contenant une série de concentrations de la subs-
Concentration de la substance à expérimenter qui
tance à expérimenter, préparée en mélangeant des
entraîne une diminution de respectivement 10 % ou
quantités appropriées de concentrés nutritifs, d’eau
50 % de la croissance ou du taux de croissance par
de mer, de solutions mères de substance à expéri-
rapport aux solutions témoins.
menter et un inoculum de cellules algales en phase
exponentielle de croissance. Les solutions d’essai
3.7 concentration sans effet observé, CSEO:
sont incubées pendant une période minimale de
Concentration la plus élevée de la substance à expé-
72 h, pendant laquelle la concentration cellulaire de
rimenter pour laquelle il n’y a aucune diminution sta-
chacune d’entre elles est mesurée au moins toutes
tistiquement significative de la croissance ou du taux
,
les 24 h. L’inhibition est mesurée comme étant la di-
de croissance par rapport aux solutions témoins.
minution de la croissance ou du taux de croissance
par rapport aux cultures témoins réalisées dans des
4 Réactifs
conditions identiques.
4.1 Organismes d’essai
3 Définitions
Utiliser comme algue marine, soit
Pour les besoins de la présente Norme internationale, a) Skeletonema costatum (Greville) Cleve (CCAP
les définitions suivantes s’appliquent. 1077/1C, NIVA BAC 1, ISTPM P4 - Bouin);
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substances nutritives à de l’eau de mer naturelle ou
soit
synthétique. Pour Skeletonema, l’utilisation d’eau de
b) Phaeodactylum tricorn u tum Bohlin (CCAP mer naturelle est nécessaire pour le maintien à long
1052/lA - Oban, 109O/lA Gottingen, NIVA BAC terme des cultures et peut également être nécessaire
2, ISTPM PI). pour le milieu d’essai, car un milieu d’eau de mer
synthétique ne permet pas toujours une croissance
Ces algues sont des espèces phytoplanctoniques
suffisante pour satisfaire les critères de qualité de
courantes (phylum Bacillariophyta) et largement pré-
l’essai. Si de l’eau de mer naturelle [de salinité égale
sentes dans les eaux estuariennes et côtières.
à 30 %O (m/m) + 5 %CI (m/m)] est utilisée, veiller à ce
qu’elle ne soit pas polluée.
On peut se procurer les souches recommandées sous
forme de cultures monospécifiques et non axéniques
Préparer l’eau de mer synthétique selon la compo-
auprès de:
sition indiquée dans le tableau 1.
N IVA: Norwegian Institute for Water Research
Toutes les substances chimiques utilisées doivent
P.O. Box 173 Kjelsas
être de qualité analytique.
N-041 1 Oslo
Norvège
ISTPM Pl
Tableau 1 - Eau de mer synthétique
ISTPM P4 -
INERIS
Bouin: Concentration de sel
9, rue de Rocroy
Sel dans l’eau de mer
75010 Paris
synthétique
France
911
NaCI 22
Dunstaffnage Marine Laboratory
CCAP:
P.O. Box 3 Oban
MgCI,,GH,O
917
Argyll PA34 4AD
Na,SO, (anhydre)
Royaume-Uni 3,7
CaCI, (anhydre) J#O
Collection of Algal Cultures
Gottingen:
Institute of Plant Physiology
KCI 0,65
University of Gottingen
NaHCO, 0,20
Nikolausberger Weg 18
D-3400 Gottingen
0,023
Sels de H,BO,
Allemagne
Stériliser l’eau de mer par filtration sur membrane
NOTE 2 Les cultures met-es peuvent être maintenues
(5.4).
dans le milieu (voir 4.3 et 6.1). Un repiquage régulier est
nécessaire. Des intervalles d’une semaine peuvent être né-
cessaires pour Skeletonema; des intervalles de deux
ou de trois semaines peuvent être suffisants pour
Phaeodactylum.
4.4 Substances nutritives
Préparer trois solutions mères de substances
4.2 Eau
nutritives dans l’eau, selon les compositions indi-
quées dans le tableau2.
L’eau utilisée pour la préparation de l’eau de mer
synthétique, du milieu nutritif et des solutions de
NOTE 3 Ces solutions mères seront éventuellement di-
substance à expérimenter, doit être déionisée ou
luées (voir 6.1) pour obtenir les concentrations finales en
d’une qualité équivalente. Veiller à éviter toute conta-
substances nutritives des solutions d’essai.
mination de l’eau par des substances inorganiques ou
organiques pendant la préparation et le stockage. Au-
Toutes les substances chimiques utilisées doivent
cun matériel en cuivre ne doit être utilisé.
être de qualité analytique.
Stériliser les solutions mères 1 et 3 en autoclave à
120 “C pendant au moins 15 min, et la solution mère
4.3 Eau de mer
2 par filtration sur membrane (5.4).
Pour la culture et l’essai relatif à Phaeodactylum, le
Conserver les solutions dans l’obscurité à 4 “C.
milieu de culture (6.1) est préparé à partir d’ajout de
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exemple la présence de matières particulaires et la
couleur de l’échantillon.
Solutions mères de substances
Tableau 2 -
nutritives
5.3 Flacons de culture, par exemple fioles coniques
Concentration Concentration
Substance nutritive
de 250 ml avec bouchons perméables à l’air.
dans la finale de la
solution mère solution
d’essai
5.4 Appareillage pour filtration sur membrane,
utilisant des filtres de 0,2 prn de diamètre moyen de
Solution mère 1
pore.
48 mg/1 149 pg/l Fe)
FeCI,,GH,O
MnCl,,4H,O 144 mg/1 605 pg/l (Mn)
5.5 Autoclave.
ZnS0,,7H,O 45 mg/1 150 pg/l 0)
0,157 mg/1 0,6 pg/l (CU)
CuSO,,SH,O
CoCI,,6H,O 0,404 mg/1 L5 pg/l (Cd
5.6 pH-mètre.
1 140 mg/1
17J cigll
H3f303
1 000 mg/1
Na,EDTA 1) 15,O WI
6 Mode opératoire
Solution mère 2
Hydrochlorure
50 mg/1
25 la
6.1 Préparation du milieu de culture
de thiamine
0,005 pg/l
Biotine 0,Ol mg/1
Ajouter 15 ml de solution mère 1, 0,5 ml de solution
Vitamine B12
OJO mg/1 0,05 pg/l
mère 2 et 1 ml de solution mère 3 (voir tableau 2) à
(cyanocobalamine)
environ 900 ml d’eau de mer naturelle ou synthétique
Solution mère 3
(4.3) et compléter à 1 litre avec cette même eau de
3‘0 911 3,O mg/1
K3PO, mer.
50,O mg/1
NaNO, 50,O g/l
14,9 g/i 14,9 mg/1
Na,Si0,,5H,O
Ajuster le pH à 8,0 + 0,2 en ajoutant une solution di-
luée d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium.
1) La formation de complexes à partir des métaux
lourds, due à la présence dans le milieu nutritif d’EDTA
à concentration relativement élevée, peut rendre l’essai 6.2 Préparation de I’inoculum
inapplicable aux effluents contenant des métaux lourds.
L’inocolum d’algues utilisé pour l’essai doit être pré-
levé sur une préculture en phase de croissance
5 Appareillage
La préculture doit être préparée
exponentielle.
3 d + 1 d avant le début de l’essai, comme suit.
-
Tout matériel en contact avec le milieu d’essai doit
être en verre ou en matériau chimiquement inerte. Ajouter au milieu de culture (6.1) une quantité suffi-
sante de cellules provenant de la culture algale mère,
Appareillage courant de laboratoire, et
de façon à obtenir une concentration cellulaire initiale
d’environ 2 x 1 O3 à 1 O4 cellules par millilitre. Maintenir
5.1 Armoire ou pièce à température contrôlée,
la préculture dans les mêmes conditions que celles
pourvue d’une lampe fluorescente blanche assurant
de l’essai (voir 6.6) pendant 3 d + 1 d. Après ce délai,
un éclairement continu convenant pour satisfaire aux
la préculture est normalement en phase de croissance
prescriptions sur les conditions d’éclairement spéci-
exponentielle et possède une concentration cellulaire
fiées en 6.6.
suffisante pour pouvoir être utilisée comme inoculum.
Mesurer la concentration cellulaire de la préculture
immédiatement avant l’essai (voir 6.7), afin de calculer
5.2 Appareil permettant de mesurer la concen-
tration cellulaire algale, de préférence un compte- le volume d’inoculum nécessaire.
particules ou un microscope à chambre de comptage.
L’état de la croissance des cultures d’algues peut
6.3 Choix des concentrations d’essai
également être déterminé par une méthode indirecte
à l’aide d’un spectromètre, d’un turbidimètre ou d’un
Les concentrations de la substance à expérimenter
fluorimètre de sensibilité suffisante et s’il est établi
doivent normalement suivre une progression géomé-
une corrélation acceptable avec la concentration cel-
trique, par exemple 10 mg/l; 3,2 mg/l; i,O mg/l;
lulaire. L’appareil utilisé doit permettre de mesurer
mg/l.
0,32 mg/l; . . . . 0,Ol
avec précision des concentrations cellulaires aussi
faibles que 104 cellules par millilitre et de distinguer Si possible, les concentrations doivent être choisies
la croissance algale des effets perturbateurs, par de façon à obtenir plusieurs (c’est-à-dire 4 ou 5) ni-
3
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ISO 10253:1995(F)
Préparer une série séparée de concentrations de la
veaux d’inhibition de croissance allant de moins de
substance à expérimenter, sans algues, pour servir
10 % à plus de 90 %.
de blancs pour les déterminations de concentration
NOTE 4 La gamme de concentrations acceptables est
cellulaire.
déterminée en réalisant un essai préliminaire de «recherche
de la gamme)) couvrant plusieurs ordres de grandeur de
II est admis, si cela est justifié par des considérations
différence entre les concentrations d’essai. Lors de cet es-
techniques, de modifier le plan d’essai en augmentant
sai préliminaire, il n’est pas nécessaire de procéder a une
le nombre de concentrations et en réduisant le nom-
répétition pour chaque concentration d’essai.
bre de répétitions pour chaque concentration.
Mesurer le pH des échantillons pour chaque concen-
64 Préparation des solutions mères de
tration des solutions d’essai et des solutions témoins.
s;b Istance à expérimenter
Si nécessaire, préparer des solutions mères de subs-
tance à expérimenter dans le milieu de croissance
algale par dilution. La concentration de la substance
à expérimenter dans les solutions mères doit être
6.6 Incubation
telle qu’après ajout dans les récipients d’essai conte-
nant le milieu de croissance ensemencé avec les al-
Incuber les flacons de culture bouchés à 20 “C, sous
on obtienne la gamme de concentrations
gues,
lumière blanche continue. La température ne doit pas
requise pour l’essai.
varier de plus de 2 “C durant l’essai. L’intensité lumi-
neuse au niveau moyen des solutions d’essai, mesu-
L’essai doit normalement être effectué sans ajus-
rée à l’aide d’un récepteur approprié dans le domaine
tement du pH. Toutefois, c
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.