Rapeseed — Determination of glucosinolate content — Spectrometric method for total glucosinolates by glucose release

This document specifies a method for the determination of the content of the total glucosinolates in rapeseeds (colza) using visible spectrometry to determine the glucose released from glucosinolates by hydrolysis.

Colza — Détermination de la teneur en glucosinolates — Méthode spectrométrique pour les glucosinolates totaux par libération de glucose

Le présent document spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en glucosinolates totaux dans les graines de colza (colza) par spectrométrie visible, afin de déterminer le glucose libéré par les glucosinolates par hydrolyse.

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17-May-2022
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Technical specification
ISO/TS 12788:2022 - Rapeseed — Determination of glucosinolate content — Spectrometric method for total glucosinolates by glucose release Released:5/18/2022
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Technical specification
ISO/TS 12788:2022 - Rapeseed — Determination of glucosinolate content — Spectrometric method for total glucosinolates by glucose release Released:5/31/2022
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Standards Content (sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 12788
First edition
2022-05
Rapeseed — Determination
of glucosinolate content —
Spectrometric method for total
glucosinolates by glucose release
Colza — Détermination de la teneur en glucosinolates — Méthode
spectrométrique pour les glucosinolates totaux par libération de
glucose
Reference number
ISO/TS 12788:2022(E)
© ISO 2022
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ISO/TS 12788:2022(E)
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ISO/TS 12788:2022(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 1

6 Apparatus .................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling ....................................................................................................................................................................................................................... 4

8 Preparation of the test sample.............................................................................................................................................................. 5

8.1 Reduction of test sample to laboratory sample ......................................................................................................... 5

8.2 Moisture and volatile matter content ................................................................................................................................ 5

8.3 Grinding ........................................................................................................................................................................................................ 5

9 Procedure ....................................................................................................................................................................................................................5

9.1 Test portion ............................................................................................................................................................................................... 5

9.2 Extraction of glucosinolates ....................................................................................................................................................... 5

9.2.1 General ........................................................................................................................................................................................ 5

9.2.2 Principle ..................................................................................................................................................................................... 5

9.2.3 Operating mode ................................................................................................................................................................... 5

9.3 Hydrolysis and collection of glucose from glucosinolates by myrosinase and

column chromatography ............................................................................................................................................................... 6

9.4 Glucose determination .................................................................................................................................................................... 6

9.4.1 General ........................................................................................................................................................................................ 6

9.4.2 Glucose oxidase/peroxidase glucose assay (5.4) ................................................................................... 6

9.4.3 Glucose hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase assay (5.8) ............................ 7

10 Calculation of glucosinolate content ............................................................................................................................................... 8

11 Expression of results ....................................................................................................................................................................................... 9

12 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 9

12.1 Interlaboratory test ......... ................................................................................................................................................................... 9

12.2 Repeatability ............................................................................................................................................................................................ 9

12.3 Reproducibility ....................................................................................................................................................................................... 9

12.4 Critical difference ................................................................................................................................................................................ 9

12.4.1 General ........................................................................................................................................................................................ 9

12.4.2 Comparison of two groups of measurements in one laboratory ............................................. 9

12.4.3 Comparison of two groups of measurements in two laboratories ..................................... 10

13 Test report ...............................................................................................................................................................................................................10

Annex A (informative) Extraction and purification of myrosinase from Sinapis alba L., also

called white or yellow mustard.........................................................................................................................................................11

Annex B (informative) Determination of recovery of glucosinolates ............................................................................15

Annex C (informative) Results of the interlaboratory test .......................................................................................................18

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20

iii
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ISO/TS 12788:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 2,

Oleaginous seeds and fruits and oilseed meals.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO/TS 12788:2022(E)
Introduction

Glucosinolates are important antinutritional and flavour components of brassica oilseeds. They are

particularly important in brassica seeds that have been modified to reduce the level of glucosinolates

such as low glucosinolate types of rapeseed (canola). Determination of the level of glucosinolates in

these seeds often reflects the commercial value and, certainly, discrimination between seeds with high

levels of glucosinolates and those with low levels of glucosinolates is important both for commercial

testing and scientific studies. This document provides a method for the estimation of total glucosinolates

without requiring chromatographic apparatus. It complements ISO 9167, which is the reference method.

This document is a Technical Specification as the precision data issued from the collaborative trial is

not sufficient.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 12788:2022(E)
Rapeseed — Determination of glucosinolate content —
Spectrometric method for total glucosinolates by glucose
release
1 Scope

This document specifies a method for the determination of the content of the total glucosinolates in

rapeseeds (colza) using visible spectrometry to determine the glucose released from glucosinolates by

hydrolysis.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 664, Oilseeds — Reduction of laboratory sample to test sample
ISO 665, Oilseeds — Determination of moisture and volatile matter content
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
total glucosinolates

quantity of glucose released on hydrolysis by myrosinase and determined enzymatically

Note 1 to entry: The total glucosinolates is expressed as micromoles per gram of the seeds.

4 Principle

Total glucosinolates in a ground, full-fat brassica seed sample can be determined directly by estimation

of glucose released on hydrolysis as the glucose unit is common to all glucosinolates. Hydrolysis of

glucosinolates by myrosinase quantitatively releases glucose from the glucosinolates. The glucose is

analysed using either glucose oxidase/peroxidase enzyme assay or glucose hexokinase/glucose-6-

phosphate dehydrogenase enzyme assays.
5 Reagents

Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and water conforming to

grade 2 of ISO 3696.
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ISO/TS 12788:2022(E)
5.1 Hydrochloric acid (2 M).

Dissolve 43 ml 36 % hydrochloric acid or 49 ml 32 % hydrochloric acid in 250 ml water.

5.2 Phenol tungstate reagent.

Dissolve 5,0 g sodium tungstate, 5,0 g sodium phosphate, dibasic, anhydrous, and 9,0 g sodium chloride

in approximately 350 ml distilled water in a 500 ml volumetric flask. Adjust pH to 3,0 with 2 M

hydrochloric acid (approximately 125 ml). Add 2,0 g phenol and make up to the mark with water.

5.3 Glucose determination reagents.
5.4 Glucose oxidase/peroxidase assay.

NOTE The reagents in this assay can be available in kit form. In this assay, β-D-glucose reacts with oxygen

in the presence of glucose oxidase to form D-glucono-1,4-lactone and hydrogen peroxide. The hydrogen peroxide

reacts with a colourless dye in the presence of peroxidase to give a coloured compound that can be measured

spectrophotometrically.
5.5 Sodium phosphate buffer.

Dissolve 10 g sodium phosphate dibasic anhydrous in approximately 750 ml distilled water in a 1 l

volumetric flask.
5.6 Glucose oxidase reagent.

Add 105,3 mg of glucose oxidase (EC 1.1.3.4) from Aspergillus niger having activity of 25 000 units/100 mg

or 131,7 mg of glucose oxidase having activity of 20 000 units/100 mg, to the sodium phosphate buffer

mixture (5.5) and shake to mix.
5.7 Peroxidase colour reagent.

Dissolve 16,7 mg peroxidase (EC 1.11.1.7) type II from horseradish having an activity of 200 pupugallen

units per mg solid and 333 mg 4-aminoantipyrine (4-amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-

pyrazol-3-one, 98 %) in a beaker with approximately 15 ml water. Add the contents of beaker to the 1 l

volumetric flask containing the glucose oxidase (5.6) plus the sodium phosphate mixture (5.5) and fill

with distilled water to obtain the glucose oxidase/peroxidase mixture. Store this solution in a brown

bottle and refrigerate at between 2 °C and 4 °C.
5.8 Glucose hexokinase/Glucose-6-phosphate dehydrogenase glucose assay.

This assay is most conveniently carried out using commercially available kits. Glucose is first

phosphorylated to glucose-6-phosphate (G-6-P) in the presence of the enzyme hexokinase and

adenosine-5-triphosphate. G-6-P, in the presence of glucose-6-phosphate dehydrogenase, is oxidized by

nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADP) to gluconate-6-phosphate with the formation of

reduced nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH). The increase in absorption of NADPH

at 334 nm, 340 nm or 365 nm is measured. The following are constituents of a typical kit.

a) Bottle containing dry ingredients including triethanolamine buffer – pH 7,6, NADP – 110 mg, ATP

– 260 mg, magnesium sulfate, stabilizers to a total mass of 7,2 g. The contents of this bottle are

diluted to 45 ml with water to make Solution 1.

b) Solution 2 (suspension): Bottle containing 1,1 ml enzyme suspension consisting of hexokinase

(EC 2.7.1.1 about 320 U) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49 about 160 units).

NOTE Solution 1 is stable for four weeks at +4 °C and for two months at –20 °C and solution 2 is stable for

one year at 4 °C.
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ISO/TS 12788:2022(E)
5.9 Myrosinase solution.

Dissolve 12,5 mg myrosinase (beta-thioglucoside glucohydrolase EC 3.2.1.147, lyophilized, 200 U/g, from

white mustard seed) per 1,0 ml distilled water, allowing for 0,5 ml per sample. A sufficient quantity of

this solution to allow for the analyses planned should be made up fresh on the day of analysis. A method

for preparing myrosinase from white mustard seed (Sinapis alba L.) is given in Annex A.

5.10 Sodium hydroxide (0,5 M).

Dissolve 20 g sodium hydroxide in approximately 800 ml distilled water in a 1 l beaker. Transfer solution

to a 1 l volumetric flask and top up to 1 l with water.
5.11 Sodium acetate buffer (0,2 M).

Add 16,5 g sodium acetate anhydrous and 11,5 ml glacial acetic acid to 950 ml water in a 1 l volumetric

flask. Adjust pH to 4,9 with 2 M hydrochloric acid and top up to 1 l with water.
5.12 Tris-HCl buffer.

Add 1,6 g tris(hydroxymethyl)aminomethane to 900 ml water in a 1 l volumetric flask. Adjust to pH 7,0

using 2 M hydrochloric acid and fill to 1 l with water.

5.13 Glucose solution, which is used to prepare a calibration curve to relate the absorbance of samples

with the absorbance of standard glucose solutions. The calibration samples (5.13.2) should be prepared

immediately prior to measurement on the spectrometer.
5.13.1 Stock solution.

Dry D-glucose (99 % purity) under vacuum at 40 °C for 4 h. In a 1 l volumetric flask, weigh approximately

1 g dry D-glucose to an accuracy of 0,1 mg. Add 1 g benzoic acid and make up to 1 l with water.

5.13.2 Calibration samples.

Accurately measure aliquots of the glucose stock solution (5.13.1) into individual 10 ml volumetric

flasks. Add 2 ml phenol tungstate reagent (5.2) to each 10 ml volumetric flask. Carefully fill the

volumetric flasks to the 10 ml mark with water. The preparation of the calibration samples is described

in Table 1.
Table 1 — Calibration sample preparation description
Parameter Calibration sample number
1 2 3 4 5 6 7
Volume of glucose stock standard solution
0 0,10 0,20 0,50 1,0 1,5 2,0
(5.13.1)
Volume of phenol tungstate reagent (5.2) 2 2 2 2 2 2 2
Glucose concentration (μg/l) 0 0,010 0,020 0,050 0,100 0,15 0,200
Glucose content in 10 ml flask (μmol) 0 0,56 1,11 2,78 5,55 8,32 11,10
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following shall be used.

6.1 Spectrometer, capable of operating in the visible region, in particular at 505 nm and equipped

with cells of path length 1 cm, or, if the glucose hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase assay

is used, a spectrometer capable of operating in the ultraviolet region between 334 nm and 365 nm.

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ISO/TS 12788:2022(E)
6.2 Analytical balance, capable of displaying 0,000 1 g.

6.3 Centrifuge, capable of producing a radial acceleration of 5 000g, suitable for use with tubes

(6.10).
6.4 Micro grinder, e.g. a coffee mill.
6.5 Tubes, (13 × 100) mm screw cap test tubes.

6.6 Water-bath, capable of being maintained at a temperature of 37 °C and equipped with a rack to

hold chromatography columns (6.9).
6.7 Heating block, to hold tubes (6.5) maintaining a temperature of 95 °C.

6.8 Ion exchange resin, weak anion exchanger with high binding capacity, pore size 30 000 Da

exclusion limit, working pH 2 to 9 and 3 meq/g to 4 meq/g ion exchange capacity (DEAE-Sephadex®

A-25 can be used).

6.9 Chromatography columns, (0,8 × 4) cm polypropylene columns (9 cm total column height)

which hold up to 2,0 ml of chromatography media and 10 ml of eluant or sample in an integral reservoir,

equipped with stopcock and stopper and a suitable stand. Pasteur pipettes, 150 mm long packed with

glass wool may be suitable.
6.9.1 Preparation of ion exchange columns:

a) Place 100 mg of ion exchange resin (6.8) into columns (6.9). This amount has a theoretical capacity

of at least 300 microequivalents.
b) Attach stopcocks to columns.

c) Fill each column with approximately 10 ml distilled water, letting approximately 2,0 ml run through

the open stopcock.
d) Close the stopcock and cap the column loosely.
e) Let column-packing swell for a minimum of 16 h.

f) Run the following through the columns, without allowing the column to run dry: 5,0 ml 0,5 M

sodium hydroxide (5.10), followed by 10 ml distilled water, then 5,0 ml 0,2 M sodium acetate buffer

(5.11), then 10 ml water.
g) Lose the stopcock and cap the column loosely until sample is applied.
6.10 Concentrating tubes, 12 ml capacity. Suitable for centrifugation at 5 000g.
6.11 Glass cuvettes, 1 cm path length (disposable cuvettes may be used).
7 Sampling

Sampling should have been carried out in accordance with ISO 21294. If large non-oleaginous foreign

bodies have been separated before the reduction of the laboratory sample, allowance shall be made for

this in the calculation.

1) DEAE-Sephadex® A-25 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for

the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent

products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO/TS 12788:2022(E)
8 Preparation of the test sample
8.1 Reduction of test sample to laboratory sample
Prepare the laboratory sample in accordance with ISO 664.
8.2 Moisture and volatile matter content

Determine the moisture and volatile matter content of the test sample in accordance with ISO 665,

prior to sampling for grinding. If the seeds have a moisture and volatile matter content in excess of

10 % (mass fraction), dry them to less than 10 % (mass fraction) using a current of air at approximately

45 °C. If the seeds have been treated, wash them with dichloromethane and dry them in a current of air

at ambient temperature.
8.3 Grinding

Grind the seeds in the microgrinder (6.4) for 20 s. Mix then grind for a further 5 s.

9 Procedure
9.1 Test portion

Weigh approximately 200 mg measured to the nearest 0,1 mg of ground seed (see 8.3) into a

(13 × 100) mm screw cap test tube (6.5). Record this mass as m.
9.2 Extraction of glucosinolates
9.2.1 General

A procedure for testing the efficiency of extraction and subsequent analytical procedures is given in

Annex B.
9.2.2 Principle

Heat is applied to ground canola seed samples to denature the natural myrosinase, keeping the

glucosinolates intact during extraction. Glucosinolates, extracted with boiling water, are applied to a

column packed with a weak anionic exchange resin that binds the glucosinolates. Myrosinase is applied

to the column, releasing glucose from all glucosinolates present. The resulting glucose is eluted from

the columns with water.
9.2.3 Operating mode
Place the test tube, uncovered, in a 95 °C heat block (6.7) for 15 min.

NOTE It is useful to measure the temperature with a thermometer inserted into a control sample of 200 mg

ground seed similar to the samples being tested placed in a tube (6.5). Once the thermometer has reached a

stable temperature of 95 °C, the control and thermometer can be removed.

Add approximately 2,0 ml boiling water using a heated Pasteur pipette to the test tube. Heating can be

achieved by flushing the pipette several times in the boiling water prior to use. Cap, shake and return

the tube to the heating block for another 5 min. Remove the test tube from the heat block and allow to

cool. Add 2 ml room temperature water to the test tube and shake. Centrifuge at 5 000g for 10 min. Pour

the supernatant into a 12 ml graduated concentrating tube (6.10). Add 2,0 ml room temperature water

and repeat two more times. Adjust the volume in the 12 ml graduated concentrating tube to 10,0 ml

with distilled water.
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ISO/TS 12788:2022(E)

9.3 Hydrolysis and collection of glucose from glucosinolates by myrosinase and column

chromatography

Using a class A pipette, accurately apply an aliquot of the supernatant (see 9.2.3) according to Table 2,

avoiding any lipid layer which can have formed, to a prepared column (6.9), and add sufficient distilled

water to make the total aliquot and water equal 5 ml, and allow the column to drain.

Table 2 — Preparation of the sample mixture
Parameter Expected glucosinolate level (μmol/g sample)
< 30 31 to 80 81 to 120 121 to 200
Volume of aliquot (ml) (V) 5,0 3,0 2,0 1,0
Volume of additional water (ml) 0 2,0 3,0 4,0
Glucosinolates in aliquot (μmol) < 3,0 1,9 to 4,8 3,2 to 4,8 2,4 to 4,0

Rinse the column with 3 ml tris HCl buffer (5.12) rinsing the sides of the column and let drain. Carefully

add 0,50 ml of myrosinase solution (5.9) to the column and allow the myrosinase solution to enter the

column packing, leaving a slight meniscus over the packing. Close the column stopcock and cap the

columns.

The 0,50 ml volume is approximately the dead volume of the columns described in 6.9. If other columns

are used, this volume should be adjusted appropriately.

Incubate columns for 1 h at 37 °C in the water bath (6.6). Rinse the column four times with 1 ml water

and catch the eluant in a clean 12 ml graduated concentrating tube (6.10).

After this point, do not wait more than overnight before completing the analysis.

9.4 Glucose determination
9.4.1 General

The glucose determination can be carried out by glucose oxidase/peroxidase or glucose hexokinase/

glucose-6-phosphate dehydrogenase systems according to the availability of equipment or reagents.

9.4.2 Glucose oxidase/peroxidase glucose assay (5.4)
9.4.2.1 General

A deproteinizing phenol tungstate reagent is added to the solution eluted from the columns to remove

protein and other interfering substances, permitting enzyme activity in this assay. The glucose colour

reagent contains glucose oxidase, peroxidase and 4-aminoantipyrine. Glucose oxidase specifically

oxidizes glucose to gluconic acid and hydrogen peroxide. In the presence of peroxidase, the hydrogen

peroxide oxidizes 4-aminoantipyrine, an oxygen acceptor that turns a pink colour when oxidized. This

coloured product absorbs light in the visible range (λ = 505 nm) and the colour is proportional to the

max

amount of glucose present in the sample being tested. The following uses the reagents as given above.

If a commercial kit is used, the calibration and testing should be carried out in accordance with the kit

instructions.
9.4.2.2 Glucose calibration curve

This calibration curve will be used to compare the absorbance of samples with the absorbance of

standard glucose solutions to determine the unknown glucose concentrations of the samples. The

calibration should be repeated every time a new glucose colour reagent is prepared.

Place 1,0 ml aliquots of each standard dilution (5.13.2) into (13 × 100) mm screw cap test tubes (6.5).

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ISO/TS 12788:2022(E)

Add 3,0 ml glucose colour reagent (5.7) to each test tube and mix. Incubate test tubes at 37 °C for 15 min

in a water bath (6.6).

Measure absorbance of contents of test tube in a 1 cm cell on the spectrometer (6.1) at 505 nm. Correct

the absorbance of the contents of each test tube for reagent absorbance, as shown by Formula (1):

A = A – A (1)
corr measured blank
where
A is the absorbance of the reference tube contents;
measured
A is the absorbance of 0 ml of glucose solution.
blank

Plot A against the glucose concentration (μmol/ml) (absorbance as a function of glucose

corr

concentration; a linear relationship is expected). Calculate the slope a and y-intercept b of the best fit

line relating glucose concentration (μmol/ml) with absorbance (y = ax + b).
9.4.2.3 Glucose measurement in samples

Add 2,0 ml phenol tungstate reagent (5.2) to the 12 ml graduated concentrating tube (9.3) and

accurately dilute to 10,0 ml with water.

Prepare a reagent absorbance correction blank by adding 2,0 ml phenol tungstate reagent (5.2) to a

clean 12 ml graduated concentrating tube and diluting to 10,0 ml with water.
Mix cont
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 12788
Première édition
2022-05
Colza — Détermination de la
teneur en glucosinolates —
Méthode spectrométrique pour les
glucosinolates totaux par libération de
glucose
Rapeseed — Determination of glucosinolate content — Spectrometric
method for total glucosinolates by glucose release
Numéro de référence
ISO/TS 12788:2022(F)
© ISO 2022
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ISO/TS 12788:2022(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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ISO/TS 12788:2022(F)
Sommaire Page

Avant-propos .............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1

3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe.......................................................................................................................................................................................................................... 1

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 4

7 Échantillonnage ....................................................................................................................................................................................................5

8 Préparation de l’échantillon pour essai ...................................................................................................................................... 5

8.1 Réduction de l’échantillon pour essai en échantillon pour laboratoire ............................................... 5

8.2 Teneur en eau et en matières volatiles .............................................................................................................................. 5

8.3 Broyage ......................................................................................................................................................................................................... 5

9 Mode opératoire ................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 Prise d’essai ............................................................................................................................................................................................... 5

9.2 Extraction des glucosinolates ................................................................................................................................................... 6

9.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 6

9.2.2 Principe....................................................................................................................................................................................... 6

9.2.3 Mode opératoire ........................................................................................................................................... ....................... 6

9.3 Hydrolyse et collecte du glucose à partir des glucosinolates par la myrosinase et

la chromatographie sur colonne ............................................................................................................................................. 6

9.4 Dosage du glucose ................................................................................................................................................................................ 7

9.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 7

9.4.2 Dosage du glucose par la glucose oxydase/peroxydase (5.4)..................................................... 7

9.4.3 Dosage par la glucose hexokinase/glucose-6-phosphate déshydrogénase

(5.8) ................................................................................................................................................................................................ 8

10 Calcul de la teneur en glucosinolates ............................................................................................................................................. 9

11 Expression des résultats ............................................................................................................................................................................. 9

12 Fidélité .........................................................................................................................................................................................................................10

12.1 Essai interlaboratoires ................................................................................................................................................................. 10

12.2 Répétabilité ............................................................................................................................................................................................ 10

12.3 Reproductibilité .................................................................................................................................................................................. 10

12.4 Différence critique ........................................................................................................................................................................... 10

12.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 10

12.4.2 Comparaison de deux groupes de mesures dans un laboratoire ......................................... 10

12.4.3 Comparaison de deux groupes de mesures dans deux laboratoires ................................. 10

13 Rapport d’essai ...................................................................................................................................................................................................11

Annexe A (informative) Extraction et purification de la myrosinase à partir de Sinapis

alba L., aussi appelée moutarde blanche ou jaune .......................................................................................................12

Annexe B (informative) Détermination du taux de récupération des glucosinolates .................................16

Annexe C (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires .............................................................................................19

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................21

iii
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ISO/TS 12788:2022(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 2, Graines et fruits oléagineux et farines de graines oléagineuses.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO/TS 12788:2022(F)
Introduction

Les glucosinolates sont des composants antinutritionels et aromatisants importants des oléagineux

Brassica. Ils sont particulièrement importants dans les graines de Brassica qui ont été modifiées

pour réduire le niveau de glucosinolates, comme les variétés de colza à faible teneur en glucosinolates

(canola). La détermination du niveau de glucosinolates dans ces graines reflète souvent la valeur

commerciale, et la distinction entre les graines avec de hauts niveaux de glucosinolates et celles avec

de faibles niveaux est évidemment importante à la fois pour les essais commerciaux et les études

scientifiques. Le présent document fournit une méthode permettant d’estimer les glucosinolates totaux

sans nécessiter d’appareil de chromatographie. Il complète l’ISO 9167, qui est la méthode de référence.

Ce document est une Spécification technique car les données de précision issues de l'essai collaboratif

ne sont pas suffisantes.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 12788:2022(F)
Colza — Détermination de la teneur en glucosinolates —
Méthode spectrométrique pour les glucosinolates totaux
par libération de glucose
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en glucosinolates totaux

dans les graines de colza (colza) par spectrométrie visible, afin de déterminer le glucose libéré par les

glucosinolates par hydrolyse.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 664, Graines oléagineuses — Réduction de l'échantillon pour laboratoire en échantillon pour essai

ISO 665, Graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
glucosinolates totaux

quantité de glucose libérée lors de l’hydrolyse de la myrosinase et dosée de manière enzymatique

Note 1 à l'article: Les glucosinolates totaux sont exprimés en micromoles par gramme de graines.

4 Principe

Les glucosinolates totaux contenus dans un échantillon entier de graines de Brassica moulues peuvent

être déterminés directement par une estimation du glucose libéré lors de l’hydrolyse, car l’unité

de glucose est commune à tous les glucosinolates. L’hydrolyse des glucosinolates par la myrosinase

libère quantitativement du glucose à partir des glucosinolates. Le glucose est analysé soit par dosage

enzymatique de la glucose oxydase/peroxydase, soit par des dosages enzymatiques de la glucose

hexokinase/glucose-6-phosphate déshydrogénase.
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5 Réactifs

Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau

de qualité 2 conformément à l’ISO 3696.
5.1 Acide chlorhydrique (2 M).

Dissoudre 43 ml d’acide chlorhydrique à 36 % ou 49 ml d’acide chlorhydrique à 32 % dans 250 ml d’eau.

5.2 Réactif de tungstate de phénol.

Dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 5,0 g de tungstate de sodium, 5,0 g de phosphate de sodium

dibasique anhydre et 9,0 g de chlorure de sodium dans environ 350 ml d’eau distillée. Ajuster le pH à 3,0

avec de l’acide chlorhydrique à 2 M (environ 125 ml). Ajouter 2,0 g de phénol et compléter jusqu’au trait

avec de l’eau.
5.3 Réactifs pour le dosage du glucose.
5.4 Dosage de la glucose oxydase/peroxydase.

NOTE Les réactifs utilisés pour ce dosage peuvent être disponibles sous forme de kit. Dans ce dosage, le

β-D-glucose réagit avec l’oxygène en présence de glucose oxydase pour former de la D-glucono-1,4-lactone et du

peroxyde d’hydrogène. Le peroxyde d’hydrogène réagit avec un colorant incolore en présence de peroxydase

pour donner un composé coloré pouvant être mesuré par spectrophotométrie.
5.5 Tampon de phosphate de sodium.

Dans une fiole jaugée de 1 l, dissoudre 10 g de phosphate de sodium dibasique anhydre dans environ

750 ml d’eau distillée.
5.6 Réactif de glucose oxydase.

Ajouter 105,3 mg de glucose oxydase (EC 1.1.3.4) produite par Aspergillus niger ayant une activité de

25 000 unités/100 mg ou 131,7 mg de glucose oxydase ayant une activité de 20 000 unités/100 mg,

dans le mélange tampon de phosphate de sodium (5.5) et agiter pour mélanger.
5.7 Réactif colorant de peroxydase.

Dissoudre 16,7 mg de peroxydase (EC 1.11.1.7) de type II produite à partir de raifort ayant une activité

de 200 unités de pupugallen par mg de solide et 333 mg de 4-aminoantipyrine (4-amino-1,2-dihydro-

1,5-diméthyl-2-phényl-3H-pyrazol-3-one, 98 %) dans un bécher avec environ 15 ml d’eau. Ajouter le

contenu du bécher dans la fiole jaugée de 1 l contenant la glucose oxydase (5.6) plus le mélange de

phosphate de sodium (5.5) et compléter avec de l’eau distillée pour obtenir le mélange de glucose

oxydase/peroxydase. Conserver cette solution dans une bouteille brune et la réfrigérer entre 2 °C et

4 °C.

5.8 Dosage du glucose par la glucose hexokinase/glucose-6-phosphate déshydrogénase.

La manière la plus pratique pour réaliser ce dosage est d’utiliser les kits disponibles dans le commerce.

Le glucose est d’abord phosphorylé en glucose-6-phosphate (G-6-P) en présence de l’enzyme hexokinase

et d’adénosine-5-triphosphate. Le G-6-P, en présence de glucose-6-phosphate déshydrogénase, est oxydé

par le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP) en gluconate-6-phosphate avec formation

de nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate réduit (NADPH). L’augmentation de l’absorption de

NADPH à 334 nm, 340 nm ou 365 nm est mesurée. Les constituants d’un kit type sont les suivants.

a) Bouteille contenant des ingrédients secs, notamment un tampon de triéthanolamine de pH 7,6, du

NADP – 110 mg, de l’ATP – 260 mg, du sulfate de magnésium, des stabilisants d’une masse totale de

7,2 g. Le contenu de cette bouteille est dilué à 45 ml avec de l’eau pour obtenir la solution 1.

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b) Solution 2 (suspension): Bouteille contenant 1,1 ml de suspension d’enzyme composée d’hexokinase

(EC 2.7.1.1, environ 320 U) et de glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49, environ

160 unités).

NOTE La solution 1 est stable pendant quatre semaines à +4 °C et pendant deux mois à –20 °C, et la solution 2

est stable pendant un an à 4 °C.
5.9 Solution de myrosinase.

Dissoudre 12,5 mg de myrosinase (bêta-thioglucoside glucohydrolase EC 3.2.1.147, lyophilisée, 200 U/g,

produite à partir de graines de moutarde blanche) par 1,0 ml d’eau distillée, soit 0,5 ml par échantillon.

Il convient de préparer le jour de l’analyse une quantité suffisante de cette solution pour permettre

les analyses prévues. Une méthode de préparation de la myrosinase à partir de graines de moutarde

blanche (Sinapis alba L.) est fournie dans l’Annexe A.
5.10 Hydroxyde de sodium (0,5 M).

Dans un bécher de 1 l, dissoudre 20 g d’hydroxyde de sodium dans environ 800 ml d’eau distillée.

Transférer cette solution dans une fiole jaugée de 1 l et compléter à 1 l avec de l’eau.

5.11 Tampon d’acétate de sodium (0,2 M).

Dans une fiole jaugée de 1 l, ajouter 16,5 g d’acétate de sodium anhydre et 11,5 ml d’acide acétique

glacial à 950 ml d’eau. Ajuster le pH à 4,9 avec de l’acide chlorhydrique à 2 M et compléter à 1 l avec de

l’eau.
5.12 Tampon de tris-HCl.

Dans une fiole jaugée de 1 l, ajouter 1,6 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane à 900 ml d’eau. Ajuster

le pH à 7,0 avec de l’acide chlorhydrique à 2 M et compléter à 1 l avec de l’eau.

5.13 Solution de glucose, servant à préparer une courbe d’étalonnage afin de mettre en relation

l’absorbance des échantillons avec l’absorbance des solutions étalons de glucose. Il convient de préparer

les échantillons d’étalonnage (5.13.2) immédiatement avant le mesurage dans le spectromètre.

5.13.1 Solution mère.

Sécher le D-glucose (pureté de 99 %) sous vide à 40 °C pendant 4 h. Dans une fiole jaugée de 1 l, peser

environ 1 g de D-glucose sec avec une précision de 0,1 mg. Ajouter 1 g d’acide benzoïque et compléter à

1 l avec de l’eau.
5.13.2 Échantillons d’étalonnage.

Mesurer avec précision des aliquotes de la solution mère de glucose (5.13.1) dans des fioles jaugées

individuelles de 10 ml. Ajouter 2 ml de réactif de tungstate de phénol (5.2) dans chaque fiole jaugée de

10 ml. Remplir avec précaution les fioles jaugées jusqu’au trait de 10 ml avec de l’eau. La préparation des

échantillons d’étalonnage est décrite dans le Tableau 1.
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Tableau 1 — Description de la préparation des échantillons d’étalonnage
Paramètre Numéro de l’échantillon d’étalonnage
1 2 3 4 5 6 7
Volume de solution mère de glucose (5.13.1) 0 0,10 0,20 0,50 1,0 1,5 2,0
Volume de réactif de tungstate de phénol
2 2 2 2 2 2 2
(5.2)
Concentration en glucose (μg/l) 0 0,010 0,020 0,050 0,100 0,15 0,200
Teneur en glucose dans une fiole de 10 ml
0 0,56 1,11 2,78 5,55 8,32 11,10
(μmol)
6 Appareillage
Utiliser le matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Spectromètre, capable de fonctionner dans la région visible, en particulier à 505 nm, et équipé de

cellules ayant un trajet optique de 1 cm, ou, si le dosage de la glucose hexokinase/glucose-6-phosphate

déshydrogénase est réalisé, un spectromètre capable de fonctionner dans la région des ultraviolets

entre 334 nm et 365 nm.
6.2 Balance analytique, avec une précision d’affichage de 0,000 1 g.

6.3 Centrifugeuse, capable de produire une accélération radiale de 5 000g, adaptée pour une

utilisation avec des tubes (6.10).
6.4 Microbroyeur, par exemple moulin à café.
6.5 Tubes, tubes à essai à bouchon vissant de (13 × 100) mm.

6.6 Bain-marie, réglable à une température de 37 °C et muni d’un rack pour maintenir les colonnes

de chromatographie (6.9).
6.7 Bloc chauffant, pour maintenir les tubes (6.5) à une température de 95 °C.

6.8 Résine échangeuse d’ions, faible échangeur d’anions avec une forte capacité de liaison, une

limite d’exclusion de 30 000 Da, un pH de travail de 2 à 9 et une capacité d’échange d’ions de 3 méq/g à

4 méq/g (la résine DEAE-Sephadex® A-25 peut être utilisée).

6.9 Colonnes de chromatographie, colonnes en polypropylène de (0,8 × 4) cm (hauteur de colonne

totale de 9 cm), contenant jusqu’à 2,0 ml de milieux pour chromatographie et 10 ml d’éluant ou

d’échantillon dans un réservoir intégré, munies d’un robinet et d’un bouchon avec un support approprié.

Des pipettes Pasteur, de 150 mm de long, garnies de laine de verre peuvent convenir.

6.9.1 Préparation des colonnes échangeuses d’ions:

a) Placer 100 mg de résine échangeuse d’ions (6.8) dans les colonnes (6.9). Cette quantité a une

capacité théorique d’au moins 300 microéquivalents.
b) Attacher les robinets aux colonnes.

1) DEAE-Sephadex® A-25 est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information

est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou

recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est

démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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ISO/TS 12788:2022(F)

c) Remplir chaque colonne avec environ 10 ml d’eau distillée, en laissant passer approximativement

2,0 ml par le robinet ouvert.
d) Fermer le robinet et boucher la colonne sans serrer.
e) Laisser le garnissage de la colonne gonfler pendant au minimum 16 h.

f) Faire passer dans les colonnes ce qui suit, sans laisser la colonne fonctionner à vide: 5,0 ml

d’hydroxyde de sodium à 0,5 M (5.10), suivis de 10 ml d’eau distillée, puis de 5,0 ml de tampon

d’acétate de sodium à 0,2 M (5.11), puis 10 ml d’eau.

g) Desserrer le robinet et boucher la colonne sans serrer jusqu’à ce que l’échantillon soit appliqué.

6.10 Tubes concentrateurs, d’une capacité de 12 ml. Adaptés pour une centrifugation à 5 000g.

6.11 Cuvettes en verre, avec un trajet optique de 1 cm (des cuvettes à usage unique peuvent être

utilisées).
7 Échantillonnage

Il convient que l’échantillonnage ait été réalisé conformément à l’ISO 21294. Si, avant la réduction de

l’échantillon pour laboratoire, on a séparé les gros corps étrangers non oléagineux, il doit en être tenu

compte dans le calcul.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
8.1 Réduction de l’échantillon pour essai en échantillon pour laboratoire
Préparer l’échantillon pour laboratoire conformément à l’ISO 664.
8.2 Teneur en eau et en matières volatiles

Déterminer la teneur en eau et en matières volatiles de l’échantillon pour essai conformément à

l’ISO 665, avant de réaliser l’échantillonnage pour le broyage. Si les graines ont une teneur en eau et en

matières volatiles supérieure à 10 % (fraction massique), les sécher à moins de 10 % (fraction massique)

à l’aide d’un courant d’air à environ 45 °C. Si les graines ont été traitées, les laver au dichlorométhane et

les sécher dans un courant d’air à température ambiante.
8.3 Broyage

Broyer les graines dans le microbroyeur (6.4) pendant 20 s. Les mélanger, puis les broyer pendant

encore 5 s.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai

Peser environ 200 mg de graines moulues (voir 8.3), à 0,1 mg près, dans un tube à essai à bouchon

vissant de (13 × 100) mm (6.5). Noter cette masse m.
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9.2 Extraction des glucosinolates
9.2.1 Généralités

Un mode opératoire permettant de vérifier l’efficacité de l’extraction et des modes opératoires

analytiques ultérieurs est fourni dans l’Annexe B.
9.2.2 Principe

De la chaleur est appliquée sur les échantillons de graines de canola moulues pour dénaturer la

myrosinase naturelle, en gardant intacts les glucosinolates pendant l’extraction. Les glucosinolates,

extraits avec de l’eau bouillante, sont appliqués dans une colonne garnie d’une résine faiblement

échangeuse d’anions qui lie les glucosinolates. La myrosinase est appliquée dans la colonne, libérant

le glucose de tous les glucosinolates présents. Le glucose obtenu est élué à partir des colonnes avec de

l’eau.
9.2.3 Mode opératoire

Placer le tube à essai, non couvert, dans un bloc chauffant à 95 °C (6.7) pendant 15 min.

NOTE Il est utile de mesurer la température avec un thermomètre inséré dans un échantillon témoin de

200 mg de graines moulues, similaire aux échantillons à soumettre à l’essai, placé dans un tube (6.5). Une fois que

le thermomètre a atteint une température stable de 95 °C, le témoin et le thermomètre peuvent être retirés.

Dans le tube à essai, ajouter environ 2,0 ml d’eau bouillante à l’aide d’une pipette Pasteur chauffée.

La pipette peut être chauffée en la rinçant plusieurs fois à l’eau bouillante avant utilisation. Boucher,

agiter et retourner le tube sur le bloc chauffant pendant encore 5 min. Retirer le tube à essai du bloc

chauffant et le laisser refroidir. Ajouter 2 ml d’eau à température ambiante dans le tube à essai et

agiter. Centrifuger à 5 000g pendant 10 min. Verser le surnageant dans un tube concentrateur gradué

de 12 ml (6.10). Ajouter 2,0 ml d’eau à température ambiante et répéter deux autres fois. Dans le tube

concentrateur gradué de 12 ml, ajuster le volume à 10,0 ml avec de l’eau distillée.

9.3 Hydrolyse et collecte du glucose à partir des glucosinolates par la myrosinase et la

chromatographie sur colonne

À l’aide d’une pipette de classe A, appliquer précisément une aliquote du surnageant (voir 9.2.3)

conformément au Tableau 2, en évitant toute couche de lipide pouvant s’être formée, dans une colonne

préparée (6.9), et ajouter une quantité suffisante d’eau distillée pour que le volume total aliquote et eau

soit égal à 5 ml, et laisser la colonne se vidanger.
Tableau 2 — Préparation du mélange échantillon
Paramètre Niveau de glucosinolates attendu (μmol/g d’échantillon)
< 30 31 à 80 81 à 120 121 à 200
Volume d’aliquote (ml) (V) 5,0 3,0 2,0 1,0
Volume d’eau additionnel (ml) 0 2,0 3,0 4,0
Glucosinolates dans l’aliquote (μmol) < 3,0 1,9 à 4,8 3,2 à 4,8 2,4 à 4,0

Rincer la colonne avec 3 ml de tampon de tris-HCl (5.12) en rinçant les bords, et laisser la colonne se

vidanger. Ajouter avec précaution 0,50 ml de solution de myrosinase (5.9) dans la colonne, et laisser

la solution de myrosinase pénétrer dans le garnissage, en laissant un léger ménisque au-dessus du

garnissage. Fermer le robinet de la colonne et boucher les colonnes.

Le volume de 0,50 ml représente à peu près le volume mort des colonnes décrites en 6.9. Si d’autres

colonnes sont utilisées, il convient que ce volume soit ajusté de manière appropriée.

Incuber les colonnes pendant 1 h à 37 °C dans le bain-marie (6.6). Rincer la colonne quatre fois avec

1 ml d’eau et récupérer l’éluant dans un tube concentrateur gradué propre de 12 ml (6.10).

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Après ce point, ne pas attendre plus d’une nuit pour réaliser l’analyse.
9.4 Dosage du glucose
9.4.1 Généralités
Le d
...

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